Hla-g转录物和同种型及它们的用途

文档序号：1539150 发布日期：2020-02-14 浏览：43次 >En<

阅读说明：本技术 Hla-g转录物和同种型及它们的用途 (HLA-G transcripts and isoforms and their uses ) 是由 E·D·卡罗塞拉戴安娜·特罗尼克-勒·鲁简-菲利普·戴斯里斯杰罗姆·韦瑞尼弗朗索瓦· 于 2018-07-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及HLA-G分子及其治疗用途的领域。本发明涉及新的HLA-G同种型,即衍生自HLA-G基因的新的RNA转录物和蛋白质,包含其的药物组合物,以及这些转录物的特异性引物和这些蛋白质的特异性抗体。本发明进一步涉及这些分子的诊断或治疗用途。(The present invention relates to the field of HLA-G molecules and their therapeutic uses. The present invention relates to novel HLA-G isoforms, i.e., novel RNA transcripts and proteins derived from HLA-G genes, pharmaceutical compositions comprising the same, as well as primers specific for these transcripts and antibodies specific for these proteins. The invention further relates to the diagnostic or therapeutic use of these molecules.)

HLA-G转录物和同种型及它们的用途

技术领域

本发明涉及HLA-G分子及其治疗用途的领域。本发明涉及新的HLA-G同种型，即衍生自HLA-G基因的新的RNA转录物和蛋白质，包含其的药物组合物，以及这些转录物的特异性引物和这些蛋白质的特异性抗体。本发明进一步涉及这些分子的诊断或治疗用途。

背景技术

HLA-G是具有有效免疫调节活性的HLA Ib类分子，其在需要调节免疫反应以避免同种异体移植识别(即母胎界面或移植患者)的生理条件下表达。HLA-G首先被描述在维持妊娠中起关键作用[1]，并发现其在绒毛外细胞滋养层细胞中的胎儿母体界面中组成性表达。

HLA-G具有耐受原(tolerogenic)作用，通过与T或B淋巴细胞、NK细胞或多形核细胞相互作用来调节适应性免疫和天然免疫。这种作用是通过α3结构域将完全可溶的同种型和膜结合的同种型直接与抑制性受体结合而介导的。实际上，髓系的B和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞表达免疫球蛋白质样转录物ILT2(CD85j，ILIRB1)[15]；单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞表达ILT-4(CD85d，LILRB2)[16]。杀伤细胞免疫球蛋白质样受体(KIR2DL4/p49)对HLA-G具有特异性，并由蜕膜NK细胞表达。与其他抑制性受体不同，其也可以介导激活[17，18]。另外，可溶性HLA-G通过CD8样经典的I类可溶性分子触发T细胞和NK细胞的凋亡[19]。

在正常情况下，HLA-G的表达仅限于一些组织，而在病理情况下则强烈增加。实际上，HLA-G在包括实体瘤和血液肿瘤的几种病理条件下高水平重新表达。已在不同的人类实体瘤和血液肿瘤中检测到膜结合的HLA-G和可溶性HLA-G的过表达，并且可能代表了肿瘤细胞通过抑制NK和T细胞介导的裂解而逃避免疫系统控制的机制。特别是，在最常见的人肾恶性肿瘤之一[4]的透明细胞肾细胞癌(ccRCC)中已报道了HLA-G表达的高发生率[2，3]。另外，在鼠模型中已经证明了HLA-G作为使得肿瘤能够逃逸的免疫检查点的作用[5，6]。

另一方面，HLA-G介导的对免疫反应的控制的丧失可能导致由免疫效应细胞的不受控制的激活引起的自身免疫性/炎性疾病的发作。最近几年的一些研究表明，HLA-G在控制自身免疫性/炎性疾病(诸如多发性硬化症(MS)、克罗恩病(CD)、牛皮癣、天疱疮、乳糜泻，系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、青少年特发性关节炎，和类风湿关节炎(RA))中起着重要的作用[23]。

已鉴定出7种HLA-G同种型，其中4种是膜结合的(HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3和HLA-G4)，而3种是可溶的(HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7)。所有这些HLA-G均在其N末端包括肽信号。

HLA-G1蛋白质同种型包括三个外部结构域(α1、α2和α3)、跨膜区和胞质结构域。HLA-G2蛋白质同种型不包括α2结构域(即α1和α3结构域是直接连接的)，其后是跨膜结构域和胞质结构域。HLA-G3蛋白质同种型缺少α2和α3结构域，即，它包括直接连接到跨膜结构域和胞质结构域的α1结构域。HLA-G4蛋白质同种型缺少α3结构域，即，它包括α1结构域、α2结构域、跨膜结构域和胞质结构域。

可溶性HLA-G同种型均缺少跨膜结构域和胞质结构域。有趣的是，所有这些可溶性HLA-G蛋白质都包含任何膜结合的HLA-G中不存在的其他氨基酸，这是由于一个内含子的保留所致。更具体地：

-HLA-G5蛋白质同种型包含α1、α2和α3结构域，以及由内含子4编码的21个氨基酸残基的额外C末端肽序列(由于转录剪接和RNA成熟后内含子4保留)；

-HLA-G6蛋白质同种型对应于没有α2的HLA-G5，即HLA-G6包含α1和α3结构域，以及由内含子4编码的21个氨基酸残基的额外C末端肽序列(由于转录剪接和RNA成熟后内含子4保留)；

-HLA-G7蛋白质同种型仅包含α1结构域，以及由内含子2编码的2个额外C末端的氨基酸残基(由于转录剪接和RNA成熟后内含子2保留)；

报导的所有七种HLA-G同种型均来自一个初级转录物的选择性(alternative)剪接，具有相似的翻译起始位点，尚未提出独特的功能作用。

到目前为止，HLA-G基因外显子的编号基于IMGT/HLA数据库(在本文中也称为IMGT/HLA命名法)，并被描述为包含8个外显子、7个内含子和3'非翻译端，分别对应以下结构域：外显子1：信号序列、外显子2：α1细胞外结构域、外显子3：α2，细胞外结构域、外显子4：α3细胞外结构域、外显子5：跨膜结构域、外显子6：胞质结构域I、外显子7：胞质结构域II(非翻译的)、外显子8：胞质结构域III(非翻译的)以及3'非翻译区。

但是，根据Ensembl数据库，HLA-G基因可能在5'端具有IMGT/HLA数据库中所没有的一个补充外显子。另外，由于外显子7对应于非翻译的结构域，因此将其视为外显子本身是否有意义这一问题仍未解决。

因此，该补充外显子的存在将更改5'非翻译区(UTR)的大小和启动子的位置。通过修饰蛋白质和/或miRNA的结合，这可以改变基因的调节。

在小鼠模型中出现了基于合成HLA-G衍生的蛋白质或抗体的治疗方法，并且这些新的治疗工具可能被证明可用于治疗癌症、传染病、自身免疫性/炎性疾病，和同种异体移植排斥。此外，已经显示出HLA-G1的可溶形式(也称为HLA-G5)抑制血管生成，并且已提出将其用作预防病理性新血管形成的治疗靶标[28]。

因此，在这种情况下，需要基于HLA-G分子的新治疗方法。

发明内容

发明人发现了HLA-G基因的新转录物，最有可能是由于选择性剪接。

发明人已证明存在HLA-G转录物，该HLA-G转录物在5'末端具有对应于外显子1(根据IMGT/HLA命名法)上游区域的补充序列。有趣的是，这些转录物(本文中称为长HLA-G转录物)与先前已知的HLA-G转录物相比也具有106bp的缺失，并具有可用作翻译起始起点的ATG[29]。

这些结果证实了这样的假设，即基于Ensembl数据库使用新的命名法是有意义的。因此，除非另有说明，否则下文将使用Ensembl命名法。在这种新的命名法中(如图1所示)，第一外显子位于5'末端的补充序列内，而先前的外显子7已被取消。因此，外显子编号因而被修改：外显子1：对应于新发现的序列；外显子2：信号序列；外显子3：α1细胞外结构域；外显子4：α2细胞外结构域；外显子5：α3细胞外结构域；外显子6：跨膜结构域；外显子7：胞质结构域I；外显子8：胞质结构域III(非翻译的)以及3'非翻译区(与IMGT/HLA命名法相比，外显子1重命名为外显子2，外显子2重命名为外显子3等)。

此外，发明人发现了以前从未报道过的保留内含子1、4、6或7的新HLA-G转录物，以及同时保留两个内含子(特别是内含子3和4或者内含子3和5)的转录物。

发明人进一步表明，选择性剪接使得可能存在新的翻译起始密码子，该新的翻译起始密码子不同于位于外显子2中的翻译起始密码子，迄今为止，外显子2中的翻译起始密码子被认为是HLA-G蛋白质的唯一可能的翻译起始密码子。在新的转录物中，在外显子1和外显子4中发现了可能的翻译起始密码子。

换句话说，新的转录物编码新的HLA-G蛋白质，其各自的结构不同于迄今为止已经公开的HLA-G同种型。

在这些新的转录物中，发明人已经鉴定出一些以前尚未公开的与HLA-G蛋白质相关的主要特征。

第一个特征是在鉴定出的一些新HLA-G蛋白质中，在其N末端(即外显子1(根据IMGT/HLA命名法)的上游)有五个氨基酸残基MKTPR。此特征来自外显子1中翻译的启动。仅为了方便和清楚起见，并且与它们的氨基酸序列的实际长度无关，具有这种特征的HLA-G蛋白质在本文中被称为“长HLA-G”，以突出显示所述额外的氨基酸残基的存在。

第二个特征是在鉴定出的一些新HLA-G蛋白质中不存在α1结构域。

第三个特征是在鉴定出的一些新的HLA-G蛋白质中不存在跨膜结构域，所述蛋白质具有不同于已知的可溶性HLA-G蛋白质HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7的肽序列。仅为了方便和清楚起见，具有这些特征的HLA-G蛋白质在本文中被称为“可溶性HLA-G”。

第四个特征是，在鉴定出的一些新HLA-G蛋白质中，至少有一部分不同于内含子2或4(在HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7中观察到了这种保留)的内含子保留。预期所有新鉴定出的HLA-G蛋白质具有耐受原性，与已知的HLA-G蛋白质的报道功能一致。因此，这些蛋白质可用于治疗自身免疫性/炎性疾病(诸如多发性硬化症(MS)、克罗恩病(CD)、牛皮癣、天疱疮、乳糜泻、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、青少年特发性关节炎，和类风湿关节炎(RA))，以及预防同种异体移植排斥。

另外，基于本领域的知识，预期新发现的HLA-G转录物和相应的蛋白质在癌细胞逃避免疫检查点的能力中起作用，并因此构成重要的治疗靶标。在此背景下，发明人设计了靶向新RNA转录物或它们编码的蛋白质的分子，以及包含此类分子的组合物，其可用于治疗癌症，特别是治疗透明细胞肾细胞癌(ccRCC)。

如实验部分中详述，本发明人已经证明，新鉴定出的HLA-G蛋白质在体内具有令人惊讶的血管生成作用。该作用与文献中报道的HLA-G5/可溶性HLA-G1的作用形成鲜明对比。一方面，新鉴定出的HLA-G蛋白质因此可由于治疗性血管生成在需要血管生成的病状(诸如缺血，其是例如在心血管疾病、外周动脉疾病和中风中发现的症状)的治疗中是有用的。

进一步地，发明人设计了可用于检测这些转录物及它们编码的蛋白质的引物和抗体，因此可用于诊断癌症。因此，本发明的第一方面是经分离的HLA-G蛋白质，其序列具有以下特征中的至少一个：

-它在其N末端部分包含五个氨基酸残基MKTPR，即SEQ ID NO:1，和/或；

-它没有α1结构域，也就是说没有序列SEQ ID NO:3，和/或；

-它没有跨膜/胞质结构域，也就是说没有序列SEQ ID NO:6，和；

-它包括由于保留一个内含子的至少一部分而产生的氨基酸，条件是(proviso)所述内含子不是内含子2或内含子4。

术语“HLA-G蛋白质”涵盖由HLA-G基因(优选基因ID 3135的人HLA-G基因(如在GeneBank数据库中基于基因组参考GRCh38.p10所提及)表达产生的任何蛋白质或多肽。优选地，“HLA-G蛋白质”是蛋白质或多肽，其包括至少对应于根据Ensembl命名法的人HLA-G基因的外显子1至8的任何的翻译的序列。换句话说，“HLA-G蛋白质”优选包括以下结构域中的至少一个：在其N末端部分的五个氨基酸残基MKTPR、肽信号、α1结构域、α2结构域、α3结构域、跨膜结构域和胞质结构域。

在本发明的上下文中，“肽信号”具有序列SEQ ID NO:2。

在本发明的上下文中，“α1结构域”具有序列SEQ ID NO:3。

在本发明的上下文中，“α2结构域”具有序列SEQ ID NO:4。

在本发明的上下文中，“α3结构域”具有序列SEQ ID NO:5。

在本发明的上下文中，“跨膜/胞质结构域”具有序列SEQ ID NO:6。

术语“由内含子保留产生的氨基酸”应按本领域中通常理解来解释。在本发明的上下文中，本领域技术人员可以通过将蛋白质的序列与没有由内含子保留产生的任何氨基酸的参考序列(诸如由HLA-G基因所有外显子的翻译组成的参考序列)进行比较来容易地鉴定此类氨基酸。适用于这种比较的参考序列是序列SEQ ID NO:7，其对应于具有HLA-G基因的所有外显子且没有内含子的HLA-G蛋白质的肽序列，也就是说具有在其N末端部分的五个氨基酸残基MKTPR、肽信号、α1、α2和α3结构域、跨膜/胞质结构域。根据本发明，内含子保留会产生与SEQ ID NO:7相比构成额外的任何氨基酸残基。

优选地，在本发明的上下文中，“没有跨膜/胞质结构域的HLA-G蛋白质的序列，也就是说，该序列没有序列SEQ ID NO:6”是由以下序列组成的蛋白质：

-SEQ ID NO:1的至少一部分；和/或；

-SEQ ID NO:2的至少一部分；和/或；

-SEQ ID NO:3的至少一部分；和/或；

-SEQ ID NO:4的至少一部分；和/或；

-SEQ ID NO:5的至少一部分；和

-条件是所述蛋白质不具有HLA-G5、HLA-G6或HLA-G7的序列，也就是说分别由SEQID NO:90、91和92的任一序列组成。

发明人特别地鉴定了根据本发明的几种新的HLA-G蛋白质。根据本发明的经分离的HLA-G蛋白质优选为序列包括选自SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:31组成的组的序列或由选自SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:31组成的组的序列组成的蛋白质。

优选地，根据本发明的HLA-G蛋白质(序列在其N末端部分包括五个氨基酸残基MKTPR)为序列包括选自由SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16组成的组的序列或由选自由SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16组成的组的序列组成的蛋白质。

优选地，没有α1结构域的序列的根据本发明的HLA-G蛋白质是序列包括选自由SEQID NO:9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、29、30、31组成的组的序列或由选自由SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、29、30、31组成的组的序列组成的蛋白质。

优选地，没有α2结构域的序列的根据本发明的HLA-G蛋白质是序列包括选自由SEQID NO:8、10、12、13、14、16、18、20、21、23、25、27、28、30组成的组的序列或由选自由SEQ IDNO:8、10、12、13、14、16、18、20、21、23、25、27、28、30组成的组的序列组成的蛋白质。

根据本发明的HLA-G蛋白质可以是经纯化的蛋白质或合成的蛋白质，其可以通过本领域技术人员已知的常规技术获得。

优选地，本发明还包括上述蛋白质的变体，也就是说，其序列与至少一种上述蛋白质具有至少80、85、90或95％的一致性的蛋白质。

在本发明的意义上，两个核酸或氨基酸序列之间的“百分比一致性”或“％一致性”是指在最佳比对后获得的待比较的两个序列之间相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，此百分比纯粹是统计性的，并且两个序列之间的差异沿其长度随机分布。传统上，两个核酸或氨基酸序列的比较是通过对序列进行最佳比对后进行比较来进行的，所述比较可以分段进行，也可以使用“比对窗口”进行。除了手工比较外，还可以通过Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法、通过Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索方法或通过使用这些算法的计算机软件的方法(威斯康星州遗传学软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，遗传学计算机组，575Science Dr.，麦迪逊，威斯康星州，或通过比较软件BLAST NR或BLAST P)进行序列最佳比对的比较。

通过比较两个最佳比对的序列来确定两个核酸或氨基酸序列之间的一致性百分比，其中要比较的核酸或氨基酸序列与参考序列相比可以具有添加或缺失，以实现两个序列之间的最佳比对。通过确定两个序列之间，优选两个完整序列之间的氨基酸、核苷酸或残基相同的位置数目，用相同的数目除以比对窗口中的位置总数，并将结果乘以100得到两个序列之间的百分比一致性，来计算一致性百分比。

例如，可以将默认参数(特别是对于参数“开放间隙罚分”：5，和“延伸间隙罚分”：2；所选择的矩阵例如是程序提出的“BLOSUM 62”矩阵)与BLAST程序“BLAST 2序列”[27](可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html网站获得)一起使用；要比较的两个序列之间的百分比一致性由程序直接计算。

优选地，本发明进一步包括根据本发明的HLA-G蛋白质的功能变体，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，并因此不改变分子的功能性质。

优选地，本发明还包括通过将任何化学修饰引入蛋白质的一个或更多个氨基酸残基、肽键、N-和/或C-末端中而从上述蛋白质衍生的经修饰蛋白质，目的是增加蛋白质的稳定性、生物利用度或生物活性，只要经修饰的蛋白质保持功能。

如本领域众所周知的，在体内使用经分离的蛋白质的替代方案可以是使用以可表达形式编码所述蛋白质的多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组载体。此类载体可对于蛋白质的生产或体内治疗用途是有用的。

本发明的另一方面涉及编码本发明蛋白质的经分离的多核苷酸。合成或重组多核苷酸可以是单链和/或双链的DNA、RNA或其组合。优选地，多核苷酸包括针对表达蛋白质的宿主优化的编码序列。

本发明的另一方面涉及包括所述多核苷酸的重组载体。优选地，所述重组载体是当被转染或转化到宿主细胞中时能够表达所述多核苷酸的表达载体。将多核苷酸以适当的方向和正确的阅读框***表达载体以进行表达。优选地，多核苷酸可操作地连接至少一种转录调节序列，并且可选地连接至少一种翻译调节序列。重组载体包括用于基因工程和基因治疗的常用载体，包括例如质粒和病毒载体。

本发明的另一方面提供了用所述多核苷酸或重组载体转化的宿主细胞。

可以使用熟知的重组DNA技术来制备本发明的多核苷酸、载体和/或细胞。

预期本发明的蛋白质具有类似于本领域已知的HLA-G蛋白质的耐受原性，特别是因为本文公开的所有新发现的HLA-G蛋白质都具有α3结构域。

本发明的另一方面涉及药物组合物，其包括至少一种本发明的蛋白质、多核苷酸和/或载体，以及优选地，药学上可接受的载体。

合适的媒介物或载体包括任何药学上可接受的媒介物，诸如缓冲剂、稳定剂、稀释剂、盐、防腐剂、乳化剂、甜味剂等。媒介物通常包括等渗水性溶液或非水性溶液，其可以根据已知技术制备。合适的溶液包括缓冲溶质，诸如磷酸盐缓冲溶液、氯化物溶液、林格氏溶液等。

本发明的另一方面涉及本发明的蛋白质、多核苷酸和/或载体，其用作药物。

优选地，本发明的上述蛋白质、多核苷酸和/或载体用于治疗自身免疫性和/或炎性疾病，或用于预防和/或治疗同种异体移植排斥，用于预防和/或治疗缺血(优选与心血管疾病、外周动脉疾病或中风有关的缺血)，或用于预防和/或治疗血管性视网膜病。

在本发明的上下文中，术语血管性视网膜病包括冯·希佩尔血管瘤病、海绵状视网膜血管瘤、渗出性视网膜病、特发性黄斑毛细血管扩张症(里斯病)、视网膜中央动脉的阻塞、动脉分支的阻塞、睫状视网膜动脉的阻塞、眼动脉阻塞、视网膜静脉阻塞。

在医学用途的背景下，本领域技术人员可以优选地选择在本发明的HLA-G蛋白质中具有α-3结构域的蛋白质，诸如序列SEQ ID NO:7、8、9、10、13、14、17、18、19、20、21、22、23、26、27、31的任何蛋白质。

有利地，用作药物，优选用于上述治疗的HLA-G蛋白质是序列包括选自由SEQ IDNO:7、8、9、10、13、14、17、18、19、20、21、22、23、26、27、和31组成的表的序列或由其组成的蛋白质。

在本发明的上下文中，自身免疫性/炎性疾病优选是指多发性硬化症(MS)、克罗恩病(CD)、牛皮癣、天疱疮、乳糜泻、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、幼年特发性关节炎，和类风湿性关节炎(RA)，但优选是牛皮癣。

本发明还提供了用于治疗自身免疫性/炎性疾病，或预防和治疗同种异体移植排斥，用于预防和/或治疗局部缺血(优选与心血管疾病、外周动脉疾病或中风相关的局部缺血)，或用于预防和/或治疗血管性视网膜病的方法，包括：对个体施用治疗有效量的至少一种本发明的蛋白质、多核苷酸和/或载体，或如上所述的组合物。

“治疗有效量”在此是指随时间推移足以至少减少或防止疾病进展的量。通常，所述量可以由技术人员根据病理状况、受试者、治疗的持续时间、其他活性成分的存在等进行调节。

如已经说过的，新发现的HLA-G转录物和相应的蛋白质是重要的治疗靶标，特别是对于癌症的治疗。通常，出于治疗目的，RNA转录物可被反义寡核苷酸靶向，而蛋白质可被特异性抗体靶向。

例如，不含编码α1结构域，但包含编码信号肽和α2和α3结构域的序列的RNA转录物，在编码信号肽的序列与编码α2结构域的序列之间具有连接，对应于在其他HLA-G蛋白质中找不到的序列SEQ ID NO:32。类似地，由编码α3结构域和信号肽但不含α1和α2结构域的序列组成的RNA转录物包括序列SEQ ID NO:33，其对应于编码α3结构域和信号肽的序列之间的连接。编码可溶性HLA-G的RNA转录物包括序列SEQ ID NO:34。

本发明的另一个目的是具有与以下序列的至少一部分互补的序列的反义寡核苷酸：

-SEQ ID NO:32；

-SEQ ID NO:33，或者；

-SEQ ID NO:34。

本发明进一步涉及包括编码至少一种本发明的反义寡核苷酸的多核苷酸的重组载体。

本发明的新的HLA-G蛋白质具有分别由连接序列SEQ ID NO:32、33和34编码的特定肽序列SEQ ID NO:35、36和37，它们可用作抗原以产生对这类蛋白质特异的抗体，即对某些HLA-G蛋白质特异的抗HLA-G抗体。

本发明的另一个目的是对序列SEQ ID NO:35、36或37的至少一个肽特异的抗体。

为了本发明的目的，术语“抗体”是指与另一分子特异性结合并因此被定义为与另一分子的特定空间和极性组织互补的免疫球蛋白质。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，可以通过本领域熟知的技术(诸如免疫宿主并收集血清(多克隆)，或者制备连续的杂交细胞系并收集分泌的蛋白质(单克隆)，或通过克隆并表达至少编码天然抗体特异性结合所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变形式)制备。抗体可包括完整的免疫球蛋白质或其片段，该免疫球蛋白质包括各种类别和同种型，诸如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM。功能性抗体片段可以包括能够以与全长抗体相似的亲和力保持结合的抗体的部分(例如，Fab、Fv和F(ab')2或Fab')。另外，在适当的情况下，可以使用免疫球蛋白质或其片段的聚集体、聚合物和缀合物，只要基本上保持对特定分子的结合亲和力。

术语“至少一种肽的抗体特异性”应按本领域中通常理解来解释，也就是说，表明所述抗体对所述至少一种肽表现出显著的亲和力，优选约10^-5M(KD)或更高的亲和力。亲和力可以通过本领域技术人员众所周知的各种方法来确定，包括但不限于Biacore分析、Blitz分析和Scatchard图。

本发明的另一个目的是药物组合物，其包括根据本发明的抗体、反义寡核苷酸和/或编码其的载体，并且优选地，药学上可接受的载体。

本发明的另一方面涉及本发明的抗体、反义寡核苷酸，和/或编码其的载体，其涉及用作药物。

优选地，本发明的上述抗体、反义寡核苷酸和/或编码其的载体用于治疗癌症。

癌症的非限制性实例包括食道癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌和***癌；肝细胞癌、骨肉瘤、圆柱瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、结肠炎相关癌、多发性骨髓瘤以及各种类型的白血病和淋巴瘤(诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、霍奇金淋巴瘤和MALT淋巴瘤)。在一个优选的实施方案中，所述癌症是透明细胞肾细胞癌(ccRCC)。

本发明还提供了一种用于治疗癌症的方法，该方法包括：对个体施用治疗有效量的本发明的抗体、反义寡核苷酸和/或编码其载体，或者如上所述的组合物。

如已经指出的，发明人已经鉴定出癌细胞样品包括特定的HLA-G转录物，即对应于人HLA-G基因表达的RNA分子。这些RNA转录物对应于序列SEQ ID NO:38至74。因此，基于生物样品中这些RNA转录物的存在，发明人已经开发了用于诊断癌症的体外方法。

本发明进一步涉及用于诊断癌症的体外方法，其包括检测在受试者的生物样品中的至少RNA转录物和/或如上公开的本发明的至少一种蛋白质，所述RNA转录物具有选自由序列SEQ ID NO:38至74组成的列表的序列。

术语“生物样品”是指从受试者获得的样品，包括生物组织或液体来源的样品。这些样品能是但不限于从包括人类的哺乳动物分离的体液(例如血液、血浆、血清或尿液)、器官、组织、级分(fractions)和细胞。生物样品还可以包括生物样品的包括组织(例如，器官或组织的截面部分)的部分。生物样品还可以包括来自生物样品的提取物，例如来自生物液体(例如血液或尿液)的抗原。优选地，受试者是哺乳动物，但是优选地是人类。

在本发明的上下文中，检测到至少一种RNA转录物(该RNA转录物具有选自由序列SEQ ID NO:38至74组成的列表的序列)，和/或本发明的至少一种蛋白质，表明受试者患有癌症。

如上所述，可以通过对所述蛋白质特异的至少一种抗体实施合适的免疫学方法(例如ELISA、RIA、免疫荧光、免疫组织化学)来进行本发明的至少一种蛋白质的检测。

RNA转录物的检测可通过对所述RNA具有特异性的核苷酸探针(例如，附着至生物芯片)杂交，或通过对所述RNA转录特异的核苷酸引物扩增(例如，通过RT-PCR)进行。

发明人开发了特别适合于检测本发明的至少一种RNA转录物的核苷酸引物：

-序列SEQ ID NO:75的引物int4R，其设计为与内含子4的起点(beginning)杂交，并因此能用于检测保留该内含子的HLA-G转录物；

-序列为SEQ ID NO:76的引物Ex1F，其设计为与外显子1互补的区域杂交，并因此可用于检测编码长HLA-G蛋白质的转录物；

-序列SEQ ID NO:77的引物PrPrF，其设计为与位于该基因5'转录末端注释的区域进一步上游的区域(报告为启动子区域)杂交，并因此可用于检测编码长HLA-G蛋白质的转录物；

-序列SEQ ID NO:78的引物Int3F，其设计成与内含子3内的区域杂交，并能用于检测保留该内含子的HLA-G转录物；

-序列SEQ ID NO:79的引物Int5R，其设计成为内含子5内的区域杂交，并能用于检测保留该内含子的HLA-G转录物；

这些引物对于实施本发明的诊断方法特别有用。因此，在一个实施方案中，在本发明的方法中，至少使用具有选自由SEQ ID NO:75至79组成的列表中的序列的引物进行本发明的至少RNA转录物的检测。

这些特异性引物可以彼此组合或与HLA-G转录物特异的其他已知引物(诸如本领域已公开的序列SEQ ID NO:80的引物G526R)结合使用。进一步地，引物Int3F和引物Int5R或引物int4R的任何组合可用于检测保留两个内含子(内含子3和4，或内含子3和5)的转录物。

在一个优选的实施方案中，在本发明的诊断方法中，使用以下组合的至少一种进行本发明的至少RNA转录物的检测：

-序列SEQ ID NO:76的引物Ex1F或序列SEQ ID NO:77的引物PrPrF，和序列SEQ IDNO:80的引物G526R；

-序列SEQ ID NO:75的引物int4R，和序列SEQ ID NO:78的引物Int3F；

-序列SEQ ID NO:78的引物Int3F，和序列SEQ ID NO:79的引物Int5R；

因此，本发明的另一个目的是具有选自由SEQ ID NO:75至79组成的列表中的序列的引物。

本发明进一步涉及试剂盒，其包括至少两个引物，所述引物具有选自由SEQ IDNO:75至80组成的列表的序列。

优选地，试剂盒至少包括选自以下项组成的列表的引物组合：

-序列SEQ ID NO:76的引物Ex1F或序列SEQ ID NO:77的引物PrPrF，和序列SEQ IDNO:80的引物G526R；

-序列SEQ ID NO:75的引物int4R，和序列SEQ ID NO:78的引物Int3F；

-序列SEQ ID NO:78的引物Int3F，和序列SEQ ID NO:79的引物Int5R；

本发明还包括将从以下实现实例中出现的其他规定，这些规定不能被解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1-HLA-G基因的结构示意图。A、IMGT/HLA命名法(顶部)和Ensembl数据库(底部)。数字代表外显子，并且HLA-G蛋白质的结构域显示在下方。TM：跨膜；CT：胞质尾。B、用于不同RT-PCR策略的引物的定位。显示了特定扩增子的大小(bp)和翻译起始密码子。

图2-这项研究中包括的8个ccRCC的差异形态学和HLA-G染色模式。滋养细胞组织用作免疫组织化学研究(H&E和免疫过氧化物酶染色)的阳性对照。

图3-ccRCC患者中HLA-G1的表达。使用HLA-G1特异性引物G257F和G526R(上图)和ACTB引物作为对照(下图)对RNA进行RT-PCR。泳道1：除了患者6和8的肿瘤之外，相邻的非肿瘤区域。泳道2、3和4：不同的肿瘤区域。对于患者6和8，显示的所有区域均与肿瘤区域相对应，因为进行了部分肾切除术，而相邻的肿瘤区域不可用。M：100bp大小的标志物。

图4-在HLA-G转录物中发现的内含子保留事件。仅考虑跨内含子-外显子连接的读长。丢弃仅对应于内含子序列的读长。

图5-主要内含子保留事件的分子验证。A：为扩增经保留的内含子而开发的RT-PCR策略的图示。B：使用肌动蛋白质引物作为不存在基因组DNA的对照(左)，和使用Int1和G257R引物检测内含子1(右)的存在的RT-PCR分析的结果。523bp的条带表明没有内含子2，有内含子2会产生649bp的条带。C：仅保留内含子4的HLA-G转录物(左图)或同时保留数个内含子的HLA-G转录物(中图和右图)。

图6-鉴定5'延伸的转录物HLA-G1。A、DNA序列细节显示两个ATG之间的距离缩短。使用G526R引物向上进行该序列。B、106bp缺失的示意图；两个ATG标有下划线。

图7：A：注射后第38天拍摄的异种移植了被编码长HLA-G1病毒载体感染的RCC7细胞的NSG小鼠的照片。B：注射后第38天拍摄的异种移植了被编码长HLA-G1L病毒载体感染的RCC7细胞的NSG小鼠的照片。

图8：A：皮内注射后第25天，异种移植了表达GFP、HLA-G1或HLA-G1L的RCC7细胞的裸鼠照片。B：皮内注射后第25天，异种移植了生在在基底膜基质并表达GFP、HLA-G1或HLA-G1L的RCC7细胞的裸鼠照片。

图9：在左耳注射对照RCC7细胞(表达GFP)和右耳表达HLA-G1L的RCC7细胞8天后(A和B)，NSG免疫缺陷小鼠的照片。

图10：在左耳注射对照RCC7细胞和右耳表达HLA-G1的RCC7细胞8天后(A和B)，NSG免疫缺陷小鼠的照片。

具体实施方式

A.新的HLA-G同种型的检测和分析

1.材料和方法

1.1、肿瘤和患者

该研究的所有患者均于2014年11月至2015年4月在圣路易医院(法国巴黎)泌尿科接受了ccRCC根治性肾切除术作为首次治疗干预。中位肿瘤大小为50毫米(范围从35到175)。根据2010年原发性肿瘤TNM分类，这些肿瘤分为pT1a(患者6)、pT1b(患者1、3和8)，和pT3a(患者2、4、5和7)。两名患者(患者2和4)出现内脏转移。根据世界卫生组织对肾脏肿瘤的分类，经验丰富的泌尿病理学家将所有这些肾脏肿瘤归为ccRCC[8]。参加本研究的所有患者均给予了自由和知情的书面同意。该研究得到巴黎圣路易斯医院的机构审查委员会的批准。

1.2、肿瘤样品处理

对于每个肿瘤，根据肿瘤大小，我们分离了3到10个10×5×5mm的样品，代表了空间范围和宏观的肿瘤内异质性。每个样品的一半在紧闭肾动脉后1小时内在液氮中速冻，以及另一半用于进行组织学分析并通过照相记录。还分离了在组织病理学检查中不包含肿瘤细胞的区域作为对照。

1.3、免疫组织化学

对每个肿瘤在厚度为4μm，***固定和石蜡包埋的肿瘤组织切片上进行了免疫组织化学研究。使用了以下鼠源抗体：4H84，识别位于所有HLA-G同种型共有的α1结构域中的表位的IgG1(稀释度1/200，圣克鲁斯生物技术，加利福尼亚州圣克鲁斯)，以及识别由存在于可溶性HLA-G5和-G6同种型中(保留的内含子5(Ensembl数据库)编码的表位的两种抗体5A6G7和2A12(稀释度1/100，Exbio抗体，Exbio Co.，CR)。使用OptiView DAB IHC检测试剂盒(Roche)，在短时或标准抗原回收的条件下，在Roche(BenchMark ULTRA系统，亚利桑那州图森)的自动切片染色器上进行染色，抗体在37℃孵育32分钟，ultraWash程序，用苏木精II复染4分钟，上蓝试剂复染8分钟。阳性和阴性对照对每种方法均给出适当的结果。

免疫组织化学分析由泌尿病理学家使用BX51显微镜(Olympus France S.A.S，Rungis)进行。通过染色强度分别为阴性、弱、中或强，以及染色分布为阴性(占肿瘤面积的0％)、最小(占肿瘤的0-10％)、局灶性(<50％肿瘤面积)或弥漫性(>50％肿瘤面积)的基于膜和/或细胞质染色，对每种免疫染色进行评分。每次运行时，使用滋养层组织作为阳性对照，并且使用同种型特异性免疫球蛋白质作为阴性对照。

1.4、滋养层细胞样品制备

滋养层细胞组织是从流产(怀孕少于三个月)获得的。机械解离后，将样品保存在-80℃下的Trizol^TM试剂(LifeTech，ref.15596-026)中，直到使用下述方案提取RNA。

1.5、RNA提取

从在Trizol^TM试剂(LifeTechnologie，ref.15596026)中手动压碎的组织切片中分离总RNA。氯仿分离后，根据制造商的说明使用miRNeasy mini Kit(Qiagen，ref.217004)纯化RNA，并额外进行DNase处理(Qiagen，ref.79254)。使用Nanodrop分光光度计和Agilent2100生物分析仪系统评估RNA纯度和浓度。RNA完整性数(RIN)值大多>8。

1.6、RT-PCR

使用GoScript逆转录酶试剂盒(Promega，ref.A5001)和热循环仪Eppendorf(MasterCycler，Pro S)对RNA逆转录成cDNA。使用LifeTech的ampliTaq聚合酶(Ref.N80800166)，以10μL的最终体积(含2μL cDNA模板)进行PCR反应。为了扩增，进行了40个循环(在94℃下30秒，55或60℃下30秒，以及72℃下30秒)。HLA-G和肌动蛋白质(ATCB)引物描述于表1。在所有实验中，将ATCB扩增作为对照。将PCR扩增产物与6X上样染料(Promega，ref.G1881)混合，并用以1mg/mL的浓度的2μL溴化乙锭染色的100mL的2％琼脂糖凝胶上进行分析。所使用的分子量标志物是来自Invitrogen的1Kb加DNA阶梯(ref.10787018)。使用ChemiDoc XRS系统(Biorad)进行成像，并使用ImageLab软件(Biorad)进行解释。

表1用于RT-PCR实验的PCR引物

1.7、RNA测序

按照Illumina TRUSEQ方案，从1μg总RNA中制备索引互补DNA文库。AMPure XP珠(Beckman Coulter，Inc.)纯化的PCR产物的平均大小为275bp。在NextSeq 500(ILLUMINA)上的四个cDNA文库的等摩尔库中进行转录组的配对末端150bp读长测序。

1.8、HLA-G同种型的高通量分析

通篇将使用Ensembl命名法。使用BWA比对仪(BWA MEM选件)，将来自NGS测序的短读长映射到人类参考基因组NCBI Hg19[20]。从比对文件中滤除低质量的映射读长，并使用samtools提取映射到HLA-G基因座的读长(Li等，2009)。通过选择与内含子和周围外显子之一重叠的读长进行内含子保留检测，仅当我们检测到与5'和3'侧翼外显子重叠的读长时，才评估对内含子的保留。外显子跳过检测是通过分析呈现***映射的读长，按映射的外显子的顺序搜索不连续性来执行的，例如：映射到外显子4的末端和外显子6的开始但未映射到外显子5的读长表示跳过外显子5。每个读长的子集都通过IGV进行了视觉验证[22]。对于内含子n的保留，支持该事件的读长pni的百分比计算为支持事件的读长(外显子n/内含子连接处的读长、对内含子n的内部内含子读长和内含子n/外显子n+1连接处的读长)与跨事件发生区域(从外显子n与内含子n之间的连接处到内含子n与外显子n+1之间的交界处的区域)的读长总数之间的比例：使R(i)是严格地在区域i中的读长次数(读长仅在区域i中并且不与其他区域重叠)，并且R(i，j)是与区域i和j重叠的读长数。使S(i)是支持外显子I跳过的读长次数(外显子n和外显子m重叠的读长，其中m>n+1)。因此，支持内含子保留的读长数为IRn＝R(外显子n，内含子n)+R(内含子n)+R(内含子n，外显子n+1)。内含子保留区的读长数为Tn＝IRn+R(外显子，外显子+1)+S(n)；因此，pni由pni＝IRn/Tn给出。

对于外显子n的跳过，支持该事件的读长pne的百分比由pne＝S(n)/Tn给出。潜在偏差的分析通过使用TopHat2校准器进行评估[24]。

2.结果

2.1、ccRCC中HLA-G同种型分布的明显亚细胞异质性

为了考虑将HLA-G作为癌症治疗的潜在靶点，对来源于ccRCC患者的肿瘤细胞中HLA-G的表达进行了评估。为此，根据肿瘤大小，将每个肿瘤分离为3至10个切片。对苏木精和伊红(H&E)染色的载玻片进行的显微镜分析证实了经典地与ccRCC相关的形态学异质性(图2，左图)[8]。我们通过用针对HLA-G的特异性抗体进行免疫染色进一步剖析了这种异质性：4H84，其识别位于所有七个经报告的HLA-G同种型共有的α1域中的表位，以及抗体5A6G7，其仅识别可溶性HLA-G5和HLA-G6同种型。该抗体靶向保留的内含子5(根据IMGT/HLA命名法，以前称为内含子4)编码的氨基酸。将高水平表达HLA-G的滋养层细胞用作阳性对照。

即使所有肿瘤在至少一个区域中表达HLA-G，该表达在肿瘤之间和内部也是不同的。患者1和2的肿瘤在所有区域均显示出4H84抗体强烈的免疫染色。染色为膜质和细胞质(图2)。值得注意的是，还检测到位于肿瘤细胞胞质中的透明小球的另外非常强的染色。这些透明小球在H&E玻片上清晰可见，并构成了肿瘤中非常罕见的一个方面[9]。另一方面，使用5A6G7抗体，在细胞质中发现了弱或中等的颗粒状细胞质免疫染色，但在透明球中却没有。HLA-G在其他患者的肿瘤中的表达有很大不同：患者6和7的肿瘤表现出弥漫性但中度的4H84抗体膜免疫染色。用5A6G7免疫染色，这两个肿瘤显示无(患者6)或弱以及病灶性局部病灶(患者7)，这表明不存在可溶性蛋白质HLA-G5和HLA-G6。在另外两个肿瘤(患者4和5)中，仅在一个肿瘤区域的小显微镜下观察到由4H84抗体评估的HLA-G的表达。值得注意的是，患者4肿瘤中唯一的HLA-G阳性区域与胞浆内透明小球精确对应。在肿瘤的任何其他区域都没有观察到染色。

患者3和8的肿瘤细胞的免疫染色图谱是出乎意料的。用标记所有已报道的HLA-G同种型的4H84抗体未检测到免疫染色。缺乏用该抗体标记的肿瘤切片通常可以解释为没有HLA-G表达。然而，分别在患者3和8的肿瘤细胞中观察到弥散性强颗粒状胞浆内5A6G7免疫染色，以及弥散性，稀薄性和颗粒状胞浆内免疫染色。考虑到我们目前对已报道的七种HLA-G同种型的结构的了解，这是不可预测的，因为它们均包含4H84抗体识别的α1结构域。为了尝试更好地理解这些差异，我们使用了名为2A12的抗体进行了相似的分析，该抗体还识别了存在于可溶性HLA-G5和-G6同种型中的保留内含子5(Ensembl数据库)编码的表位。结果显示出不同且意想不到的免疫染色模式，特别是患者1和2中的透明小球的标记。

总之，免疫组织化学研究的结果清楚地表明了ccRCC肿瘤中HLA-G表达的内异质性和间异质性(intra-and inter-heterogeneity)。但是，在我们对HLA-G同种型结构的普遍了解的范围内，某些免疫染色模式是出乎意料的。

2.2、在ccRCC中表达的HLA-G1转录物的调查

为了更好地了解ccRCC中表达的HLA-G同种型并阐明免疫组化分析的结果，通过RT-PCR进一步评估了HLA-G同种型多样性。上面研究的八名患者的肿瘤切片用图1B中示意图所示的众所周知的G257F和G526R引物扩增[10]。这些引物扩增包含4H84抗体识别的表位的区域。对作为对照的每个样品进行肌动蛋白质mRNA的扩增。在患者1、2和6的所有肿瘤切片中均发现了一条预定的290bp的条带，该条带对HLA-G1转录物的扩增具有特异性，而该条带仅在其他患者的肿瘤的一个或两个区域中被检测到(图3)。在非肿瘤相邻组织中未检测到扩增产物。由于不同同种型的序列高度相似，并且这些RT-PCR条件不能使得鉴定缺少外显子4(引物G526的靶标)的其他同种型(如HLA-G2、-G3、-G6或-G7)，因此我们进行了RNAseq的一项大规模研究，目的是提供ccRCC中表达的同种型的全面描述。

2.3、RNA-Seq显示未注释的HLA-G转录物

RNAseq技术提供了最强大的方法来分析表达的同种型，提供了检测选择性剪接事件和未注释转录物的机会，这对于理解物种的发展和疾病机制至关重要[25]。

乍一看，我们已经在非常高的覆盖深度(深度>300x)下对四个代表性样品进行了测序。根据“材料和方法”中所述的Ensembl 70(GRCh37.p8)参考注释对读长进行比对和定量。选择性剪接的同种型主要分为两大类：外显子跳跃和内含子保留，其中单个外显子或内含子被选择性剪接或包含在成熟信息中。

为了验证上述ccRCC患者的HLA-G表达模式是否构成ccRCC患者的一般概况的代表性子集，我们将我们的结果与“肾脏癌基因组”(CAGEKID)研究队列(包括在四个不同的欧洲国家(捷克共和国、英国、罗马尼亚和俄罗斯)接受治疗的100位ccRCC患者)获得结果进行比较。生成的数据构成了高质量的资源，使得能够高精度地检测选择性剪接事件(Scelo等，2014)。此外，我们已经深入评估了研究HLA-G的共同因素(诸如选择RNAseq数据的比对子或参考序列)是否可能通过使用两种不同的比对BWA MEM和TopHat2来潜在地影响我们的分析。结果证实与BWA MEM或TopHat2比对的数据产生相似的结果(补充数据)。进一步地，在个体水平上的读长计数表明，在我们的小规模ccRCC患者队列和Cagekid队列中发现的HLA-G转录物的表达谱之间有很大的相似性。这些结果总结在表2和3中，并将在以下各节中更全面地讨论。

2.4、表达的HLA-G转录物中未描述的内含子保留事件

内含子保留是哺乳动物中最罕见的选择性剪接类型，并且仅占替代转录物的大约3％[12]。到目前为止，在HLA-G转录物文献中仅报道了内含子3或内含子5(根据IMGT/HLA命名法，以前称为内含子2和内含子4)的保留。保留内含子3的转录物编码HLA-G7[13]以及保留内含子5的那些转录物编码HLA-G5和HLA-G6[7]。

在我们的RNAseq分析中，外显子包含的内含子被标记为保留。显示在图4中，并总结在表2中的结果表明，代表内含子3和5保留的读长最多。此外，这些数据还支持了一些新的整体发现，这些发现来自四个额外的内含子的保留：1、4、6和7。为了验证内含子保留的转录物的表达，我们首先寻找了包含内含子1的转录物的存在。为此，我们使用图5中描述的策略进行了RT-PCR扩增。首先，将靶向内含子1的引物(Int1F)与G257F的反向引物G257R结合使用[13]。由于内含子的存在可能是由于污染内源基因组DNA所致，因此所有样品均与位于两个不同外显子上的肌动蛋白质特异性引物平行扩增。来自mRNA的cDNA的扩增的预期大小为320bp，而基因组DNA的预期大小为560bp。结果显示在所有样品中仅扩增了320bp片段，表明不存在基因组污染(图5B，左图)。鉴于此结果，我们使用引物Int1F和G257R进一步扩增了肿瘤样品。获得了预期大小(521bp)的扩增条带，与HLA-G转录物中内含子1的存在一致(图5B，右图)。由于HLA-G的转录起始仅与外显子2相关[26]，因此该事件以前在文献中未见报道。我们没有检测到649bp的PCR扩增条带，该条带对应于内含子2的伴随保留。这与RNAseq分析的结果一致，该结果表明内含子2很少保留。

表2、ccRCC样品中所有观察到的HLA-G剪接事件的读长数选择患者1、3、4和5为代表性样品，旨在探索HLA-G同种型的多样性。B00E4I3和B00E4IS是在CAGEKID(肾脏的癌症基因组CAncer GEnome of the KIDney)中HLA-G表达最高的两个样品[14]。

进行了进一步的分析以验证内含子4的保留(图5C)。为此，将引物G257F与特异性靶向内含子4的引物(称为int4R)结合使用进行RT-PCR。用这些引物扩增产生430bp的DNA片段(图5C，左图)，表明HLA-G转录物中内含子4的存在。扩增条带的大小也与内含子3伴随保留的存在一致。为了进一步评估相同的转录物是否可能同时保留多个内含子，我们使用引物int3F(其序列与内含子3的区域互补)结合引物int4R进行了RT-PCR扩增。结果揭示了一个380bp的DNA片段，这是预期将内含子3和4保留在同一转录物中(图5C，中图)。此外，用Int3F和Int5R引物进行的扩增产生了725pb的扩增条带(图5C，右图)。值得注意的是，该条带的大小对应于内含子3和5的保留，不包括内含子4。这些结果清楚地表明，肿瘤样品可能表达保留单个内含子的转录物，而另一些保留几个不同内含子的转录物，这些个转录物保留内含子可能不一样。据我们所知，这些事件以前没有描述过。

2.5、具有5’-延伸端的新HLA-G转录物

RNAseq数据进一步揭示了一些读长在外显子1的任一侧对齐(图4)。以前没有报道过源自该区域的转录物。实际上，该区域的结构仍是一个有争议的问题，因为Ensembl数据库中包含的信息表明HLA-G转录物可能起始于此外显子，该外显子位于IMGT/HLA命名法所定义的外显子1的5'(图1A)。该外显子的存在与否可能引起主要的修饰，包括启动子定位，5'-非翻译区的长度和转录/翻译起始位点。我们评估是否可以通过RT-PCR扩增在此外显子或甚至上游起始HLA-G转录物。设计了两条特异性引物。引物Ex1F，其序列与外显子1(Ensembl数据库)中的区域互补，以及引物PrPr，其序列与当前被认为是启动子区域的上游区域互补(示意性表示于图1B中)。使用这两种上游引物结合G526R进行RT-PCR产生两条预期大小的条带：分别为690bp(对于Ex1F-G526R)和725bp(对于PrPr-G526R)(数据未显示)。为了验证这些片段的特异性，对经扩增的DNA样品进行了测序，并使用BLAST在公共数据库中搜索了核苷酸相似性。结果证明与HLA-G高度相似，除了缺失了106bp的片段。由于这种缺失，位于外显子1末端的ATG与位于外显子2的ATG之间的距离从118bp减少到12bp(图6A)。结果，106bp的缺失使两个ATG都符合要求。现在，这可能使得能够在位于第一个外显子的ATG处开始翻译，并产生一种蛋白质，该蛋白质的5'延伸端应具有5个其他氨基酸(MKTPR)。目前，唯一的翻译起始起始位点归因于外显子2(对应于IMGT/HLA命名法定义的外显子1)中的ATG。在所测试的一些但并非全部的滋养层细胞样品中也发现了该转录物。这表明调节其表达的因素仍有待阐明。

总而言之，这些结果与名为HLA-G1L的新型HLA-G转录物的存在一致，该转录物具有延伸的5'末端，可能在滋养层细胞和ccRCC肿瘤细胞中与先前报道的HLA-G同种型共表达。

2.6、选择性剪接的外显子潜在地产生新的可溶性HLA-G同种型

外显子跳跃是选择性剪接的主要形式之一，其产生多个mRNA同种型，其外显子序列的精确组合不同。在这里，我们将外显子跳跃事件定义为含外显子形式与不含外显子形式之间的配对，其发生在相同外显子并具有相同侧翼内含子上。同一外显子可能参与多个外显子跳跃事件。

对于HLA-G，文献中仅报告了外显子4(HLA-G2)，外显子5(HLA-G4)或两者同时(HLA-G3)同时跳跃的现象。在这项研究中，与BWA mem匹配的读长揭示了从未发现过的外显子跳跃。表2报告了主要的跳跃事件。我们还通过使用TopHat2确认了这些结果。

最高的阅读覆盖率与外显子7单独跳跃一致，外显子7包含蛋白质的终止密码子。然而，由于在外显子8的开头发现了一个额外的框内终止密码子，因此预期缺少该外显子的编码蛋白质不会有重大修饰。最重要的是，将外显子7与编码跨膜结构域的外显子6一起跳跃是高度相关的，因为它们的缺失可能会产生缺乏跨膜结构域和胞质尾巴的同种型，并且因此仍会构成尚未报告的可溶性蛋白质。

当使用序列与外显子6区域互补的引物G963R进行RT-PCR时，与正向引物G257F(外显子3)或G256F(外显子4)结合使用时，无法获得扩增产物。然而，当将引物G257F与G526R结合使用时，产生了预期的290bp扩增片段。这些结果加在一起与具有外显子3和4但缺乏外显子6的HLA-G转录物一致。此外，当使用这些引物分析患者1的样品时，使用引物组合G526F-G963R获得了扩增的条带，而使用G257F-G963R未检测到扩增的条带，这与缺少外显子3的转录物的表达相一致。

2.7、缺乏α-1结构域的选择性剪接的HLA-G同种型

对RNAseq数据的进一步分析表明，某些读长可能在外显子4处起始。这是通过量化外显子受***点上游20pb内读长的原始计数来确定的。预测的N端截短蛋白质将缺少肽信号和α1结构域。为了评估翻译成蛋白质是否可能在该区域开始，我们检查了外显子4的核苷酸序列。该分析揭示了框内ATG的存在，其可能充当翻译起始密码子。我们的初步结果(未显示)显示，缺少α-1结构域的转录物可能也缺少α-2结构域，因此仅编码α-3结构域。

值得注意的是，这些同种型的表达现在可以为某些肿瘤样品用4H84和针对可溶性同种型产生的抗体标记后产生的免疫染色模式的差异提供一个假设，这在以前的关于HLA-G同种型结构的广泛知识解释中并没有得到解释。

表3、观察到的每个剪接事件的转录物百分比总体样品的百分比是表示该事件的样品的百分比。最后两列是针对表达HLA-G的77个CAGEKID样品计算的相同指标。

B.HLA-G同种型的促肿瘤作用

1、材料和方法

1.1、表达HLA-G同种型的慢病毒的生产

将HLA-G1和HLA-G1L同种型引入质粒pWPXL(10510bp)，位于BamH1(3499)和NdeI(4334)位点之间，正好是指导两个亚型HLA-G的表达的EF-1α启动子的3'。

对于HLA-G1:

3438bp的***片段包括以SEQ ID NO.93AGTGTGGTACTTT序列起始，并在3'以SEQID NO.94TGGAAGACATGAGAACTTTCCA序列结尾的HLA-G1 cDNA。该片段后是GFP的“红色”变体(维多利亚水母绿色荧光蛋白质水母)，名为海王星，已在CMV启动子的控制下。最后，在3'末端引入分子条形码作为整合标记，并用于体内转移监测(Grosselin等，Stem Cells，10：2162-71，2013)。

对于HLA-G1L：

3279bp的***片段包括以SEQ ID NO.95ATATAGTAACATAGTGT序列起始，并在3'以SEQ ID NO.94TGGAAGACATGAGAACTTTCCA序列结尾的HLA-G1L cDNA。该片段后是GFP的“蓝色”(青色)变体，ECFP，ECFP在433/445nm和475/503nm处具有双峰激发和发射光谱，使得是具有光泽和改进的光稳定性的荧光染料。ECFP被置于CMV启动子的控制之下。最后，在3'末端引入分子条形码作为整合标记，并用于体内转移监测(Grosselin等，Stem Cells，10：2162-71，2013)。

这两个质粒用于以1.20E+08TU(转导单位)/ml产生慢病毒WPXLΔU3 SIN、包膜VSV-G、OGM组II，2类。

2、结果

每个慢病毒包含不同的HLA-G同种型。慢病毒被转导至特征明确的不表达HLA-G的肾细胞癌透明细胞系(RCC7细胞)中。对于每种同种型，均进行了两次独立的转导，以提高结果的可靠性和鲁棒性(robustness)。

每种条件下，将每个经转导的RCC7细胞系进行皮内注射到5只NSG小鼠中。未转导的RCC7细胞用作对照。

皮内注射细胞后，定期评估肿瘤/转移性生长。

在处死小鼠时，肿瘤转移灶和不同的组织被去除，用于免疫组织化学和表达(RNA)分析。每种同种型都与条形码相关联，从而可以确保获得的肿瘤和转移灶来自经注射的细胞。

如图7所示，来自带有长HLA-G1L同种型的RCC7系细胞的异种移植小鼠在J 38显示出更明显的肿瘤生长，至少部分与更发达的肿瘤内和肿瘤周围新血管形成有关。在这些肿瘤中未观察到肿瘤内坏死修复，这与携带HLA-G1同种型的RCC7系产生的肿瘤不同。

用裸鼠进行了类似的实验。图8A显示了注射后第25天，异种移植了表达GFP、HLA-G1或HLA-G1L的RCC7细胞的裸鼠照片。图8B显示了注射后第25天，异种移植了生长在基底膜基质并表达GFP、HLA-G1或HLA-G1L的RCC7细胞的裸鼠照片。

C.HLA-G同种型的促血管生成作用

如上所述制备表达GFP、HLA-G1或HLA-G1L的RCC7细胞(B点)。

向NSG小鼠的左耳注射对照物(表达GFP的RCC7细胞)，而向右耳注射表达HLA-G1或HLA-G1L的RCC7细胞。在第8天照相。结果示于图9(对照RCC7细胞对HLA-G1L)和图10(对照RCC7细胞对HLA-G1)。

结果证明了HLA-G1L表达的促血管生成作用，而HLA-G1的表达未再现该作用。

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序列表

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法国公立援助医院

<120> HLA-G转录物和同种型及它们的用途

<130> F0263S00652/PCT

<150> EP17305986.6

<151> 2017-07-24

<160> 95

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

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Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg

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Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu

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Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu

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Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro

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Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr

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Trp Lys Gln Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val Ala

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

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Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp

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Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg

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Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu

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Trp Met

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

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<212> PRT

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<213> 智人

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<212> DNA

<213> 智人

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<212> DNA

<213> 智人

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<212> DNA

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tagggctacg gaatgaagac gccaaggatg gtggtcatgg cgccccgaac cctcttcctg 120

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