阅读说明：本技术 反应处理装置 (Reaction processing apparatus ) 是由 福泽隆 川口磨 于 2018-06-18 设计创作，主要内容包括：反应处理装置(100)包括：流路(12),其供样品(50)移动；反应处理容器(10),其包括被设置在流路(12)的两端的一对第一空气连通口(24)及第二空气连通口(26)；温度控制系统(102),其在流路(12)中的第一空气连通口(24)与第二空气连通口(26)之间提供中温区域(38)、以及高温区域(36)；以及送液系统(120),其为了使样品(50)在流路(12)内移动及停止而进行空气的喷出及吸引。反应处理容器(10)的一对空气连通口中距高温区域(36)较远的第一空气连通口(24)经由管(130)与送液系统(120)连通。反应处理容器(10)的一对空气连通口中较接近高温区域(36)的第二空气连通口(26)被开放在大气压中。(A reaction processing device (100) is provided with: a flow path (12) through which a sample (50) moves; a reaction processing container (10) having a pair of first and second air communication ports (24, 26) provided at both ends of a flow path (12); a temperature control system (102) that provides a medium-temperature region (38) and a high-temperature region (36) between a first air communication port (24) and a second air communication port (26) in a flow path (12); and a liquid feeding system (120) which performs air ejection and suction for moving and stopping the sample (50) in the flow path (12). A first air communication port (24) of the pair of air communication ports of the reaction processing container (10), which is farther from the high-temperature region (36), is communicated with the liquid feeding system (120) via a pipe (130). A second air communication port (26) of the pair of air communication ports of the reaction processing container (10) which is closer to the high temperature region (36) is opened to the atmospheric pressure.)

反应处理装置

技术领域

本发明涉及被使用于聚合酶链式反应(PCR：Polymerase Chain Reaction)的反应处理装置。

背景技术

基因检测被广泛应用于各种医学领域中的检查、农作物及病原性微生物的鉴定、食品的安全性评价，以及病原性病毒和各种感染病的检查。为了高灵敏度地对微小量的DNA进行检测，已知有对扩增DNA的一部分而得到的物质进行分析的方法。其中，使用PCR的方法是一种令人瞩目的技术，其选择性地对从生物体等提取的极微量的DNA中的某一部分进行扩增。

PCR为一种如下的反应：向混合有包含DNA的生物样品与由引物或酶等构成的PCR试剂的样品提供预定的热循环，反复使其发生变性、退火、以及延伸反应，从而选择性地对DNA的特定部分进行扩增。

虽然在PCR中，通常，通过将预定量的目标样品放入PCR管或形成有多个孔的微孔板(微孔池)等反应处理容器中来进行反应，但是近年来，用包括被形成于基板的微细的流路的反应处理容器(也称芯片(chip))来进行反应的做法逐渐得到了实用化(例如专利文献1)。

[现有技术文献]

[非专利文献]

专利文献1:日本特开2009-232700号公报

发明内容

[发明要解决的课题]

另外，因为PCR能够合成数百万个DNA的副本，而对混入物非常敏感，所以在从极微量的检测体DNA开始反应的情况下，之前进行的反应的生成物的污染物会成为问题。以前进行的反应的生成物会影响下一个反应这样的现象被称为“污染(carry-over)”。防止或降低污染是非常重要的。其原因在于，例如含有目标序列的以前的反应生成物仅在反应系统中混入1个拷贝，就有可能使结果的解释错误。

本发明鉴于这样的状况而完成，其目的在于提供一种能够防止或至少抑制PCR中的污染的反应处理装置。

[用于解决技术课题的技术方案]

为了解决上述问题，本发明的一个方案的反应处理装置包括：反应处理容器，其包括供样品移动的流路、以及被设置在流路的两端的一对空气连通口；温度控制部件，其在流路中的一对空气连通口之间，提供被维持在第一温度的第一温度区域、以及被维持在高于第一温度的第二温度的第二温度区域；以及送液系统，其为了使样品在流路内移动及停止而进行空气的喷出及吸引。反应处理容器的一对空气连通口中，距第二温度区域较远的空气连通口经由管而被与送液系统连通，反应处理容器的一对空气连通口中，较接近第二温度区域的空气连通口被开放在大气压中。

也可以是，送液系统包括：腔室，其具有有一定的体积的内部空间、以及对内部空间与外部进行连通的第一空气口及第二空气口；第一泵，其被配置为从第一空气口向腔室的内部空间喷出空气；以及第二泵，其被配置为从第二空气口向腔室的内部空间喷出空气。腔室的第一空气口经由管而被与反应处理容器的一对空气连通口中距第二温度区域较远的空气连通口连通，腔室的第二空气口被开放在大气压中，第一泵与第二泵也可以被以交替进行空气的喷出动作的方式控制。

也可以是，在反应处理容器的流路的两端中的至少在距第二温度区域较远一方的流路端部设置有过滤器。

发明效果

根据本发明，能够提供一种可防止或至少抑制PCR中的污染的反应处理装置。

附图说明

图1的(a)、图1的(b)及图1的(c)是用于说明在本发明的实施方式的反应处理装置中能够使用的反应处理容器的图。

图2是反应处理容器所包括的基板的俯视图。

图3是反应处理容器的剖视图，是用于说明各部位与基板的主表面的关系的图。

图4是示意性地表示样品被导入到反应处理容器内的状况的图。

图5是用于说明本发明的实施方式的反应处理装置的示意图。

图6是用于说明送液系统的构成的概略图。

图7是表示向反应处理容器的流路内的样品提供热循环的状况的图。

图8是表示本实施方式的反应处理装置的PCR的扩增结果的图。

图9是表示本实施方式的反应处理装置的PCR的扩增结果的图。

图10是表示初始的检测体浓度不同的6个检测体所对应的Ct值的表。

图11是表示绘制有图10所示的初始浓度与Ct值的关系的标准曲线的图。

图12是用于说明比较例的反应处理装置的图。

图13是表示比较例的反应处理装置所进行的PCR的扩增结果的图。

图14是用于说明反应处理装置的另一实施方式的图。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式的反应处理装置进行说明。对于各附图所示的相同或等同的组件、构件、以及处理，标注相同的附图标记，并适当省略重复的说明。此外，实施方式并不对发明进行限定，仅为例示，并非实施方式中记载的所有特征及其组合都是发明的本质性内容。

图1的(a)、图1的(b)及图1的(c)是用于说明可在本发明的实施方式的反应处理装置中使用的反应处理容器10的图。图1的(a)是反应处理容器10的俯视图，图1的(b)是反应处理容器10的主视图，图1的(c)是反应处理容器10的仰视图。图2是反应处理容器10所包括的基板14的俯视图。

在图3中，示出用于说明反应处理容器10的概念性的剖视图。反应处理容器10由如下构件构成：树脂性的基板14，其在下表面14a上形成有槽状的流路12；流路密封膜16，其被粘贴在基板14的下表面14a上用于密封流路12；第一密封膜18，其同样被粘贴于基板14的下表面14a上用于密封第一空气连通口24及第二空气连通口26；以及第二密封膜20，其被粘贴在基板14的上表面14b上用于密封第一样品导入口45及第二样品导入口46。图3是说明它们相对于基板14如何配置的图。

基板14优选由相对于温度变化较为稳定且不易被使用的样品溶液侵蚀的材质形成。进而，基板14优选由成形性好，透明性及阻隔性良好，且具有较低的自身荧光性的材质形成。作为这样的材质，除玻璃、硅(Si)等无机材料外，还有丙烯酸、聚丙烯、硅酮等树脂，其中，优选环烯烃聚合物树脂(COP)。基板14的尺寸的一个例子为长边76mm、短边26mm、厚度3mm。

在基板14的下表面14a，形成有槽状的流路12。在反应处理容器10中，流路12的大部分被形成为在基板14的下表面14a露出的槽状。其原因在于，能够通过使用了模具等的射出成型而使其容易地成形。为了密封该槽并将其作为流路来利用，在基板14的下表面14a上，粘贴有流路密封膜16。槽的截面形状并不被特别地限定，也可以为矩形状或“U”字形状(圆形状)。此外，为了使成形时的脱模性良好，也可以具备从下表面14a起沿深度方向锥状地变窄的形状，例如也可以是台形状。流路12的尺寸的一例最大为宽度0.7mm、深度0.7mm。

关于流路密封膜16，既可以是一个主表面具备粘接性，也可以是在一个主表面上形成有通过按压或紫外线等能量照射、加热等来发挥粘接性或粘附性的功能层，且该流路密封膜16具备如下功能：能够容易地与基板14的下表面14a紧密接触从而与其一体化。流路密封膜16优选由也含有粘接剂并具有较低的自身荧光性的材质形成。虽然在这一点上，由环烯聚合物、聚酯、聚丙烯、聚乙烯或丙烯酸等树脂构成的透明膜较为适合，但是不被限定于此。此外，流路密封膜16也可以由板状的玻璃或树脂形成。因为在该情况下，能够期待其刚性，所以有助于防止反应处理容器10的弯曲或变形。

在基板14上形成有与流路12的一端12a连通的第一空气连通口24。同样地，形成有与流路12的另一端12b连通的第二空气连通口26。一对第一空气连通口24及第二空气连通口26被以露出于基板14的下表面14a的方式形成。即，一对第一空气连通口24及第二空气连通口26露出的面与形成有流路12的面相同。

在基板14中的第一空气连通口24与流路12的一端12a之间，设置有第一过滤器28。在基板14中的第二空气连通口26与流路12的另一端12b之间，设置有第二过滤器30。被设置在流路12的两端的一对第一过滤器28及第二过滤器30除了低杂质特性良好以外，还可以仅使空气通过，从而可防止污染物，使得不会因PCR而妨碍目的DNA的扩增及其检测，或是不使目的DNA的品质劣化。作为过滤器材料，作为一例，能够使用将聚乙烯进行防水处理后得到的材料，但只要具备上述功能，就可以从公知的材料中进行选择。第一过滤器28及第二过滤器30的尺寸被形成为无间隙地收容于被形成于基板14的过滤器设置空间那样的尺寸，例如可以是直径4mm、厚度2mm。

此外，流路12在紧挨第二过滤器之前成为2个系统。存在蒸发后的样品的一部分成为液滴而附着于流路内部的情况，尤其是，在预定维持比较高的温度的第二过滤器30附近，附着的液滴有可能妨碍样品的送液，为了对其进行补偿，而形成2个系统。

流路12在一对第一空气连通口24及第二空气连通口26之间，包括能够利用后述的反应处理装置来控制多个级别的温度的反应区域。通过使样品在维持了多个级别的温度的反应区域中连续往复地移动，从而能够向样品提供热循环。

在后述的反应处理装置搭载有反应处理容器10时，流路12的反应区域包含被维持在比较高的温度(约95℃)的反应区域(以下，称为“高温区域36”)、以及被维持在比高温区域36更低的温度(约62℃)的反应区域(以下，称为“中温区域38”)。高温区域36位于流路12中的纸面右侧，其一端经由第二过滤器30、以及第二过滤器30与第二空气连通口26的连接流路261而与第二空气连通口26连通，另一端经由连接流路40而与中温区域38连通。中温区域38位于流路12中的纸面中央，其一端经由连接流路40而与高温区域36连通，另一端经由连接区域41而与后述的低温区域34连通。

高温区域36及中温区域38分别包含组合曲线部与直线部而成的连续折返的蛇行状的流路。在像这样设为蛇行状的流路的情况下，会存在如下这样的优点：能够有效地使用构成后述的温度控制部件的加热器等的有限的有效面积，易于减少反应区域内的温度的波动，并且能够减小反应处理容器的实体的大小，能够有助于对反应处理装置的小型化。另一方面，连接流路40可为直线状的流路。

流路12还包含被维持在比中温区域38更低的温度的区域(以下，称为“低温区域34”)。在低温区域中，可以控制为维持在比中温区域低的温度，也可以不特别地进行控制。低温区域34位于流路12的纸面左侧，其一端经由第一过滤器28、以及第一空气连通口24与第一过滤器28间的连接流路241而与第一空气连通口24连通，另一端经由连接区域41而与中温区域38连通。

低温区域34用于进行提取预定量的样品的所谓分注。低温区域34包括：分注流路42，其用于规定预定量的样品；2个支流路(第一支流路43及第二支流路44)，其从分注流路42分岔；第一样品导入口45，其被配置在第一支流路43的端部；以及第二样品导入口46，其被配置在第二支流路44的端部。第一样品导入口45经由第一支流路43而与分注流路42连通。第二样品导入口46经由第二支流路44而与分注流路42连通。为了以最小限度的面积来分注预定量的样品，分注流路42被设为蛇行状的流路。第一样品导入口45及第二样品导入口46被形成为露出于基板14的上表面14b。即，第一样品导入口45及第二样品导入口46露出的面是形成有流路12的面的相反侧的面。在以第一支流路43从分注流路42分岔的分岔点为第一分岔点431，以第二支流路44从分注流路42分岔的分岔点为第二分岔点441时，被供给到PCR的样品的体积大致由第一分岔点431与第二分岔点441之间的分注流路42内的体积来决定。

如上所述，第一过滤器28、以及第二过滤器30在基板14的下表面14a露出。因为在基板14的下表面14a上形成有流路12，所以也可以是，用于密封流路12的流路密封膜16具有如图1的(c)中所示的也会同时密封第一过滤器28、第二过滤器30那样的外形。角部也可以为带有圆度的形状，使得其难以剥落。在该实施方式中，作为流路密封膜16，使用株式会社3M公司制的聚丙烯膜9795。

此外，虽然第一空气连通口24、第二空气连通口26也露出于基板14的下表面14a，但是为了密封它们，如图1的(c)中所示，使用与流路密封膜16分体的第一密封膜18。

进而，为了密封第一样品导入口45、第二样品导入口46、以及连接流路241及261，如图1的(a)中所示，在基板14的上表面14b粘贴有第二密封膜20。在除了流路密封膜16以外，还粘贴有第一密封膜18及第二密封膜20的状态下，全流路成为闭空间。

在本实施方式的反应处理装置100中，仅在第一空气连通口24连接有作为送液部件的加压式泵(后述)，第二空气连通口26被开放在大气压中。加压式泵与第一空气连通口24的连接、以及第二空气连通口26的开放以如下方式进行：剥去与它们对应的部分的第一密封膜18而使第一空气连通口24及第二空气连通口26露出。也可以是，在第一密封膜18，形成没有粘接性的标签181，以能够在剥离时易用手指抓持且容易剥离地进行操作。此外，也可以是，它们的连通口的开放通过以针等在第一密封膜18的第一空气连通口24及第二空气连通口26的相应位置穿孔来进行。此时，第一密封膜18优选由针的穿孔较为容易的材质及厚度构成的膜。此外，反过来，也可以将第二空气连通口26与加压式泵连接，将第一空气连通口24开放在大气压中。

从第一样品导入口45及第二样品导入口46通过的样品向反应处理容器10内的导入以在第二密封膜20的连接流路241及261不会露出的范围内，仅将第一样品导入口45及第二样品导入口46的相应部分暂时从基板14剥离的方式进行，在导入预定量的样品后，将第二密封膜20再次粘回到基板14的上表面14b。因此，作为第二密封膜20，优选具备针对多次循环的粘贴/剥离较为耐久那样的粘接性的膜。此外，第二密封膜20也可以为在样品导入后粘上新的膜的方案，在该情况下，与反复的粘贴/剥离相关的特性的重要性可被缓和。

也可以是，第一密封膜18及第二密封膜20与流路密封膜16同样，在一个主表面形成有粘接剂层，或是形成有通过按压而发挥粘接性或粘附性的功能层。虽然在这一点上，由环烯烃聚合物、聚酯、聚丙烯、聚乙烯或丙烯等树脂构成的透明膜较为适合，但是不被限定于此。此外，虽然如上所述，优选即使通过多次粘贴/剥离，也不会劣化到其粘接性等特性给使用带来影响的程度，但是在为进行剥离并导入样品等后，粘上新的膜的方式的情况下，与该粘贴/剥下相关的特性的重要性可被缓和。在本实施方式中，使用了株式会社3M公司制的聚丙烯膜9793等作为第一密封膜18及第二密封膜20。

接着，对如以上那样构成的反应处理容器10的使用方法进行说明。首先，准备出应利用热循环来扩增的样品。作为样品，例如可举出在一种或两种以上的包含DNA的混合物中，作为PCR试剂而添加了荧光探针、耐热酶及4种脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的样品。进而，将会发生特异性反应的引物混合到反应处理对象的DNA中。也能够使用市面上销售的实时PCR用试剂套装等。

接着，在第二密封膜20中，在连接流路241及261不会露出的范围内，仅将第一样品导入口45及第二样品导入口46的相应部分从基板14剥离，使第一样品导入口45及第二样品导入口46露出并开放。

也可以是，在第二密封膜20，形成无粘接性的标签201，以能够在剥离时易以手指抓持且容易剥离地进行操作。操作人抓住标签201，例如将第二密封膜20剥到图1的(a)所示的虚线(A)处为止。

接着，以移液器(ピペッター)、滴定管或针筒等将样品导入到样品导入口。图4示意性地表示样品50被导入到反应处理容器10内的情况。在图4中，为了说明被导入的样品50与反应处理容器10的关系，省略了膜等的记载。样品50被从第一样品导入口45及第二样品导入口46中的任意一者导入到分注流路42。导入的方法不限于此，例如可以用移液管或滴定管直接导入适量的样品50。在从任意一个样品导入口导入的样品中，超过支流路的体积而剩余的样品会积蓄在另一个样品导入口。因此，出于将样品导入口部分作为一种容器来利用的目的，也可以将其制作成具有一个固定空间。如后所述，通过从第一空气连通口24加压，被填充在第一分岔点431及第二分岔点441间的分注流路42的样品50会被供给到PCR。如此，反应处理容器10的低温区域34会起到提取预定量的样品的分注功能。

接着，将第二密封膜20再贴回到基板14上，并对第一样品导入口45及第二样品导入口46进行密封。因为密封后不再需要，所以也可以预先切去标签201。也可以是，不粘贴剥下来的第二密封膜20，而是贴上新的第二密封膜20。以上，样品50向反应处理容器10的导入完成。

上述反应处理容器中的分注功能并不妨碍以移液器一边精密地对样品进行分注一边将其导入。在该情况下，因为是预先被分注的，所以从任意一个样品导入口导入的样品的前端也可以不到达另一个样品导入口侧的分岔点。

图5是用于说明本发明的实施方式的反应处理装置100的示意图。因为在上面说明的反应处理容器10的形态中，流路12和第一空气连通口24、第二空气连通口26存在于反应处理容器10的表面14a，所以实际上，流路12与来自送液系统120的连接部分被配置在基板14的同侧，在此，需要注意的是以下的点：为了使附图易于理解以进行说明，概念性地、容易理解地表示出了流路12与来自送液系统120的连接部分被记载为特意被配置在基板14的不同侧的情况、以及各温度区域存在于一对空气连通口之间的情况。

本实施方式的反应处理装置100包括：容器设置部(未图示)，其设置有反应处理容器10；温度控制系统102；以及CPU105。温度控制系统102如图5所示，被构成为：针对被设置于容器设置部的反应处理容器10，能够将反应处理容器10的流路12中的高温区域36高精度地维持、控制在约95℃，将中温区域38维持、控制在约62℃，将低温区域34维持、控制在约30℃～40℃。

温度控制系统102调节热循环区域的各温度区域的温度，具体而言，包括：高温用加热器104，其用于加热流路12的高温区域36；中温用加热器106，其用于加热流路12的中温区域38；低温用加热器112，其用于加热流路12的低温区域34；例如热电偶等温度传感器(未图示)，其用于测量各温度区域的实际温度；高温用加热器驱动器108，其控制高温用加热器104的温度；中温用加热器驱动器110，其控制中温用加热器106的温度；以及低温用加热器驱动器114，其控制低温用加热器112的温度。利用温度传感器测量的实际温度信息被发送到CPU105。CPU105基于各温度区域的实际温度信息来控制各加热器驱动器，使得各加热器的温度成为预定的温度。各加热器例如可以为电阻加热元件或珀耳帖元件等。也可以是，温度控制系统102进一步包括用于提高各温度区域的温度控制性的其它组件。

本实施方式的反应处理装置100进一步包括送液系统120，该送液系统120进行空气的喷出及吸引，以使样品50在反应处理容器10的流路12内移动及停止。

图6是用于说明送液系统120的构成的概略图。送液系统120包括腔室125；第一泵122；第二泵124；第一泵驱动器126，其用于驱动第一泵122；第二泵驱动器128，其用于驱动第二泵124；以及管130。第一泵驱动器126及第二泵驱动器128由CPU105控制。

腔室125具有：内部空间125a，其具有固定的体积；以及第一空气口125b及第二空气口125c，其使内部空间125a与外部连通。在腔室125的内部空间125a，配置有第一泵122及第二泵124。第一泵122及第二泵124例如可以为由隔膜泵构成的微型增压泵。作为第一泵122、第二泵124，例如可使用株式会社村田制作所制的微型增压泵(型号MZB1001T02)等。第一泵122被配置为：从喷出口122a喷出的空气会从腔室125的第一空气口125b喷出。第二泵124被配置为：从喷出口124a喷出的空气会从腔室125的第二空气口125c喷出。

腔室125的第一空气口125b经由管130而与反应处理容器10的一对空气连通口中距高温区域36较远的空气连通口即第一空气连通口24连通。另一方面，腔室125的第二空气口125c被开放在大气压中。在这样的连接状态下，CPU105经由第一泵驱动器126及第二泵驱动器128进行控制，使得第一泵122与第二泵124交替进行空气的喷出动作。在进行第一泵122的喷出动作并停止第二泵124时，管130内会成为正压，从管130向反应处理容器10的第一空气连通口24喷出空气。另一方面，因在停止第一泵122并进行第二泵124的喷出动作时，空气会被从腔室125第二空气口125c喷出，故腔室125的内部空间125a会成为负压，因此，管130内也会成为负压，空气会被从反应处理容器10的第一空气连通口24吸引到管130。通过利用管130进行的空气的喷出或吸引，能够使样品50在流路内往复式地移动，并使其反复暴露在反应处理容器10的流路12的各温度区域中，结果，能够向样品50提供热循环。更具体而言，通过在高温区域36中反复提供变性，在中温区域38中反复提供退火、延伸的各工序，从而使样品50中的目标DNA选择性地扩增。换言之，高温区域36可视为变性温度域，中温区域38可视为退火、延伸温度域。此外，滞留在各温度区域中的时间能够通过改变样品50在各温度区域的预定位置停止的时间来适当设定。

本实施方式的反应处理装置100进一步包括荧光检测器140。如上所述，在样品50中，添加了预定的荧光探针。因为伴随DNA扩增的进展，从样品50发出的荧光信号的强度会増加，所以能够将该荧光信号的强度值当作作为PCR的进展或反应的终端的判定材料的指标。

作为荧光检测器140，能够使用日本板硝子株式会社制的光纤型荧光检测器FLE－510，该检测器是一种非常紧凑的光学系统，能够迅速地进行测定，且无论明亮的场所还是阴暗的场所，都能够对荧光进行检测。该光纤型荧光检测器能够预先进行调谐，使得其激发光/荧光的波长特性与样品50所发出的荧光特性相适，并能够针对具有各种特性的样品来提供最优的光学系统及检测系统，进而，因为由光纤型荧光检测器带来的光线的直径较小，所以适于检测来自存在于流路等较小的或较细的区域的样品的荧光，响应速度也较为优异。

光纤型的荧光检测器140包括：光学头142；荧光检测器驱动器144；以及光纤146，其连接光学头142与荧光检测器驱动器144。在荧光检测器驱动器144中，包含激发光用光源(LED或被调整为会射出激光及其它特定波长的光源)、光纤型波分复用器及光电转换元件(PD、APD或光电倍增器等光检测器)(均未图示)等，并且该荧光检测器驱动器144由用于控制它们的驱动器等构成。光学头142由透镜等光学系统构成，并承担激发光向样品的指向性照射，以及从样品所发出的荧光的聚光的功能。被聚集的荧光通过光纤146而被荧光检测器驱动器144内的光纤型波分复用器与激发光分开，并由光电转换元件转换为电信号。

在本实施方式的反应处理装置100中，光学头142被配置为：能够检测到来自连接高温区域36与中温区域38的流路内的样品50的荧光。因为样品50在流路内反复往复移动会导致反应发生进展，样品50所包含的预定的DNA会扩增，所以能够通过监视检测出的荧光的量的变动来实时地获知DNA的扩增的进度。此外，在本实施方式的反应处理装置100中，如后述那样，会利用来自荧光检测器140的输出值，并将其活用于样品50的移动控制中。只要荧光检测器可发挥对来自样品的荧光进行检测的功能，就不被限定于光纤型荧光检测器。

参照图5，针对利用反应处理装置100来向样品50提供热循环的动作进行说明。将填充有样品50的反应处理容器10设置于反应处理装置100中，将反应处理容器10的第一空气连通口24经由管130而连接于腔室125的第一空气口125b，将反应处理容器10的第二空气连通口26开放在大气压中。然后，通过仅使第一泵122动作，从而使管130内成为正压，并使低温区域34内的样品5移动到中温区域38或高温区域36。在使样品50从高温区域36向中温区域38移动时，仅使第二泵124动作。由此，因为管130内会成为负压，所以样品50会从高温区域36向中温区域38移动。另一方面，在使样品50从中温区域38向高温区域36移动时，仅使第一泵122动作。由此，因为管130内会成为正压，所以样品50会从中温区域38向高温区域36移动。然后，通过使第一泵122与第二泵124交替动作，从而使样品50在高温区域36与中温区域38之间连续地往复移动，能够对样品50提供热循环。

图7是表示向反应处理容器10的流路内的样品提供热循环的情况的图。在图7所示的反应处理容器10中，被填充在低温区域34的第一分岔点431及第二分岔点441间的分注流路42的样品50在高温区域36与中温区域38之间移动。

如以上说明的那样，在本实施方式的反应处理装置100中，仅在距高温区域36较远的第一空气连通口24经由管130连接有送液系统120，接近高温区域36的第二空气连通口26则开放在大气压中。PCR中的污染中，被扩增的一部分的DNA片段以悬浮微粒等形态漂浮或附着在管130内的空气中，其被认为是因混入到反应处理容器10内的样品中而产生的。DNA片段的悬浮微粒被认为多于混杂有DNA片段的液体气化时产生。关于气化现象，当然样品(溶液)的蒸气压越高越容易发生，因此，通过开放比较容易发生气化现象的高温区域36侧的空气连通口(即接近高温区域36的第二空气连通口26)，并使送液系统120仅与比较难以发生气化现象的中温区域38侧的空气连通口(即距高温区域36较远的第一空气连通口24)连通，从而DNA片段难以作为悬浮微粒而被带入到管130内，并能够防止或至少抑制污染。

为了确认如以上那样被构成的反应处理装置100的效果，利用本实施方式的反应处理装置100，进行了以PCR来扩增特定菌株的实验。供进行PCR的样品的调整如以下这样进行。在此，参考了大阪市水道局的主页所公开的文献“使用了基因检查法的大肠杆菌迅速测定法”(http://www.city.osaka.lg.jp/suido/cmsfiles/contents/0000245/245422/6_250227.pdf)所记载的内容。

(i)对于正向引物，使用5’-GTG TGA TAT CTA CCC GCT TCG C-3’(序列号1)；对于反向引物，使用5’-AGA ACG GTT TGT GGT TAA TCA GGA-3’(序列号2)，并选定5’-FAM-TCGGCA TCC GGT CAG TGG CAG T-MGB-3’(序列号3)作为TaqMan(注册商标)探针。此外，各引物的浓度(最终浓度)分别设为900nM(nM：纳摩尔/升)、900nM及250nM。

(ii)将在上述(i)中扩增的区域的模板DNA委托给合成DNA制造商，以1×10⁶Copies/μL的浓度来进行制作。接下来，制作成由10倍的稀释系列构成的标准检测体(1×10¹～1×10⁶Copies/μL)。

(iii)进而，按照说明书，将0.1U/μL的takara-bio株式会社制SpeedSTAR(注册商标)HS DNA Polymerase作为DNA聚合酶与附属于其的×10Fast buffer I、以及dNTP Mix混合并添加到试剂中。另外，[U/μL]中的“U”＝unit(单位)是酶活性量的单位，在最适条件下1分钟内能够转换1μmol(1×10^－6mol)的底物的酶的量被定义为1U，可粗略表示酶的量。

(iv)向该试剂24μL中添加在(ii)中制成的浓度不同的标准检测体1μL，从而将其制成样品。进而，准备出不添加标准检测体的试剂作为阴性对照(ネガコン)的样品。另外，所谓阴性对照，是指在效果的对照实验中，应以阴性为结果的对照(样品)，在该情况下，即使进行PCR，也会得到不含菌(阴性)这样的结果。与此相反的是阳性对照(ポジコン)，其对应于上述标准检测体，通过进行PCR来得到含菌(阳性)这样的结果。

在以如上述那样的方式制作出的样品中，将包含浓度为1×10⁶Copies/μL的检测体的样品作为阳性对照样品，与阴性对照样品交替进行了PCR扩增。以移液管将样品的15μL导入到上述反应处理容器10中。进而，因为在反应处理容器10中，设置有可进行分注的分注流路42，所以即使改变反应处理容器10，也能够降低因每次样品体积的差异而导致的结果的误判定。

被提供给热循环的样品在上述反应处理容器10中的高温区域36与中温区域38之间反复进行往复移动。热循环条件设为在被维持在62℃的中温区域38(退火、延伸区域)中保持样品10秒，在被维持在95℃的高温区域36(热变性区域)中保持样品3秒，并以此为1个循环反复进行。低温区域34的温度维持在30～40℃左右。

图8表示本实施方式的反应处理装置100所进行的PCR的扩增结果。在图8中，横轴为循环数(C)，纵轴为荧光信号强度(任意单位)。用上述反应处理装置100来测定由荧光检测器140检测的荧光信号相对于循环数的强度。当样品中的检测体扩增时，荧光信号的强度会増加。图8表示交替进行了阳性对照样品的PCR与阴性对照样品的PCR各3次的结果。如图8所示，可知阳性对照样品情况下的荧光信号强度从26个循环附近起急剧上升，阳性对照样品中的检测体不断扩增。另一方面，可知阴性对照样品情况下的荧光信号强度在进行了50个循环后也为大致一定(背景水平(background level))，且污染(carry-over)小到未产生或可忽略的程度。

图9也表示本实施方式的反应处理装置100所进行的PCR的扩增结果。在此，对包含初始浓度为1×10¹～1×10⁶Copies/μL(各隔10倍)的6个检测体的样品进行PCR。从图9可知，随着初始检测体浓度变高，荧光信号强度上升的循环数，即检测体的扩增开始的循环数会变少。

图10是表示初始检测体浓度为1×10¹～1×10⁶Copies/μL的6个检测体所对应的Ct值(阈值循环数)的表。在此，将Ct值定为各扩增曲线的平台期的10％。

图11表示绘制了图10所示的初始浓度与Ct值的关系的校准曲线。当根据图11求出校准曲线的斜率(S)时，其为－3.55。此外，当计算PCR效率(10^(－1/S)－1)时，其为91.2％，可知进行了良好的PCR。

接着，针对比较例进行说明。图12是用于说明比较例的反应处理装置200的图。该比较例的反应处理装置200中，送液系统220的构成与图5所示的反应处理装置100的送液系统120不同。送液系统220包括：第一泵222；第二泵224；第一泵驱动器226，其用于驱动第一泵222；第二泵驱动器228，其用于驱动第二泵224；第一管230；以及第二管232。

在送液系统220中，第一泵222及第二泵224不在腔室内，而是被配置在大气压中。并且，反应处理容器10的第一空气连通口24经由第一管230而与第一泵222的喷出口连通，反应处理容器10的第二空气连通口26经由第二管232而与第二泵224的喷出口连通。也可以是，在第一空气连通口24与第一管230的连接部及第二空气连通口26与第二管232的连接部，分别配置有用于确保气密性的垫片234、236或密封件。

在像这样被构成及配置的送液系统220中，当使第一泵222与第二泵224交替进行喷出动作时，能够使样品50在反应处理容器10的流路12内往复移动。

图13表示比较例的反应处理装置200所进行的PCR的扩增结果。在图13中，横轴为循环数(C)，纵轴为荧光信号强度(任意单位)。关于样品，在准备出与图8中说明的实验同样地调整得到的阳性对照和阴性对照之后，交替进行PCR各2次。根据图13所示的放大曲线可知，针对阳性对照，得到了与图8所示的扩增结果同样的结果，而针对阴性对照，荧光信号强度也会在30个循环以上开始上升。第一次的阴性对照和第二次的阴性对照的Ct值分别为41.89及41.41。关于该Ct值的等级，在图11所示的校准曲线中，检测体的初始浓度大致与1×10²Copies/μL对应，在比较例的反应处理装置200中，在检测体的初始浓度为1×10²Copies/μL以下时，会产生如下风险：分不清是实际即为阳性还是因污染而检测到的。

另一方面，在本发明的实施方式的反应处理装置100中，能够谋求防止这种污染，因此，例如即使为1×10¹Copies/μL等级或其以下的初始浓度，也能够定量。

从图8所示的扩增结果可知，在将送液系统120仅与反应处理容器10的第一空气连通口24连通的本实施方式的反应处理装置100中，在阴性对照中，未产生污染。另一方面，从图13所示的扩增结果可知，在将送液系统220与反应处理容器10的第一空气连通口24及第二空气连通口26连通的比较例的反应处理装置200中，在阴性对照中，产生了污染。因此，根据这些实验结果，关于PCR中的污染，在阳性对照中被扩增的DNA片段会作为悬浮微粒而漂浮在管内的空气中，这被认为是其混入到了反应处理容器10内的样品中的缘故。

此外，在本实施方式中，在反应处理容器10的流路12的两端，设置有过滤器。这些过滤器在防止或抑制污染上是有效的。尤其是，当考虑到DNA片段难以作为悬浮微粒而被带入到管130内时，优选至少在距高温区域36较远的流路的一端12a设置过滤器(即第一过滤器28)。

图14是用于说明反应处理装置的另一实施方式的图。图14所示的反应处理装置400是用于针对反应处理容器510进行热循环的装置，该反应处理容器510包括高温区域536、中温区域538及低温区域534这3个级别的反应区域。反应处理容器510在流路的两端具备第一空气连通口524及第二空气连通口526。

反应处理装置400包括2个荧光检测器(第一荧光检测器251及第二荧光检测器252)。第一荧光检测器251包括：第一光学头151，其用于对来自从反应处理容器510的流路的高温区域536与中温区域538之间的区域通过的样品50的荧光进行检测；第一荧光检测器驱动器152；以及第一光纤153，其连接第一光学头151与第一荧光检测器驱动器152。第二荧光检测器252包括：第二光学头154，其对来自从反应处理容器510的流路的中温区域538与低温区域534之间的区域通过的样品50的荧光进行检测；第二荧光检测器驱动器155；以及第二光纤156，其连接第二光学头154与第二荧光检测器驱动器155。

即使对于如图14所示的包括3个级别的反应区域的反应处理容器510，在距高温区域536较远一方的空气连通口即第一空气连通口524上经由管130而连接有送液系统120，作为接近高温区域536一方的空气连通口即第二空气连通口526开放在大气压中，由此也能够得到防止或抑制污染的效果。

在反应处理装置400中，热循环条件例如设为在被维持在95℃的高温区域536中将样品50保持3秒，在被维持在55℃的低温区域534中将样品50保持10秒，在被维持在70℃的中温区域538中将样品50保持10秒，并以此为1个循环反复进行。在3个级别的反应区域中进行PCR的情况下，从样品50的调整的容易性及添加剂的选择范围的扩大等观点出发是有利的。进而，也可以是，为了聚合酶的活性化，在开始热循环前，在高温区域536中将样品50保持2分钟左右。

以上，基于实施方式，对本发明进行了说明。本领域技术人员应理解的是，本实施方式仅为例示，在它们的各构成要素及各处理过程的组合中能够存在各种变形例，并且那样的变形例也在本发明的范围之内。

[附图标记说明]

10、510反应处理容器、12流路、14基板、16流路密封膜、18第一密封膜、20第二密封膜、24、524第一空气连通口、26、526第二空气连通口、28第一过滤器、30第二过滤器、34、534低温区域、36、536高温区域、38、538中温区域、40、41连接区域、42分注流路、43第一支流路、44第二支流路、45第一样品导入口、46第二样品导入口、50样品、100、200、400反应处理装置、102温度控制系统、104高温用加热器、105CPU、106中温用加热器、108高温用加热器驱动器、110中温用加热器驱动器、112低温用加热器、114低温用加热器驱动器、120、220送液系统、122、222第一泵、124、224第二泵、125腔室、125a内部空间、125b第一空气口、125c第二空气口、126、226第一泵驱动器、128、228第二泵驱动器、130、230、232管、136、234、236垫片、140荧光检测器、142光学头、144荧光检测器驱动器、146光纤、151第一光学头、152第一荧光检测器驱动器、153第一光纤、154第二光学头、155第二荧光检测器驱动器、156第二光纤、181、201标签、241、261连接流路、251第一荧光检测器、252第二荧光检测器、431第一分岔点、441第二分岔点。

[工业可利用性]

本发明可用于聚合酶链式反应(PCR)。

[序列表自由文本]

序列号1：正向PCR引物

序列号2：反向PCR引物

序列号3：探针

[序列表]NSG-70055WO序列表.txt

序列表

<110> 日本板硝子株式会社(NIPPON SHEET GLASS COMPANY, LIMITED)

<120> 反应处理装置(REACTION TREATMENT DEVICE)

<130> P0013463WO01

<150> JP 2017-123604

<151> 2017-06-23

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 正向PCR引物(Forward PCR Primer)

<400> 1

gtgtgatatc tacccgcttc gc 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向PCR引物(Reverse PCR Primer)

<400> 2

agaacggttt gtggttaatc agga 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TaqMan(R)探针(TaqMan(R) Probe)

<400> 3

tcggcatccg gtcagtggca gt 22