阅读说明：本技术 核酸扩增方法和核酸分析用装置 (Nucleic acid amplification method and foranalysis of nucleic acids device ) 是由 横井崇秀 植松千宗 板桥直志 于 2017-04-05 设计创作，主要内容包括：提供一种用于在基板上规则地配置、无扩增偏倚地形成扩增核酸片段簇的方法和装置。本发明涉及的方法中,在具有具备亲水性的多个第一表面、和围绕各个前述多个第一表面且亲水性比前述第一表面低的第二表面的基板上,形成封入有作为模板的核酸的液滴,在基板上的液滴内进行核酸扩增反应后,将液滴除去,进一步在基板上进行核酸扩增反应。(A kind of method and apparatus for regularly configuring on substrate, forming amplification of nucleic acid segment cluster in bias without amplification are provided.In method of the present invention, have hydrophilic multiple first surfaces on the substrate of each aforesaid plurality of first surface and the hydrophily second surface lower than said first surface, form the drop for being sealed with the nucleic acid as template, after carrying out nucleic acid amplification reaction in drop on substrate, drop is removed, nucleic acid amplification reaction is further carried out on substrate.)

核酸扩增方法和核酸分析用装置

技术领域

本发明涉及基板上的核酸扩增方法和核酸分析用装置。

背景技术

专利文献1中，作为基板上的核酸扩增方法，记载了可以包括下述步骤的制作生物分子的图形化表面的方法：(a)准备试剂的步骤，该试剂包括(i)在表面不连续、具有被表面的间隔区域分隔的特定点的阵列、以及(ii)含有多种不同的目标生物分子的溶液；以及(b)使试剂反应，将生物分子输送至特定点，使各个生物分子分别附着于各个特定点的步骤，该步骤中对间隔区域施加电场，从间隔区域获取生物分子。

专利文献2中记载了作为将核酸等物质封入于基板上的方法而使用容纳部13的底面为亲水性且侧壁12的上表面为疏水性的阵列。因此，在珠子导入工序中使用亲水性的第一溶剂20的情况下，能够更有效地将含有珠子21、21’的第一溶剂20导入容纳部13中，进一步，能够防止珠子容纳工序中使用的疏水性的第二溶剂30进入容纳部13，因而能够使容纳部13内的亲水性的第一溶剂20被疏水性的第二溶剂30被覆而密闭，形成液滴(Droplet)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2013/188582号

专利文献2：国际公开WO2016/006208号

发明内容

发明所要解决的课题

并列型测序仪中，为了提高分析的容易性，需要形成在基板上规则地配置、单一分子来源的扩增核酸片段簇的技术。

专利文献1中，记载了形成在基板上规则地配置、单一分子来源的扩增核酸片段簇的技术。可是，多个模板的扩增反应是在没有隔离的溶液内进行的，因此存在下述问题：由于模板DNA在基板上附着的速度的差异，先前有助于形成簇的DNA分子在周边基板上成为进一步形成簇的模板，产生扩增偏倚。因此，需要在基板上使各模板在隔离的液体中扩增的技术。

另一方面，专利文献2中记载了在基板上规则地配置、将核酸等物质按照液滴进行隔离的技术。可是，没有实现基板上的扩增核酸片段簇的形成，因此必须用另外的装置将形成的扩增核酸片段簇配置在基板上。

本发明的目的在于，提供在基板上规则地配置、无扩增偏倚地形成扩增核酸片段簇的技术。

用于解决课题的方法

为了解决上述课题，本发明提供一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：

准备基板的工序，前述基板具有以任意的规则性配置的有亲水性的多个第一表面、和围绕各个前述多个第一表面且亲水性比前述第一表面低的第二表面，在前述第一表面固定或配置有与作为模板的核酸特异性结合的分子，

在前述基板上供应含有前述作为模板的核酸的试样溶液与含有核酸扩增底物和核酸合成酶的反应溶液的混合溶液，在前述第一表面上配置前述混合溶液，前述作为模板的核酸结合在与前述作为模板的核酸特异性结合的分子上的工序，

在前述基板上供应疏水性溶剂，形成封入有配置在前述第一表面上的前述混合溶液的液滴的工序，

在前述液滴内进行前述核酸的扩增反应的工序，

从前述基板上将前述疏水性溶剂除去的工序，

在前述基板上供应含有核酸扩增底物和核酸合成酶的反应溶液的工序，以及

进行前述核酸的扩增反应的工序。

此外，为了解决上述课题，本发明还提供一种核酸分析用装置，其特征在于，具备进行核酸扩增反应的反应容器、容纳含有作为模板的核酸的试样溶液的试样溶液槽、容纳疏水性溶剂的疏水性溶剂槽、以及容纳至少含有核酸扩增底物的反应溶液的反应溶液槽，前述反应容器中设有能够与前述试样溶液槽、前述疏水性溶剂槽和前述反应溶液槽连接的第一开口部和第二开口部，在前述反应容器内的上表面或者底面中的任一者设有基板，前述基板具有具备亲水性的多个第一表面、和围绕各个前述多个第一表面且亲水性比前述第一表面低的第二表面，在前述第一表面固定或配置有与作为模板的核酸特异性结合的分子。

发明的效果

根据本发明，能够在基板上规则地配置、无扩增偏倚地形成扩增核酸片段簇。因此，能够实现并列型测序仪中有效且高精度的核酸扩增和之后的核酸分析。

附图说明

图1为实施例1的核酸分析用装置的构成图。

图2A中，(a)为示出实施例1的具有亲水性图形区域的基板的例子的图。(b)为示出实施例1的具有亲水性图形区域的基板的例子的横截面的图。

图2B为示出实施例1的核酸分析用装置中亲水性图形区域的

具体实施方式

的图。

图3示出实施例1的核酸扩增方法的各工序的概要图。

图4示出实施例2的核酸扩增方法的各工序的概要图。

图5示出实施例1或2的核酸扩增方法的结果的概念图。

图6示出实施例3的核酸扩增方法的各工序的概要图。

图7示出实施例3的核酸扩增方法的结果的概念图。

图8示出实施例4的核酸扩增方法的各工序的概要图。

图9为实施例5中的核酸分析用装置的构成图。

图10示出实施例5的核酸扩增方法的各工序的概要图。

图11示出实施例5的核酸扩增方法的流程图。

图12示出实施例5的核酸扩增方法的流程图。

图13为进行实施例6中的DNA测序的情况中的核酸分析用装置的构成图。

具体实施方式

以下，使用附图对实施例进行说明，但本发明不限定于这些实施例。

实施例1

图1为用于实施本实施例中的核酸扩增方法的核酸分析用装置的一个例子的构成图。作为进行核酸扩增反应的反应容器的流动池100在其底面设有基板102，前述基板102具有：以任意的规则性配置的有亲水性的多个第一表面，以及围绕各个前述多个第一表面且亲水性比第一表面低的第二表面。以下将第一表面称为亲水性图形区域101。其中，基板102也可以设于流动池100内的上表面。流动池100上具备第一开口部104和第二开口部105，可以通过第一开口部104和第二开口部105实现任意液体向流动池100内的供应和从流动池100的排出。将该液体流经的区域称为流动池溶液槽103。试样溶液槽106、疏水性溶剂槽107和反应溶液槽108通过各阀门110对第一开口部104进行连接。此外，排液槽109通过阀门110对第二开口部105进行连接。利用各阀门110的开闭，能够实现对流动池100内的液体供应和排出的控制。这里，试样溶液槽106所容纳的试样溶液是含有作为模板的核酸的溶液。作为模板的核酸可以为双链，也可以为单链，还可以为DNA或RNA、或者杂交核酸。反应溶液槽108所容纳的反应溶液例如是含有核酸合成酶、核酸扩增底物等的溶液。疏水性溶剂槽107所容纳的疏水性溶剂是在与试样溶液、反应溶液混合时分为2层的溶剂，优选在试样溶液、反应溶液中溶解性低，具有高排斥性。此外，基板102可以根据在流动池100的上表面或者下表面的设置形态的改变，来选择疏水性溶剂相对于试样溶液和反应溶液的比重。例如可以使用脂肪族烃(烷烃、环烷烃、角鲨烯等)、芳香族烃(苯、甲苯等)、硅油、石蜡油、氟利昂液体(Fluorinert FC-40等)等。

其中，也可以根据向流动池100供应的液体的种类，增加所连接的开口部或增加连接于开口部的液槽。此外，通过在第一开口部104和第二开口部105中的至少一方或两方设置泵112，能够实现利用加压或减压向流动池溶液槽103内的溶液供应和排出。此外，可以是：流动池溶液槽103设为能够调节至适合于核酸扩增反应和后续的碱基序列分析等酶反应的目标温度，关于温度调节机构，虽然图中未示出，但在流动池100中具备，或者在流动池100之外另外具备。此外，试样溶液槽106、疏水性溶剂槽107、反应溶液槽108和排液槽109可以分别具备图中未示出的与流动池溶液槽103不同的温度调节机构，可以调节至与流动池溶液槽103不同的任意温度。此外，试样溶液槽106和反应溶液槽108可以根据核酸扩增反应的特性所要求的事项诸如希望在即将使用之前混合的试剂的隔离等，来增加其数量。此外，本发明涉及的核酸分析用装置能够对基板102上进行观察(优选能够在光学上进行观察)，虽然图中没有示出，但可以具备能够对前述流动池内的前述基板上进行观察的观察部。此外，即使流动池100上下反转，也能够进行核酸扩增反应。

图2A为具有亲水性图形区域101的基板102的构成例。图2A的(a)是以各中心间的距离为1.2μm的方式配置直径0.8μm的多个亲水性图形区域101的基板的例子，本构成的亲水性图形区域101的密度为约80万个/mm²。使用并列型测序仪的情况下，通过高密度配置核酸扩增片段簇来实现碱基序列分析通量的提高，因此亲水性图形区域101的直径优选为0.5～2.0μm左右，亲水性图形区域101的密度优选为约20万个/mm²以上。优选使亲水性图形区域规则地配置，由此，碱基序列分析的通量进一步提高，此外，观察、图像处理变得容易。

图2A的(b)为从(a)的具有亲水性图形区域101的基板的横截面进行观察的例子。基板102的下层基板201是亲水性的，下层基板201上存在亲水性比下层基板201低的分隔壁202，由此，在基板上形成并列的亲水性图形区域101。图示的例子中，基板102呈亲水性图形区域101的直径0.8μm、分隔壁202的高度0.8μm的凹状结构。该凹状结构的最底面是亲水性图形区域101(第一表面)。在液滴形成的容易性、高密度配置方面，这样的构成是优选的。其中，亲水性图形区域101的形状没有限定，可以为圆形、椭圆形、四边形等。此外，分隔壁202的侧面可以是亲水性的，也可以是疏水性的。

图2B示出核酸分析用装置中的亲水性图形区域的一个实施方式。基板上(优选第一表面)固定有用于固定模板核酸的分子203。一个实施方式中，在基板上的亲水性图形区域101，固定或者配置有与作为核酸扩增用引物的模板核酸特异性结合的分子203(即与模板核酸的一部分具有互补性的寡核苷酸)。例如，可以在亲水性图形区域101上固定有寡核苷酸、或者在亲水性图形区域101上预先配置含有寡核苷酸的水凝胶。这里，与模板核酸特异性结合的分子根据模板核酸的种类和序列的不同而不同，本领域技术人员可以按照惯例进行设计。另一实施方式中，可以是：在亲水性图形区域101固定有与核酸扩增用引物结合的官能团203，在试样溶液310和/或反应溶液330中加入核酸扩增用引物，供应试样溶液310或者反应溶液330后，通过该官能团在基板上配置或者固定核酸扩增引物。作为这样的官能团，可以利用例如亲和素-生物素键、APTES-氨基键。

关于本实施例中的基板上核酸扩增方法的各工序，使用图3所示流动池100的侧向截面图进行说明。其中，图3示出试样溶液310为含有模板核酸的反应溶液(即含有核酸合成酶、引物和底物)的实施方式。

本发明中，作为模板的核酸只要是希望扩增的核酸即可，没有特别限定，例如包括信使RNA(mRNA)、非编码RNA(ncRNA)、微小RNA(microRNA)、基因组DNA、以及它们的片段、DNA与RNA的杂交核酸等，可以为单链，也可以为双链。第二代测序仪(NGS)中，在确定核酸的碱基序列时，优选读取具有多样性且均匀的序列簇。因此，通过以上述那样的核酸为模板，在规则地配置的多个亲水性表面各导入1分子后，在使各亲水性表面隔离的条件下进行扩增反应，能够减少扩增反应和序列分析阶段中的偏倚的产生。

图3(a)：准备容纳有试样溶液310的试样溶液槽106、容纳有疏水性溶剂320的疏水性溶剂槽107、容纳有反应溶液330的反应溶液槽108、排液槽109。试样溶液310以在亲水性图形区域101上形成的液滴内作为模板的核酸成为单一分子的方式预先调整了浓度。反应中使用的核酸合成酶可以为滚环扩增方法(RCA)中使用的链置换型核酸合成酶，也可以为聚合酶链反应(PCR)中使用的耐热性核酸合成酶，本领域技术人员可以根据给定的作为模板的核酸的扩增方法自由选择。例如，模板核酸为RNA的情况下，最开始可以使用互补链合成酶。此外，在基板上(优选第一表面)固定或者配置有与作为核酸扩增用引物的模板核酸特异性结合的分子。

图3(b)：试样溶液槽106内所容纳的试样溶液310通过第一开口部104从试样溶液槽106供应至流动池溶液槽103。

图3(c)：疏水性溶剂槽107所容纳的疏水性溶剂320通过第一开口部104供应至流动池溶液槽103，剩余的试样溶液310通过第二开口部105排出至排液槽109，从而进行流动池溶液槽103内的溶液替换。通过该溶液替换，试样溶液310残留于配置在基板102上的多个亲水性图形区域101，在基板102上形成被疏水性溶剂320和分隔壁202隔离的液滴305。通过以这种方式隔离在液滴内，能够防止封入液滴内的作为模板的核酸的扩散导致的污染，此外防止量少的试样溶液的蒸发。

图3(d)：液滴305中包含试样溶液310所含的模板核酸和反应溶液。因此，通过在液滴305被供应至流动池溶液槽103的疏水性溶剂320隔离的状态下，利用温度调节功能对流动池溶液槽103进行加温，液滴305内的核酸扩增反应得以进行。核酸扩增反应优选为滚环扩增方法(RCA)或者聚合酶链反应(PCR)。

本发明中，试样溶液310所含的作为模板的核酸的浓度设为在基板上形成封入有1分子以下作为模板的核酸的液滴的浓度、即期待每个液滴为1分子的浓度。因此，含有作为模板的核酸的试样溶液310优选稀释至该浓度。由此，正式核酸扩增工序后，带有扩增核酸片段308的亲水性图形区域与不带有扩增核酸片段308的亲水性图形区域共存。预先固定在亲水性图形区域101上的寡核苷酸、或者预先配置的含有寡核苷酸的水凝胶作为核酸扩增用引物进行利用，从而扩增核酸片段308与液滴305内的核酸扩增同时并行且固定在亲水性图形区域101上。其中，核酸扩增片段在基板上的固定方法不限定于上述方法，可以应用本技术领域中使用的各种方法。此外，液滴内的扩增核酸片段308只要至少一部分固定在亲水性图形区域101即可。

由此，可以在基板102上，使各模板在隔离的液滴305内进行扩增，因此能够实现在基板上规则地配置、无扩增偏倚地形成扩增核酸片段308的簇。

实施例2

本实施例中，作为提高基板上扩增核酸片段簇的核酸扩增量的技术，在图3记载的工序之后，实施图4记载的工序。即，在液滴内进行核酸的扩增反应后，在基板上供应至少含有扩增反应底物的反应溶液，进行核酸进一步的扩增反应。

图4(a)为在基板102上形成的液滴内进行核酸扩增反应的流动池100的侧向截面图，与图3(d)所示情形是同样的。

图4(b)：反应溶液槽108所容纳的反应溶液330通过第一开口部104供应至流动池溶液槽103内，疏水性溶剂320通过第二开口部105排出至排液槽109，从而进行流动池溶液槽103内的溶液替换。其中，可以在供应反应溶液330之前通过吸引等将疏水性溶剂320除去。此外，通过在将疏水性溶剂320除去后使基板102的表面干燥而使亲水性图形区域101上干燥后再进行反应溶液330的供应，能够实现有效的供应。由此，形成于亲水性图形区域101上的液滴305对扩增核酸片段308的隔离分别解除，反应溶液330供应至扩增核酸片段308。通过利用温度调节功能对流动池溶液槽103加温，在带有扩增核酸片段308的亲水性图形区域101中进行核酸扩增反应。通过以这种方式在由液滴305导致的隔离被解除的状态下进行核酸扩增反应，不仅获得基板102上液滴305内的核酸扩增反应，而且获得了更多拷贝数的单一分子来源的扩增核酸片段308的簇。此外，也可以将形成液滴的工序和在液滴内进行核酸的扩增反应的工序重复一次以上之后，将反应溶液330供应至基板102上，进行核酸进一步的扩增反应。

假定用图2A所示基板102进行图4(a)和图4(b)中的核酸扩增反应，对这种情况下扩增核酸片段的拷贝数进行说明。这里，核酸设为DNA(脱氧核糖核酸)。本实施例中，凹部(亲水性图形区域)的尺寸设为直径、深度均为0.8μm，其容积设为约0.4fL。反应中使用的核酸扩增底物(4种三磷酸脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP))的浓度设为各200μM，这种情况下，形成的液滴内存在的4种核酸扩增底物分别为5万分子左右。假定400碱基的DNA分子，其中4种核酸扩增底物均等地各含有100碱基，这种情况下，每扩增一分子DNA，4种核酸扩增底物分子各消耗100分子。图4(a)的DNA扩增反应中，如果假定全部核酸扩增底物分子完全在目标DNA的扩增中被消耗，则根据5万分子/100分子，上限是扩增500分子的DNA。不过，DNA扩增反应中核酸扩增底物浓度的降低、作为扩增反应的副产物生成的焦磷酸成为反应效率降低的重要原因，因此在DNA扩增中完全消耗给定的核酸扩增底物量基本上很困难。随后实施图4(b)的DNA扩增反应的情况下，由液滴导致的隔离被解除，在液滴内的核酸扩增中受到限制的核酸扩增底物重新供应至固定有单一分子来源的扩增核酸片段的亲水性图形区域101上，因此，能够进行进一步的核酸扩增反应，可获得1000～1万分子左右的扩增核酸片段拷贝数。

实施例3

本实施例中，减少了实施例1或2中不带有扩增核酸片段308的亲水性图形区域101，提高了带有核酸片段308的亲水性图形区域501的比例。如图5所示，关于带有从模板核酸扩增得到的核酸片段的亲水性图形区域501相对于扩增反应前的亲水性图形区域101的比例，由于导入的模板核酸以1分子/1液滴的方式稀释，因而根据概率分布(称为泊松分布)为30％左右。

关于本实施例中的基板上核酸扩增方法的各工序，使用图6进行说明。

图6(a)示出图4(a)的状态。带有单一分子来源的作为模板的核酸的亲水性图形区域上的液滴305的比例服从概率分布(称为泊松分布)，因此为30％左右。因此，实施图4(a)所示核酸扩增反应后，重复进行流动池100中图6(b)～(d)所示液滴305的形成和液滴305内的核酸扩增反应。

图6(b)：排出至排液槽109的试样溶液310通过第二开口部105供应至流动池溶液槽103，流动池溶液槽103内的疏水性溶剂320通过第一开口部104排出至疏水性溶剂槽107，从而进行流动池溶液槽103内的溶液替换。其中，供应试样溶液310之前，可以通过吸引等将疏水性溶剂320除去。此外，通过在吸引疏水性溶剂320后使基板102上干燥后再进行反应溶液330的供应，能够实现有效的供应。

图6(c)：排出至疏水性溶剂槽107的疏水性溶剂320通过第一开口部104供应至流动池溶液槽103，液滴305的形成中未使用的剩余的试样溶液310通过第二开口部105排出至排液槽109，从而进行流动池溶液槽103内的溶液替换。由此，在不带有扩增核酸片段308的亲水性图形区域101上形成新的封入有单一分子来源的作为模板的核酸的液滴305。

图6(d)：在液滴305被供应至流动池溶液槽103的疏水性溶剂320隔离的状态下，利用温度调节功能，流动池溶液槽103被加温，从而进行液滴305内的核酸扩增反应。由此，在基板102上新形成扩增核酸片段308的簇。

图6(e)：将图6(b)～(d)中的工序重复一次以上之后，进行与图4(b)同样的操作。由此，基板102中，能够提高形成了单一分子来源的扩增核酸片段308簇的亲水性图形区域501的比例。具体地，如图7所示，通过扩增处理的1次重复，可以预期空的亲水性图形区域101中有30％左右新形成了具有扩增核酸片段的亲水性图形区域501。重复该扩增处理时，供应的试样溶液中的模板核酸由于电荷排斥而难以进入已经有核酸片段的亲水性图形区域。此外，即使新的模板核酸进入了已经有核酸片段的区域的情况下，存在于该区域的模板分子与新的模板分子的存在比也有很大不同，因而即使在允许进入的状态下进行扩增反应的情况下，也不会妨碍后面进行的测序分析。

本实施例中，试样溶液310是重复利用的，因此容纳试样溶液310的试样溶液槽106和排液槽109利用与流动池溶液槽103不同的温度调节机构控制在任意的温度。此外，图6(a)～(d)中试样溶液310和疏水性溶剂320可以不进行再利用而是准备新的溶液，这种情况下，可以增加用于容纳的溶液槽的数量。

实施例4

关于本实施例中的基板上核酸扩增方法的各工序，使用图8所示流动池100的侧向截面图进行说明。其中，图8示出下述实施方式：试样溶液310是含有模板核酸的溶液，在导入疏水性溶剂320形成液滴前，将试样溶液310和作为含有核酸合成酶、核酸扩增底物等的溶液的反应溶液330在试样溶液槽106内混合。在向流动池100添加前，试样溶液310与反应溶液330是分离的，这作为防止试样溶液内不希望的DNA扩增反应的方法是有效的。

图8(a)：准备容纳有试样溶液310的试样溶液槽106、容纳有疏水性溶剂320的疏水性溶剂槽107、容纳有反应溶液330的反应溶液槽108、排液槽109。试样溶液310以下述方式预先调整浓度：在亲水性图形区域101上形成的作为试样溶液与反应溶液的混合物的液滴内，作为模板的核酸为单一分子。反应中使用的核酸合成酶可以为滚环扩增方法(RCA)中使用的链置换型核酸合成酶，也可以为聚合酶链反应(PCR)中使用的耐热性核酸合成酶，本领域技术人员可以根据给定的作为模板的核酸的扩增方法自由选择。例如，模板核酸为RNA的情况下，最开始可以使用互补链合成酶。此外，基板上(优选第一表面)固定或者配置有与作为核酸扩增用引物的模板核酸特异性结合的分子。

图8(b)：从反应溶液槽108向试样溶液槽106供应反应溶液330，调制试样溶液310与反应溶液330的混合溶液840。试样溶液与反应溶液也可以在流动池溶液槽内混合，为了进行均匀的混合溶液的供应，优选在向流动池溶液槽供应前将两者混合。反应溶液330在后续工序中也有使用，因此优选在这个时刻不用掉全部量。

图8(c)：混合溶液840从试样溶液槽106通过第一开口部104供应至流动池溶液槽103。

图8(d)：疏水性溶剂槽107所容纳的疏水性溶剂320通过第一开口部104供应至流动池溶液槽103，剩余的混合溶液840通过第二开口部105排出至排液槽109，从而进行流动池溶液槽103内的溶液替换。通过该溶液替换，混合溶液840残留于配置在基板102上的多个亲水性图形区域101，在基板102上形成被疏水性溶剂320和分隔壁202隔离的液滴305。通过以这种方式隔离在液滴内，能够防止封入于液滴内的作为模板的核酸的扩散导致的污染，此外防止量少的试样溶液的蒸发。

以下，如图3(d)所示，在液滴305被供应至流动池溶液槽103的疏水性溶剂320隔离的状态下，利用温度调节功能，流动池溶液槽103被加温，从而进行液滴305内的核酸扩增反应。此外，如实施例2和图4所示，可以重复进行核酸扩增反应。此时，可以从反应溶液槽108供应反应溶液330。进一步，如实施例3和图6所示，可以重复进行模板核酸向流动池的导入。此时，可以将试样溶液槽106中的混合溶液840或者废液槽109中回收的混合溶液840向流动池溶液槽103供应。

由此，能够在基板102上使各模板在隔离的液滴305内扩增，因此能够实现在基板上规则地配置、无扩增偏倚地形成扩增核酸片段308的簇。此外，通过在将疏水性溶剂除去后进一步进行核酸扩增反应，可获得1000～1万分子左右的扩增核酸片段拷贝数。

实施例5

图9为用于实施本实施例中的核酸扩增方法的核酸分析用装置的一个例子的构成图。关于流动池100、亲水性图形区域101、基板102、流动池溶液槽103、第一开口部104、第二开口部105、试样溶液槽106、疏水性溶剂槽107、反应溶液槽108、排液槽109、阀门110、泵112，与图1的构成是同样的。图9所示构成中，设有用于使试样溶液与反应溶液混合的溶液混合槽913、导入洗涤溶液的洗涤溶液槽914、用于控制试样溶液槽和/或溶液混合槽的温度的温度控制装置915、用于控制流动池溶液槽103的温度的温度控制装置916、用于对基板上进行观察的观察部917、控制部918。溶液混合槽913和洗涤溶液槽914通过各阀门110对第一开口部104进行连接。利用各阀门110的开闭，能够实现对于流动池100内的液体供应和排出的控制。观察部只要是能够对基板上进行观察的装置即可，可以使用任意装置。例如可以使用光学显微镜、相位差显微镜、荧光显微镜等。利用观察装置对存在扩增得到的核酸片段的区域、不存在扩增得到的核酸片段的区域(即未导入模板核酸的区域)等进行观察，可以决定操作的结束或操作的重复，或者决定向其后操作的转入是否正确。控制部例如可以使用PC。与图1的构成同样地，流动池100上下反转也能够进行核酸扩增反应。

关于本实施例中的基板上核酸扩增方法的各工序，使用图10所示流动池100的侧向截面图进行说明。其中，图10示出下述实施方式：试样溶液310为含有模板核酸的溶液，在导入疏水性溶剂320形成液滴前，使试样溶液310与反应溶液330在溶液混合槽913内混合。此外，将步骤的流程图示于图11。

图10(a)：准备容纳有试样溶液310的试样溶液槽106、容纳有疏水性溶剂320的疏水性溶剂槽107、容纳有反应溶液330的反应溶液槽108、排液槽109、溶液混合槽913。试样溶液310以如下方式进行了浓度调整：在作为亲水性图形区域101上形成的试样溶液与反应溶液的混合物的液滴内，作为模板的核酸成为单一分子。具体地，以使含有模板核酸的试样溶液的浓度在与反应溶液混合了的时刻为1分子/1液滴以下的方式进行稀释。反应中使用的核酸合成酶可以为滚环扩增方法(RCA)中使用的链置换型核酸合成酶，也可以为聚合酶链反应(PCR)中使用的耐热性核酸合成酶，本领域技术人员可以根据给定的作为模板的核酸的扩增方法自由选择。例如，模板核酸为RNA的情况下，最开始可以使用互补链合成酶。此外，在基板上(优选第一表面)固定或者配置有与作为核酸扩增用引物的模板核酸特异性结合的分子。试样溶液槽106和溶液混合槽913的温度利用温度控制装置915调节为冰温至4℃左右。

图10(b)：将来自试样溶液槽106的试样溶液310和来自反应溶液槽108的反应溶液330分注入溶液混合槽913并混合，调制混合溶液840。混合的溶液的量只要成为适合核酸合成的溶液组成即可，本领域技术人员可以适当设定。试样溶液310和反应溶液330在后续工序中也有使用，因此优选在该时刻不用掉全部量。

图10(c)：混合溶液840从溶液混合槽913通过第一开口部104供应至流动池溶液槽103。供应的溶液量只要是足以覆盖设于流动池溶液槽103底面的具有凹部(亲水性图形区域)的基板的液量即可，无需充满整个流动池溶液槽103。

图10(d)：疏水性溶剂槽107所容纳的疏水性溶剂320通过第一开口部104供应至流动池溶液槽103，剩余的混合溶液840通过第二开口部105排出至排液槽109，从而进行流动池溶液槽103内的溶液替换。通过该溶液替换，混合溶液840残留于配置在基板102上的多个亲水性图形区域101，在基板102上形成被疏水性溶剂320和分隔壁202隔离的液滴305。通过以这种方式隔离在液滴内，能够防止封入于液滴内的作为模板的核酸的扩散导致的污染，此外防止量少的试样溶液的蒸发(基板上液滴形成工序)。混合溶液840和疏水性溶剂320流入排液槽109，在一方为疏水性溶剂的性质上，混合溶液与疏水性溶剂在排液槽内不会混合，因此能够从排液槽对混合溶液进行再利用。必须供应能够使剩余混合溶液充分排出的疏水性溶剂，但无需填充流动池溶液槽103内。对排液槽内的混合溶液进行再利用的情况下，排液槽的温度调节为冰温至4℃。

以下，如图3(d)所示，在液滴305被供应至流动池溶液槽103的疏水性溶剂320隔离的状态下，利用温度控制装置916，流动池溶液槽103被加温，从而进行液滴305内的核酸合成反应(液滴内核酸合成反应工序)。加温的方法没有限定，优选不会妨碍对流动池100内的基板上表面扩增得到的核酸簇进行观察。核酸扩增后，使流动池溶液槽103冷却而使核酸合成反应停止。

接下来，从流动池溶液槽103将疏水性溶剂320除去(疏水性溶剂除去工序)。疏水性溶剂的除去可以通过对流动池溶液槽103减压或者加压来进行，也可以在流动池溶液槽103中注入气体而进行，或者还可以从洗涤溶液槽914供应洗涤溶液而进行。关于气体的组成，目的是将流动池溶液槽内的溶液替换除去，其组成没有特别限定。洗涤溶液的组成没有特别限定，优选为缓冲液组成与反应溶液相同、组成中不含核酸合成酶、底物、引物的全部或者一部分的溶液。供应洗涤溶液的情况下，也可以在流动池溶液槽103中导入气体或者通过加压或减压将洗涤溶液除去。

此外，如实施例2和图4所示，可以重复进行核酸扩增反应。此时，可以从反应溶液槽108将反应溶液330供应至流动池溶液槽103。利用温度控制装置916，流动池溶液槽103被加温，从而进行核酸合成反应(非隔离基板上扩增工序)。本工序的反应溶液不含模板核酸分子，因此不发生向基板上的亲水性图形区域101供应新的核酸分子。供应的反应溶液的量定义为足以完全覆盖具有凹部(亲水性图形区域)的基板底面的液量，供应反应溶液时，具有多个凹部的基板底面形成一个连续的反应场。在用上述那样的疏水性溶剂隔离的液滴内，底物量是有限的，因此凹部内的扩增拷贝数受到限制，但通过形成使液滴开放的反应场，凹部内底物量的限制解除，能够合成大量核酸分子。核酸扩增后，使流动池溶液槽103冷却而使核酸合成反应停止。也可以根据需要从洗涤溶液槽914向流动池溶液槽103供应洗涤溶液，将反应溶液除去。

一边利用观察部917对基板上进行观察，一边确认这些操作是否结束，能够判断操作的重复、向后续工序的转移。溶液供应、温度控制装置的加温和冷却、利用观察部的观察可以利用控制部918适当控制。

进一步，如实施例3和图6所示，可以重复进行模板核酸向流动池的导入。将该步骤的流程图示于图12。非隔离基板上扩增工序后，从洗涤溶液槽914向流动池溶液槽103供应洗涤溶液，将反应溶液除去，接下来将该洗涤溶液从流动池溶液槽103除去后，重复进行基板上液滴形成工序、液滴内核酸合成反应工序、疏水性溶剂除去工序和非隔离基板上扩增工序。此时，可以向流动池溶液槽103中，供应使来自试样溶液槽106的试样溶液310与来自反应溶液槽108的反应溶液330在溶液混合槽913中混合而得到的混合溶液840、或者废液槽109中回收的混合溶液840。

由此，能够在基板102上使各模板在隔离的液滴305内扩增，因此能够实现在基板上规则地配置、无扩增偏倚地形成扩增核酸片段308的簇。此外，通过在将疏水性溶剂除去后进一步进行核酸扩增反应，可获得1000～1万分子左右的扩增核酸片段拷贝数。

实施例6

图13为进行DNA测序的情况中的核酸分析用装置的一个例子的构成图。具体地，除了本发明涉及的核酸分析装置的构成(将各试剂合称为基板上核酸簇形成试剂盒1301)以外，还具备DNA测序试剂盒1302。碱基序列分析反应中要求的功能为向流动池溶液槽的溶液供应和溶液替换、流动池溶液槽的温度调节、观察部，可以与形成DNA簇的构成共用。利用图13记载的构成，能够在基板102上形成DNA簇后，接着，在不使基板102移动的情况下以同一流动池溶液槽103为反应场，对碱基序列进行分析。利用进一步具备观察部917和控制部918的构成，能够实现这一系列工序的控制和观察的自动化。

其中，本发明不限定于上述实施例，也包括各种变形例。例如，为了对本发明便于理解地进行说明，上述实施例中详细地进行了说明，但不限定为必须具备说明的全部构成。此外，可以将某实施例的构成的一部分替换成其他实施例的构成，此外，也可以在某实施例的构成中增加其他实施例的构成。另外，还可以对各实施例的构成的一部分进行其他构成的增加、去除、替换。

符号说明

100：流动池

101：亲水性图形区域

102：基板

103：流动池溶液槽

104：第一开口部

105：第二开口部

106：试样溶液槽

107：疏水性溶剂槽

108：反应溶液槽

109：排液槽

110：阀门

112：泵

201：下层基板

202：分隔壁

203：用于固定模板核酸的分子

305：液滴

308：扩增核酸片段

310：试样溶液

320：疏水性溶剂

330：反应溶液

501：带有扩增核酸片段的亲水性图形区域

840：试样溶液和反应溶液的混合溶液

913：溶液混合槽

914：洗涤溶液槽

915、916：温度控制装置

917：观察部

918：控制部

1301：基板上核酸簇形成试剂盒

1302：DNA测序试剂盒