阅读说明：本技术 一种中药制剂的检测方法 (Detection method of traditional Chinese medicine preparation ) 是由 徐向平 夏新华 黄胜 朱丽 谢安 欧金秀 叶惠煊 于 2018-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种中药制剂的检测方法,所述制剂由制何首乌、金樱子肉、桑椹桑椹、女贞子、豨莶草、川牛膝和菟丝子等七种药味组成,具有补肝肾、益精髓的功效,所述检测方法包括以下步骤：对制剂中的制何首乌、桑椹桑椹、川牛膝和女贞子进行鉴别；测定制剂中制何首乌中二苯乙烯苷的含量。(The invention relates to a detection method of a traditional Chinese medicine preparation, the preparation consists of seven medicinal herbs of prepared fleece-flower root, cherokee rose fruit, mulberry, glossy privet fruit, siegesbeckia orientalis, medicinal cyathula root, dodder seed and the like, and has the effects of nourishing liver and kidney and benefiting essence, and the detection method comprises the following steps: identifying radix Polygoni Multiflori Preparata, Mori fructus, radix Cyathulae and fructus Ligustri Lucidi in the preparation; measuring the content of stilbene glucoside in radix Polygoni Multiflori Preparata.)

一种中药制剂的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药制剂的检测方法，属于中药技术领域。

背景技术

益龄精收载于《中华人民共和国***药品标准中药成方制剂第六册》，为九芝堂股份有限公司独家生产品种。该制剂由制何首乌、金樱子肉、桑椹、女贞子(酒蒸)、豨莶草(蜜酒蒸)、川牛膝(酒蒸)和菟丝子(酒蒸)等七种药味组成，具有补肝肾、益精髓的功效，临床上用于肝肾亏虚所致的头昏，目眩，耳鸣，心悸，乏力，咽干，失眠等症。

现行质量标准中，只收载了制何首乌和桑椹的薄层鉴别方法，且无含量测定项。其中制何首乌鉴别项中展开体系含毒性较大的苯，对检验人员的健康影响较大；桑椹鉴别项中桑椹对照药材前处理时的加水量未明确，在实际检验工作中，不同检验人员的理解不同，容易造成结果重复性差；方中君药制何首乌具有补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨，化浊降脂的作用，而二苯乙烯苷为其主要活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、调节血脂、神经保护等作用，以其作为指标性成分进行含量测定，能够较为客观的评价益龄精的质量。

本发明的目的是提供一种中药制剂益龄精的检测方法，利用该检测方法，可简便有效地定性定量检测中药制剂有效成分，确保对药品质量有效控制，

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种中药制剂益龄精的检测方法，所述制剂益龄精由制何首乌、金樱子肉、桑椹桑椹、女贞子、豨莶草、川牛膝和菟丝子等七味中药制成，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

(1)用TLC法对制剂中的制何首乌、桑椹、川牛膝和女贞子进行鉴别；

(2)用HPLC法测定制剂中制何首乌中二苯乙烯苷的含量。

所述制剂中的制何首乌的鉴别包括以下步骤：取该制剂40ml，置分液漏斗中，加二氯甲烷振摇提取3次，第一次加二氯甲烷40ml，第二次加二氯甲烷30ml，第三次加二氯甲烷30ml，分取合并二氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取缺制首乌的阴性样品40ml，同法制成阴性对照溶液；再取何首乌对照药材0.2g，加二氯甲烷20ml，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为9:1:0.1的甲苯-醋酸乙酯-甲酸混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

所述制剂中的川牛膝的鉴别包括以下步骤：取该制剂40ml，置分液漏斗中，加二氯甲烷振摇提取3次，第一次加二氯甲烷40ml，第二次加二氯甲烷30ml，第三次加二氯甲烷30ml，分取合并二氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；取缺川牛膝的阴性样品溶液40ml，同法制成阴性对照溶液；另取川牛膝对照药材1g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液浓缩至约20ml，置分液漏斗中，加二氯甲烷30ml振摇提取，分取二氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液，照中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取上述对照药材溶液20μl，供试品溶液和缺川牛膝阴性对照溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为1:1的沸程为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯混合溶液为展开剂，饱和30min，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

所述制剂中的桑椹的鉴别包括以下步骤：取该制剂40ml，置分液漏斗中，加二氯甲烷振摇提取3次，第一次加二氯甲烷40ml，第二次加二氯甲烷30ml，第三次加二氯甲烷30ml，分取合并二氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；取缺桑椹的阴性样品溶液40ml，同法制成阴性对照溶液；取桑椹对照药材2g，加水60ml煎煮30分钟，滤过，滤液浓缩至约20ml，置分液漏斗中，加二氯甲烷30ml振摇提取，分取二氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液与缺桑椹阴性对照溶液各10μl，对照药材溶液20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5:4:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

所述制剂中的女贞子的鉴别包括以下步骤：取该制剂20ml，用***振摇提取2次，每次20ml，合并***液，低温挥干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取缺女贞子的阴性样品溶液20ml，同法制成阴性对照溶液；再取女贞子对照药材0.5g，加50％乙醇20ml，超声30min，滤过，滤液照供试品溶液制备方法处理，制成对照药材溶液；照中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取上述对照药材溶液，供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为20:11的环已烷-丙酮混合溶液为展开剂，饱和30min，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇液，热风吹至斑点显色清晰，结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

所述制剂中的制何首乌中二苯乙烯苷的含量测定，照中国药典2015年版四部通则0512高效液相色谱法试验，步骤如下：

(1)色谱条件：色谱柱为PhenomenexC18柱(250mm×4.6mm,5μm)；检测波长为310-330nm；流动相A为乙腈，流动相B为水，分析时间30分钟，等度洗脱，流动相A:流动相B的体积比为20:80；流速0.8-1.2mL·min^-1；柱温为25-40℃；进样量10μl；理论塔板数不低于2000；

(2)对照品溶液的制备：精密称取二苯乙烯苷(2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)对照品13mg，置50ml容量瓶中，加稀乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到对照品溶液母液。精密量取对照品溶液母液1mL置10ml容量瓶中，加稀乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.0260mg/mL的对照品溶液；

(3)供试品、阴性对照溶液的制备：精密量取制剂样品3.0ml，置于100ml量瓶中，加稀乙醇适量，振摇使溶解，再加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，静置，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。取缺制何首乌的阴性样品，同供试品溶液方法制成缺制何首乌的阴性对照溶液。

进一步地，所述制剂中的制何首乌中二苯乙烯苷的含量测定，照中国药典2015年版四部通则0512高效液相色谱法试验，所述步骤(1)中色谱条件优选为：色谱柱为PhenomenexC18柱(250mm×4.6mm,5μm)；检测波长为320nm；流动相A为乙腈，流动相B为水，分析时间30分钟，等度洗脱，流动相A:流动相B的体积比为20:80，流速1.0mL·min^-1；柱温为30℃；进样量10μl；理论塔板数不低于2000。

为了更好地理解本发明，以下通过试验例进一步阐述本发明的有益效果，旨在说明本发明的作用，而非限制本发明。

发明人对本发明中药制剂益龄精中二苯乙烯苷的含量测定方法进行了深入研究，详述如下：

1.1仪器和材料

shimadzu高效液相色谱仪(日本岛津公司)；PhenomenexC18柱(4.6×250mm,5μm)；SK3300H超声清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)；DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。

益龄精3批，九芝堂股份有限公司生产的中试产品，批号分别为20090821、20090901、20090903。何首乌对照药材(批号：120934-201009)、川牛膝对照药材(批号：121065-200503)、桑椹对照药材(批号：121158-201103)、女贞子对照药材(批号：121041-200604)、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(批号：110844-200607，供含量测定用)，均购自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯试剂，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1色谱条件：色谱柱为PhenomenexC18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈-水(20:80)；等度洗脱，分析时间30分钟；检测波长为320nm；流速1.0mL·min^-1；柱温为30℃；进样量10μl；理论塔板数不低于2000；

1.2.2对照品溶液的制备：精密称取二苯乙烯苷(2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)对照品13mg，置50ml容量瓶中，加稀乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到对照品溶液母液。精密量取对照品溶液母液1mL置10ml容量瓶中，加稀乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.0260mg/mL的对照品溶液；

1.2.3供试品、阴性对照溶液的制备：精密量取样品3.0ml，置于100ml量瓶中，加稀乙醇适量，振摇使溶解，再加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，静置，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。取缺制何首乌的阴性样品，同供试品溶液方法制成缺制何首乌的阴性对照溶液。

1.3专属性试验

照1.2.1项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪。结果供试品色谱中，在与阴性对照色谱相应的位置上无相同的色谱峰，说明阴性对照样品无干扰，表明该方法专属性良好，结果见附图1-3。

1.4线性关系考察：精密吸取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液1、2、4、8、12、16μl，注入高效液相色谱仪中，测定其峰面积积分值，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为Y＝1498.7X+4077.2，r＝0.9999。结果表明，二苯乙烯苷在26.0～416.0ng范围内具有良好的线形关系，见图4。

1.5精密度试验：精密吸取同一供试品溶液(批号20090821)10μl，连续进样6次，测定其峰面积积分值，结果RSD值为1.82％，表明仪器精密度良好。

1.6稳定性试验：分别精密吸取同一供试品溶液10μl，于0、2、4、8、12、24h进样，测定其峰面积积分值，结果RSD值为0.93％，表明供试品溶液在24小时内基本稳定。

1.7重复性试验：精密量取同一批号样品(批号20090821)3.0ml，共6份，照1.2.3项下供试品溶液制备方法，按1.2.1项下色谱条件，进样测定，结果二苯乙烯苷含量平均值为0.67mg/ml，RSD值为1.99％，表明该方法重复性良好。

1.8回收率试验：精密量取已知含量的样品(二苯乙烯苷含量为0.67mg/ml)1.5ml，共6份，置50ml量瓶中，分别精密加入二苯乙烯苷对照品溶(0.26mg/ml)3.9ml(即1.014mg)，然后按上述方法制备供试品溶液，并测定含量，计算回收率，测得二苯乙烯苷的平均回收率为100.13％，RSD值为1.93％，结果见表1。

表1回收率试验结果

1.9样品的测定：按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，测定三批样品中二苯乙烯苷的含量，结果见表2。

表2三批样品含量测定结果

本发明的有益效果：(1)对制何首乌、川牛膝、桑椹及女贞子进行了薄层色谱鉴别，且对制何首乌、川牛膝、桑椹的薄层鉴别的供试品溶液可通过同一个处理方法制备，即一个供试品溶液用于三种药材的薄层鉴别，简化了操作步骤、操作时间和溶剂使用量；

(2)本发明所述检测方法，是一种检测项目更全面，质量控制指标更科学、合理，操作更简化的能进一步确保药品安全和疗效的质量控制方法。本发明的定性定量检测方法，既可以用于益龄精的定性定量检测，又可以用来对相同处方的其他剂型如胶囊、颗粒等剂型的定性定量检测。

附图说明

图1二苯乙烯苷对照品HPLC色谱图

图2为益龄精供试品溶液HPLC色谱图

图3为缺制何首乌阴性样品溶液HPLC色谱图

图4为二苯乙烯苷标准曲线图

图5制何首乌薄层鉴别图1-对照药材溶液、2-供试品溶液(20090821)、3-供试品(20090901)、4-供试品溶液(20090903)、5-阴性对照溶液

图6川牛膝薄层鉴别图1-对照药材溶液、2-供试品溶液(20090821)、3-供试品溶液(20090901)、4-供试品溶液(20090903)、5-阴性对照溶液

图7桑椹薄层鉴别图1-供试品溶液(20090821)、5-供试品溶液(20090901)、3-供试品溶液(20090903)、4-对照药材溶液、5-阴性对照溶液

图8女贞子薄层鉴别图1-对照药材溶液、2-供试品溶液(20090821)、3-供试品溶液(20090901)、4-供试品溶液(20090903)、5-阴性对照溶液

实施方式

实施例1

益龄精批号：20090821

1薄层鉴别

1.1制何首乌的TLC法鉴别：取益龄精40ml，置分液漏斗中，加二氯甲烷振摇提取3次，起一次加二氯甲烷40ml，分取二氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取缺制首乌的阴性样品40ml，同法制成阴性对照溶液；再取何首乌对照药材0.2g,，加二氯甲烷20ml，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为9:1:0.1的甲苯-醋酸乙酯-甲酸混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见附图5。

1.2川牛膝的TLC法鉴别：取2.1项下供试品溶液作为供试品溶液；取缺川牛膝的阴性样品溶液40ml，同法制成阴性对照溶液；另取川牛膝对照药材1g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液浓缩至约20ml，置分液漏斗中，加二氯甲烷30ml振摇提取，分取二氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取上述对照药材溶液20μl，供试品溶液和缺川牛膝阴性对照溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为1:1的沸程为60～90℃的石油醚-醋酸乙酯混合溶液为展开剂，饱和30min，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见附图6。

1.3桑椹的TLC法鉴别：取2.1项下供试品溶液作为供试品溶液；取缺桑椹的阴性样品溶液40ml，同法制成阴性对照溶液；取桑椹对照药材2g，加水60ml煎煮30分钟，滤过，滤液浓缩至约20ml，置分液漏斗中，加二氯甲烷30ml振摇提取，分取二氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液与缺桑椹阴性对照溶液各10μl，对照药材溶液20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5:4:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见附图7。

1.4女贞子的TLC法鉴别：取该制剂20ml，用***振摇提取2次，每次20ml，合并***液，低温挥干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取缺女贞子的阴性样品溶液20ml，同法制成阴性对照溶液；再取女贞子对照药材0.5g，加50％乙醇20ml，超声30min，滤过，滤液照供试品溶液制备方法处理，制成对照药材溶液；照中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取上述对照药材溶液，供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为20:11的环已烷-丙酮混合溶液为展开剂，饱和30min，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇液，热风吹至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见附图8。

2.制何首乌中二苯乙烯苷含量测定

2.1色谱条件：色谱柱为PhenomenexC18柱(250mm×4.6mm,5μm)；检测波长为320nm；流动相A为乙腈，流动相B为水，分析时间30分钟，等度洗脱，流动相A:流动相B的体积比为20:80；流速1.0mL·min^-1；柱温为30℃；进样量10μl；理论塔板数不低于2000；

2.2对照品溶液的制备：精密称取二苯乙烯苷(2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)对照品13mg，置50ml容量瓶中，加稀乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到对照品溶液母液。精密量取对照品溶液母液1mL置10ml容量瓶中，加稀乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.0260mg/mL的对照品溶液；

2.3供试品、阴性对照溶液的制备：精密量取样品3.0ml，置于100ml量瓶中，加稀乙醇适量，振摇使溶解，再加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，静置，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。取缺制何首乌的阴性样品，同供试品溶液方法制成缺制何首乌的阴性对照溶液。

2.4测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。含量测定结果：本批次每1ml含制何首乌按二苯乙烯苷计，为0.67mg。

实施例2

益龄精批号：20090901

制何首乌中二苯乙烯苷含量测定

色谱条件：色谱柱为PhenomenexC18柱(250mm×4.6mm,5μm)；检测波长为310nm；流动相A为乙腈，流动相B为水，分析时间30分钟，等度洗脱，流动相A:流动相B的体积比为20:80；流速0.8mL·min^-1；柱温为40℃；进样量10μl；理论塔板数不低于2000；

对照品溶液的制备：精密称取二苯乙烯苷(2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)对照品13mg，置50ml容量瓶中，加稀乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到对照品溶液母液。精密量取对照品溶液母液1mL置10ml容量瓶中，加稀乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.0260mg/mL的对照品溶液；

供试品、阴性对照溶液的制备：精密量取样品3.0ml，置于100ml量瓶中，加稀乙醇适量，振摇使溶解，再加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，静置，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。取缺制何首乌的阴性样品，同供试品溶液方法制成缺制何首乌的阴性对照溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。含量测定结果：本批次每1ml含制何首乌按二苯乙烯苷计，为0.60mg。

实施例3

益龄精批号：20090903

制何首乌中二苯乙烯苷含量测定

色谱条件：色谱柱为PhenomenexC18柱(250mm×4.6mm,5μm)；检测波长为330nm；流动相A为乙腈，流动相B为水，分析时间30分钟，等度洗脱，流动相A:流动相B的体积比为20:80；流速1.2mL·min^-1；柱温为25℃；进样量10μl；理论塔板数不低于2000；

对照品溶液的制备：精密称取二苯乙烯苷(2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)对照品13mg，置50ml容量瓶中，加稀乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到对照品溶液母液。精密量取对照品溶液母液1mL置10ml容量瓶中，加稀乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.0260mg/mL的对照品溶液；

供试品、阴性对照溶液的制备：精密量取样品3.0ml，置于100ml量瓶中，加稀乙醇适量，振摇使溶解，再加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，静置，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。取缺制何首乌的阴性样品，同供试品溶液方法制成缺制何首乌的阴性对照溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。含量测定结果：本批次每1ml含制何首乌按二苯乙烯苷计，为0.71mg。