具体实施方式

本发明提供了一种抗肿瘤多肽Bax-BH3，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：Asp-Ala-Ser-Thr-Lys-Lys-Leu-Ser-Glu-Cys-Leu-Arg-Arg-lle-Gly-Asp-Glu-Leu-Asp-Ser。在本发明中，编码所述抗肿瘤多肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：ATGGATGCGTCCACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTCTCCGGCGAATTGGAGATGAACTGGACAGC。本发明对所述抗肿瘤多肽Bax-BH3的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的多肽制备方法即可。

在本发明的具体实施过程中，所述抗肿瘤多肽Bax-BH3优选的通过以下方法制备获得：S1)将编码所述抗肿瘤多肽的基因连接到表达质粒上获得重组载体；S2)将所述重组载体转入细胞中进行表达获得抗肿瘤多肽Bax-BH3。

本发明编码所述抗肿瘤多肽的基因连接到表达质粒上获得重组载体。在本发明中，编码所述抗肿瘤多肽的基因优选的通过生物技术公司进行人工合成；所述表达质粒优选为pLVX-mCherry-N1质粒；编码所述抗肿瘤多肽的基因优选的连接到pLVX-mCherry-N1质粒的EcoR I和Xho I酶切位点之间。本发明以人工合成的基因为模板，以SEQ ID No.3和SEQID No.4所示的序列为引物，进行PCR扩增获得获得具有EcoRI和Xho I酶切位点的DNA片段，然后利用EcoR I和Xho I分别对所述DNA片段和pLVX-mCherry-N1质粒进行双酶切获得酶切DNA片段和酶切质粒，将所述酶切DNA片段和酶切质粒连接获得重组载体。在本发明中，所述PCR反应体系和程序优选的如表1所示。

表1 PCR反应体系和程序

在本发明中，所述双酶切的体系优选的如表2所示。在本发明中，所述双酶切的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述pLVX-mCherry-N1质粒酶切的时间优选为2.5～3.5h，更优选为3h；所述DNA片段酶切的时间优选为5～7h，更优选为6h。在本发明中，在所述双酶切结束后，优选的进行连接，所述连接的体系优选的如表3所示；所述连接的温度优选为15～17℃，更优选为16℃，所述连接的时间优选为10～14h，更优选为12h。在本发明中，连接成功后的重组载体的结构示意图如图1所示，在pLVX-mCherry-N1的EcoR I和Xho I酶切位点中插入编码抗肿瘤多肽Bax-BH3的基因，其中N端连接于EcoR I酶切位点处，C端连接于Xho I酶切位点处；整个重组载体共计8778bp，包括CVM启动子、mCherry、Puro抗性基因、ori序列和Amp抗性基因。本发明在获得所述重组载体后，将所述重组载体转化到stbl3感受态细胞中进行培养和筛选；本发明对所述培养和筛选的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规的培养和常规的酶切、电泳和测序的筛选方法即可。

表2双酶切反应体系

表3连接体系成分及用量

本发明筛选获得正确的重组载体后，将所述重组载体转入细胞进行表达。在本发明中，所述细胞优选为HEK-293T细胞；本发明对所述转入的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转入方法即可。

在本发明中，转入所述重组载体后，细胞发生了明显的凋亡，细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出；可见将含有编码抗肿瘤多肽Bax-BH3的基因的重组载体转入HEK-293T细胞后，可以促使细胞凋亡事件的发生。

本发明提供了一种高分子载体，所述高分子载体为嵌段共聚物精氨酰甘氨酰天冬氨酸-聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))。在本发明中，嵌段共聚物RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))是以甲基丙烯基功能化后的罗丹明B和甲基丙烯酸甲酯MMA作为疏水端重复单元，利用RAFT反应合成疏水端Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))，再与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA进行聚合反应合成一端亲水一端疏水的链状共嵌段高分子聚合物PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))，最后通过酰胺化反应连接靶向肽RGD，合成RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))。本发明中，所述高分子载体的具体制备方法参见实施例记载。

本发明提供了一种抗肿瘤药物，包括所述的抗肿瘤多肽Bax-BH3和辅料。在本发明中，所述抗肿瘤多肽Bax-BH3在所述抗肿瘤药物中的质量百分含量优选为1％～99％；本发明对所述辅料的种类没有特殊限定，采用抗肿瘤多肽Bax-BH3药学上可接受的辅料即可；所述辅料优选的包括载体或赋形剂。在本发明中，所述载体优选为高分子载体，尤其是能够在液体中自行组装成球状的、既具有亲水基团又具有疏水基团的荧光共嵌段高分子。在本发明中，所述药物适于注射给药。

本发明提供了一种荧光高分子纳米胶束，包括所述的抗肿瘤多肽Bax-BH3和高分子载体。在本发明中，所述高分子载体优选为嵌段共聚物精氨酰甘氨酰天冬氨酸-聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))。本发明利用所述嵌段共聚物精氨酰甘氨酰天冬氨酸-聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))在水中可自组装成球的性质制备荧光高分子纳米胶束。

本发明还提供了所述的荧光高分子纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：1)将嵌段共聚物RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))溶解于有机溶剂中获得嵌段共聚物溶液；2)将抗肿瘤多肽Bax-BH3溶于水中获得多肽溶液；3)将所述嵌段共聚物溶液逐滴滴加至所述多肽溶液中获得荧光高分子纳米胶束；步骤1)和2)之间无时间顺序限定。

在本发明中，将嵌段共聚物RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))溶解于有机溶剂中获得嵌段共聚物溶液。在本发明中，所述嵌段共聚物溶液的浓度优选为2～3mg/mL，更优选为2.2～2.8mg/mL，最优选为2.5mg/mL；在本发明中，所述有机溶剂优选为四氢呋喃。

在本发明中，将抗肿瘤多肽Bax-BH3溶于水中获得多肽溶液。在本发明中，所述多肽溶液的浓度优选为0.3～0.7mg/mL，更优选为0.4～0.6mg/mL，最优选为0.5mg/mL。在本发明中，所述水优选为高纯水。

本发明在获得嵌段共聚物溶液和多肽溶液后，将所述嵌段共聚物溶液逐滴滴加至所述多肽溶液中获得荧光高分子纳米胶束。在本发明中，所述逐滴滴加过程中优选的对多肽溶液进行超声处理，所述超声处理的功率为150～250W，优选为200W；在本发明中，每一滴所述嵌段共聚物溶液的体积优选为5～15μl，更优选为8～12μl，最优选为10μl。在本发明中，所述嵌段共聚物溶液与多肽溶液的体积比优选为1：(8～12)，更优选为1：(9～11)，最优选为1:10；本发明在所述逐滴滴加结束后，优选的继续进行超声处理5～15min，更优选为8～12min，最优选为10min。本发明在所述超声后，优选的采用旋转蒸发的方法去除体系中的溶剂，所述旋转蒸发的温度优选为45～55℃，更优选为50℃。

本发明还提供了所述的抗肿瘤多肽Bax-BH3、所述的抗肿瘤药物、所述的荧光高分子纳米胶束在制备预防和/或治疗因Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白表达异常导致的疾病的药物中的应用。在本发明中，所述疾病包括恶性肿瘤和自身免疫性疾病；所述恶性肿瘤包括但不限于肺癌、恶性血液肿瘤疾病。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

目的基因片段合成

目的基因片段合成是由吉林省库美生物科技有限公司进行合成的，其序列如下：

ATGGATGCGTCCACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTCTCCGGCGAATTGGAGATGAACTGGACAGC(SEQID No.2)。

根据目的基因序列设计内含EcoR I、Xho I的引物如下：上游引物序列5'-CCGCTCGAGATGGATGCGTCCACCAAGAAG-3'(SEQ ID No.3)，内含Xho I位点(加粗)；下游引物序列5'-CCGGAATTCGCTGTCCAGTTCATCTCC-3'(SEQ ID No.4)，内含EcoR I位点(加粗)，该引物由吉林省库美生物科技有限公司进行合成。以合成的目的基因为模板，进行PCR扩增，反应条件见表1。

目的基因与pLVX-mCherry-N1表达载体的双酶切

用EcoR I、Xho I对目的基因以及pLVX-mCherry-N1(购自genewiz金维智生物技术有限公司，货号DS16071812)分别进行双酶切，得到有粘性末端的DNA片段，用1.0％琼脂糖电泳检测酶切后各目的基因片段和线性载体，酶切反应体系见表2。酶切温度为37℃，其中目的基因酶切时间为6h，载体质粒酶切时间为3h。

目的基因与pLVX-mCherry-N1连接和转化

将双酶切后的目的基因、pLVX-mCherry-N1载体、buffer、ddH₂O及所需的酶加入到无菌的0.5mL EP管中，于16℃连接过夜，反应条件见表3。同时做对照反应，对照组只有线性载体，无目的DNA片段。反应完后，将过夜连接的产物转化到stbl3感受态细胞中。连接成功后的重组载体的示意图如图1所示。

重组载体的筛选

将转化有重组载体的stbl3感受态细胞涂布在培养皿培养过夜后取出。挑取单菌落于3mL含终浓度100μg/mL的氨苄的LB液体培养基中，置于37℃的恒温摇床中，200rpm过夜培养。然后使用无内毒素质粒大提试剂盒对重组载体进行抽提，并对提取的重组载体进行aflII酶酶切(载体质粒LVX-mCherry-N1的517bp处和6057bp处均含有aflII酶切位点)后用1.0％琼脂糖电泳检测酶切后的DNA片段，观察在5616bp和3238bp附近是否有目的片段；若有目的片段则为阳性，结果为阳性时，送样进行测序验证。

重组载体转染HEK-293T细胞

将培养好的HEK-293T细胞(购自ATCC)消化，血球计数板计数，用含体积百分含量为10％FBS的培养基将细胞稀释后加入到六孔板中，每孔2×10⁵个细胞。将六孔板置于37℃5％的CO₂培养箱中培养，待细胞长到50～70％用于转染。

实验分为五组，即空白对照组(CTL)、只含有转染试剂组(PEI)、用转染试剂转染对照质粒(对照质粒购自genewiz：80-322406707_R4)(PEI/pLVX-C)组、转染试剂转染重组载体组(PEI/pLVX-BH₃)、加入Z-VAD-FMK抑制剂组(inhibit/PEI/pLVX-BH₃)。

转染时所用质粒与转染试剂的质量体积比(m：v)为1:2，六孔板中每孔加入1μg质粒，对应加入2μl转染试剂；提前将质粒及转染试剂分别用无血清培养基稀释，充分震荡，于25℃下分别静置5min，吸取转染试剂加入含有质粒的无血清培养基中，轻弹混匀，25℃放置20min获得复合物。将细胞中原有培养基换为无血清培养基，将复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃培养箱中放置4h后吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养12h。Z-VAD-FMK(Selleck)以20μM的浓度在转染前2h加入六孔板中，用Hoechst33342染料对细胞核进行颜色，荧光显微镜下观察转染后细胞状况。

结果如图2所示，空白对照及仅含有转染试剂组细胞状态良好，由于没有转入荧光质粒，因此不含有红色荧光；其余三组实验由于转入了荧光质粒，因此显微镜下可见明显的红色荧光产生，证明转染实验成功。用转染试剂转入对照质粒的组可观察到细胞状态几乎没有发生改变，而转入含有编码Bax-BH3多肽的基因的重组载体后，细胞发生了明显的凋亡，细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出，加入抑制剂能显著抑制细胞凋亡。可见将含有编码Bax-BH3多肽的基因的重组载体转入HEK-293T细胞后，可以促使细胞凋亡事件的发生。

利用Annexin V-FITC流式细胞凋亡实验对转染后的细胞进一步检测，具体步骤为：将HEK-293T细胞用不含EDTA的胰酶消化收集；用PBS洗涤细胞二次(1000rpm离心5min)收集1～5×10⁵细胞；加入400μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入2μL Annexin V-FITC混匀后，加入2μL Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应10min；在1h内，用流式细胞仪进行凋亡检测，结果如表2所示。

表2AnnexinV-FITC流式细胞凋亡检测重组载体转染后细胞存活率表

由于对照质粒在转染后荧光强度较强，对流式结果干扰较大，因此以不含红色荧光的pGL3-basic载体作为对照质粒组替换进行实验。并对结果进行量化处理得到图4的柱状图。从图4中对比可得，转染重组载体组中的细胞存活率大幅降低，其应为重组载体转染进入细胞后，目的基因表达产生的Bax-BH3多肽使细胞发生凋亡；而在此基础上加入凋亡抑制剂Z-VAD-FMK后，细胞存活率明显提高。由此可知，转染进入细胞的重组载体所表达的Bax-BH3多肽具有促细胞凋亡的作用。

实施例2

一种荧光高分子纳米胶束包覆Bax-BH3肽的组合方式

如图5所示，本实施例以PHPMA(聚甲基丙烯酸β-羟丙酯)作为亲水端，PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)作为疏水端，罗丹明B作为荧光标记，RGD作为靶向肽(RGD肽购自吉尔生化上海有限公司)，合成一种一端亲水一端疏水的荧光共嵌段高分子胶束，利用其能在水中自组装成球的性质，包覆Bax-BH3肽(Bax-BH3肽由吉尔生化上海有限公司代为合成)。

如图6所示，以修饰后的罗丹明B和MMA作为疏水端重复单元，利用RAFT反应合成疏水端Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))，再与HPMA进行聚合反应合成一端亲水一端疏水的链状共嵌段高分子聚合物PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))，利用NHS对高分子聚合物进行羧基保护，最后合成RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))，利用其在水中可自组装成球的性质制备荧光高分子纳米胶束。

具体合成过程如下所述，反应原料均来自于北京化工厂与美国sigma试剂公司。

首先进行甲基丙烯基功能化罗丹明B的合成，合成过程共两步，首先对罗丹明B进行还原，合成还原态的罗丹明B(Rhob)，再使用甲基丙烯酰氯对Rhob进行功能化修饰，具体过程如下所示。

将罗丹明B1g溶于37.5mL的四氢呋喃(THF)溶液中，将LiAlH₄为0.2g加入到37.5mL的THF溶液中，N₂保护条件下，室温搅拌过夜12h。逐滴加入12.5mL水，猝灭反应，过滤，留滤液，用二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，加入6g Na₂SO₄干燥。将单质硫为60mg和反应物为100mg混合于圆底烧瓶中，在N₂保护条件下，160℃反应30min，而后冷却至室温，加入2.95mL无水乙醇，0.23mL浓盐酸，5.9mL蒸馏水，混匀。用5.9mL二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，加入Na₂SO₄干燥。真空干燥得粗产物1。柱层析纯化粗产物，展开剂比例为二氯甲烷/甲醇＝9:1得到纯化后的产物Rhob。

甲基丙烯酰氯为25mg，三乙胺为50mg，Rhob为75mg以二氯甲烷为溶剂，室温反应过夜。混合物用蒸馏水洗涤，用无水硫酸钠干燥，真空干燥得粗产物，柱层析纯化。展开剂比例为二氯甲烷/甲醇＝9:1。得到甲基丙烯基功能化罗丹明B(Rhob-MA)。

而后进行精氨酰甘氨酰天冬氨酸-聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))的合成。此段合成共三步，分别是聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))的合成，聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))的合成，精氨酰甘氨酰天冬氨酸-聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-嵌段聚甲基丙烯酰罗丹明B-聚甲基丙烯酸甲酯RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))的合成。具体合成过程如下所述。

Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))的合成：MMA为5mL，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸CPADB为25mg，偶氮二异丁腈AIBN为3mg，Rhob-MA为12mg，以THF为反应溶剂，冻融脱气三次后N₂保护，70℃反应6h，反应后产物石油醚沉淀，真空干燥得到纯化后产物Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))。

PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))的合成：HPMA为50mg，AIBN为3mg，上一步得到的反应产物Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))(36mg)，以THF为反应溶剂，冻融脱气三次后N₂保护，70℃反应12h，反应后产物乙醚沉淀，真空干燥得到纯化后产物PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))。

RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))的合成：NHS为0.5mg，EDC为0.8mg，PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))为26mg以MES缓冲液为反应溶剂，室温反应24h。反应产物干燥后加入THF过滤，留滤液，得到纯化后的产物NHS-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))，NHS-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))为26mg，精氨酰甘氨酰天冬氨酸RGDfK为8mg，以MES缓冲液为反应溶剂，室温反应24h。产物透析纯化48h，得到纯化后的产物溶液，将溶液冻干，得到纯化后的RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))。

Bax-BH3的ESI质谱图如图7所示，计算分子量为2331，与图7结果相符。

称取2.5mg干燥后嵌段共聚物RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))，溶于1mL的四氢呋喃(THF)溶剂中。另外称取5mg Bax-BH3肽的溶于10mL高纯水中，在超声条件下，逐滴(10μL/每次)将聚合物溶液滴入到Bax-BH3多肽溶液中，完成后继续超声10min。50℃下旋蒸至无溶剂蒸出，得到装载药物的纳米胶束RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))@BH3。

按照相同的方法，分别采用不加入RGD和不加入μBax-BH3肽的方式，从而制备获得PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)@BH3和空载体PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)作为对照。

将三种材料进行粒径分析，结果如图8所示，三种荧光高分子聚合物在水中自组装形成分散性较好、粒径较为均一的纳米胶束。三种纳米胶束的平均粒径直径均在180～260nm之间，PDI均小于0.24。连接有RGD的载药纳米胶束粒径小于未连接RGD的纳米胶束，未载药的纳米胶束粒径小于载药的纳米胶束。

采用HPLC法对纳米胶束的载药量以及包封率进行测定，色谱条件为C18色谱柱(5μ250×4.6mm)，柱温35℃，流动相为A：水，B：乙睛，流速为1.0mL/min，检测波长220nm，进样体积10μL。Bax-BH3肽标准品HPLC色谱图如图9所示，出峰时间为19.733min，峰形为单峰，说明标准品纯度较好。将Bax-BH3肽并配置成1175μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，100μg/mL。采用上述色谱柱条件进行HPLC实验，依据浓度以及峰面积进行标准曲线绘制，结果如图10所示。

取1mL纳米载药胶束于EP管中，分别加入200μL乙睛溶液破坏聚合物胶束结构，离心取上清，采用HPLC法测定样品释放出的药物在220nm波长处的吸收峰面积，并根据绘制得到的标准曲线，测定载药胶束的载药量。两种载药胶束内含Bax-BH3肽的HPLC谱图以及计算得到的包封率及载药量结果如图11所示。载药胶束包封率及装载量均较好，PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))@BH3的包封率以及载药量分别是11％和9.10％，RGD-PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))@BH3的包封率以及载药量分别是14％和15.20％。

最后对纳米胶束的体外释放情况进行表征。纳米胶束属于缓释给药系统，须做体外释放实验对制剂进行评价，虽然体内外没有相关性，但是对于缓释给药系统制剂工艺相对于普通制剂更复杂，体外释放可以体现批间产品质量是否一致，也能直观的说明胶束给药系统是否真的具有缓释作用。

后续细胞实验以不含靶向肽RGD的纳米胶束作为实验材料，且靶向肽对药物释放以及细胞层面的实验结果影响不大。因此药物释放选用PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))作为样品。以pH＝7.2磷酸缓冲溶液作为释放介质，在37℃下，取PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))@BH3溶液10mL装入提前准备好的透析袋中(截留分子量5000D)，密封后放入到盛放介质的烧杯中，分别于0h、6h、12h、24h、48h、72h以上6个时间点进行取样，离心，利用HPLC检测6个样品在220nm波长下的吸收峰面积，以Bax-BH3肽标准曲线作为参比，计算得出Bax-BH3肽的释放量，根据每组数据的平均值绘制体外药物释放曲线，结果如图12所示。

单独的多肽不能进入细胞，需要借助纳米胶束进入细胞。且纳米胶束与多数大蛋白大小相仿(同为纳米级)，在体内更加不易作为异物受到排斥。且如图12所示，纳米胶束PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA))在一定程度上表现出缓释效果，有利于BH3肽更好的发挥作用。

实施例3

多肽Bax-BH3的抗肿瘤研究

通过MTT实验评价了PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)@BH3对人肺癌A549细胞增殖活性的影响。将对数生长期的肿瘤细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在DMEM中孵育24h，之后用PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)@BH3替换培养基，继续孵育24h，接着加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃孵育4h，然后除去含有MTT的培养基并向每个孔中加入150μL DMSO。最后，将孔板振摇10min，通过HBS-1096A酶标仪(南京，德铁)测量520nm处的吸光度值(OD520)，细胞存活率的计算根据下列公式进行。细胞存活率％＝(实验组OD520-空白对照组OD520)/(阴性对照组OD520-空白对照组OD520)×100％。采用相同的方法检测PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)纳米材料的生物相容性。

结果如图13、14所示，A549细胞与0～400μg/mL浓度范围内的PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)孵育24h后，细胞存活率均在90％以上，当PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)浓度达到400μg/mL时，细胞存活率超过80％，即使高达400μg/mL时，仍然有80％的A549细胞存活，而PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)@BH3则可产生严重的细胞毒性，细胞存活率明显降低，说明PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)纳米载体在0～400μg/mL浓度范围内具有良好的生物相容性，是一种相对安全的药物递送载体，PHPMA-b-Poly(MMA-alt-(Rhob-MA)@BH3对肿瘤细胞的杀伤作用主要来自于纳米载药体系中所负载的Bax-BH3肽。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种抗肿瘤多肽Bax-BH3、荧光高分子纳米胶束及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Arg Arg Ile Gly Asp

1 5 10 15

Glu Leu Asp Ser

20

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atggatgcgt ccaccaagaa gctgagcgag tgtctccggc gaattggaga tgaactggac 60

agc 63

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

ccgctcgaga tggatgcgtc caccaagaag 30

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ccggaattcg ctgtccagtt catctcc 27