阅读说明：本技术 一种HAp-CSA-SF复合凝胶材料及其制备方法和应用 (HAp-CSA-SF composite gel material and preparation method and application thereof ) 是由 葛少华 马保金 商玲玲 刘宏 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种HAp-CSA-SF复合凝胶材料,所述复合凝胶材料包括硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶层,以及在硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶层至少一个端面设置的羟基磷灰石富含层。其中,羟基磷灰石富含层一方面修复受损的内层骨组织,另一方面是增强软骨和相邻骨之间的结合强度,以确保修复后的软骨能够正常实行功能；而软骨素-丝素蛋白复合凝胶层是由硫酸软骨素和丝素蛋白混合形成的整体性凝胶。随着丝素蛋白的降解,能同时释放硫酸软骨素,进一步促进软骨再生,从而实现对软骨的修复,本发明通过多相分层设计,实现快速修复软骨组织,同时提高修复后软骨和相邻骨之间的结合强度。(The invention provides an HAp-CSA-SF composite gel material, which comprises a chondroitin sulfate-silk fibroin composite gel layer and a hydroxyapatite rich layer arranged on at least one end face of the chondroitin sulfate-silk fibroin composite gel layer. The hydroxyapatite-rich layer is used for repairing damaged inner bone tissues on one hand and enhancing the bonding strength between cartilage and adjacent bones on the other hand so as to ensure that the repaired cartilage can normally perform functions; and the chondroitin-silk fibroin composite gel layer is an integral gel formed by mixing chondroitin sulfate and silk fibroin. With the degradation of silk fibroin, chondroitin sulfate can be released at the same time, the regeneration of cartilage is further promoted, and the repair of the cartilage is realized.)

一种HAp-CSA-SF复合凝胶材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于软骨组织修复技术领域，具体涉及一种HAp-CSA-SF复合凝胶材料及其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

软骨组织工程是组织工程的重要方向之一。软骨在人体中具有承重，力量传导以及缓冲等重要作用。关节处的软骨更是维持人体正常运动的基础。然而，软骨的磨损及外力引起的软骨损伤时有发生，且会引起炎症、疼痛及运动障碍等问题。如何高效快速精确地修复受损的软骨组织，成为软骨组织工程中亟待解决的重要问题。

传统软骨组织修复材料的韧性较差，在植入后无法及时有效发挥承重、缓冲等功能。软骨组织的主要成分包括胶原蛋白以及硫酸软骨素等。有研究表明，以具有高生物相容性和良好降解性的丝素蛋白(silk fibroin,SF)作蛋白质源，能有效促进软骨再生。然而，现有的SF支架材料韧性差，支撑性能低。此外，在目前修复过程中，往往忽略了软骨和骨组织间的过渡，导致修复后软骨和骨之间的结合不牢固。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种羟基磷灰石-硫酸软骨素-丝素蛋白(HAp-CSA-SF)复合凝胶材料及其制备方法和应用。本发明通过将CSA和SF混合均匀以形成整体性凝胶。随着SF的降解，能同时释放CSA，进一步促进软骨再生。所制备的SF溶液具有粘性，可将HAp粘合，在凝胶的一面形成HAp层，从而在软骨修复过程中，促进软骨和骨之间紧密结合，促进精确仿生式修复，具有良好的实际应用之价值。

本发明的目的之一是提供一种HAp-CSA-SF复合凝胶材料。

本发明的目的之二是提供上述HAp-CSA-SF复合凝胶材料的制备方法。

本发明的目的之三是提供上述HAp-CSA-SF复合凝胶材料的应用。

为实现上述发明目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种HAp-CSA-SF复合凝胶材料，所述复合凝胶材料包括硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶层，以及在硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶层至少一个端面设置的羟基磷灰石富含层，羟基磷灰石一方面可用于修复受损的内层骨组织，另一方面能够有效增强软骨和相邻骨之间的结合强度，以确保修复后的软骨能够正常实行功能；而软骨素-丝素蛋白复合凝胶层是由硫酸软骨素和丝素蛋白混合形成的整体性凝胶。随着丝素蛋白的降解，能同时释放硫酸软骨素，进一步促进软骨再生，从而实现对软骨的修复，本发明通过多相分层设计，实现快速修复软骨组织，同时提高修复后软骨和相邻骨之间的结合强度。

其中，所述羟基磷灰石层由具纳米结构的羟基磷灰石构成，所述纳米级羟基磷灰石可以为颗粒状、棒状或线状，如羟基磷灰石纳米颗粒、羟基磷灰石纳米棒、羟基磷灰石短纳米线和羟基磷灰石长纳米线等，本发明通过在硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶的一面形成HAp层，在软骨修复过程中，促进软骨和骨之间紧密结合，促进精确仿生式修复。

本发明的第二个方面，提供上述HAp-CSA-SF复合凝胶材料的制备方法，所述制备方法包括采用酸溶醇固法进行制备，具体包括：

HAp的制备：将油酸和乙醇混合，加入钙盐溶液，随后加入碱液，再加入磷酸氢钠溶液，搅拌，高温反应即得。

CSA-SF复合酸溶液的制备：制备丝素蛋白甲酸溶液，将硫酸软骨素添加至丝素蛋白甲酸溶液中。

所述制备方法还包括将CSA-SF复合混合酸溶液置入承载有HAp的模具中，待酸液挥发冷却即得HAp-CSA-SF复合凝胶材料。

进一步的，将上述HAp-CSA-SF复合凝胶材料浸泡于无水乙醇中进行固化即得。

本发明的第三个方面，提供上述HAp-CSA-SF复合凝胶材料在制备骨修复材料中的应用。所述骨修复材料进一步为软骨修复材料。

所述骨修复材料至少具有如下任一种或多种用途：

(a)促进骨/软骨生成；

(b)促进软骨下骨组织改建；

(c)提高骨体积分数(BV/TV)；

(d)提高骨小梁厚度(Tb.Th)；

(e)提高骨小梁数目(Tb.N)；

(f)降低骨小梁间隔(Tb.sp)。

本发明的有益技术效果：

本发明提供一种HAp-CSA-SF复合凝胶材料，所述复合凝胶材料包括硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶层，以及在硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶层至少一个端面设置的羟基磷灰石富含层。其中，羟基磷灰石一方面修复受损的内层骨组织，另一方面是增强软骨和相邻骨之间的结合强度，以确保修复后的软骨能够正常实行功能；而软骨素-丝素蛋白复合凝胶层是由硫酸软骨素和丝素蛋白混合形成的整体性凝胶。随着丝素蛋白的降解，能同时释放硫酸软骨素，进一步促进软骨再生，从而实现对软骨的修复，本发明通过多相分层设计，实现快速修复软骨组织，同时提高修复后软骨和相邻骨之间的结合强度。

经试验证明，本发明的HAp-CSA-SF复合凝胶材料韧性高，促成骨成软骨效果好，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中羟基磷灰石纳米线表征图；其中，a和b为不同倍数下羟基磷灰石纳米线的SEM图；c，羟基磷灰石纳米线TEM图；d，羟基磷灰石纳米线HRTEM图。

图2为本发明实施例中SF面表征图；其中，a和b为不同倍数下SF面的SEM图；c和d为不同放大倍数下HAp面的SEM图，e为截面图；f为宏观图。

图3为本发明实施例中SF的X线衍射(XRD)；拉伸断裂实验应力-应变曲线；傅里叶红外光谱(FTIR)图。

图4为本发明实施例中CCK-8细胞增殖实验；a-f为细胞在对照TCP、SF凝胶和SF凝胶+8％CSA上进行的活死细胞染色图。

图5为本发明实施例中BMSCs在HAp/Silk复合凝胶支架上的成骨分化相关图，a-f,细胞骨架及免疫荧光染色示OPN及OCN在蛋白水平的表达；i和j,qRT-PCR示OCN及OPN在基因水平的表达。

图6为本发明实施例中MSCs在CSA-Silk复合凝胶支架上的软骨分化；其中，a-f为不同材料的甲苯胺蓝染色；g-i为qRT-PCR示COL2A，ACAN及SOX9在基因水平的表达图。

图7为本发明实施例中大体观察及国际软骨组织修复协会(ICRS)评分图。

图8为本发明实施例中Micro-CT分析软骨下骨组织改建情况图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；在本发明没有特别限定，均可通过商业途径购买得到。

正如背景技术所介绍的，现有的SF支架材料韧性差，支撑性能低。此外，在目前修复过程中，往往忽略了软骨和骨组织间的过渡，导致修复后软骨和骨之间的结合不牢固。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种HAp-CSA-SF复合凝胶材料，所述复合凝胶材料包括硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶层，以及在硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶层至少一个端面设置的羟基磷灰石富含层。

本发明的一个或多个具体实施方式中，所述纳米级羟基磷灰石可以为颗粒状、棒状或线状，如羟基磷灰石纳米颗粒、羟基磷灰石纳米棒、羟基磷灰石短纳米线和羟基磷灰石长纳米线，通过在硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶的一面形成HAp层，在软骨修复过程中，促进软骨和骨之间紧密结合，促进精确仿生式修复。

需要说明的是，羟基磷灰石富含层与硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶层的用量比例可根据待修复区域软骨厚度以及内层骨损伤程度等情况进行调整，从而为个性化骨组织修复奠定基础，在本发明的一个或多个具体实施方式中，所述羟基磷灰石富含层与硫酸软骨素-丝素蛋白复合凝胶层的质量比为0.5～2:1～50，例如1:2、1:5、1:10、1:20、1:25、1:30、1:40、1:50和1:100等。

研究发现，硫酸软骨素与丝素蛋白在适宜质量比条件下，能够更加有效促进软骨生成，提高软骨修复效率。因此在本发明的一个或多个具体实施方式中，所述硫酸软骨素与丝素蛋白的质量比为100：0.1～20，例如100:1、100:4、100:8、100:16、100:20；进一步优选为100:8。

本发明的一个或多个具体实施方式中，提供上述HAp-CSA-SF复合凝胶材料的制备方法，所述制备方法包括采用酸溶醇固法制备，具体包括：

HAp的制备：将油酸和乙醇混合，加入钙盐溶液，随后加入碱液，再加入磷酸氢钠溶液，搅拌，高温反应即得。

CSA-SF复合酸溶液的制备：制备丝素蛋白甲酸溶液，将硫酸软骨素添加至丝素蛋白甲酸溶液中。

本发明的一个或多个具体实施方式中，所述制备方法还包括将CSA-SF复合混合酸溶液置入承载有HAp的模具中，待酸液挥发冷却即得HAp-CSA-SF复合凝胶材料。

本发明的一个或多个具体实施方式中，所述制备方法还包括将上述制得的HAp-CSA-SF复合凝胶材料浸泡于无水乙醇中进行固化处理即得。

在本发明的一个或多个实施例中，所述钙盐为氯化钙，所述碱液为氢氧化钠溶液；因此，所述油酸、乙醇、氯化钙、氢氧化钠和磷酸氢钠的体积质量比为5～10ml：8～15ml：0.1～0.5g：0.2～1g：0.1～0.5g(优选为8ml：10ml：0.147g：0.5g：0.156g)。

本发明的一个或多个具体实施方式中，所述高温反应条为160～200℃反应5～20h(优选为180℃反应12h)；通过控制原料加入量以及反应条件，可以调控HAp的形貌，在本发明的优选条件下，所述HAp呈短纳米线状，其长度约为5μm,宽度约15nm，TEM结果显示其晶格宽度约0.817nm。在凝胶复合材料中的SF面，表面有一定的起伏，且相对致密，从而为其高韧性奠定基础。

本发明的一个或多个具体实施方式中，提供丝素蛋白甲酸溶液的制备方法为：将钙盐溶于甲酸溶液中，将蚕丝加入上述溶液中即得。

其中，所述钙盐为氯化钙，所述甲酸为88％(质量分数)甲酸溶液；所述氯化钙与蚕丝的质量比为0.2～1:1～2。所述蚕丝为蚕茧经脱胶处理后所得。

本发明的一个或多个具体实施方式中，硫酸软骨素与丝素蛋白的质量比为100：0.1～20，例如100:1、100:4、100:8、100:16、100:20；进一步优选为100:8。

本发明的一个或多个具体实施方式中，提供上述HAp-CSA-SF复合凝胶材料作为制备骨修复材料中的应用。所述骨修复材料进一步为软骨修复材料。

所述骨修复材料至少具有如下任一种或多种用途：

(a)促进骨/软骨生成；

(b)促进软骨下骨组织改建；

(c)提高骨体积分数(BV/TV)；

(d)提高骨小梁厚度(Tb.Th)；

(e)提高骨小梁数目(Tb.N)；

(f)降低骨小梁间隔(Tb.sp)。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例

实验材料方法：

(一)HAp-CSA-SF高韧性凝胶材料的制备与表征

1.脱胶将2.55g无水NaCO₃加入到煮沸的去离子水当中，等待完全溶解后，将3g剪碎的蚕壳倒入，并搅拌加热30min，取出脱胶之后的蚕丝，去离子水洗2～3次，并浸泡过夜，取出，室温晾干。

2.HAp短纳米线的制备

首先将8ml油酸和10ml无水乙醇混合，然后加入147mg的CaCl₂·2H₂O水溶液(6ml)，随后加入0.5g的NaOH水溶液(8ml)，再加入156mg的NaH₂PO₄·2H₂O水溶液(4ml)，搅拌10min。最后在180℃的烘箱中反应12h。用无水乙醇清洗后，获得HAp短纳米线。

3.溶解称量0.2～1g无水氯化钙，将其溶解于10～15ml 88％甲酸中，将1～2g蚕丝于上述溶液中并搅拌至完全溶解，将其倒入预先准备好的模具当中，至于通风橱中3～5小时至甲酸完全挥发。

4.固化将挥发完甲酸的凝胶浸泡于去离子水中半小时之后，再浸泡在无水乙醇中，固化。制备成丝素蛋白凝胶。

5.HAp-CSA-SF高韧性凝胶材料的制备蚕丝甲酸溶液中分别混合0％，4％，8％和16％的硫酸软骨素A(CSA)，将混合溶液倒入预先制备好HAp短纳米线层的模具中，待甲酸挥发后即制备成复合凝胶。

6.材料的表征通过扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)观察复合材料的超微结构；通过XRD(X射线衍射)、拉伸断裂实验以及FTIR(傅里叶红外光谱)分析材料的理化性质。

(二)体外实验研究研究负载CSA的SF-HAp高韧性凝胶材料对BMSCs生物学活性的影响

1.生物相容性检测

(1)将骨髓间充质干细胞(BMSCs)接种在负载不同浓度CSA的SF材料表面上，通过CCK-8检测细胞增殖情况。

(2)通过活死细胞染色检测细胞在材料上的生长情况。

2.成骨性能的检测

(1)分别将BMSCs接种在复合材料的HAp面和SF面上，进行矿化诱导，通过免疫荧光观察成骨指标OPN和OCN的表达情况。

(2)通过qRT-PCR检测OPN以及OCN在基因水平的表达情况。

3.成软骨性能的检测

(1)将细胞接种在负载了不同浓度CSA的SF表面上，甲苯胺蓝染色观察其体外成软骨效应。

(2)通过qRT-PCR检测成软骨指标COL2A，ACAN，SOX9在基因水平的表达情况。

(三)体内实验检测负载CSA的SF-HAp高韧性凝胶材料对成软骨分化、成骨分化以及关节骨软骨再生的作用

1.动物实验分为五组，分别为空白对照组(negative control)，单纯SF材料(SF组)，负载CSA的SF材料(SF+CSA组)，无CSA的复合材料组(SF+HAp)以及负载CSA的复合材料组(SF+CSA+HAp)。在8w龄的雄性SD大鼠的股骨滑车上建立直径和深度均为1.6mm的缺损，分别将上述材料放置在缺损当中。术后6周处死所有实验动物并取材。

2.大体标本观察以及运用国际软骨组织修复协会(international cartilagerepair society,ICRS)评分评价软骨再生情况。

3.处死大鼠后通过对不同组别的关节样本进行微计算机断层扫描(microcomputed tomography,micro CT),观察复合材料对关节软骨损伤所致软骨下骨改建的作用。

实验结果：

(一)材料表征

1.SEM结果显示，所制备的HAp短纳米线的长度约为5μm,宽度约15nm，TEM结果显示其晶格宽度约0.817nm(图1)。复合材料的SF面，表面有一定的起伏，且相对致密，这也为其高韧性奠定了基础；并且，截面图亦可以看出SF和HAp结合紧密而牢固；材料HAp面具备上述的短纳米线的特征；材料宏观图表明材料可以成任意的大小和形状(图2)。

2.XRD结果提示，复合材料表现出单纯HAp的特征晶像峰；拉伸-断裂实验显示当材料形变量达到60％时材料才发生断裂，并且，复合HAp之后，材料产生同等形变所需拉力更大，提示材料具备较好的韧性；FTIR结果表明复合材料具备HAp以及CSA的特征峰(图3)。

(二)体外实验

1.CCK-8细胞增殖实验结果表明负载高浓度(12％和16％)CSA的SF材料明显抑制细胞增殖；活死细胞染色结果提示与对照组TCP相比，SF材料以及8％CSA-SF材料表面均具备良好的生物相容性(图4)。

2.免疫荧光染色结果显示，HAp面可以明显的促进OPN以及OCN在蛋白水平的表达；进一步的qRT-PCR结果发现，HAp可以明显促进OPN以及OCN在基因水平的表达(图5)。

3.通过甲苯胺蓝染色观察到，与对照组以及其他实验组相比，负载8％硫酸软骨素的SF材料使甲苯胺蓝染色更加明显，成软骨特征更为明显；qRT-PCR结果发现，与对照组相比，负载8％硫酸软骨素的SF材料明显促进成软骨指标COL2A，ACAN以及SOX9的表达。(图6)

(三)体内实验

1.大体观察以及ICRS评分结果表明，与其他组相比，SF+CSA+HAp组成软骨效应更加明显，新生软骨充满缺损，并且与周围组织整合。(图7)

2.Micro-CT结果表明，，SF+CSA+HAp组软骨下骨改建效果较好，骨体积分数(BV/TV)，骨小梁厚度(Tb.Th)以及骨小梁数目(Tb.N)均明显增强，骨小梁间隔(Tb.sp)明显减少。(图8)

综上，本实施例成功制备的HAp-CSA-SF高韧性凝胶材料，具备成骨成软骨效应。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。