阅读说明：本技术 一种用于检测癌症化疗敏感性的血浆蛋白分子、应用及试剂盒 (Plasma protein molecule for detecting cancer chemotherapy sensitivity, application and kit ) 是由 梁廷波 白雪莉 章琦 楼煜 叶茅 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于检测癌症化疗敏感性的血浆蛋白分子、应用及试剂盒。一种用于检测癌症化疗敏感性的血浆蛋白分子,包括人血浆蛋白GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin mu heavy chain和FCN2中的至少一种。本发明研究发现上述人血浆蛋白浓度在不同化疗响应的胰腺癌患者中存在显著差异,作为肿瘤标记物单独使用时预测胰腺癌化疗响应的ROC曲线下面积可达到0.5550～0.7275；将这五种人血浆蛋白浓度组合作为肿瘤标记物联合患者年龄预测胰腺癌化疗响应的ROC曲线下面积可达0.915,可作为预测肿瘤化疗敏感性的肿瘤标记物,实现化疗敏感人群的有效筛选,大大提升临床获益。(The invention discloses a plasma protein molecule for detecting cancer chemotherapy sensitivity, application and a kit. A plasma protein molecule for detecting cancer chemotherapy sensitivity comprises at least one of human plasma proteins GSN, APOA4, IGHG1, immunologlobulin mu heavy chain and FCN 2. The research of the invention finds that the concentration of the human plasma protein has obvious difference in pancreatic cancer patients with different chemotherapy responses, and the area under the ROC curve for predicting the pancreatic cancer chemotherapy response can reach 0.5550-0.7275 when the human plasma protein is used as a tumor marker alone; the area under the ROC curve of the five human plasma protein concentration combinations used as tumor markers for predicting the pancreatic cancer chemotherapy response in combination with the age of a patient can reach 0.915, and the human plasma protein concentration combinations can be used as tumor markers for predicting the tumor chemotherapy sensitivity, so that the effective screening of chemotherapy-sensitive people is realized, and the clinical benefit is greatly improved.)

一种用于检测癌症化疗敏感性的血浆蛋白分子、应用及试 剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术检测技术领域，特别是涉及一种用于检测癌症化疗敏感性的血浆蛋白分子、应用及试剂盒。

背景技术

肿瘤是威胁人类生命健康的重要疾病之一。胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤，素有“万癌之王”之称。其发病隐匿，使得很多患者往往在诊断时已失去了外科手术的机会，而不佳的化疗响应率，更是极大的限制了胰腺癌患者的预后。

近年随着多方研究的探索，FOLFIRINOX、纳米白蛋白紫杉醇联合吉西他滨等一些化疗方案逐渐脱颖而出，成为治疗胰腺癌的主要化疗策略。然而不幸的是，这些方案在胰腺癌人群中有效率仍然十分有限。因此，寻找有效的肿瘤标记物帮助准确识别化疗获益人群，对于提升胰腺癌患者预后有着重要意义。CA19-9是临床上最为常用的肿瘤标记物之一，其对于胰腺癌诊断有着良好的灵敏性和特异性。基于CA19-9的表达模式，研究发现对于CA19-9下降超过20％的患者，FOLFIRINOX方案可获得更高的客观缓释率(ORR，44.0％vs.22.9％)。然而，CA19-9并非表达于所有胰腺癌患者，该策略也无法在化疗前对患者的响应情况作出预测。为解决这个问题，一些研究在肿瘤循环DNA和血清蛋白标记物上作出了探索，发现ctDNA(KRAS)、CEA和sCD40L等生物标记物均可在一定程度上预测化疗药物的敏感性。然而，这些生物标记物，不论是单用还是联用，其预测的灵敏性和特异性都难以满足临床的需求。所以，开发新的肿瘤标记物，在化疗前对药物敏感性作出预测具有良好的应用前景。

随着技术的发展与成熟，基于质谱的蛋白质组学策略逐渐在临床检测和基础研究中大展身手。其高通量、高灵敏度、高准确性的技术特点，为生物医学领域带来了巨大的便利，使得大规模筛选生物标记物成为了可能。因此，利用组学大数据的策略筛选新的标记物，并构建多标记物的预测模型，或能将化疗预测的准确性提升到新的水平。

发明内容

本发明研究发现人外周血提取的游离蛋白GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin muheavy chain(IgM heavy chain，IgM抗体的重链)、FCN2，其血浆蛋白浓度在化疗响应不同的胰腺癌患者中呈现出显著差异，进一步分析可以发现血清GSN、APOA4、Immunoglobulinmu heavy chain、FCN2的高表达及IGHG1的低表达与肿瘤对FOLFIRINOX方案的敏感性相关。以该蛋白分子构建胰腺癌化疗响应预测模型，其受试者工作特征(receiver operatingcharacteristic，ROC)曲线下面积可达0.88，联合患者年龄预测胰腺癌化疗响应的ROC曲线下面积可达0.915。所以，血浆蛋白标志物分子联合患者临床信息构建的预测模型可作为预测肿瘤化疗响应的肿瘤标记物，进而帮助临床筛选化疗敏感人群。

一种用于检测癌症化疗敏感性的血浆蛋白分子，包括人血浆蛋白GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin mu heavy chain和FCN2中的至少一种。

优选的，所述的血浆蛋白分子，包括以下蛋白组合中的一种：GAI、GAF、GAM、GIF、GIM、GFM、AIF、AFM、IFM、AIM，其中G：GSN、A：APOA4、I：IGHG1、M：Immunoglobulin mu heavychain、F：FCN2。

更优选的，所述的血浆蛋白分子，包括人血浆蛋白GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin mu heavy chain和FCN2。五种人血浆蛋白组合在一起使用，结果更加准确。

本发明又提供了所述的血浆蛋白分子在作为检测癌症化疗敏感性的靶点中的应用。所述的应用，癌症种类为胰腺癌。所述的应用，化疗方案为FOLFIRINOX方案。

所述的应用，包括检测血浆中人血浆蛋白GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin muheavy chain和FCN2的浓度，以及将上述5种人血浆蛋白浓度数据输入到预生成的随机森林模型中对患者的化疗响应进行预测评估。

所述预生成的随机森林模型构建方法为：

取已知FOLFIRINOX方案敏感及耐药的患者血浆中人血浆蛋白GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin mu heavy chain和FCN2的浓度数据，

设定种子数为2019，以2∶1比例进行随机分组构建训练集与验证集，导入5种蛋白的浓度矩阵、治疗响应情况和相应的临床信息：性别、年龄、肿瘤标记物、肿瘤大小及位置，利用随机森林算法构建模型，并重复以上运算100次获得模型平均预测的ROC工作曲线，设定树的数量为1000，末梢节点最小观察资料数为1∶5，利用ranger函数拟合得到最终模型。

本发明还提供了一种用于检测癌症化疗敏感性的试剂盒，包括：

(1)用于从血浆中提取蛋白的试剂；

(2)用于检测人血浆蛋白GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin mu heavy chain和FCN2浓度的试剂。

本发明研究发现人血浆蛋白GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin mu heavychain、FCN2浓度在不同化疗响应的胰腺癌患者中存在显著差异，作为肿瘤标记物单独使用时预测胰腺癌化疗响应的ROC曲线下面积可达到0.5550～0.7275；将这五种人血浆蛋白浓度组合作为肿瘤标记物联合患者年龄预测胰腺癌化疗响应的ROC曲线下面积可达0.915。所以，基于血浆蛋白分子GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin mu heavy chain、FCN2(包含以上五种蛋白的任意组合及其中各部分的任意组合)联合患者临床信息，可作为预测肿瘤化疗敏感性的肿瘤标记物，辅以前期构建的随机森林模型，实现化疗敏感人群的有效筛选，大大提升临床获益。

附图说明

图1为化疗耐药和敏感胰腺癌患者的血浆蛋白浓度对比结果图。

图2为实施例3中模型构建时抽取的其中一个模型决策树结果图。

图3为血浆蛋白组合在胰腺癌化疗响应预测中的敏感性和特异性分析结果图。

图4为单蛋白标记物模型在胰腺癌化疗响应预测中的敏感性和特异性分析结果图。

图5为基于二元Logistic回归分析建立的传统三蛋白标记物组合模型在胰腺癌化疗响应预测中的敏感性和特异性分析结果图。

具体实施方式

样品来源：胰腺癌患者血浆样品来源于浙江大学医学院附属第一医院。

伦理审批：经浙江大学医学院附属第一医院科研伦理审查委员会伦理审查，批件号：(2019)科研快审第(622)号。

实施例1

外周血样品提取血浆蛋白。方法如下：

使用抗凝采血管采集人外周血，离心(3000g，4℃，20分钟)去除血细胞后，上清于-80℃冰箱冻存。检测时，取出冻存上清，4℃下融解。离心(10000g，60分钟)以去除大的细胞碎片等物质。取100μl上清，加入200μl蛋白提取液(购自Biognosys公司，试剂盒产品号：Ki-3013)充分混匀后4℃静置5分钟。离心(14000g，4℃，10分钟)后取上清，得到血浆蛋白样本。

实施例2

利用蛋白定量试剂盒(购自Thermo Fisher公司，产品号：23225)的方法步骤对血浆蛋白样本进行定量。使用蛋白酶(购自Biognosys公司，试剂盒产品号：Ki-3013)对蛋白进行酶解，获得可供上机的肽段。并依据定量结果在相同含量的多肽样本中添加等量的核素标记标准肽段(购自Biognosys公司，产品号：Ki-3019)，制成可供上机的肽段样本。

实施例3

对实施例2中的样本进行质谱检测，进而获得目标蛋白的定量结果。依据绝对定量结果和上机样本体积对目标蛋白的血浆浓度进行计算，并将获得的浓度导入前期构建的随机森林模型中，进而对患者的化疗响应情况作出预测。

检测共涉及胰腺癌化疗患者血浆样品共40例，其中FOLFIRINOX方案敏感患者25例，耐药患者15例，结果表明，不同化疗响应的患者外周血中GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin mu heavy chain、FCN2蛋白水平显著不同(图1)。

设定种子数为2019，以2∶1比例进行随机分组构建训练集与验证集，导入5种蛋白的浓度矩阵、治疗响应情况和相应的临床信息：性别、年龄、肿瘤标记物、肿瘤大小及位置，利用随机森林算法构建模型，并重复以上运算100次获得模型平均预测的ROC工作曲线。设定树的数量为1000，末梢节点最小观察资料数为1∶5，利用ranger函数拟合得到最终模型。抽取模型决策树显示基于该5个血清蛋白可对样本集的胰腺癌作出高效的预测，准确率高达95％。基于该决策树，可以发现血清GSN、APOA4、Immunoglobulin mu heavy chain、FCN2的高表达及IGHG1的低表达与肿瘤对FOLFIRINOX方案的敏感性相关(图2)。

实施例4

基于该随机森林模型对验证队列展开分析，ROC曲线显示，基于血浆蛋白分子GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin mu heavy chain、FCN2联合患者年龄的预测模型可有效预测胰腺癌患者化疗响应情况，ROC曲线下面积可达0.915(图3)。特别地，在保证诊断特异性100％的情况下，敏感性可达80％以上。其预测效率显著优于存在单蛋白标记物模型(使用wilson/brown模型，结果如图4所示)及基于二元Logistic回归分析建立的传统三蛋白标记物组合模型(图5和表1)。而后者因利用单一队列进行训练和验证，存在较高的过拟合风险，在扩大队列中验证效果不佳。因此，血浆蛋白分子联合临床数据在胰腺癌患者化疗敏感性预测中具有极佳的优势，远超现行临床使用的标准方法。

表1

蛋白组合	AUC
		GAI	0.810
GAF	0.778
		GAM	0.890
GIF	0.833
		GIM	0.865
GFM	0.888
		AIF	0.835
AFM	0.885
		IFM	0.903
AIM	0.808

注：G：GSN、A：APOA4、I：IGHG1、M：IgM heavy chain、F：FCN2。

综上，本发明首次发现基于人血浆蛋白分子(包括GSN、APOA4、IGHG1、Immunoglobulin mu heavy chain、FCN2，包含以上五种蛋白的任意组合及其中各部分的任意组合)的化疗敏感性预测模型在胰腺癌患者中有很好的预测效果，因而可作为现有化疗响应预测策略的重要补充，效率远优于现行临床方法。