阅读说明：本技术 一种骨组织修复材料 (A kind of osseous tissue renovating material ) 是由 喻风雷 王彬 邓登谱 彭慕云 梁恒星 黄奇 钱邦伦 曾超 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于组织工程再生修复领域,公开了一种骨组织修复材料包括纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架和细胞因子。本发明所述骨组织修复材料中的纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架可高效负载细胞因子SDF-1和BMP-2,且对负载的细胞因子具有一定的缓释效果。纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架具有良好的生物相容性和细胞附着能力。纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架通过装载并释放SDF-1,获得优越的趋化和募集自体种子细胞的活性；通过负载BMP-2,改变局部微环境,诱导MSCs成骨分化。本发明所述骨组织修复材料通过纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架负载的两个细胞因子的协同作用,可以同时解决种子细胞和细胞外微环境的需求。(The invention belongs to organizational project Regeneration and Repair field, disclosing a kind of osseous tissue renovating material includes nano-particle modified more micropore cytoskeletons and cell factor.Nano-particle modified more micropore cytoskeletons in osseous tissue renovating material of the present invention can high-efficient carrier cell factor SDF-1 and BMP-2, and there is certain slow release effect to the cell factor of load.Nano-particle modified more micropore cytoskeletons have good biocompatibility and cell adhesive ability.Nano-particle modified more micropore cytoskeletons are by loading and discharge SDF-1, obtaining superior chemotactic and raising the activity of self seed cell；By loading BMP-2, changes local microenvironment, induce MSCs Osteoblast Differentiation.The synergistic effect for two cell factors that osseous tissue renovating material of the present invention is loaded by nano-particle modified more micropore cytoskeletons, can solve the demand of seed cell and extracellular microenvironment simultaneously.)

一种骨组织修复材料

技术领域

本发明属于组织工程再生修复领域，具体涉及一种骨组织修复材料。

背景技术

先天性畸形、严重创伤、成骨不全和恶性肿瘤扩大手术切除等疾患均有 可能导致大面积组织缺损，而组织缺损修复重建是目前重建外科医生所面临 的一大难题，与其紧密相关的组织再生修复研究也是当前基础医学研究领域 最具广泛发展前景的研究方向之一。而由于骨组织在解剖结构和功能主要是 支撑和保护其他组织脏器，如胸壁骨骼，其承载的微观生理功能相对较少， 骨组织修复重建只需要恢复其解剖支撑结构即能满足基本的功能需求。由此 可见，骨性缺损修复重建是目前组织再生修复研究中最接近临床应用的方向。

临床实践中，面对较大尺寸的骨缺损，外科医生在重建修复手术中需要 及时有效地对缺损的骨性结构进行置换和植入，以最大程度的恢复其结构和 生理功能。传统的外科骨性重建策略主要包括自体骨移植、同种异体移植物 和人工植入物的使用。自体移植物作为骨移植物的金标准，具有最佳的组织 相容性优势，但存在取材受限，手术操作较复杂等缺点，不适用于大范围的 骨性缺损重建。与自体移植相比，同种异体植入物移植存在免疫反应和感染 传播的相关风险，而人工植入物对于处于生长发育阶段的个体而言，需要多次重建手术以适应机体生长的需求。随着近年来再生医学和组织工程研究领 域的快速发展，组织工程学骨修复重建被认为是最有潜力的替代方案，组织 工程学骨修复重建具有其独特的优势，例如可无限供应，无排异反应，避免 疾病传播以及可自适应生长发育的需求等。骨组织工程的关键要素是再生修 复的种子细胞和用于细胞粘附、增殖和分化的支架材料。以往的研究策略往 往未能兼顾种子细胞、支架和ECM多个要素。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种骨 组织修复材料，以解决种子细胞和细胞外微环境的需求。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种骨组织修复材料，其特征在于，包括纳米颗粒修饰的多微孔细胞支 架和细胞因子。

本发明所述的骨组织修复材料中所述纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架由 带正电荷且能够被化学交联的纳米颗粒与明胶-壳聚糖-琼脂糖多微孔细胞支 架材料结合而成。

作为优选，所述纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架中所述纳米颗粒为壳寡 糖/肝素纳米颗粒。

作为优选，所述纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架中所述明胶-壳聚糖-琼脂 糖多微孔细胞支架材料由壳聚糖、明胶和琼脂糖采用化学交联冷冻凝胶法制 备得到，所述明胶-壳聚糖-琼脂糖含量为4～5wt％，所述壳聚糖、明胶和琼脂 糖的质量比为1:1:(2～3)。

在一些实施方案中，所述化学交联冷冻凝胶法制备明胶-壳聚糖-琼脂糖多 微孔细胞支架具体为壳聚糖完全溶解于醋酸溶液后加入明胶充分混匀溶解， 加入琼脂糖水溶液混匀，并在混匀过程中逐滴加入5％(v/v)戊二醛溶液进行交 联，然后置于-14℃下孵育16小时制备冷冻凝胶，室温解冻制备出多微孔细胞 支架。

在一些实施例中，按mg/ml计，所述明胶与所述5％(v/v)戊二醛溶液的质 量体积比为150：1至250：1。

在一些实施方案中，所述的骨组织修复材料中，所述纳米颗粒修饰的多 微孔细胞支架的制备方法为纳米颗粒重悬于水后得到纳米颗粒悬浮液，明胶- 壳聚糖-琼脂糖多微孔细胞支架材料加入纳米颗粒悬浮液中37℃震荡6小时， 加入5％的戊二醛37℃反应20min，清洗后冷冻干燥。

作为优选，本发明所述的骨组织修复材料中所述细胞因子为SDF-1和/或 BMP-2。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种骨组织修复材料包括纳米颗粒 修饰的多微孔细胞支架和细胞因子。本发明所述骨组织修复材料中的纳米颗 粒修饰的多微孔细胞支架可高效负载细胞因子SDF-1和BMP-2，且纳米颗粒 修饰的多微孔细胞支架材料对负载的细胞因子具有一定的缓释效果。CSO/H 纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架具有良好的生物相容性和细胞附着能力。纳 米颗粒修饰的多微孔细胞支架通过装载并释放SDF-1，获得优越的趋化和募 集自体种子细胞的活性；纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架通过负载BMP-2， 改变局部微环境，诱导MSCs成骨分化。本发明所述骨组织修复材料通过纳 米颗粒修饰的多微孔细胞支架负载的两个细胞因子的协同作用，可以同时解 决种子细胞和细胞外微环境的需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1多微孔细胞支架的肉眼外观(A)和SEM图像(B，400 ×，bar＝200μm)；扫描电镜下多微孔细胞支架切面呈现出薄壁的不规则的类 蜂窝状多孔结构；

图2示实施例1被CSO/H纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架的SEM图像； A：10000×，bar＝5μm；B：25000×，bar＝3μm，纳米颗粒呈微球形，均匀分 布于多微孔细胞支架表面；

图3示实施例2WST-8化学结构和反应原理图；

图4示实施例2CCK-8测定用于评估NP修饰的多微孔细胞支架或未修饰 的支架对MSC的细胞毒性作用的模式图像；

图5示实施例2各组细胞增殖曲线图，n＝5；

图6示实施例3纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架的细胞附着评价图；

图7示实施例4使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测来自纳米颗粒修饰的 多微孔细胞支架的SDF-1和BMP-2的释放曲线，SDF-1早期呈爆发释放第4天后 释放逐渐趋于平稳，BMP-2释放趋势相较于SDF-1而言更趋平缓，但在第10天 开始BMP-2累及释放量多于SDF-1(n＝3)；

图8示实施例5Transwell细胞迁移实验模型评价纳米颗粒修饰的多微孔 细胞支架释放的SDF-1对MSCs体外的趋化活性的模式图像；

图9示实施例5使用体外Transwell细胞迁移模型评价从纳米颗粒修饰的 多微孔细胞支架释放SDF-1诱导干细胞的定点迁移的能力，其中图(A)仅针 对SDF-1，细胞支架的转移的MSC的代表性图像，在Transwell测定中具有 加载的SDF-1的-NP对照和NP修饰的支架；图(B)孵育12、24、48和72 小时后Transwell迁移测定中的平移MSC的平均数，结果是来自三个独立实 验的五个不同视野的平均值±SD，*p<0.05，**p<0.01，n＝15(结果是来自三个标本的五个不同视野的细胞数均值±SD)；

图10示实施例6MSCs成骨诱导实验评估纳米颗粒修饰的多微孔细胞支 架释放的BMP-2的成骨诱导活性模式图像；

图11示实施例6经过长达21天孵育后的MSCs的碱性磷酸酶(ALP)活 性的分析和茜素红染色的结果图；图(A)示接种到24孔板中并与材料一起 培养长达21天的MSC的ALP活性分析图，结果表示为平均值±SD，每组的* p<0.05；图(B)示在支架上接种长达21天的MSC的茜素红染色结果图：将 纳米-支架组与最小培养基一起孵育，并将阳性对照(+)组与骨诱导培养基一 起孵育；

图12示实施例7纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架释放SDF-1的体内募集 MSC的效果图，n＝3。

具体实施方式

本发明公开了一种骨组织修复材料。本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领 域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法 及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内 容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和 应用本发明技术。

在一些实施方案中，本发明对纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架材料的生 物相容性评估主要通过两个方面进行：第一：采用CCK-8试剂盒测定来定量 评估纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架或未被纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架 对MSCs的细胞增殖的影响；第二：通过将GFP标记的MSCs接种于纳米颗 粒修饰的多微孔细胞支架材料后，通过倒置荧光显微镜观察接种的细胞的有 无附着、细胞形态以及细胞密度来进行定性评估纳米颗粒修饰的多微孔细胞 支架材料作为细胞支架的可能性。结果显示，纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架对MSCs增殖无明显抑制作用，并能够有效附着种子细胞，具有良好的细 胞相容性。GFP标记的MSCs可附着于纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架材料 表面和微孔中，细胞展开呈星状、梭形或多突状，细胞处于健康形态，且密 度较高。表明纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架是MSCs良好的附着支架，具 有优异的细胞相容性。

在一些实施方案中，本发明使用Transwell细胞迁移实验评估纳米颗粒修 饰的多微孔细胞支架多微孔细胞支架释放的SDF-1在体外诱导趋化MSCs的 能力。通过棉签擦出聚碳酸酯膜上侧细胞后，并用结晶紫膜下侧的细胞染色 来定量评价MSCs的迁移数量。结果显示负载于纳米颗粒修饰的多微孔细胞 支架后，SDF-1可以长时间保持其生物活性，持续发挥趋化干细胞的作用。

在一些实施方案中，本发明使用MSCs成骨诱导实验评估纳米颗粒修饰 的多微孔细胞支架释放的BMP-2在体外诱导MSCs成骨分化的能力。通过成 骨诱导测定法检测从NP修饰的支架释放的BMP-2的活性。结果显示纳米颗 粒修饰的多微孔细胞支架负载的BMP-2持续释放可能连续发挥成骨诱导活 性。通过茜素红对细胞染色进一步定性评估钙沉积和钙结节的程度。结果表 明支架或纳米颗粒对促进MSCs成骨分化没有明显的活性。而负载细胞因子 的纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架也显示出更显著的阳性染色结果，呈现最 深的茜素红染色结果，表明纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架和细胞因子在骨 诱导中起到明显的协同效果。

在一些实施方案中，本发明采用小动物活体应该成像系统(Spectrum In VivoImaging System，IVIS)评价纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架释放SDF-1 的体内募集MSC的活性。结果显示单纯的纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架无 明显的MSCs趋化活性。表明从纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架释放的SDF-1 可以在体内募集MSCs超过2周。通过释放的SDF-1募集MSC可能是为组织 修复再生种子细胞来源的更好的解决方案。

体外MSCs迁移实验和体内MSCs募集研究显示纳米颗粒修饰的多微孔 细胞支架释放的SDF-1具备强的趋化能力，携带SDF-1的纳米颗粒修饰的多 微孔细胞支架可以在体内长时间募集自体MSCs，获得优越的趋化和募集自体 种子细胞的活性。而通过BMP-2的持续释放可为骨组织修复提供更有利的细 胞外微环境。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一 部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技 术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发 明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通 过商业渠道购买获得。所用水均为去离子水。所述壳寡糖/肝素纳米颗粒采用 申请号为201510235782.1的中国专利公开的方法制备。本研究中均采用 GraphPad Prism version6(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)统计学软件进 行分析，所有结果认为P值<0.05的差异具有统计学意义。所有计量资料的结 果都用均数±标准差表示。两组及多组计量资料采用Student’s-test和One-way ANOVA分析。

实施例1、纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架

1、采用化学交联冷冻凝胶法制备明胶-壳聚糖-琼脂糖多微孔细胞支架材料。

使用明胶作为底物，以5％(v/v)戊二醛为化学交联剂与壳聚糖进行交联， 而琼脂糖在低温下具有自凝胶的性质，三者结合制备多微孔细胞支架。

(1)50ml离心管中加入5ml 1％(v/v)的醋酸溶液，电子天平称量100mg 壳聚糖，将其加入上述醋酸溶液中，充分震荡，使其完全溶解。

(2)壳聚糖完全溶解于醋酸溶液后，称量100mg明胶粉末加入其中，加 入过程中保持离心管摇动。摇匀后置入烤箱40℃恒温干燥灭菌烤箱30分钟。 使壳聚糖和明胶其充分混匀并溶解。

(3)称取定量的琼脂糖粉末(200mg)置于5ml双蒸水(ddH₂O)，微 波炉加热至其充分溶解(溶液变澄清透明表明已充分溶解)。

(4)将琼脂糖溶液在室温下冷却至50-60℃后，加入壳聚糖-明胶溶液中 充分震荡混匀，混匀过程中逐滴加入0.5ml 5％(v/v)戊二醛溶液用于化学交联。 混匀后将溶液立即倒入5ml塑料注射器中。

(5)置于-14℃温度(低温恒温器)下孵育16小时制备冷冻凝胶。之后， 将冷冻凝胶在室温的去离子水中解冻，并从塑料注射器模具中取出即制备出 多微孔细胞支架。将多微孔细胞支架浸泡与装有150ml去离子水的烧杯中， 并低速在振荡器上洗涤过夜以冲洗交联剂的未反应的醛基。多微孔细胞支架 在室温下干燥以研究其物理和化学行为以及生物相容性的检查。

(6)扫描电子显微镜表征多微孔细胞支架，SEM结果见图1。

多微孔细胞支架的宏观外形(图1A)可见其是半透光的、淡黄色的偏脆 性的固体材料，经60℃无菌烤箱干燥2小时后基本形状和机械性能没有明显 变化，而在经PBS缓冲液浸润后脆性降低，弹性增加。多微孔细胞支架材料 的切面肉眼略微可见呈微孔状。SEM下的微观结构显示(图1B)，电镜下多 微孔细胞支架的微观切面由平均大小约为100μm的互连微孔和薄壁构成的不 规则蜂窝状形貌结构(图1B)。从微观形貌上，多微孔细胞支架表现出细胞 支架的理想特征，三维的、多微孔的互连结构。

对多微孔细胞支架孔隙率，溶胀率、液体流率以及体外降解速率进行测定， 结果显示多微孔细胞支架孔隙率为82％，溶胀率为15.03，液体流率＞10 ml·min^-1，表明多微孔细胞支架均具有高孔隙率、溶胀率和液体流率，适用于 细胞粘附，浸润和增殖。

2、壳寡糖/肝素纳米颗粒与多微孔细胞支架材料的结合

(1)准确称取5mg壳寡糖/肝素纳米颗粒至离心管中，双蒸水溶解，乙 酸滴定纳米颗粒悬浮液。

(2)从原始多微孔细胞支架样品裁取成固定大小的圆柱状(直径:13mm、 厚度:2mm)，并通过分析天平进行称重并记录。超声波漂洗5分钟，加入纳 米颗粒悬浮液离心管中。

(3)将离心管置于37℃恒温水浴震荡器中(60rpm)，物理自组装使纳 米颗粒与多微孔细胞支架上明胶相互吸附，6小时后进行下一步处理。

(4)加入5％的戊二醛，使纳米颗粒与多微孔细胞支架进一步交联，37℃ 反应20min。PBS缓冲液清洗5分钟×3次。

(5)将结合了纳米颗粒的多微孔细胞支架材料进行冷冻干燥处理后，对 结合了纳米颗粒的材料进行称重。测定与纳米颗粒结合前后多微孔细胞支架 的质量差以计算纳米颗粒的结合量。

(6)扫描电镜观察多微孔细胞支架与纳米颗粒的结合情况，扫描电子显 微镜(Hitachi S-3400N，日本)获取图象(图2)。

结果显示，多微孔细胞支架均可被壳寡糖/肝素纳米颗粒(CSO/H NP) 修饰，纳米颗粒结合量达到17.52±4.16μg·mg^-1，表明多微孔细胞支架结合纳 米颗粒的能力较强。

实施例2、细胞增殖试验评价纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架的细胞毒性 (CCK-8法)

Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)是检测细胞增殖、细胞存活和细胞 毒性的试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用快速高灵敏度检测试剂盒，为 MTT法的替代方法，试剂盒中采用水溶性四唑盐-WST-8，在电子耦合试剂存 在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan(图3)。 细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的 细胞，颜色的深浅和细胞数目呈良好线性关系。具体操作如下：

(1)饥饿处理细胞系：待检测增殖实验的细胞系用不含血清的纯细胞培 养基“饥饿”处理6小时后，种板到24孔细胞培养板。

(2)接种细胞：将对MSCs用1ml胰蛋白酶消化，加含血清的培养基3ml 中和，并轻轻吹打，使其脱壁，细胞重悬后，用细胞计数仪进行计数，24孔 细胞培养板每孔5000个MSCs，加入完全培养基至每孔400μl，每组设置5 个重复孔，共三组(空白组，明胶-壳聚糖-琼脂糖多微孔细胞支架组(支架组)， 纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架组(纳米-支架组))，设置0、24、48、72、 96、120小时的时间间隔(设置在6个24孔细胞培养板内)。

(3)细胞培养：37℃，5％CO₂细胞培养箱培养。培养第二天各组细胞均 已贴壁，设置为0小时。取0时的24孔板，向每孔加入40μL CCK-8溶液， 本步骤要注意避免生成气泡，气泡会折光影响O.D值。

(4)将培养板在培养箱内孵育2小时(37℃，5％CO₂的条件下)。

(5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD值)作为基础值。

(6)分组处理：在剩余的5块24孔板置入定制的小室(图4)，三组分 别予以不同处理：A组，空白组，不做任何处理；B组，多微孔细胞支架组(支 架组)，小室内置入未结合纳米颗粒的多微孔细胞支架材料；C组，纳米颗 粒修饰的多微孔细胞支架组(纳米-支架组)，小室内置入纳米颗粒修饰的多 微孔细胞支架材料。

(7)在第24、48、72、96、120小时按0小时相同步骤测出吸光度值， 且每次孵育的时间和0小时时间点一致，均为2min。

(8)绘制三组的细胞生长曲线：横坐标是各时间点，纵坐标是吸光度值 或者活细胞相对数量。

纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架材料对MSCs的增殖影响的评估是通过 将支架材料与MSCs共孵育来评估(图4)。孵育过程中，纳米颗粒修饰的多 微孔细胞支架材料浸没于培养基中，但不与细胞直接接触。以免孵育过程中 部分MSCs附着于材料，影响最终结果的精确性。三组MSCs分别培养5天， 各组细胞增殖曲线如图5所示。

结果显示，3组中MSCs的增殖速度在第1天和第2天没有显着差异。在 第3-5天，纳米修饰的多微孔细胞支架组(纳米-支架组)和对照组之间的增 殖能力存在显着差异(p<0.05)，但两组细胞的OD值在最后3天呈交替上 升。而多微孔细胞支架组(支架组)和对照组之间的OD值仅在第3天有显 着差异，并且总体上，两组中MSC的增殖能力没有显着差异。表明纳米修饰 的支架或未被修饰的支架显示对MSCs没有显着的细胞毒性，对MSCs的增 殖影响不显著。

实施例3、纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架的细胞附着评价

纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架作为一种用于组织修复再生的细胞支 架，其最重要的一项功能就是可以被干细胞附着。细胞附着之后才能够进一 步进行增殖和分化，并在细胞因子的作用下，促进组织修复再生。为了评估 纳米颗粒修饰多微孔细胞支架的细胞黏附性能，将GFP标记的MSCs接种到 支架上，然后孵育一定时间后，在倒置荧光显微镜下观察细胞的形态和附着 情况。具体操作如下：

(1)饥饿处理细胞系：取汇合度80％左右的GFP标记MSCs。用不含血 清培养基“饥饿”处理6-8小时。

(2)将已消毒灭菌并进行干燥处理的支架材料置入24孔细胞培养板中。

(3)接种细胞：将MSCs用1ml胰蛋白酶消化1分钟后，加含血清的培 养基3ml中和，并轻轻吹打，使其脱壁。细胞重悬后，用细胞计数仪进行计 数。取10000个GFP标记的MSCs缓慢滴入材料表面，待其逐渐浸入支架中。 每孔再加入完全培养基400μl。

(4)然后将接种了GFP标记MSCs的支架在24孔板中，置入在37℃的 潮湿的5％CO 2培养箱中孵育2天。通过评估附着于支架的细胞密度和附着 的细胞的形态来定性评价材料的细胞可附着性。结果见图6。

结果显示了附着于支架的高密度MSC，从图中可见GFP标记的MSCs可 附着于材料表面和微孔中，细胞展开呈星状、梭形或多突状，可推断细胞处 于健康形态，且密度较高。结果表明纳米修饰的多微孔细胞支架是MSCs良 好的附着支架，具有优异的细胞相容性。

实施例4、细胞因子与多微孔细胞支架表面纳米颗粒结合和体外释放

(1)将BMP-2或者SDF-1稀释并配制成不同浓度细胞因子溶液。将纳 米修饰的多微孔细胞支架完全浸没于细胞因子悬液中，37℃恒温水浴震荡器 (60rpm)6h，使其充分负载。移除纳米修饰的多微孔细胞支架后。通过细胞 因子ELISA试剂盒测定溶液中残余的细胞因子含量，并计算负载效率。公式 如下：

包封率＝(A–B)/A×100％

载药率＝(A-B)/C×100％

公式中，A为细胞因子总质量；B为负载完成后残留细胞因子质量；C为 纳米颗粒质量。

(2)细胞因子体外释放试验

①将各组装载细胞因子纳米修饰的多微孔细胞支架置于10mlPBS缓冲液 中，置入37℃，60rpm恒温水浴箱内，无菌环境中进行震荡孵育；

②孵育预定的时间后，从离心管中移出纳米修饰的多微孔细胞支架置入 新的10mlPBS缓冲液中。原来的PBS样本各自取样1ml后-20℃冷冻保存， 按时间和分组对样本进行标记；

③此后按照设定的时间点进行取样并更新孵育液体。依次放入编号的样 品管中，冷冻保存；

④取样周期为15天。所有样本从-20℃冰箱取出，按ELISA检测试剂盒 说明书进行细胞因子定量分析，计算细胞因子的累计释放量。

(3)细胞因子ELISA检测实验

使用前将所有试剂和样品置于室温下进行复温。洗涤缓冲液需待瓶中晶 状体完全溶解后再用去离子水按1：25(vol：vol)的比例稀释后使用。

①按照前面部分的说明准备所有试剂，工作标准和待测样品。从板框上 取下多余的微孔板，将它们放回装有干燥剂包的铝箔袋中，然后重新密封。

②向每个孔中加入100μLAssayDiluent RD1-55。

③每孔加入100μL标准品，对照品或待测样品，用试剂盒中的胶条覆盖 密封。室温下在转速设定为500±50r/min的水平轨道微孔板振荡器上孵育2小 时。

④吸去每个孔的液体，并采用稀释后的洗涤缓冲液(400μL)填充每个孔 进行洗涤，然后完全吸去洗涤缓冲液，重复该过程三次，共洗涤四次。在每 个步骤中必须完全去除洗涤缓冲液，否则会影响结果的精确性。最后一次洗 涤后，通过抽吸除去任何剩余的洗涤缓冲液。翻转孔板在干净的的纸巾上吸 去残余液体。

⑤向每个孔中加入200μL人细胞因子缀合物。再次盖上胶条。室温下在 转速设定为500±50r/min的水平轨道微孔板振荡器上孵育2小时。

⑥如步骤④中那样重复抽吸/洗涤四次。

⑦每孔加入200μL底物溶液。在室温下在避光孵育30分钟。

⑧每孔加入50μL终止液。孔中的颜色应从蓝色变为黄色。如果孔中的颜 色为绿色或颜色变化不均匀，可轻轻敲打板以确保彻底混合。

⑨吸光度测定：使用设置为450nm的酶标仪，在30分钟内确定每个孔的 吸光度(optical density，OD)值。校正波长设置为540nm或570nm。根据 预设的标准品浓度和测定的标准品浓度绘制标准曲线，再根据标准曲线和待 测样品的OD值计算待测样品中细胞因子浓度。

表1CSO/H纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架的细胞因子负载效率

Group<sup>*</sup>	2μg/mg	1μg/mg	500ng/mg	250ng/mg
					SDF-1EE(％)	89.54±1.39	94.37±1.48	94.41±1.37	93.53±1.87
BMP-2EE(％)	82.73±2.95	92.67±1.82	92.85±1.52	93.78±1.25

*每mg纳米颗粒分别负载2μg、1μg、500ng和250ng细胞因子

表1结果显示了纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架的细胞因子负载效率。 纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架具有较高的SDF-1和BMP-2负载效率(超过 80％)。细胞因子的生理浓度远低于100ng/ml。因此，细胞因子负载量足以 满足组织工程的需要。

加载在纳米颗粒修饰支架中的细胞因子(SDF-1和BMP-2)的体外释放曲 线显示在图7中。具有加载的SDF-1的纳米颗粒修饰的支架在前3个检测时间点 显示典型的初始爆发性释放。5天后表现出缓和释放模式。相比之下，BMP-2 的释放曲线显示出类似于药代动力学中的零级释放模式，整体释放趋势更平 稳。然而，装载有SDF-1和BMP-2的纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架均有效地 实现超过15天的持续释放。细胞因子负载于纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架 后，可长时间保持持续释放的细胞因子的生物活性。

实施例5、评估纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架释放的SDF-1的趋化活性(Transwell法)

使用Corning公司的Transwell小室研究纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架 释放的SDF-1的趋化活性，小室的底部是聚碳酸脂膜，通过计数穿过小室底 部的细胞数量来反映细胞的迁移能力。Transwell小室内称为上室，上室加入 计数好的细胞悬液，将小室放入专用培养板，培养板内称为下室，下室根据 实验目的置入不同的干预因素，可对上室的细胞产生相应的生物学效应。聚 碳酸脂膜有8μm大小的微孔，细胞可经微孔迁移至聚碳酸酯膜的下表面，通 过计数聚碳酸酯波下面的细胞数来判断干预因素对细胞的趋化能力(图8)。

具体方法如下：

(1)饥饿处理MSCs：待实验的细胞系用不含血清培养基“饥饿”处理6 小时后进行迁移实验。

(2)分别在transwell上、下室分别加入200μl，600μl无血清培养基，37℃， 5％CO₂细胞培养箱孵育30min后，吸弃培养基。

(3)取对数期MSCs用1ml胰蛋白酶消化，加入3ml 10％血清浓度培养 基中和，并轻轻吹打，使其脱壁。吸取1ml细胞悬液到1.5mlEP管，800rpm 离心5min，加1ml的1×PBS溶液重悬后800r/分钟再离心3min，重复PBS溶 液洗涤细胞一次，加入1ml含2％血清培养基重悬，计数细胞后，调整细胞细 胞密度至2.5×10⁵个/ml。

(4)上室加200μl细胞悬液，下室加600μl 2％血清浓度培养基，并分三 组处理：A组加入未负载细胞因子的纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架；B组加 入单独的SDF-1；C组加入负载SDF-1的纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架；

(5)37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育至预定时间点(12小时、24小时、 48小时以、72小时)。

(6)37℃孵育至预定的时间后，达到预定时间点取出小室，吸去小室内 培养基，用棉签拭去上室面未穿过细胞，1×PBS溶液清洗后，用5％戊二醛固 定30min，PBS洗两遍，0.1％的结晶紫染色30min，1×PBS溶液漂洗，晾干。

(7)倒置显微镜拍照计数聚碳酸酯膜背面迁移的细胞数。随机计数中间 及四周5个视野的细胞数。

如图9的结果所示：A组在四个时间点迁移的MSCs数量均明显低于B、 C两组。表明单纯的纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架对MSCs没有明显的趋 化作用，影响细胞跨膜数量的主要因素是SDF-1对MSCs的趋化作用，因此 跨膜细胞数量明显低于其他两组。而B组和C组之间跨越跨膜的MSC的数 量在孵育48小时之后才出现明显统计学差异(p<0.01，图9)，表明C组的 SDF-1发挥趋化活性的时间明显长于B组。该实验结果表明，负载于纳米颗 粒修饰的多微孔细胞支架后，SDF-1可以长时间保持其生物活性，持续发挥 趋化干细胞的作用。

实施例6、成骨诱导实验评价纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架释放的BMP-2 成骨诱导活性

使用成骨诱导实验研究纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架释放的BMP-2的 诱导MSCs的成骨活性。设置4个分组：A组，空白的纳米颗粒修饰的多微 孔细胞支架组；B组：BMP-2组，单纯加入BMP-2进行诱导；C组：纳米颗 粒修饰的多微孔细胞支架&BMP-2组，置入载有BMP-2的纳米颗粒修饰的多 微孔细胞支架进行诱导；D组：阳性对照组，采用成骨诱导液进行诱导。通 过成骨诱导测定法检测从NP修饰的支架释放的BMP-2的活性。具体操作如 下：

(1)将C57BL/6小鼠骨髓间质干细胞置于37℃，5％CO₂的培养箱中培 养。

(2)当细胞融合度达到80-90％时，用0.25％Trypsin-0.04％EDTA进行消 化。

(3)将消化下来的MSC(4×10⁴)接种于具有正常培养基的24孔板的每 个孔中。24孔板事先包被0.1％明胶，每孔加入400μl完全培养基。

(4)将细胞置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养。

(5)当细胞融合度达到60％-70％时，小心的将孔内完全培养基吸走。分 别按照预设的4个分组予以干预，A、C两组支架置于定制小室中，避免与 MSCs直接接触(图10)。

(6)每隔3天换用A、B、C组用完全培养基半量换液，D组使用MSCs 成骨诱导分化完全培养基半量换液(使用前需预热至37℃)。

(7)在37℃加湿的5％CO 2培养箱中孵育预定的时间(7天、14天和 21天)后，使用ALP微孔板测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)测量每 个孔中的碱性磷酸酶活性。每孔中的样品用0.1％茜素红染色并用显微镜成像。 结果见图11。

图11A结果显示，在缺乏诱导培养基的A组(纳米-支架组)的组中观察 到比在其他组中低得多的ALP活性，这意味着纯支架或来自支架的纳米颗粒 并无诱导MSCs早期成骨的活性。相反，其他组(B组，BMP-2组；C组， 载有BMP-2的纳米-支架组；D组，阳性对照组)显示出明显的ALP阳性结 果(与A组相比，p<0.05)。而暴露于C组(载有BMP-2的纳米-支架组) 细胞的ALP活性在第7天表现出与B组(BMP-2组)的相似的ALP活性。 然而，C组ALP活性增长速度较快，在第14天和第21天，ALP活性明显高 于B组(p<0.01)，并且在14天内接近D组(阳性对照组)(p<0.05)。 由此可见，纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架负载的BMP-2持续释放可能连续 发挥成骨诱导活性，并且负载BMP-2的组中的ALP活性最终在第21天超过 D组，但差距并不显著(p＝0.09)。

通过茜素红对细胞染色进一步定性评估钙沉积和钙结节的程度。在接种 MSC后7天、14天和21天对细胞茜素红染色结果如图11B所示，B组(BMP-2 组)、C组(载有BMP-2的纳米-支架组)和D组(阳性对照组)显示明显 的茜素红阳性染色，而A组(纳米-支架组)细胞在持续孵育21天后几乎没 有阳性染色。结果表明支架或纳米颗粒对促进MSCs成骨分化没有明显的活 性。与B组相比，从C组在第14天和第21天也显示出更显著的阳性染色结 果。更重要的是，C组在孵育21天后在四组中呈现最深的茜素红染色结果， 这意味着相对于B组单独BMP-2干预而言，C组纳米颗粒修饰的多微孔细胞 支架和细胞因子在骨诱导中起到明显的协同效果。

实施例7、IVIS评估纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架释放SDF-1的体内趋化 活性

使用小动物活体荧光成像系统研究纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架释放 的SDF-1的体内募集MSCs活性。设置A、B两组：A组在皮下植入负载SDF-1 的纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架；B组皮下植入未负载细胞因子的纳米颗 粒修饰的多微孔细胞支架(对照组)。具体操作如下：

(1)取雄性7周龄BALB/c裸鼠(湖南斯莱克竟达实验动物有限公司提 供)，按照设置的分组分别接受材料植入手术：在用戊巴比妥(50mg/kg) 麻醉后，镊子提起裸鼠背部皮肤，眼科剪横向剪开皮肤，切口长度约1cm。 镊子提起切口皮缘，眼科剪钝性分离皮下筋膜至肌层。继续钝性分离扩大皮 下空间，按分组要求植入材料后，1#丝线连续缝合皮肤切口。

(2)重悬细胞：取汇合度80％左右的GFP标记MSCs。用不含血清培养 基“饥饿”处理6-8小时后。吸去培养基，2mlPBS缓冲液冲洗一遍。加入1ml 胰酶消化液，37℃孵育2分钟，加入3ml完全培养基中和消化液。细胞计数 后800r/分钟离心3分钟。用生理盐水将GFP标记MSCs稀释至1×10 ⁷个/ml。

(3)在预定时间点(1天、3天、7天、10天、15天和18天分组)后， 将100μl中的1×10⁶个GFP-MSC注射到尾静脉中。细胞注射后48小时，七 氟烷气体麻醉后，通过小动物活体成像系统光谱(IVIS Spectrum，PerkinElmer) 下观察小鼠并成像，通过植入位置的绿色荧光强度定性评估SDF-1的对MSCs 的在体内募集效果。实验结果如图12所示。

结果显示，在最初的10天内，A组小鼠背部激发了相对高的荧光亮度， 荧光在第15天变得更弱，然后最终消失。相反，B组在所有时间点都没有显 示荧光，由此可见单纯的纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架无明显的MSCs趋 化活性。该结果表明从纳米颗粒修饰的多微孔细胞支架释放的SDF-1可以在 体内募集MSCs超过2周。通过释放的SDF-1募集MSC可能是为组织修复再 生种子细胞来源的更好的解决方案。