阅读说明：本技术 一种检测降钙素原的荧光免疫层析试纸及其制备方法 (Fluorescence immunochromatographic test paper for detecting procalcitonin and preparation method thereof ) 是由 戴瞻 于 2019-11-04 设计创作，主要内容包括：一种检测降钙素原的荧光免疫层析试纸,包括PVC底板；PVC底板上从左到右依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；样品垫的一端固定在PVC底板上,样品垫的另一端搭设在结合垫上,样品垫的中心处设有样品滴入孔；结合垫的一端固定在PVC底板上,结合垫的另一端搭设在硝酸纤维素膜上；硝酸纤维素膜上从左到右依次设有检测线和质控线,吸水垫的左端搭设在硝酸纤维素膜上。本发明检测试纸通过时间分辨免疫荧光微球对抗体蛋白进行标记,并且多抗进行捕获,从而使得检测灵敏度更高。大大缩短了检测时间,效率高,具有良好的稳定性和重复性。(A fluorescence immunochromatographic test paper for detecting procalcitonin comprises a PVC base plate; a sample pad, a combination pad, a nitrocellulose membrane and a water absorption pad are sequentially arranged on the PVC bottom plate from left to right; one end of the sample pad is fixed on the PVC bottom plate, the other end of the sample pad is overlapped on the combination pad, and a sample dropping hole is formed in the center of the sample pad; one end of the combination pad is fixed on the PVC bottom plate, and the other end of the combination pad is erected on the nitrocellulose membrane; the nitrocellulose membrane is sequentially provided with a detection line and a quality control line from left to right, and the left end of the water absorption pad is erected on the nitrocellulose membrane. The detection test paper marks the antibody protein through the time-resolved immunofluorescence microspheres, and captures the polyclonal antibody, so that the detection sensitivity is higher. The detection time is greatly shortened, the efficiency is high, and the stability and the repeatability are good.)

一种检测降钙素原的荧光免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及一种检测降钙素原的荧光免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

降钙素原(procalcitonin，PCT)是无激素活性的降钙素前体物质，是由116个氨基酸组成，分子量为13KD的糖蛋白。PCT由神经内细胞分泌(包括甲状腺、肺和胰腺组织细胞)表达，经酶切分解为降钙素(CT))，羧基端肽及氨基端肽。PCT在人体内的半衰期为25-30h，稳定性好，在正常人血清中含量极低。在导致全身炎症反应综合征(SIRS)的许多情况下，诸如细菌性感染、胰腺炎、烧死、多发伤，血中PCT的含量异常升高，而CT无明显变化。血中PCT水平与感染及损伤的严重程度呈正相关，且已成为用于脓毒症、严重脓毒症、脓毒休克的诊断和疗效监测的有效指标。

PCT(降钙素原，procalcitonin)是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用。

PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。目前检测PCT的方法有很多种，除了过去使用费时不易自动化的凝胶层分析法和高效液相色谱分析法外，现今检测PCT较特异、敏感的方法有：酶联免疫吸附法、放射免疫法和免疫荧光法。

酶联免疫吸附法是利用两种鼠单克隆抗体双抗体夹心法原理检测血清中PCT，方法较特异，无交叉反应。但是酶联免疫吸附法检测敏感性低，最低限为仅10ug/L，正常人血清中PCT浓度不能检出。

放射免疫法既能检测游离型PCT，又能检测结合型PCT，检测灵敏度高，最低限为4pg/L。但放射免疫法检测所需时间较长，通常需要数小时，且放射性元素的污染限制了此方法的应用。

免疫荧光法是一种定量的免疫荧光检测方法，两种鼠单克隆抗体与PCT抗原的两个不同的结合位点结合，一种抗体经荧光标记(示踪剂)，另一种固定在试管壁，抗体与血清中的PCT分子反应形成“夹心复合物”，荧光标记抗体被缚在试管壁上，通过发光试剂记数荧光标志物的含量，荧光信号的强度与标本PCT浓度成正比，同时测定标准品，根据已知抗原浓度的PCT制成标准曲线后，以定量得到标本的PCT浓度，此方法敏感性与放射免疫法相似。但是免疫荧光法需要配备昂贵的免疫荧光检测仪。

因此，如何解决上述问题，是本领域技术人员着重要研究的内容。

发明内容

为克服上述现有技术中的不足，本发明目的在于提供一种检测降钙素原的荧光免疫层析试纸及其制备方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种检测降钙素原的荧光免疫层析试纸，包括PVC底板；所述PVC底板上从左到右依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述样品垫设置在所述PVC底板的最左端，所述样品垫的一端固定在所述PVC底板上，所述样品垫的另一端搭设在所述结合垫上，所述样品垫的中心处设有样品滴入孔；所述结合垫的一端固定在所述PVC底板上，并位于所述样品垫另一端的下方，所述结合垫的另一端搭设在所述硝酸纤维素膜上；所述结合垫中含有复数个时间分辨免疫荧光微球；所述时间分辨免疫荧光微球的表面修饰有与蛋白或抗体共价耦连的羧基基团；所述硝酸纤维素膜上从左到右依次设有检测线和质控线，所述检测线和所述质控线在所述硝酸纤维素膜上平行相距设置；所述检测线为PCT多抗的划线，其浓度为1.5mg/ml；所述质控线为羊抗鼠IgG抗体划线,其浓度为1mg/ml；所述吸水垫设置在所述PVC底板的最右端，所述吸水垫的左端搭设在所述硝酸纤维素膜上。

上述方案中，有关内容解释如下：

1、上述方案中，每个所述时间分辨免疫荧光微球中包裹有数以万计的荧光物质，不会泄漏，大大提高了荧光的标记效率，有效提高了分析灵敏度。所述荧光物质为稀土铕离子配合物，其激发光波长为365nm，反射光波长为610nm，所述时间分辨免疫荧光微球的直径为200nm。所述时间分辨免疫荧光微球是一种具有特殊功能的微球，微球表面修饰有一定密度的羧基或其它功能基团，与蛋白或抗体的共价偶联，大大提高标记物的稳定性。

2、上述方案中，所述硝酸纤维素膜为硝酸纤维膜，所述硝酸纤维素膜为表面平整的白色或乳色膜，且所述硝酸纤维素膜的含水量在25％-50％之间，所述硝酸纤维素膜的膜孔径为8μm。

3、上述方案中，还包括塑料外壳，所述塑料外壳包括塑料上壳和塑料下壳；所述荧光免疫层析试纸装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，所述塑料上壳上设有加样孔和观察窗，所述加样孔对应于试纸条上的样品垫设置，所述观察窗对应于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线设置。

本发明还提供了一种检测降钙素原的荧光免疫层析试纸的制备方法，包含以下步骤：

(1)时间分辨免疫荧光微球的预处理

将时间分辨免疫荧光微球用超声分散处理5min后，取50ul，14000rpm高速离心15min后去除上清液，沉淀物用190ul10mmol/L，pH6.0的MES缓冲液洗涤；分别配备20mg/ml的碳二亚胺和琥珀酰亚胺，各加入5ul，室温反应30min后，14000rpm高速离心15min，沉淀物用pH为6.0的MES溶液洗涤并重悬至500ul，获得时间分辨免疫荧光微球溶液；

(2)结合PCT单克隆抗体的时间分辨免疫荧光微球的制备

将步骤(1)中处理后的时间分辨免疫荧光微球溶液中加入50ugPCT单克隆抗体，混匀，室温反应2小时，用4％的BSA室温封闭2小时后，14000rpm高速离心15min，用含0.1％BSA、0.2％Tween20、0.1％NaN₃的50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl保存液洗涤并重悬至100ul，于4℃避光保存，获得结合PCT单克隆抗体的时间分辨免疫荧光微球溶液；

(3)喷金与划膜的处理

用含有1％蔗糖的10mmol/LPBS缓冲液分别稀释羊抗鸡IgG和小鼠抗人PCT单克隆抗体至浓度1mg/ml，取步骤(2)中获得的结合PCT单克隆抗体的时间分辨免疫荧光微球溶液100ul，14000rpm高速离心15min；用250ul含0.5BSA、0.3％Tween20、10％蔗糖的50mmol/L、pH为7.5的Tris-HCl微球重悬液重悬；用喷金划膜仪以1ul/cm的量在所述硝酸纤维素膜上平行喷涂控制线和检测线，所述控制线和检测线之间间隔4mm，用喷金划膜仪以2ul/cm的量在硝酸纤维素膜上平行喷涂时间分辨免疫荧光微球线，与所述检测线间隔4mm；放入37℃烘箱避光烘干10小时，加入干燥剂封存备用；

(4)试纸条的组装

在PVC底板上依次相互交错2mm搭接粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水垫，从而得到试纸板，再将试纸板切割成4mm的试纸条；再将试纸条组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设有加样孔和观察窗，所述加样孔对应于试纸条上的样品垫，所述观察窗对应于试纸条上的检测线和质控线设置。

进一步地，所述PVC底板的尺寸为80*300mm；所述样品垫为全血滤垫，其尺寸为30*300mm，玻璃纤维棉材质；所述硝酸纤维素膜尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质；所述吸水垫尺寸为28*300mm。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的有益效果如下：

传统试纸条检测PCT抗原，是单抗捕获。本发明PCT多抗捕获，因此灵敏度高于传统试纸条；本发明检测试纸通过时间分辨免疫荧光微球对抗体蛋白进行标记，并且多抗进行捕获，从而使得检测灵敏度更高。大大缩短了检测时间，效率高，具有良好的稳定性和重复性。操作简便，无需特殊的仪器设备。本发明具有突出的实质性特点和显著性进步。

附图说明

图1为本发明荧光免疫层析试纸的结构示意图；

图2为本发明时间分辨荧光免疫层析检测PCT浓度的标准曲线示意图。

图中：1、PVC底板；2、样品垫；3、样品滴入孔；4、结合垫；5、硝酸纤维素膜；6、检测线；7、质控线；8、吸水垫。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例结合附图说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

如图1所示，一种检测降钙素原的荧光免疫层析试纸，包括PVC底板1；所述PVC底板1上从左到右依次设有样品垫2、结合垫4、硝酸纤维素膜5及吸水垫8；所述样品垫2设置在所述PVC底板1的最左端，所述样品垫2的一端固定在所述PVC底板1上，所述样品垫2的另一端搭设在所述结合垫4上，所述样品垫2的中心处设有样品滴入孔3；所述结合垫4的一端固定在所述PVC底板1上，并位于所述样品垫2另一端的下方，所述结合垫4的另一端搭设在所述硝酸纤维素膜5上；所述结合垫4中含有复数个时间分辨免疫荧光微球(图中未示出)；所述时间分辨免疫荧光微球的表面修饰有与蛋白或抗体共价耦连的羧基基团；所述硝酸纤维素膜5上从左到右依次设有检测线6和质控线7，所述检测线6和所述质控线7在所述硝酸纤维素膜5上平行相距设置；所述检测线6为PCT多抗的划线，其浓度为1.5mg/ml；所述质控线7为羊抗鼠IgG抗体划线,其浓度为1mg/ml；所述吸水垫8设置在所述PVC底板1的最右端，所述吸水垫8的左端搭设在所述硝酸纤维素膜5上。

本发明时间分辨荧光免疫层析法检测PCT的试剂盒，采用双抗夹心法免疫层析原理，检测人全血中PCT含量。所述试剂盒由时间分辨荧光免疫层析法检测PCT的试纸条和含有PCT标准曲线的ID卡组成。

每个所述时间分辨免疫荧光微球中包裹有数以万计的荧光物质，不会泄漏，大大提高了荧光的标记效率，有效提高了分析灵敏度。所述荧光物质为稀土铕离子配合物，其激发光波长为365nm，反射光波长为610nm，所述时间分辨免疫荧光微球的直径为200nm。所述时间分辨免疫荧光微球是一种具有特殊功能的微球，微球表面修饰有一定密度的羧基或其它功能基团，与蛋白或抗体的共价偶联，大大提高标记物的稳定性。

所述硝酸纤维素膜5为硝酸纤维膜，所述硝酸纤维素膜5为表面平整的白色或乳色膜，且所述硝酸纤维素膜5的含水量在25％-50％之间，所述硝酸纤维素膜5的膜孔径为8μm。

所述检测线6为PCT多抗的划线，其浓度为1.5mg/ml；所述质控线7为羊抗鼠IgG抗体划线,其浓度为1mg/ml。

还包括塑料外壳，所述塑料外壳包括塑料上壳和塑料下壳；所述荧光免疫层析试纸装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，所述塑料上壳上设有加样孔和观察窗，所述加样孔对应于试纸条上的样品垫设置，所述观察窗对应于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线设置。

本发明还提供了一种检测降钙素原的荧光免疫层析试纸的制备方法，包含以下步骤：

(1)时间分辨免疫荧光微球的预处理

将时间分辨免疫荧光微球用超声分散处理5min后，取50ul，14000rpm高速离心15min后去除上清液，沉淀物用190ul10mmol/L，pH6.0的MES缓冲液洗涤；分别配备20mg/ml的碳二亚胺和琥珀酰亚胺，各加入5ul，室温反应30min后，14000rpm高速离心15min，沉淀物用pH为6.0的MES溶液洗涤并重悬至500ul，获得时间分辨免疫荧光微球溶液；

(2)结合PCT单克隆抗体的时间分辨免疫荧光微球的制备

将步骤(1)中处理后的时间分辨免疫荧光微球溶液中加入50ugPCT单克隆抗体，混匀，室温反应2小时，用4％的BSA室温封闭2小时后，14000rpm高速离心15min，用含0.1％BSA、0.2％Tween20、0.1％NaN₃的50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl保存液洗涤并重悬至100ul，于4℃避光保存，获得结合PCT单克隆抗体的时间分辨免疫荧光微球溶液；

(3)喷金与划膜的处理

用含有1％蔗糖的10mmol/LPBS缓冲液分别稀释羊抗鸡IgG和小鼠抗人PCT单克隆抗体至浓度1mg/ml，取步骤(2)中获得的结合PCT单克隆抗体的时间分辨免疫荧光微球溶液100ul，14000rpm高速离心15min；用250ul含0.5BSA、0.3％Tween20、10％蔗糖的50mmol/L、pH为7.5的Tris-HCl微球重悬液重悬；用喷金划膜仪以1ul/cm的量在所述硝酸纤维素膜上平行喷涂控制线和检测线，所述控制线和检测线之间间隔4mm，用喷金划膜仪以2ul/cm的量在硝酸纤维素膜上平行喷涂时间分辨免疫荧光微球线，与所述检测线间隔4mm；放入37℃烘箱避光烘干10小时，加入干燥剂封存备用；

(4)试纸条的组装

在PVC底板上依次相互交错2mm搭接粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水垫，从而得到试纸板，再将试纸板切割成4mm的试纸条；再将试纸条组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设有加样孔和观察窗，所述加样孔对应于试纸条上的样品垫，所述观察窗对应于试纸条上的检测线和质控线设置。

进一步地，所述PVC底板的尺寸为80*300mm；所述样品垫为全血滤垫，其尺寸为30*300mm，玻璃纤维棉材质；所述硝酸纤维素膜尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质；所述吸水垫尺寸为28*300mm。

该实施例中试纸条组装在塑料外壳内，形成中时间分辨荧光免疫层析法检测PCT的试剂盒，每个试剂盒内均匹配一个含有PCT标准曲线的ID卡，相同批次的产品标准曲线相同，通过所述PCT试纸条测定不同浓度的校准品，以校准品浓度为X轴，检测线、质控线荧光强度的比值为Y轴，绘制成标准曲线，写入并生成相应条码信息存储在ID卡中，并打印出匹配的条码粘贴在试纸条外壳上。检测浓度时，ID卡***仪器ID卡插口，干式荧光免疫分析仪读取试纸条外壳上对应的条码信息，获取相应的标准曲线。

实施例2：时间分辨荧光免疫层析检测PCT浓度

按实施例1制备好的试纸条中加入不同浓度的人PCT抗原校准品(100.0ng/ml、50.0ng/ml、20.0ng/ml、10.0ng/ml、5.0ng/ml、1.0ng/ml、0.5ng/ml、0.2ng/ml、0.05ng/ml、0.02ng/ml共十个浓度，每个浓度设置三个重复，均由1.0mg/ml人PCT抗原用样本缓冲液稀释而成)，层析15min后，通过江苏苏州和迈精密仪器生物制药有限公司生产的FIC-S1型干式荧光免疫分析仪读取检测线、控制线的荧光强度比值(检测线检测值/控制线检测值)。

以PCT校准品浓度为X轴，以样品检测线荧光强度质控线荧光强度为Y轴建立方程并拟合成标准曲线，如图2所示，R值为0.9945。

该过程具体包括下列步骤：

(1)将待检测样本及检测试剂复温至室温；

(3)吸取全血样本100ul，加入到试纸条的加样孔中，室温避光反应15分钟；

(4)开启干式荧光免疫分析仪，初始化自检完毕后***对应检测PCT的ID卡；

(5)将试纸条***仪器的试纸条插口中，运行仪器，通过相应的分析软件自动计算出待测样本中的PCT的浓度。

临床样本检测

采集医院检测PCT的全血样本60份，用本发明的试剂盒与罗氏标本进行比较。本发明试剂盒中，取全血100ul加入到检测卡加样孔中，层析15分钟后通过苏州和迈精密仪器有限公司生产的FIC-S1型干式荧光免疫分析仪读取浓度，同一血样采用对比系统罗氏PCT试剂盒进行浓度检测。两种方法检测结果进行线性分析，其相关性很好R＝0.981，平均相对偏差小于10％，结果符合临床分析要求，适合用于临床检测。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。