阅读说明：本技术 用核三系油菜f2代分离选育同质临保及纯合不育系方法 (Method for separating and breeding homogeneous temporary protection and homozygous sterile line by using nuclear three-line rape F2 generation ) 是由 侯剑 侯燕 侯国佐 于 2019-12-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用核三系油菜F2代种子分离选择同质临保及纯合不育系的方法,该方法是在没有核三系亲本(即临保系和纯合不育系)育种材料的基础上,直接选择其丰产稳产性好、抗逆性强、品质优等综合经济性状好的杂交品种(组合)套袋自交,根据F2代、F3代育性表现不同分别采取可育与不育株同袋杂交、可育株自交、初花后在调查的基础上取相应株行材料的植株分别作父母本在蚊帐内制种、所产生的相应种子再对其进行育性鉴定等方法,在3-4代内直接快速分离选择出同质临保及纯合不育系的方法。(The invention discloses a method for separating and selecting homogeneous temporary protection and homozygous sterile lines by using seeds of a nuclear three-line rape F2 generation, which is characterized in that hybrid varieties (combinations) with good high yield and stable yield, strong stress resistance, excellent quality and other comprehensive economic properties are directly selected for bagging selfing on the basis of breeding materials without nuclear three-line parents (namely temporary protection lines and homozygous sterile lines), fertile plants of fertile and sterile plants are respectively adopted to be subjected to bagging hybridization, fertile plant selfing and initial flowering on the basis of investigation according to the difference of fertility performances of the F2 generation and the F3 generation, plants of corresponding plant row materials are respectively taken as parents to produce seeds in a mosquito net, and the generated corresponding seeds are subjected to fertility identification and the like, so that the homogeneous temporary protection and homozygous lines are directly and rapidly separated and selected in the 3-4 generation.)

用核三系油菜F2代分离选育同质临保及纯合不育系方法

技术领域

本发明涉及一种用核三系杂交油菜品种(组合)F2代种子直接分离选择同质临保及纯合不育系的快速选育，属于油菜品种选育技术领域。

背景技术

油菜是我国主要的油料作物。油菜杂种优势利用在世界上处于领先水平。自上世纪八十年代第一个杂交油菜秦油二号问事以来，已育成审定数百个杂交油菜通过国家和各省审定应用于生产，特别是自上世纪九十年代后，已成功将优质油菜育种与杂种优势育种相结合，育成一大批产量高、品质优、含油量高的品种在国内普及推广。

油菜杂种优势育种中，主要通过创建和选育油菜雄性不育系来实现在生产上应用。目前较大面积应用的不育系主要有细胞质雄性不育和细胞核雄性不育，细胞核雄性不育又分隐性细胞核雄性不育和显性细胞核雄性不育，其中显性细胞核雄性不育因恢复源较少，育成的品种不多，因此目前除胞质不育三系外，隐性细胞核雄性不育是育成品种最多的基本材料。

隐性细胞核雄性不育材料的优点是恢复源广，且其不育性彻底、稳定，不受环境影响。此类材料又分隐性细胞核雄性不育两系和隐性细胞核雄性不育三系，前者不育系中包含有50％的可育株，在制种中必须在开花前拔除，而后者可实现100％的不育。因此后者既比胞质雄性不育材料不育性稳定(目前主要应用的胞质不育材料对低温敏感表现有微量花粉)、不育性彻底且恢复源广，又克服了隐性核不育两系材料在制种中要拔除50％的可育株的弱点，是目前油菜杂优育种较理想材料。

油菜隐性核不育三系与双隐性不育两系一样，其不育性也是受两对隐性基因(ms₁ms₁ms₂ms₂)控制，但不同的是前者它具有一对上位基因(RfRf)控制，当上位基因同为隐性时rfrf时，能抑制不育基因ms₁ms₁ms₂ms₂对育性的表达，使其变为可育。此种基因型为rfrfms₁ms₁ms₂ms₂，称其为临保系。当它与不育基因RfRfms₁ms₁ms₂ms₂杂交时，只生成一种不育基因型Rfrfms₁ms₁ms₂ms₂，因此表现为全不育，前基因型RfRf ms₁ms₁ms₂ms₂称为纯合不育系，后基因型Rfrfms₁ms₁ms₂ms₂称为杂合不育系。因此在隐性核不育三系育种中转育新的纯合不育系和临保系进而配制全不育系并配制和育成新的杂交种就成为育种的主要任务。

新纯合不育系及临保系转育的目的就是用优良的经济性状(包括丰产性、抗逆性、优良品质等综合优良经济性状)来进一步改良原有的纯合不育系及临保系。转育方法一般就采用稳定的纯合不育系作母本，所选具有某些优良的目标性状作父母进行杂交，然后F₂进行分离成对测交，此方法测交工作量大。因为用纯合不育系与一般优良亲本品种杂交，因其父本不一定具有一对纯合的RfRf上位基因，假设其基因型为隐性，则转育材料的基因型为rfrfMs₁Ms₁Ms₂Ms₂，其F₂代可育与不育的分离的比例为61：3，在3株不育株中，纯合不育型只占1/3而且花期无法识别，且又要用可育株来保持，而在其61株可育株中，能保持纯合不育基因型下代出现1/2可育株只有4株，其机率只有4/61，因此F₂代分离成对测交获得纯合不育系的机率只有1/3×4/61＝4/183；即如果要一个转育材料后期世代出现4个左右的纯合不育选择材料，其F2代要同时测交180个以上的成对测交组合，假设每个不育株上能测交两个成对测交组合，这需要有90株左右的不育株群体，而这需种植1800株以上的F2群体才能达到；同时下年成对测交的180余个组合要全部种植株行，其花期对有1/2左右不育株率的12个左右的的株行既要成对测交，又要用临保系对不育株行进行成对测交以鉴定其不育基因的纯合性(RfRfms₁ms₂ms₂或Rfrfms₁ms₁ms₂ms₂)，且这种与临保系测交的每个不育株行要成对测交5株以上才能保证育性鉴定全不育的保证程度达91％以上。因此F₂代分离测交选育纯合不育系的方法在F2和F3不仅测交工作量大，且所需种植的群体数量也很大，如果一年转育的材料较多，几乎无法操作。

同样，在此群体中，选育临保系的工作量也很大，出现的机率更低。该群体可育株中临保系植株只有1/61，在不育株中纯合不育型只有1/3,因此要选育出一株临保系需要成对测交183个组合，需要183株不育株，该群体不育株率只有3/64,183株不育株需种植3904株的F2植株群体。仅选一株临保系就需种植这样大的群体，测交这么多的组合，显然是不能完成的。

以上的选育技术还是建立在有核三系纯合不育系的基础之上的，对于没有核三系育种基础的育种工作者，还没有条件完成此种方法的选育。

发明内容

本发明的目的是提供一种可实现核三系油菜F2代种子选择同质临保及纯合不育系的方法，以解决现有技术存在的以上问题。

本发明的核心技术是:

1、没有核三系亲本(及纯合不育系、临保系)的材料基础的情况下，直接从核三系品种(材料)F2分离世代中选择不育株率在18％-25％的株行群体作分离选择材料为的是缩短育种时间，减少工作量；

2、用相邻的不育株与可育株一起套袋同时完成不育株杂交和可育株自交来替代可育株套袋自交和不育株与可育株人工成对剥蕾杂交，可大大减少人工杂交工作量。

3、提早一年在初花期在杂交种子种植的株行中选择具有1/2左右不育株率的不育株带土取苗与自交种子株行中具有临保作用的植株带土取苗，移至蚊帐内隔离制种既缩短了育种时间，也节省工作量，增加纯合不育系纯度选择的稳定性。

本发明是这样实现的：

本发明是一种用核三系杂交油菜品种(组合)F2代种子直接分离选择同质临保及纯合不育系的快速选育方法，按如下方法步骤实现：

步骤1：通过试验从引进的核三系杂交品种(组合)选择其丰产稳产性好、抗逆性强、品质优等综合经济性状好的杂交品种(组合)5-8个分别种植，花期每品种(组合)选株套袋自交8-10株，成熟后分株收获F2自交种并进行考种及品质分析，留种备用。

步骤2：每品种(组合)选择F2优良单株1-2株种植株行，株行密度一万株左右/亩，株行群体达到600-700株，中上等管理水平。初花期前后对每个株行调查不育株率，选择不育株率在18％-25％的株行群体，花期在此群体内选择100对左右相邻的不育株与可育株捆在一起，不育株与可育株分别挂牌编号，再用较大一点能隔离外面花粉专用纸袋(如硫酸纸袋或无纺布纸袋，以下简称纸袋)将两株花序套在一个纸袋内保持纸袋内有一定空度以便可育株与不育株授粉，开花期内摇袋提袋帮助授粉，使其不育株育可育育株花粉杂交结实，每个成对杂交和自交种子种子量要求达到10g以上。成熟后对可育自交株和不育杂交株种子分别收获保存备用。

步骤3：即第三个种植年度，其工作程序较复杂，下分别序述：

(1)将自交株和杂交株种子分别取4-5g种植相应的株行，剩余种子留存备用。株行种植密度可达2.5-3万株/亩，株行群体300株左右。中等管理水平，防止倒伏以不影响后期工作和结果。

(2)初花期首先分别调查自交株种子株行和杂交株种子株行的不育株率。

(3)对其在杂交种子种植的株行不育株率调查中，表现全不育株行其所对应的测交父本单株就是临保系，从而可在自交种子株行中找到相应编号种子的株行，其株行单株应表现全可育，选株套袋20株左右，成熟后收种保存。

(4)对其在杂交种子种植的株行不育株率调查中，表现1/2左右(取45％-55％)不育的株行中(有可能选育出纯合不育系)，在其中选5-6对相临的不育株与可育株一起共套一个纸袋，花期摇袋人工辅助授粉让不育株在纸袋内结实。成熟后袋内可育与不育株分别收种保存。

(5)在3(3)中能保持杂交种子株行全不育所相对应的自交种子株行植株，初花期细心带土取苗作父本；杂交种子株行中不育株率表现1/2左右(45％-55％)株行植株，每株行在初花期细心带土取苗20株左右的不育株作母本，均移至有蚊帐隔离的条件下细心带土移栽，母本1行区，每隔4行栽1行父本栽后浇水培土保证活，严格隔离，人工辅助授粉。成熟后帐内以母本株行为单位分别混合收种保存。

步骤4：分述如下：

(1)将上年在蚊帐内隔离制种的母本株行混合种子，每株行取样2-3g,种植株行，行长3米，行距0.4米，1行区，种子条播不匀苗，不施或少施肥，花期调查不育株率；将上年杂交种子种植株行表现1/2左右不育的株行中不育株与可育株一起套袋中的不育株种子，取4-5个单株分别种植株行，密度12000株/亩，株行群体80-100株，花期调查不育株率，并与蚊帐内相应条播不匀苗的株行不育株率相对应比较，当条播不匀苗相对应株行为全不育，本行不育株率在50％(45％-55％)左右，其此行材料就为纯合不育系。在此行内继续进行不育株与可育株一起套袋并同时进行植株丰产稳产性、抗逆性、品质等综合经济性状的选择。

(2)种植上年杂交株行中表现全不育所对应单株自交种子株行(临保系)中套袋自交种子4-5株个株行，花期调查不育株率应表现为全可育，并选株套袋8-10株，同时继续对其株行进行植株丰产稳产性、抗逆性、品质等综合经济性状的选择。

(3)将4(1)中表现为合格的纯合不育系中的不育株带土取苗作为母本，4(2)中表现为合格的临保系中植株带土取苗作为母本，仍在蚊帐内隔离制种，收种保存，下年既可对新选的纯合不育系及临保系的育性进行鉴定，又可利用所产生的全不育系进行组合测交或制种。

与现有技术相比，本发明的方法能够在没有核三系亲本(即临保系和纯合不育系)育种材料的基础上，直接选择其丰产稳产性好、抗逆性强、品质优等综合经济性状好的杂交品种(组合)，通过在F2代植株的基础上自交分离、测交、杂交、再根据F3株行的育性表现不同分别采取可育与不育株同袋杂交、可育株自交、初花后在调查的基础上取相应株行材料的植株分别作父母本在蚊帐内制种、所产生的相应种子再对其进行育性鉴定等方法，在2-3代内直接快速分离选择出同质临保及纯合不育系的方法。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明技术方案及技术原理：

(1)本发明的技术特点是：

①直接用核三系杂交品种(组合)作选择材料，没有核三系亲本(及纯合不育系、临保系)的材料基础。

②工作量相对小。用相邻的不育株与可育株一起套袋同时完成不育株杂交和可育株自交来替代可育株套袋自交和不育株与可育株人工成对剥蕾杂交，可大大减少人工杂交工作量。提早一年在蚊帐内隔离制种既缩短了育种时间，也节省工作量，增加纯合不育系纯度选择的稳定性

③时间快，以杂交种F2代种子为起点，选择不育株率在18％-25％的株行群体作分离选择材料，保证2-3代就能分别相应出稳定的纯合不育系、临保系。

(2)主要关键技术及技术原理：

核三系杂交品种(组合)是用核三系的全不育系作母本，优质恢复系作父本配置的杂交品种(组合)。母本核三系全不育系的基因型是Rfrfms₁ms₁ms₂ms₂，它作为母本在杂交时所产生的配子只有两种Rfms₁ms₂和rfms₁ms₂。父本恢复系可能有几种基因型，但由于恢复系是稳定的品种材料，同一基因要么同时是显性，要么同时是隐性。因此常规优质的恢复系其基因型只有四种：①RfRfMs₁Ms₁Ms₂Ms₂②rfrfMs₁Ms₁Ms₂Ms₂③RfRfMs₁Ms₁ms₂ms₂(或ms₁ms₁Ms₂Ms₂)③rfrfMs₁Ms₁ms₂ms₂(或ms₁ms₁Ms₂Ms₂)，其杂交时只有四种基本配子，与母本杂和型全不育系杂交，产生6种F1种子的基因型，6种F1种子的基因型种子种植后的植株结实后产生F2代种子再种植后就会分离出多种基因型。以上几种所编顺序常规优质的恢复系基因型为序，其F2代种子出现几种可利用的基因型占总群体的机率分别是：不育株分别占：5.47％、2.34％、21.88％、9.38％，(表1)其中纯合不育株分别占3.91％、0.78％、15.63％、3.13％，临保植株分别占：0.83％、4.0％、8.0％、3.4％，纯合可育株分别占：16.53％、3.2％、40.0％、6.9％，各种基因

表1核三系杂种(材料)F1代植株可能分离的基因型及其F2植株几种分离表现

型的恢复系所配置的杂交组合分离比例差别很大，均以第③种具有RfRf Ms₁Ms₁ms₂ms₂(ms₁ms₁Ms₂Ms₂)基因型的恢复系作父本的杂交种(组合)为最好。以此具有RfRfMs₁Ms₁ms₂ms₂(ms₁ms₁Ms₂Ms₂)基因型为例：种植600株左右群体F2代植株群体会出现131株不育株，这完全能满足作杂交100个组合的需要，这100个成对组合，群体中的可育株与不育株中纯合不育型杂交后，F3代能分别出现系临保、纯合不育系5.7个株系和28个株系；而其他几种恢复系F2群体不育株要达到131株不育株，首先必须要分别种植分F2群体2349株、5598株、1396株，才能达到如此不育株数，做足100个成对测交组合，其临保系出现的机率分别只有0.59个株系、1.3个株系、1.15个株系，纯合不育系出现的机率分别只有11.81个株系、1.33个株系、2.3个株系。可见其它几种恢复系杂交种F2群体不但出现的不育株率低，同时测同样多的杂交组合其后代出现的临保系及纯合不育系也要低很多。

因此，在选育设计中，多种植几个组合，选择其不育株率在20％左右(18％-25％)的品种(组合)作为选择群体，能大大减少工作量，加快育种进程

在F2代杂交种子种植的株行中，出现1/2左右的不育株率的株行是选育纯合不育系的基础。步骤二群体成对测交中，纯合A×纯合B纯合A×杂合B杂合A×纯合B几种杂交种子种植后代均会表现出1/2左右的不育，其总的出现机率达57％，但只有纯合A×纯合B后

表2杂交种子种植的株行群体中出现1/2不育株率株行比例及各自的基因型表现

代仍表现为纯合A和纯合B的群体(表1)，占群体总数的28％左右，其它几中的后代则为纯合不育和杂和不育的混合体。因此几种1/2左右的不育株率的株行必须通过与临保系杂交鉴定后才能选择出真正的纯合不育系。

本发明技术与原转育技术的优势比较：

本发明与原来一般临保系和纯合不育系的选育技术具有较多优势，分述如下：

1、材料选择方面的优势

首先本发明供作选择材料是核三系的杂交品种(材料)，而不是核三系亲本。这对于没有核三系亲本的育种工作者具有特别的意义。其次，本发明在步骤二中所选20％左右不育株率的群体作基础择材料，它F1代杂交种是RfRf Ms1ms1ms2ms2和RfrfMs1ms1ms2ms2两种基因型，它是供杂交种制种的全不育系(杂和不育系)与具有RfRfMs1Ms1ms2ms2(配子型：RfMs1ms2)恢复系杂交产生的(表3)，该材料F2代群体不育株率和临保株率分别为21.88％和8％，群体内测交100个组合只需种植457株群体；其它技术F2代群体不育株率和临保株率分别为2.34％-25％和0％-8％，平均分别为11.72％和3.20％，群体内测交100个组合需分别种植400-4274株。

表3不同核三系不育系与不同常规品种杂交转育后在F2及F3代临保及纯合不育系的机率

本发明F2代通过群体内成对测交F3代株行出现临保系及纯合不育系的株行分别可达到5.71％和28.57％，其它技术分别只有0％-2.56％和1.04％-50.0％，平均分别为0.88％和13.6％，其中有两种技术纯合不育系出现机率高达25％和50％，但因其父母本上位基因全为显性，没有临保系植株出现，不能完成临保系的选育。

因此本发明后代出现临保系及纯合不育系的有利基因型比其它技术高，有利于后期选择；成对测交100个组合种植的F2群体比其它小，以每个材料种植600株为例，占地0.05亩，占地少，因此能在F2代多种几个不同来源的杂交品种，有利于本发明花期不育株率达标的考察及选择。

2、育种时间方面的优势

表4列出本发明与其它技术完成临保系和纯合不育系的选择所需时间，看出本发明只需4个播种年度，其中第一个年度工作量极小。如在进行核三系品质的区域试验或多点试验等工作，只需花期选株套袋即可。其它技术分别要6-7个播种年度(表4)。更为困难的是其它技术在F2代分离群体测交中，由于临保植株出现机率低，人工成对测交数量不足，结果找不到临保系，致使多年选择无结果。这是一些育种工作者在杂交品种(组合)中盲目测交选择临保及纯合不育系失败的原因。

表4本发明与常规转育技术所需用的时间年限

3、育种工作量方面的优势

只以在成对测交中用不育株与相邻可育株一起套袋来替代人工杂交为例，表5列出同样做100个成对测交组合进行比较，看出其它技术F2代要做100个杂交组合，F3代1/2左右不育株行群体内测交和与临保系杂交以鉴定其群体的纯度，分别要做285个人工杂交组合，共计达635个杂交组合，按每个熟练工一天完成7株杂交技术，共序90余个人工工作量，在加上其父母本植株分别要套袋、抽袋等，共计用工在110个以上；而本发明由于采用蚊帐内制种，减少相应的成对测交，成对测交组合数减少到385个，且不进人工杂交，且套袋、抽袋的数量比人工杂交少，增加摇袋工作量，完成其工作需工7-8个，另外，蚊帐内制种另需用工5个左右，本发明完成100个成对测交共需共13个左右，比完成相同数量的人工成对测交少用工100个左右，少了近十倍。

在成对测交所收获的自交及杂交种子这方面，本发明由于套袋了父母本整个花序，其母本所结实的时间相对长，种子也比人工杂交的多。

另外，少了种植年代，少用土地面积中均能减少用工量。

表5本发明与常规转育技术在不育株育株与可育株成对测交所用工作量比较(以做100个成对测交组合计)

4、本发明与其它技术育成的临保系及纯合不育系数量及质量稳定性比较

在可能育成临保系及纯合不育系数量方面，以成对测交100个组合为例，本发明能在3-4代的时间内选育出临保系5-6个，纯合不育系28个左右，其它技术在6-7代育成临保系和纯合不育系分别为0-5.71个和1-50个之间，平均为1.49个和15.47个。其中有两种(转育父母本上未基因同时均显性)技术出现的纯合不育系虽然较高，但没有临保系出现。

在1/2左右不育株行进行纯合不育系纯度鉴定方面，其它技术在F3代对1/2左右不育株行不育株与临保系杂交只杂交了5株(就这其工作量也很大)混合再进行其纯度鉴定，而蚊帐制种取样的不育株是20株，因此后者的育性稳定性要高得多。

表6本发明与其它技术育成的临保系及纯合不育系数量及质量稳定性比较

实施实例：

用本发明分别选育出同质纯合不育系C112A及临保系L105B，纯合不育系C113A及临保系L107B。其过程如下：

2014年和2015年春季分别从核三系品种比较试验中选择不同来源其综合性状好的组合套袋自交经考种分析，秋季分别种植5-6的个株行，2015年春季花期6个株行的不育株率在2.01％-19.59％之间，2016年春季花期5个株行的不育株率在1.9％-20.61％之间，两年都有一个株行其不育株率达到20％左右(表7)，在此群体中分别选择不育株与相邻的可育株一起套袋105株和111株，花期天气好时进行抽袋摇袋进行人工辅助授粉，成熟后代内的不育与可育单株种子分别留存备用。

表7 2015和2016年春分别的种植的几品种(组合)在F2群体不育株率的表现

2015和2016年秋季对上季留存的不育和可育株种子分别取样5g各种植相应株行，密度2-2.5万株/亩，株行留苗300株左右，中等施肥管理水平防止倒伏，花期重点对不育单株种植的株行进行不育株率调查，其结果列于表8：其中2016年的F3代株行杂交种子种植105株行，调查结果有6个株行表现全不育，占总株行的5.71％，1/2左右不育的株行有55个，占占总株行的52.8％；2017年的F3代株行杂交种子种植107株行，调查结果有5个株行表现全不育，占总株行的4.68％，1/2左右不育的株行有57个，占占总株行的53.27％。对此表现全不育的，可在可育株自交种植的株行中找出与其一同套袋的可育株行，其株行可初步确定为临保系，每行套袋15-20株自交留种；对1/2左右不育的株行首先每株行选5株左右不育株与相邻可育株一同套袋成对测交，成熟后不育与可育株分别留种，另每株行带土取不育株苗20株左右与自交株行中初步确定的临保系株行带土苗移栽至隔离蚊帐之内制种，两年分别制种了55个和57个母本株行。由于是带土移栽，在春季的蚊帐内易成活，且株行母本群体有20株左右，成熟后母本株行混种子量都在100g以上，能满足下代育性鉴定需要。

表8 2016和2017年Q026133和组合F2成对测交种子分别在F3代株行的表现

2016和2017年首先分别种植上年蚊帐制种的母本株行的55行和57行混合种子，每株行取种子3-5g，条播不匀苗，不施或少施肥，花期调查株行的不育株率，表现全不育的株系数分别为27株和29株，分别占总株行的50.94％和51.9％；同时种植初步确定的临保系株行，每个株行种植自交单株4-5株，进行生长势、整齐度及综合油优良性状的选择，成熟后室内考种分析留种备用；还要种植1/2左右不育株行中上年不育与可育株成对测交中不育株的种子，根据以上不育株率调查结果，上面表现全不育所对应的提供上年制种的27个和29个株行初步确定为纯合不育系，在此株行中，每个株行种植自交单株4-5株，同样进行生长势、整齐度及综合油优良性状的选择，成熟后室内考种分析留种备用。

为进一步鉴定其初步选出的临保系和纯合不育系的育性稳定性，在上F4群体中对初步确定为临保系和纯合不育系的株行，在观察选择的基础上，在其中其中分别选择了11-12个优良的纯合不育株系与优良的临保系再带土取苗移栽至蚊帐内制种，制种种子分别再种植鉴定，所制种种子不育株率均达到100％，其相应提供制种的纯合不育系及临保系株行就是稳定的选育材料。

表9蚊帐内F3、F4代制种母本株行的F4、F5种子分别在育性鉴定中的表现

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。