突变型PSII D1或psbA D1蛋白、其编码核酸以及应用

文档序号：1499598 发布日期：2020-02-07 浏览：20次 >En<

阅读说明：本技术 突变型PSII D1或psbA D1蛋白、其编码核酸以及应用 (Mutant PSII D1 or psbA D1 protein, nucleic acid encoding same and application thereof ) 是由连磊李华荣莫苏东彭学岗于 2018-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于农业基因工程领域,具体涉及突变型PSII D1或psbA D1蛋白、其编码核酸以及应用。所述突变型PSII D1或psbA D1蛋白的氨基酸序列与野生型水稻PSII D1或psbA D1蛋白的氨基酸序列相比,在对应于SEQ ID.04所示的野生型水稻PSII D1或psbA D1蛋白氨基酸序列中的第219、249、251、255、256、264、266和275位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：219I、249A、251V、255Y、256A、264G、264A、264T、266T和275F。本发明通过上述突变位点来赋予水稻抗PSII抑制性除草剂的能力,以解决严重的杂草稻及其他作物受除草剂药害的问题。(The invention belongs to the field of agricultural genetic engineering, and particularly relates to a mutant PSII D1 or psbA D1 protein, and a coding nucleic acid and application thereof. The amino acid sequence of the mutant PSII D1 or psbA D1 protein has one or more mutations selected from the group consisting of at positions corresponding to one or more of positions 219, 249, 251, 255, 256, 264, 266, and 275 in the amino acid sequence of the wild-type rice PSII D1 or psbA D1 protein set forth in SEQ id No. 04, as compared to the amino acid sequence of the wild-type rice PSII D1 or psbA D1 protein: 219I, 249A, 251V, 255Y, 256A, 264G, 264A, 264T, 266T, and 275F. The invention endows the rice with the PSII inhibition herbicide resistance through the mutation sites so as to solve the problem that severe weedy rice and other crops are phytotoxicity to the herbicide.)

技术领域

本发明属于农业基因工程领域，具体涉及突变型PSII D1或psbA D1蛋白、其编码核酸以及应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，养活着世界上近一半的人口，尤其在亚洲稻米是亚洲人民绝对的生命粮。然而，水稻种植面临杂草稻严重的挑战。目前抗咪唑啉酮类(乙酰乳酸合成酶，ALS)和抗乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂的水稻品种虽然其能控制杂草稻，但是使用3-4年后，杂草稻会像水稻一样抗除草剂。水稻的除草剂抗性性状会随着水稻与杂草稻之间进行杂交，即抗性水稻的花粉带着这些除草剂抗性基因授粉于杂草稻，导致杂草稻也产生抗药性，抗性杂草稻进一步发展，问题变得越来越严重，目前抗性杂草稻已经在东南亚广泛分布。

发明内容

为了解决上述问题，本发明创造性的采用了诱变水稻种子，选育抗PSII抑制性除草剂的水稻品种。出人意料的是，选育的突变体水稻花粉给其他水稻和杂草稻授粉，产生的后代不能继承对除草剂的抗性性状。这将极大的改变现有的杂草稻防治技术，为中国和东南亚等广泛受杂草稻和抗性杂草的防治提供全新的革命性解决方案。

本发明一方面提供了一种突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段，其中所述突变型PSII D1或psbA D1蛋白的氨基酸序列与野生型水稻PSII D1或psbA D1蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID.04所示的野生型水稻PSII D1或psbA D1蛋白氨基酸序列中的第219、249、251、255、256、264、266和275位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：219I、249A、251V、255Y、256A、264G、264A、264T、266T 和275F。优选地，所述突变型PSII D1或psbA D1蛋白的氨基酸序列进一步与SEQ ID.04 所示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％和至少99％的序列同一性。更优选地，所述突变型PSIID1或psbA D1蛋白具有SEQ ID.04所示的氨基酸序列，区别在于具有权利要求1中所定义的一个或多个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白的氨基酸序列在对应于 SEQ ID.04所示的野生型水稻PSII D1或psbA D1蛋白氨基酸序列中的第219、249、251、255、256、264、266和275位中的一个或多个位置处具有选自下述中的一个或多个突变：V219I、V249A、A251V、F255Y、G256A、S264G、S264A、S264T、N266T和L275F。

在进一步的实施方案中，本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白的氨基酸序列在对应于SEQ ID.04所示的野生型水稻PSII D1或psbA D1蛋白氨基酸序列中的第219、251和264位置处具有选自下述中的一个或多个突变：V219I、A251V和S264G，优选地，所述突变型PSII D1或psbA D1蛋白的氨基酸序列具有如下氨基酸突变：S264G/A251V或 S264G/V219I。

在更进一步的实施方案中，本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白具有SEQID.06或 SEQ ID.08或SEQ ID.10或SEQ ID.12或SEQ ID.14或SEQ ID.16或SEQ ID.18或SEQID.20 或SEQ ID.22或SEQ ID.24或SEQ ID.26或SEQ ID.28所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种融合蛋白，其中包含所述的突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段，以及与之融合的其它组分。在一个优选的实施方案中，所述其它组分是质体引导肽，例如引导到叶绿体内的肽，其将突变的PSII D1或psbA D1蛋白靶向叶绿体。在另一个实施方案中，所述其它组分是标签肽，例如6×His。在又一个实施方案中，所述其它组分是有助于提高所述突变型PSII D1或psbA D1蛋白的溶解性的肽，例如NusA肽。

在另一方面，本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其中包含编码所述的PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或者所述的融合蛋白的的核酸序列或者其互补序列。术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。术语“分离的”多核苷酸是指该多核苷酸基本上不包含在天然存在环境中通常伴随着其的成分。

本领域技术人员十分清楚，由于遗传密码的简并性，有多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同蛋白质的其他核酸序列在本领域普通技术人员的能力范围内，因此本发明涵盖因遗传密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的核酸序列。例如，为了在目标宿主生物例如植物中实现异源基因的高表达，可以对所述基因采用宿主生物偏好的密码子进行优化，以使其更好地表达。

因此，所述的多核苷酸具有选自下述的核酸序列：(1)编码SEQ ID.06或SEQ ID.08或SEQ ID.10或SEQ ID.12或SEQ ID.14或SEQ ID.16或SEQ ID.18或SEQ ID.20或SEQ ID.22或SEQ ID.24或SEQ ID.26或SEQ ID.28所述任意一种氨基酸序列的核酸序列或者其互补序列；(2)SEQ ID.05或SEQ ID.07或SEQ ID.09或SEQ ID.11或SEQ ID.13或SEQ ID.15或 SEQID.17或SEQ ID.19或SEQ ID.21或SEQ ID.23或SEQ ID.25或SEQ ID.27所示任意一种核酸序列、其简并序列或者其互补序列；(3)在严谨条件下与(1)或(2)所示序列杂交的核酸序列；和(4)因遗传密码的简并性而与(1)或(2)所示序列编码相同氨基酸序列的核酸序列，或其互补序列。所述严谨条件可以指6M尿素、0.4％SDS、0.5×SSC的条件或与其同等的杂交条件，也可以指严谨性更高的条件，例如6M尿素、0.4％SDS、0.1×SSC或与其同等的杂交条件。在各种条件中，温度可约为40℃以上，如需要严谨性更高的条件时，温度例如可约为50℃，进一步可约为65℃。另外，所述核酸序列被优化用于在植物细胞中表达。

本发明还提供了一种表达盒(cassette)，其中包含所述的多核苷酸。优选地，所述表达盒在5’-3’的转录方向上包含启动子区、核酸和转录和翻译的终止区。更优选地，表达盒适合在植物中表达核酸。示例性的启动子包括来自CaMV35S启动子或者稻肌动蛋白I 基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米矮缩I基因或烟草花叶病毒(TMV)Ω元件的启动子；示例性的转录和翻译的终止区包括转录终止元件或多聚腺苷酸化信号等。表达盒还可以包括，在细菌中复制所需的复制起点(例如，来自pBR322或P15Aori的ORI区)，土壤杆菌 T-DNA转移所需要的元件(例如，T-DNA的左边界和/或右边界)，从而方便从细菌往植物中的转化过程。另外，表达盒还可以包含增强子、内含子、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结合位点等，例如来自TMV、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)或苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列等作为增强子，又如可以包括来自Adh1、bronze1、肌动蛋白1或肌动蛋白2的内含子。

本发明还提供了一种载体，其中包含所述的多核苷酸。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。载体可能是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，它的复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。或者，所述载体可能是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。此外，可使用单个载体或质粒或者一起包含待引入宿主细胞基因组之总DNA的两个或更多个载体或质粒，或者转座子。或者，所述载体也可以是对宿主细胞内源性的PSII D1或psbA D1基因进行基因编辑的载体。

载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，在本领域中众多描述。优选地，本发明中的表达载体是质粒。表达载体可包含启动子、翻译起始的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录终止子、增强子等。表达载体中也可以含有一个或多个可选择标记基因以便用于选择包含载体的宿主细胞。这种可选择的标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因，或赋予新霉素耐受性的基因，赋予对四环素或氨苄青霉素耐受性的基因等。

本发明的载体可以包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。对于整合进入宿主细胞基因组的方面，所述载体可依靠编码多肽的多核苷酸序列或适于通过同源或非同源重组整合入基因组的载体的任何其它元件。或者，载体可包含用于指导在染色体的准确位置通过同源重组整合入宿主细胞基因组的附加的核苷酸序列。为了提高在准确位置处整合的可能性，整合元件应优选包含足够数目的核酸，譬如100至10,000个碱基对，优选400至10,000个碱基对，更优选800至10,000 个碱基对，它们与相应的靶序列具有高度的同一性以提高同源重组的概率。整合元件可能是与宿主细胞基因组内靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可能是非编码的或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可能通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组内。对于自主复制而言，载体可能进一步包含能使载体在所述宿主细胞内自主复制的复制起点。复制起点可能是在细胞内发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语"复制起点" 或"质粒复制子"在此定义为能使质粒或载体在体内进行复制的核苷酸序列。

可将一拷贝以上的本发明之多核苷酸***宿主细胞中以提高基因产物的产量。可通过将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组中或者通过将可扩增的可选择标记基因与所述多核苷酸包含在一起来达到多核苷酸拷贝数目的增加，在后一情形下，包含扩增拷贝的选择标记基因以及由此而来的附加拷贝的多核苷酸的细胞可通过在适当的可选择制剂存在的条件下人工培养所述细胞进行选择。

本发明的核酸序列可通过多种方法***载体中，例如通过用适当的限制性核酸内切酶消化***物和载体后进行连接。多种克隆技术在本领域中是已知的，这些均在本领域技术人员的知识范围内。

本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pBR322(ATCC37017)，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pD10，psiX174pBluescript II KS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pKK232-8，pCM7，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL(Pharmacia)等。

本发明还提供了一种宿主细胞，其中包含有所述的PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段、所述的融合蛋白、所述的多核苷酸、所述的表达盒或所述的载体。

将包含编码本发明的载体引入宿主细胞中使得载体作为染色体整合体的一部分存在或如早先所述作为自我复制的染色体外载体存在，或者载体可以对宿主细胞内源性的PSII D1或psbA D1基因进行基因编辑。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核生物细胞和真核食物细胞，例如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞，其实例有大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、SpodopteraSf9、 CHO、COS等。适当宿主细胞的选择在本领域技术人员的能力范围内。优选地，所述的宿主细胞是植物细胞。

在本发明中，术语“宿主细胞”还涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞后代。

本发明的核酸序列、表达盒或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、DEAE- 葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等(参考Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，BasicMethods in Molecular Biology，1986)。

在一个具体实施方案中，本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白可以被靶向植物内的质体，例如叶绿体。这可以通过将编码本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白的核酸序列与编码质体引导肽例如叶绿体转运肽的核酸序列阅读框一致地连接来实现。或者，可以将本发明的多核苷酸、表达盒或表达载体直接转化植物细胞的叶绿体基因组来实现。本领域技术人员清楚可用于转化植物细胞叶绿体基因组的载体和方法。例如，可以通过将DNA包被的离子轰击目标植物的树叶，并通过同源重组或非同源重组而整合编码本发明突变型PSII D1或psbA D1蛋白的核酸序列。

在适当的情况下，转化的宿主细胞可以在常规的营养培养基中培养。在转化适合的宿主细胞并培养宿主细胞至适当的细胞密度后，可以用适当的方法例如温度改变或化学诱导等诱导所选择的启动子，并可另外培养细胞一段时间以使其产生本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或融合蛋白。

本发明还提供了一种获得抗或耐受任意一种PSII类除草剂的植物的方法，其中包括将所述的植物细胞再生成植物。优选地，通过转基因、基因编辑、杂交、回交、自交或无性繁殖方式进行。

另一方面，本发明还提供了通过所述方法生产的植物。

本发明还提供了一种提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物的PSII类除草剂抗性或耐受性的方法，其中包括在所述植物细胞、植物组织、植物部分或植物中表达所述的PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或者所述的融合蛋白；或者包括将表达所述的PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或者所述的融合蛋白的植物与另一植物杂交，以及筛选具有提高的PSII类除草剂抗性或耐受性的植物或其部分；或者包括对所述植物细胞、植物组织、植物部分或植物的PSII D1或psbA D1蛋白进行基因编辑，以实现在其中表达所述的PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或者所述的融合蛋白。

本发明还提供了所述的PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段、所述的融合蛋白、所述的多核苷酸、所述的表达盒或所述的载体用于提高植物细胞、植物组织、整株植物来抗或耐受任意一种PSII类除草剂的应用。

本发明还提供了一种控制植物栽培场所的杂草的方法，包括对所述栽培场所施用控制杂草有效量的一种或多种PSII类除草剂。在本发明中，术语“场所”包括栽培本发明植物的场地例如土壤，也包括例如植物种子、植物苗以及长成的植物。术语“控制杂草有效量”指的是除草剂的量足以影响目标杂草的生长或发育，例如阻止或抑制目标杂草的生长或发育，或者杀灭所述杂草。有利地，所述控制杂草有效量不会显著影响本发明植物种子、植物苗或植物的生长和/或发育。本领域技术人员可以通过常规实验确定这样的控制杂草有效量。

本发明还提供了一种鉴定植物的方法，其中包括以下步骤：a)测定所述植物是否包含所述的多核苷酸；或，b)测定所述植物是否表达所述的PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或所述的融合蛋白。

在本发明中，“PSII类除草剂”是本身有除草活性的物质或者与能改变其效果的其他除草剂和/或添加剂合用的物质，其能够通过光合系统Ⅱ(PSⅡ)以D1蛋白为作用靶标，抑制植物的光合作用而发挥作用。PSII类除草剂在本领域中是熟知的，包括许多类型，(1)酰胺类：甲氯酰草胺/蔬草灭(pentanochlor，2307-68-8)，敌稗(propanil，709-98-8)；(2)苯吡噻唑类：灭草松/噻草平(bentazone，25057-89-0)；(3)肟类/羟基苄腈类：溴酚肟/杀草全(bromofenoxim，13181-17-4)；溴苯腈(bromoxynil，1689-84-5)；碘苯腈(ioxynil，1689-83-4)； (4)氨基甲酸酯类：甜菜安/异苯敌草(desmedipham，13684-56-5)，甜菜宁/苯敌草(phenmedipham，13684-63-4)，乙苯敌草(phenmedipham-ethyl，13684-44-1)；(5)哒嗪酮类：杀草敏(Chloridazone/Pyrazon，1698-60-8)；(6)***啉酮类：胺唑草酮/氨唑草酮(amicarbazone，129909-90-6)；(7)尿嘧啶类：除草定(bromacil，314-40-9)，环草定(lenacil， 2164-08-1)，特草定(terbacil，5902-51-2)；(8)苯基哒嗪类：哒嗪醇(pyridafol，40020-01-7)，达草止/哒草特(pyridate，55512-33-9)，QYP02410(其结构式为：

)；(9) 三嗪酮类(包括三嗪二酮类)：六嗪同/环嗪酮(hexazinone，51235-04-2)，苯嗪草酮(metamitron， 41394-05-2)，赛克津/嗪草酮(metribuzin，21087-64-9)；(10)三嗪类(包括氯代三嗪类和甲硫基三嗪类)：莠去津(atrazine，1912-24-9)，莠灭净(ametryne，834-12-8)，草净津/氰草津 /氰草净(cyanazine，21725-46-2)，敌草净(desmetryne1，014-69-3)，戊草津/异戊二净 (dimethametryn，22936-75-0)，扑灭通(prometone，1610-18-0)，扑草净(prometryn，7287-19-6)，扑灭津(propazine，139-40-2)，西玛津(simazine，122-34-9)，西草净/西草津(simetryne， 1014-70-6)，甲氧去草净/特丁通(terbumeton，33693-04-8)，特丁津(terbuthylazine，5915-41-3)，去草净/特丁净(terbutryne，886-50-0)，草达津(trietazin，1912-26-1)；(11)脲类：氯溴隆(chlorobromuron，13360-45-7)，绿麦隆(chlortoluron，15545-48-9)，枯草隆(chloroxuron， 1982-47-4)，丁隆/恶唑隆(dimefuron，34205-21-5)，敌草隆(diuron，330-54-1)，磺赛隆 (ethidimuron，30043-49-3)，非草隆(fenuron，101-42-8)，伏草隆(fluometuron，2164-17-2)，异丙隆(isoproturon，34123-59-6)，异恶隆(isouron，55861-78-4)，利谷隆(linuron，330-55-2)，溴谷隆(metobromuron，3060-89-7)，噻唑隆/甲基苯塞隆(methabenzthiazuron，18691-97-9)，甲氧苯草隆/色满隆(metobenzuron，111578-32-6)，甲氧隆(metoxuron，19937-59-8)，绿谷隆(monolinuron，1746-81-2)，绿谷隆(neburon，555-37-3)，环草隆(siduron，1982-49-6)，丁唑隆/特丁噻草隆(tebuthiuron，34014-18-1)，噻苯隆/赛二唑素(thiadiazuron，51707-55-2)； (12)其他类：卡草灵(karbutilate，4849-32-5)。

在本发明中，“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，特别是单子叶或双子叶植物，例如：水稻、小麦、玉米、谷子或大麦等禾本科植物。

术语“野生型”指的是可以在自然界中被发现存在的核酸分子或蛋白质。在本发明中，野生型蛋白可以来源于任何植物，特别是前述单子叶或双子叶植物。现有技术文献中已经公开了一些来源的野生型蛋白序列以及编码序列，这些现有技术文献在此引入本文作为参考。优选地，本发明的野生型蛋白来源于稻属，特别是水稻。更优选地，所述野生型PSIID1或psbA D1蛋白具有SEQ ID.04所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID.04所示氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。所述突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段衍生自水稻PSII D1或psbA D1蛋白，并且具有选自上述的一个或多个氨基酸取代。

术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与野生型蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、***、缺失和/或添加。

在本发明中，术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

在本发明中，“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。

对于说明书中所用的有关氨基酸取代的术语，第一个字母代表特定序列某一位置上天然存在的氨基酸，后面的数字代表相对于SEQ ID.04的位置，第二个字母代表取代该天然氨基酸的不同氨基酸。譬如V219I表示相对于SEQ ID.04的氨基酸序列而言，第219 位的缬氨酸被异亮氨酸取代。对于第一个字母不存在的氨基酸取代，其指的是相对于其野生型蛋白的氨基酸序列而言，在对应于SEQ ID.04的所述位置处，天然氨基酸被数字后的字母代表的氨基酸所取代。对于双重或多重突变，各突变之间以“/”隔开。例如， S264G/A251V表示相对于SEQ ID.04的氨基酸序列而言，第264位的丝氨酸被甘氨酸取代，第251位的丙氨酸被缬氨酸取代，全部两个突变均存在于所述具体的突变型PSII D1 或psbA D1蛋白内。

本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID.04进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Rapid similarity searches ofnucleic acid and protein data banks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730中所述的方法进行计算。在ClustalW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝-1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。

优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10og缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID.04进行比对来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。

氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman,1981,Adv. Appl.Math.2:482，Pearson&Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444，Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Res 22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则 (Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA，GeneticsComputer Group)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则(Altschul et al.,1990,Mol.Biol.215:403-10)，使用默认参数确定。

本领域技术人员还清楚的是，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维构型产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。只要取代不损害蛋白质的生物活性，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。

因此，本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白除了包含上述突变之外，还可以在氨基酸序列中包含一个或多个其他突变例如保守性取代。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的突变型PSII D1或psbA D1蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。

如本领域中所熟知的，可以从蛋白质的N和/或C末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，在另一方面，本发明还涉及从突变型PSII D1或psbA D1蛋白的 N和/或C末端缺失了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的片段，它们也在本发明的范围内，被称为生物活性片段。在本发明中，“生物活性片段”是指本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白的一部分，其保留了本发明的突变型PSII D1或psbA D1 蛋白的生物学活性、同时提高了对PSII类除草剂的耐受性或抗性。例如，突变型PSII D1 或psbA D1蛋白的生物学活性片段可以是在所述蛋白质的N和/或C末端缺失了一个或多个(例如1－50个、1－25个、1－10个或1－5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。

本发明还涉及产生本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或融合蛋白的方法，包括：(a)在有助于所述突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或融合蛋白生产的条件下培养上述宿主细胞；和(b)回收所述突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或融合蛋白。

在本发明的生产方法中，用本领域众所周知的方法将所述细胞培养于适于所述多肽产生的营养培养基上。例如，在实验室或工业发酵罐中以合适的培养基并且在允许所述多肽表达和/或分离的条件下通过摇瓶培养和小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、分批投料或固态发酵)培养细胞。用本领域已知的步骤在包含碳和氮源以及无机盐的合适营养培养基上进行培养。合适的培养基可购自供应商或依照已发表的组成配制(例如，在美国典型培养物保藏(American Type Culture Collection)的目录上)。若所述多肽被分泌入营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。若所述多肽不分泌到培养基中，则可从细胞裂解物中回收它。

可用本领域已知特异于所述多肽的方法检测该多肽。这些检测方法可包括使用特异抗体、形成酶产物或酶底物的消失。

产生的多肽可用本领域已知的方法回收。例如，可以通过离心收获细胞，用物理的或化学的方法使之破碎，并保留得到的粗提取液以进一步纯化。可以用任何方便的方法裂解表达本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或融合蛋白的转化宿主细胞，包括冻融循环、超声波、机械破碎或使用细胞溶解剂。这些方法是本领域技术人员熟知的。可以从转化宿主细胞的培养物中回收和纯化本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段，采用的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲合层析、羟磷灰石层析和植物血凝素层析等等。

在一个具体实施方案中，本发明制备对PSII类除草剂具有耐受性或抗性的宿主生物特别是植物细胞、植物组织、植物部分或植物的方法，包括用包含本发明的突变型PSIID1 或psbA D1蛋白或其生物活性片段的编码核酸序列、包含所述核酸序列的表达盒或表达载体对所述宿主生物进行转化。宿主细胞例如植物细胞的转化方法是现有技术中已知的，包括例如原生质体转化、融合、注射、电穿孔、PEG介导的转化、离子轰击、病毒转化、农杆菌介导的转化、电穿孔或轰击等。现有技术中描述了一系列这样的转化方法，例如 EP1186666中描述了大豆转化的技术，WO92/09696中描述了单子叶植物特别是水稻转化的合适技术等。还可以有利地用根癌农杆菌或发根农杆菌培养植物外植体，以将DNA转移进植物细胞。然后可以在合适的培养基中从感染的植物材料部分(如叶碎片、茎节段、根以及原生质体或悬浮培养的细胞)再生完整植物，所述培养基可以含有用于选择的抗生素或杀虫剂。转化细胞以通常的方式在植物中生长，它们可以形成生殖细胞并将转化的性状传递到子代植物。这样的植物能以正常方式培养并与具有相同转化遗传因子或其他遗传因子的植物杂交。得到的杂合个体具有相应的表型特性。

在另一个具体实施方案中，本发明制备对PSII类除草剂具有耐受性或抗性的宿主生物特别是植物细胞、植物组织、植物部分或植物的方法，包括将本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段的编码核酸整合到宿主生物的基因组中并使之表达。合适的载体和选择标记是本领域技术人员所熟知的，例如WO06/108830中描述了一种整合入烟草基因组中的方法，其公开内容通过引用并入本文中作为参考。目的基因在植物细胞中优选由组成型或诱导型启动子表达。mRNA一旦表达之后，就被翻译成蛋白质，从而将目的氨基酸掺入蛋白质中。在植物细胞中表达的编码蛋白质的基因可以在组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子的控制下。例如可以使用细菌来源的启动子，如章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子；病毒来源的启动子，如花椰菜花叶病毒(35S和19S)、35T(再改造的35S启动子，参阅美国专利No.6,166,302，特别是实施例7E)等。也可以使用植物启动子调节元件，包括但不仅限于核酮醣-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)启动子、β-菜豆素启动子、 ADH启动子、热休克启动子和组织特异性启动子。还可以使用组成型启动子调节元件从而指导在所有细胞类型和所有时间的持续基因表达(如肌动蛋白、泛素、CaMV35S等)。组织特异性启动子调节元件在本发明中也是适用的，其负责在特定细胞或组织类型(如叶或种子)中的基因表达(如玉米醇溶蛋白、油质蛋白、napin、ACP、球蛋白等)。同样的，还可以使用在植物发育的某些阶段有活性(或无活性)的启动子调节元件。这些启动子调节元件的实例包括但不仅限于花粉特异性、胚胎特异性、玉米穗丝特异性、棉花纤维特异性、根特异性、种子胚乳特异性或无性繁殖期特异性启动子调节元件等。在某些情况下可能需要使用诱导型启动子调节元件，其负责应答于特定信号(如物理刺激(热休克基因)、光(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代谢物、化学品(四环素应答)和胁迫)的基因表达。可以使用在植物中发挥功能的其他所需的转录和翻译元件。

在一个具体实施方案中，本发明所述提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物的PSII类除草剂耐受性或抗性的方法，包括用包含本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白的编码核酸序列的核酸分子转化所述植物或其部分，并使之表达。所述核酸分子可以作为染色体外实体存在而进行表达，或者可以整合到植物细胞的基因组中实现表达，特别是通过同源重组整合到植物细胞的内源基因位置处实现表达。这些实施方式均在本发明的范围之内。

在另一个具体实施方案中，本发明所述提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物的PSII类除草剂耐受性或抗性的方法，包括将表达本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白的植物与另一植物杂交，以及筛选具有提高的PSII类除草剂抗性或耐受性的植物或其部分。

在另一个具体实施方案中，本发明所述提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物中的PSII类除草剂耐受性或抗性的方法，包括对所述植物细胞、植物组织、植物部分或植物的内源性PSII D1或psbA D1蛋白进行基因编辑，以实现在其中表达本发明的突变型 PSIID1或psbA D1蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白。

在一个具体实施方案中，本发明通过传统育种技术制备除草剂耐受性或抗性提高的植物的方法，其中包括用在基因组中整合了本发明的突变型PSII D1或psbA D1蛋白或其生物活性片段的编码核酸序列的植物自交或者杂交，并筛选杂合或纯合地包含了所述编码核酸序列的后代。

本发明进一步通过上述方法获得的植物细胞、植物组织、植物部分和植物，及其后代。优选地，可以将转化了本发明多核苷酸的植物细胞、植物组织或植物部分再生为整个植株。本发明包括细胞培养物，包括组织细胞培养物、液体培养物和固体平板培养物。由本发明植物所产生和/或用于再生本发明植物的种子也包括在本发明范围内。其他植物组织和部分也包括在本发明中。本发明同样包括产生含有本发明核酸分子的植物或细胞的方法。产生这类植物的一种优选方法为通过种植本发明的种子。以这种方式转化的植物可以获得对多种具有不同作用模式的除草剂的抗性。

例如，对于用农杆菌转化植物细胞，可以将外植体与转化的农杆菌混合并孵育足够的时间以允许其转化。转化后，通过用适当抗生素的选择杀死农杆菌，并用适当的选择培养基培养植物细胞。一但形成愈伤组织，可以根据植物组织培养和植物再生领域熟知的方法通过使用适当的植物激素促进芽形成。然而，愈伤组织中间期并不总是必要的。芽形成以后，可以将所述植物细胞转移到促进根形成的培养基，从而完成植物再生。然后可以培养植物产生种子，所述种子可以用于建立将来的世代。不论转化技术如何，优选将编码细菌蛋白质的基因整合进基因转移载体中，通过在载体中纳入植物启动子调节元件以及3’非翻译转录终止区(如Nos等)使所述转移载体适于在植物细胞中表达该基因。

除非具体说明或暗示，如本文中所用，术语“一”、“一个/一种”和“所述”表示“至少一个”。本文提到或引用的所有专利、专利申请和出版物整体引入本文作为参考，其引用程度如同单独地个别引用一样。

本发明通过上述突变位点来赋予水稻抗PSII抑制性除草剂的能力，以解决严重的杂草稻及其他作物受除草剂药害的问题。

具体实施方式

下述实施例中所用的方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。

实施例1

本发明通过种植诱变后的稻种得到大量的种子，再播种得到大量的第二代稻苗，喷施PSII 类除草剂，测序分析存活苗，具体步骤如下：

从市场上购买100公斤淮稻5号和100公斤黄华占种子，在28℃人工气候室里用水浸泡 22小时后，捞出晾干浮水，再用0.7％甲磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate，EMS)浸泡12 小时。在这期间每小时搅动一次，以让甲磺酸乙酯能充分均匀地被种子吸收。另外各取部分种子，再次用水浸泡12小时，不加甲磺酸乙酯处理当对照。12小时后，捞起种子，弃掉甲磺酸乙酯水液，用大量的自来水反复冲洗2小时。捞出铺在湿草纸上在28℃人工气候室发芽。发芽后撒播到已平整好的稻田中。两个星期后检查白苗率，淮稻5号和黄华占经甲磺酸乙酯处理的白苗率是3.7％和4.2％，而对照的白苗率为零。按常规管理，让稻苗生长到开花、结子和成熟。按品种分收稻谷。晾干致含水量低于8％时，又将这大量的种子按品种分开播种，避免混杂。每平米播大约1.8万粒种子。采用以下每种除草剂在这两个品种上各喷三分之一的面积，共6个处理，另加两个来自未经诱变处理的对照(各两亩)。待秧苗长到3-4叶期时，分别用莠去津、敌草隆和本公司生产的除草剂QYP02410喷施以杀死秧苗，喷施剂量分别是 1500克/公顷、900克/公顷和1000克/公顷同时添加1500克植物油助剂。三个星期后调查秧苗的死苗情况，发现经甲磺酸乙酯诱变过的秧苗并没有完全死亡，还有少数的秧苗还是活的，而对照田块的活苗数就很少，基本全死。将代表性的健壮的存活稻苗分别记录为抗莠去津、敌草隆和QYP02410的突变株，并小心地把它们转移集中到温室里，培育得到种子。同时剪取部分叶片提取DNA做分析。重复上述试验若干次，以测完所有的种子。

按常规方法从每个样品提取水稻基因组DNA。对采自每一株的DNA样品进行了PCR扩增，扩增出PSII D1编码DNA大约1kb。所用的一对引物序列都是一样的：psbAF(SEQID.01) 和psbAR(SEQ ID.02)。所用的DNA聚合酶是Q5DNA聚合酶(NEB,New EnglandBiolabs, Boston,USA)。扩增条件为：98℃2分钟；然后98℃20秒，55℃30s秒和72℃60秒，重复35次；最后72℃2分钟。扩增片段在琼脂糖凝胶电泳中显示为～1Kb，回收后通过紫外吸收法确定其DNA浓度。

将这些PCR扩增的DNA用sanger法测序。测序结果发现这些DNA的确是水稻的PSIID1编码序列而且与野生型不同。简而言之，我们发现了在多个位点上有氨基酸变化。PSIID1蛋白在位点219、249、251、255、256、264、266、275有氨基酸突变置换。这些突变置换是V219I、V249A、A251V、F255Y、G256A、S264G、S264A、S264T、N266T和L275F。除了单位点突变外，还有双位点突变，比如S264G+A251V和S264G+V219I。很显然，这些氨基酸置换使水稻得到了对这些除草剂的抗性。

本发明进一步做了转基因水稻来表达这些突变型psbA基因。采用标准转基因方法将野生型和各突变型水稻OspsbA转入水稻进行表达。所用载体是pcambia1301，启动子是ZmUbiI，终止子是CaMV35SpolyA。用农杆菌侵染水稻愈伤组织，将重组载体转化至水稻基因组，侵染完成的愈伤组织在含有潮霉素hygromycin的筛选培养基上筛选3轮，之后分化成幼苗；对幼苗喷除草剂以鉴定其抗/耐药性，从成活的稻苗剪取部分叶片，用PCR 鉴定目的基因DNA，再用western blot鉴定PSII D1的表达。这些转基因稻苗表达突变型 PSII D1表现出对莠去津、敌草隆或QYP02419等PSII抑制性除草剂的抗性。同时，我们正在采用基因编辑方法，进一步发展基因编辑的抗PSII除草剂的非转基因水稻。

实施例2

本发明对抗性的水稻苗培育结种，并进行和野生型的相互杂交，发现以突变型做母本，野生型花粉给突变型母本授粉，所得的新种子全部继承了对PSII抑制剂的抗药性；反过来以野生型做母本，以突变植株花粉给野生型授粉，所得植株全部被杀死。具体方法如下：

根据稻苗测序结果，直接采用当代的存活植株与野生型植株进行了两组杂交实验。一组是含自于莠去津筛选的S264G突变的淮稻5号与野生型的淮稻5号，另一组是含自于敌草隆筛选的V219I突变的黄华占与野生型的黄华占。从突变型和野生型稻株中各选了50株健康的、生长期相近的水稻标记好作为试材。到开花期，将那50株又分成两组，各25株，分别做为父本和母本。对做母本的突变型稻株人工去雄，将野生型父本的花粉授到去雄的突变型母本的柱头上，进行人工杂交。同样地，对做母本的野生型稻株人工去雄，将突变型父本的花粉授到去雄的野生型母本的柱头上，进行人工杂交。套袋隔离，待种子成熟后，分株收获，晾干保存。

然后将这些杂交种子播种到花盆里培育出苗并进行抗药性测定。每处理10盆，每盆 10苗，共100苗。在3-4叶期时，分别用莠去津1500克/公顷+1500克植物油助剂、敌草隆900克+1500克植物油助剂、QYP02410 1000克+1500植物油助剂喷施。三周后记录实验结果，结果显示，野生型水稻与突变型水稻的杂种一代抗性只与母本有关，即抗性的母本的后代都是抗性的，非抗性的母本的后代都是非抗性的。抗性的父本与非抗性的母本的后代不具备抗药性。

同时，人工将抗性性状的水稻花粉给杂草稻授粉，所得种子播种到花盆里培育出苗并进行抗药性测定。每处理10盆，每盆10苗，共100苗。在3-4叶期时，分别喷施药剂。三周后记录实验结果，如表1和表2所示(其中数据为剩余植株数量)：

表1本发明所述突变型水稻后代的抗性情况

表2抗咪唑啉酮类的水稻后代的抗性情况

由此可见，本发明育成的突变品种不会随着花粉与杂草稻的杂交导致杂草稻获得抗性性状，而抗咪唑啉酮类的水稻(如巴斯夫的种子系统)花粉给杂草稻授粉的种子后代全部拥有抗咪唑啉酮类除草剂的能力。这将是水稻田防除杂草稻的革命性技术，将极大的提升亚太地区直播稻的收益。

另外，还在青岛黄岛区做了温室大棚种植测试。于500平米的水稻田内种植抗性生物型和普通水稻，田间播种杂草稻(江苏、浙江、江西、湖南采集的几种)、稗草、千金子、马唐、鸭舌草、水竹叶等，苗后水稻3-4叶每亩用量喷施25％莠去津可分散油悬浮剂200克+6％***磺草酮可分散油悬浮剂200克(本公司生产)，用单剂6％***磺草酮OD200克做对照。实验后25天统计结果。

结果显示：25％莠去津可分散油悬浮剂200克+6％***磺草酮可分散油悬浮剂200克处理田块杂草稻、普通水稻、稗草、千金子、马唐，鸭舌草、水竹叶有99％的防效。对照对杂草稻、普通水稻无效，对马唐、水竹叶防效也较差。

序列表

<110> 青岛清原化合物有限公司

<120> 突变型PSII D1或psbA D1蛋白、其编码核酸以及应用

<130> 2018.7.9

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactgcaa ttttagagag acgcgaaag 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttatccatta agagatggaa cttcaagag 29

<210> 3

<211> 1062

<212> DNA

<213> 野生型水稻psbA基因开放阅读框序列(OspsbA WT)

<400> 3

atgactgcaa ttttagagag acgcgaaagt acaagcctgt ggggtcgctt ctgcaactgg 60

ataactagca ccgaaaaccg tctttacatc ggatggttcg gtgttttgat gatccctacc 120

ttattgaccg caacttctgt atttattatc gccttcatcg ctgcccctcc agtagatatt 180

gatggtattc gtgagcctgt ttctggttct ttactttacg gaaacaatat tatctctggt 240

gccattattc ctacttctgc ggcgatcgga ttgcactttt acccaatttg ggaagctgca 300

tctgttgatg agtggttata caatggtggt ccttatgagc taattgttct acacttctta 360

cttggtgtag cttgttatat gggtcgtgag tgggaactga gtttccgtct gggtatgcgt 420

ccttggattg ctgttgcata ttcagctcct gttgcagctg ctactgctgt tttcttgatt 480

taccctattg gtcaaggaag tttctctgat ggtatgcctt taggaatatc tggtactttc 540

aactttatga ttgtattcca ggcagagcat aacatcctta tgcatccatt tcacatgtta 600

ggtgtagctg gtgtattcgg cggttcccta ttcagtgcta tgcatggttc cttggtaacc 660

tctagtttga tcagggaaac cactgaaaac gaatctgcta atgagggtta cagatttggt 720

caagaggaag aaacttataa tattgtggcc gctcatggtt attttggccg attaatcttc 780

caatatgcta gttttaacaa ctctcgttct ttacacttct tcttggctgc ttggcctgta 840

gtagggattt ggttcactgc tttaggtatt agtactatgg ctttcaatct aaacggattc 900

aatttcaacc aatctgtagt tgatagccaa ggtcgcgtta ttaatacttg ggctgatatc 960

atcaaccgtg ctaatcttgg tatggaagta atgcacgaac gtaatgctca caacttccct 1020

ctagacctag ctgctcttga agttccatct cttaatggat aa 1062

<210> 4

<211> 353

<212> PRT

<213> 野生型水稻psbA蛋白氨基酸序列(OspsbA WT)

<400> 4

Met Thr Ala Ile Leu Glu Arg Arg Glu Ser Thr Ser Leu Trp Gly Arg

1 5 10 15

Phe Cys Asn Trp Ile Thr Ser Thr Glu Asn Arg Leu Tyr Ile Gly Trp

20 25 30

Phe Gly Val Leu Met Ile Pro Thr Leu Leu Thr Ala Thr Ser Val Phe

35 40 45

Ile Ile Ala Phe Ile Ala Ala Pro Pro Val Asp Ile Asp Gly Ile Arg

50 55 60

Glu Pro Val Ser Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Asn Asn Ile Ile Ser Gly

65 70 75 80

Ala Ile Ile Pro Thr Ser Ala Ala Ile Gly Leu His Phe Tyr Pro Ile

85 90 95

Trp Glu Ala Ala Ser Val Asp Glu Trp Leu Tyr Asn Gly Gly Pro Tyr

100 105 110

Glu Leu Ile Val Leu His Phe Leu Leu Gly Val Ala Cys Tyr Met Gly

115 120 125

Arg Glu Trp Glu Leu Ser Phe Arg Leu Gly Met Arg Pro Trp Ile Ala

130 135 140

Val Ala Tyr Ser Ala Pro Val Ala Ala Ala Thr Ala Val Phe Leu Ile

145 150 155 160

Tyr Pro Ile Gly Gln Gly Ser Phe Ser Asp Gly Met Pro Leu Gly Ile

165 170 175

Ser Gly Thr Phe Asn Phe Met Ile Val Phe Gln Ala Glu His Asn Ile

180 185 190

Leu Met His Pro Phe His Met Leu Gly Val Ala Gly Val Phe Gly Gly

195 200 205

Ser Leu Phe Ser Ala Met His Gly Ser Leu Val Thr Ser Ser Leu Ile

210 215 220

Arg Glu Thr Thr Glu Asn Glu Ser Ala Asn Glu Gly Tyr Arg Phe Gly

225 230 235 240

Gln Glu Glu Glu Thr Tyr Asn Ile Val Ala Ala His Gly Tyr Phe Gly

245 250 255

Arg Leu Ile Phe Gln Tyr Ala Ser Phe Asn Asn Ser Arg Ser Leu His

260 265 270

Phe Phe Leu Ala Ala Trp Pro Val Val Gly Ile Trp Phe Thr Ala Leu

275 280 285

Gly Ile Ser Thr Met Ala Phe Asn Leu Asn Gly Phe Asn Phe Asn Gln

290 295 300

Ser Val Val Asp Ser Gln Gly Arg Val Ile Asn Thr Trp Ala Asp Ile

305 310 315 320

Ile Asn Arg Ala Asn Leu Gly Met Glu Val Met His Glu Arg Asn Ala

325 330 335

His Asn Phe Pro Leu Asp Leu Ala Ala Leu Glu Val Pro Ser Leu Asn

340 345 350

Gly

<210> 5

<211> 1062

<212> DNA

<213> 水稻psbA突变体开放阅读框序列(OspsbA V219I)

<400> 5