Hla限制性vcx/y肽和t细胞受体及其用途
阅读说明：本技术 Hla限制性vcx/y肽和t细胞受体及其用途 (HLA-restricted VCX/Y peptides and T cell receptors and uses thereof ) 是由 余嘉诚 潘科 于 2017-12-28 设计创作，主要内容包括：本文中提供了肿瘤抗原VCX/Y特异性肽和经改造的VCX/Y特异性T细胞受体。本文中还提供了产生VCX/Y特异性免疫细胞的方法及其用于治疗癌症的用途。另外,所述VCX/Y特异性肽可用作疫苗。(Provided herein are tumor antigen VCX/Y specific peptides and engineered VCX/Y specific T cell receptors. Also provided herein are methods of producing VCX/Y specific immune cells and their use for treating cancer. In addition, the VCX/Y specific peptides can be used as vaccines.)
本申请要求于2016年12月29日提交的美国临时申请序列No.62/440,233和2017年12月6日提交的序列No.62/595,422的优先权，每个申请的全部内容在此通过引用并入。
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发明背景
1.技术领域
本发明一般性地涉及免疫学和医学领域。更具体地，其涉及肿瘤抗原肽及其用于治疗癌症的用途。
2.背景技术
基于T细胞的治疗已经显示出作为用于治疗许多癌症的方法的显著前景；遗憾的是，这种方法也受到针对常见癌症的免疫原性抗原靶标的缺乏和对非癌组织的潜在毒性的阻碍。这些基于T细胞的治疗可包括ACT(adoptive cell transfer，过继性细胞转移)和疫苗接种方法。ACT通常涉及其涉及将大量的自体活化的肿瘤特异性T细胞输注到患者中，例如以治疗癌症。ACT已经在黑素瘤患者中引起治疗性临床应答(Yee 2002；Dudley 2002；Yee2014)。一般来说，为了产生有效的抗肿瘤T细胞应答，通常需要以下三个步骤：使抗原特异性T细胞致敏并活化，使活化的T细胞迁移至肿瘤部位，以及通过抗原特异性T细胞来识别并杀伤肿瘤。靶抗原的选择对于诱导有效的抗原特异性T细胞是重要的。
虽然已经鉴定了黑素瘤和少数其他实体瘤恶性肿瘤的数种肿瘤相关抗原，但是对于胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、***、乳腺癌和头颈癌的免疫原性靶标很少。鉴定和验证这些通常用于治疗恶性肿瘤和难以治疗恶性肿瘤的新表位和靶抗原是有必要的。
发明简述
在一些实施方案中，本公开内容提供了可用于过继性T细胞治疗中的VCX/Y(例如VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B和VCY)肽。在一些实施方案中，所述肽可用于体外扩增施用于哺乳动物对象(例如人患者)以治疗疾病(例如癌症)的VCX/Y特异性T细胞。在另外的实施方案中，对T细胞进行遗传改造以表达具有针对VCX/Y的抗原特异性的T细胞受体(T cellreceptor，TCR)。在另一些实施方案中，可将肽施用于哺乳动物对象以诱导针对该肽的免疫应答或对对象进行针对该肽的免疫接种，并且这样的免疫应答可用于治疗疾病(例如癌症)或降低其获得或复发的机会。
在一个实施方案中，本公开内容提供了长度为35个氨基酸或更短的分离的VCX/Y肽，其包含与SEQ ID NO：1(GAATKMAAV)，8(KVAKKGKAV)，9(SEMEELPSV)，12(KVAEKGEAV)，13(KMAAVEAPEA)，或14(MAAVEAPEA)具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述肽选择性结合HLA-A2。在一些方面中，肽包含与SEQ ID NO：1、8、9、12、13、或14具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在特定方面中，人I类HLA-A2蛋白是HLA-A*0201。
在某些方面中，肽的长度为30个氨基酸或更短，例如长度为29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个氨基酸。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含一些实施方案的分离的VCX/Y肽，以及药物载体。在一些方面中，药物组合物被配制成用于肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、吸入或皮下注射。在某些方面中，肽包含在脂质体、纳米粒(例如包含脂质的纳米粒)中，或基于脂质的载体中。在一些方面中，药物制剂被配制成用于注射或作为鼻喷雾剂吸入。
另外的一个实施方案提供了编码一些实施方案的VCX/Y肽的分离的核酸。本文中还提供了载体，其包含由编码VCX/Y肽的核酸组成的连续序列。
在另一个实施方案中，提供了在对象中促进免疫应答的方法，其包括向对象施用有效量的一些实施方案的VCX/Y肽，其中所述肽在对象中诱导抗原特异性T细胞。在一些方面中，对象被诊断患有癌症。在某些方面中，癌症是胰腺癌、卵巢癌、胃癌或乳腺癌。在特定方面中，对象是人。
在其他方面中，所述方法还包括施用至少第二抗癌治疗。在一些方面中，第二抗癌治疗选自化学治疗、放射治疗、免疫治疗或手术。在特定方面中，免疫治疗是免疫检查点抑制剂。在一个具体方面中，免疫检查点抑制剂是抗PD1单克隆抗体。
另外的一个实施方案提供了产生VCX/Y特异性T细胞的方法，其包括获得起始T细胞群，以及使起始T细胞群与一些实施方案的VCX/Y肽接触，从而产生VCX/Y特异性T细胞。在一些方面中，接触进一步限定为将起始T细胞群与抗原呈递细胞(antigen presentingcell，APC)共培养，其中APC在其表面上呈递一些实施方案的VCX/Y肽。在特定方面中，APC是树突细胞。在一些方面中，起始T细胞群是CD8+ T细胞。在某些方面中，T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)。在一些方面中，获得包括从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分离起始T细胞群。本文中还提供了药物组合物，其包含通过本文中的方法产生的VCX/Y特异性T细胞。
另外的一个实施方案提供了具有针对VCX/Y的抗原特异性的抗原受体，例如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)。另一个实施方案提供了经改造以表达VCX/Y特异性TCR或CAR的T细胞。在某些方面中，TCR结合HLA-A2，例如HLA-A*0201。在一些方面中，TCR包含与SEQ ID NO：2或19的氨基酸序列具有至少95％(例如96％、97％、98％、99％或100％)同一性的α链CDR3和/或与SEQ ID NO：3或20的氨基酸序列具有至少95％(例如96％、97％、98％、99％或100％)同一性的β链CDR3。在一些方面中，TCR包含与SEQ ID NO：5或16的氨基酸序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的α链和/或与SEQ ID NO：7或18的氨基酸序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一性的β链。在特定方面中，TCR包含SEQ ID NO：5或16的α链和/或SEQ ID NO：7或18的β链。
在一些方面中，VCX/Y特异性抗原受体包含胞内信号传导结构域、跨膜结构域和/或胞外结构域。在某些方面中，编码TCR或CAR的DNA整合至细胞的基因组中。在一些方面中，TCR或CAR的胞外结构域包含VCX/Y结合区。例如，VCX/Y结合区可以是F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。在某些方面中，胞内信号传导结构域是T淋巴细胞活化结构域。例如TCR的胞内信号传导结构域可包含CD3ξ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD8、CD27、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、GITR/CD357、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP分子、CD70、细胞因子受体、CD40，或其组合。在某些方面中，TCR的跨膜结构域包含CD28跨膜结构域、ICOS跨膜结构域、NKG2D跨膜结构域、DAP分子跨膜结构域、IgG4Fc铰链、Fc区、CD4跨膜结构域、CD3ξ跨膜结构域、半胱氨酸突变的人CD3ξ结构域、CD16跨膜结构域、CD8跨膜结构域或红细胞生成素受体跨膜结构域。
在一些实施方案中，本公开内容提供了可溶性TCR，例如本文中提供的VCX/Y TCR。在一些方面中，TCR与可检测标记或治疗剂缀合。在一些方面中，可溶性TCR用于将治疗剂(例如细胞毒性化合物或免疫刺激化合物)递送至呈现特定抗原的细胞。在一些方面中，TCR与将邻近处的细胞递送至肿瘤的另一个分子连接。在某些方面中，TCR递送毒素、细胞因子、共刺激配体、或抑制剂配体，以便将分子、细胞或化合物引导至表达肽-MHC的靶细胞。在特定方面中，TCR与抗CD3缀合。
另外的一个实施方案提供了多价TCR复合体，其包含多个上述实施方案的VCX/Y抗原受体，例如VCX/Y TCR。在一些方面中，多价TCR包含彼此缔合的2、3、4或更多个TCR。在某些方面中，多价TCR存在于脂双层中或附着于颗粒。
在另一个实施方案中，提供了编码一些实施方案的TCR的多肽。还提供了编码所述多肽的多核苷酸和包含所述多核苷酸的表达载体(例如病毒载体，例如逆转录病毒载体)。在一些方面中，载体还包含接头结构域。在某些方面中，接头结构域包含一个或更多个切割位点。在一些方面中，所述一个或更多个切割位点是弗林蛋白酶(Furin)切割位点和/或P2A切割位点，其可以通过间隔区(例如SGSG或GSG)隔开。
在另外的一个实施方案中，提供了经改造以表达一些实施方案的TCR的宿主细胞。在一些方面中，细胞是免疫细胞。在某些方面中，细胞是NK细胞、恒定NK细胞(invariant NKcell)、NKT细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)或诱导多潜能干(inducedpluripotent stem，iPS)细胞。在一些方面中，细胞从脐带中分离。在某些方面中，免疫细胞是T细胞或外周血淋巴细胞。在特定方面中，T细胞是CD8+ T细胞、CD4+ T细胞或γδ T细胞。在一些方面中，T细胞是调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)。在一些方面中，细胞是同种异体或自体的。
在另一个实施方案中，提供了用于改造一些实施方案的免疫细胞的方法，其包括使所述免疫细胞与一些实施方案的TCR或编码所述TCR的表达载体接触。在一些方面中，免疫细胞是T细胞或外周血淋巴细胞。在某些方面中，接触进一步限定为转染或转导。在一些方面中，转染包括将编码一些实施方案的TCR的RNA电穿孔至免疫细胞中。在一些方面中，该方法还包括在转导免疫细胞之前从一些实施方案的表达载体产生病毒上清液。在一些方面中，免疫细胞是经刺激的淋巴细胞。在某些方面中，经刺激的淋巴细胞是人淋巴细胞。在一些方面中，刺激包含OKT3和/或IL-2。在某些方面中，该方法还包括对免疫细胞进行分选以分离经TCR改造的T细胞。在一些方面中，该方法还包括通过连续稀释进行T细胞克隆。在某些方面中，该方法还包括通过快速扩增方案进行T细胞克隆的扩增。
另一个实施方案提供了在对象中治疗癌症的方法，其包括向对象施用有效量的一些实施方案的VCX/Y特异性T细胞或经TCR改造的宿主细胞。本文中还提供了包含有效量的一些实施方案的VCX/Y特异性T细胞或经TCR改造的宿主细胞的组合物，其用于在对象中治疗癌症。在一些方面中，癌症是胸腺瘤、膀胱癌、子宫癌、黑素瘤、肉瘤、***或头颈癌。在特定方面中，对象是人。在一些方面中，细胞是自体或同种异体的。在一些方面中，对象被确定具有表达VCX/Y的癌细胞。在特定方面中，对象被鉴定为具有HLA-A*0201等位基因。
在一些方面中，宿主细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、间充质干细胞(MSC)或诱导多潜能干(iPS)细胞。在某些方面中，宿主细胞从脐带中分离。在一些方面中，宿主细胞是自体或同种异体的。在某些方面中，T细胞是CD8+ T细胞、CD4+T细胞或γδ T细胞。
在某些方面中，所述方法还包括在施用抗原特异性T细胞之前对对象进行淋巴细胞耗竭。在一些方面中，淋巴细胞耗竭包括施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。
在一些方面中，所述方法还包括施用至少第二治疗剂。在某些方面中，至少第二治疗剂包括化学治疗、免疫治疗、手术、放射治疗或生物治疗。在特定方面中，免疫治疗是免疫检查点抑制剂。在一个具体方面中，免疫检查点抑制剂是抗PD1单克隆抗体。
在某些方面中，VCX/Y特异性T细胞和/或至少第二治疗剂经静脉内、腹膜内、气管内、瘤内、肌内、内窥镜、病灶内、经皮、皮下、区域性施用或通过直接注射或灌注施用。
在一些方面中，对象被确定患有表达VCX/Y家族的蛋白的癌细胞。在特定方面中，蛋白是VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B或VCY。
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实例尽管指出了本发明的一些优选实施方案但是仅通过举例说明方式给出，因为根据本详细描述，在本发明精神和范围之内的多种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得明显。
具体实施方式
以下附图构成本说明书的一部分并且为了进一步示出本发明的某些方面而包括在内。通过参照这些附图中的一个或更多个并结合本文中提出的一些特定实施方案的详细描述可更好地理解本发明。
图1A至1B：T2细胞的HLA-A2稳定表达测定。(A)在与T2细胞孵育18小时之后预测肽的结合测定将HLA-A2表达显示为荧光指数的。(B)蛋白质印迹检测肺癌细胞系中的VCX成员(VCX1、VCX3A和VCY)的表达。H522、H2023、H1395、H82、H1355、H1755和DFC1032表达HLA-A0201；H647表达HLA-A1101；PC-9表达HLA-A0206和HLA-A2402。
图2A至2B：从HLA-A＊0201健康供体产生VCX54特异性T细胞克隆。(A)在用VCX3A抗原脉冲的树突细胞的两次刺激之后T细胞的CD8和VCX54四聚体表达。(B)在使用快速扩增方案(rapid expansion protocol，REP)扩增之后T细胞的CD8和VCX54四聚体表达。
图3A至3B：VCX54特异性T细胞的功能亲合力。(A)以20∶1的效应物与靶标(E∶T)的比与用多种浓度的VCX54肽脉冲的T2细胞共培养的VCX54 CTL克隆的细胞毒性裂解。(B)以多种E∶T比与VCX1阳性表达人肺癌细胞系H2023(HLA-A0201+)或原代支气管上皮细胞NHBE(HLA-A0201+)共培养的VCX54 CTL克隆(C7)的细胞毒性裂解。
图4：特异性T细胞的经内源性呈递的VCX54肽的识别。以多种E∶T比与一组表达VCX3A或VCX1的HLA-A2+肺癌细胞系共培养的VCX54CTL克隆的细胞毒性裂解。
图5：VCX特异性T细胞的HLA等位基因限制性酶切分析。若干VCX54 CTL克隆对HLA-A0201阴性肺癌细胞系的细胞毒性。
图6：VCX特异性T细胞对肺癌细胞的特异性细胞毒性证实。用冷靶标抑制测定检测的VCX54 CTL克隆的内源性呈递肽特异性识别。
图7A至7B：VCX54 CTL克隆(C7)TCR使用分析。(A)TCR α链(TRAV)使用PCR鉴定。TRAV使用为TRAV-13.1或TRAV-14。(B)TCR β链(TRBV)使用流式细胞仪检测。TRBV使用为TRBV-13。
图8：VCX54 CTL克隆(C7)TCR α链和β链分析。来自IMGT数据库的序列分析显示VCX54 CTL克隆(C7)TCR使用为TRAV-14和TRBV-13。指出了TCR-α和TCR-β的相应CDR3氨基酸序列。
图9：将来自VCX54 CTL克隆的TCR构建至逆转录病毒表达载体pMSGV1中。将包含弗林蛋白酶切割位点、SGSG接头和P2A切割位点的接头片段***TCR-β链与TCR-α链之间，以保证两条链在MSCV启动子下以同等水平表达。
图10：将包含来自VCX54 CTL克隆的TCR序列的逆转录病毒表达载体pMSGV1和包膜载体RD114共转染至包装细胞系GP2-293中。通过流式细胞术显示出CD8和四聚体表达。
图11：使用VCX1+/HLA-A0201阳性肺癌细胞系H2023和HLA-A0201阳性永生化正常人小气道上皮HSAEC2-KT细胞系，用标准51Cr释放测定(51Cr release assay，CRA)筛选450个克隆。仅示出了具有多于20％的靶向H2023的细胞毒性的克隆。
图12：使用快速扩增方案(REP)扩增的TCR基因经修饰的T细胞克隆C13和C119的细胞毒性。
图13A至13B：TCR基因经修饰的T细胞克隆C119的四聚体染色和四聚体解离测定。(A)亲本VCX54 CTL克隆和TCR基因经修饰的T细胞克隆C119的四聚体染色。将C119的四聚体染色密度与亲本CTL克隆进行比较。(B)四聚体解离检测。C119克隆的半数最大结合时间(T1/2)高于亲本VCX54 CTL克隆。
图14：对于TCR基因经修饰的T细胞克隆C119的特异性应答检测的肽滴定测定。
图15A至15B：用于评价TCR基因经修饰的克隆C119的特异性应答的胞内染色测定。将VCX54亲本CTL克隆或TCR基因经修饰的T细胞克隆C119与以下以10∶1的效应物与靶标(E∶T)的比共培养：(A)HLA-A2+/VCX1+肺癌细胞系H2023或HLA-A0201+永生化正常人小气道上皮细胞系HSAEC2-KT，或(B)用10μg/ml VCX54肽或对照肽M26脉冲的T2细胞。用流式细胞术检测胞内TNF-α、CD137、IFN-γ和IL-2水平。
图16：亲本CTL克隆和TCR基因经修饰的T细胞克隆C119对肺癌细胞系H2023、永生化正常人小气道上皮细胞系HSAEC2-KT和原代人支气管上皮细胞NHBE的细胞毒性。
图17A至17C：来自VCX/Y家族的HLA-A2限制性肽。(A)肽的HLA结合测定(HLA-A2稳定化检测)。(B)CTL的VCY-37四聚体检测。(C)VCY-37 CTL对肺肿瘤或正常肺细胞系的铬释放测定。
说明性实施方案详述
对于患有许多不同癌症类型的患者，基于T细胞的免疫治疗代表了具有经证实效力的有前景的方法。然而，由于缺乏目前已知的肿瘤相关抗原，针对大多数癌症类型的抗原特异性T细胞治疗是不可行的，这阻碍了它们的临床开发。本公开内容中的研究鉴定了在包含VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B和VCY在内的所有VCX/Y家族成员中发现的新的VCX/Y家族来源的HLA-A2限制性肽表位。使用所述肽表位，从患者外周血单个核细胞(PBMC)产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其识别HLA匹配的同种异体肿瘤细胞系上的经内源性呈递的抗原，引起肿瘤细胞杀伤。因此，这些抗原特异性CTL可用于靶向实体癌症(例如胰腺癌、卵巢癌、胃癌和乳腺癌)。
因此，本公开内容提供了例如针对肿瘤抗原VCX/Y的肿瘤抗原特异性肽，其用于作为治疗癌症的免疫治疗的用途。本文中公开了示例性VCX/Y肽VCX54(例如包含SEQ ID NO：1)，其序列与包括VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B和VCY在内的所有VCX/Y家族成员共享。其他VCX/Y肽包括VCX-37(SEQ ID NO：8)、VCX-178(SEQ ID NO：9)、VCY-37(SEQ ID NO：12)、VCX-58(SEQ ID NO：13)、和VCX-59(SEQ ID NO：14)。例如肿瘤抗原特异性肽可以与T细胞群接触或用于刺激T细胞群以诱导识别或结合肿瘤抗原特异性肽的T细胞的增殖。在另一些实施方案中，可以将本公开内容的VCX/Y特异性肽施用于对象(例如人患者)，以增强对象针对癌症的免疫应答。
VCX/Y特异性肽可包含在主动免疫治疗(例如癌症疫苗)或被动免疫治疗(例如过继性免疫治疗)中。主动免疫治疗包括用经纯化的肿瘤抗原或免疫显性VCX/Y特异性肽(天然或经修饰的)对对象进行免疫接种；或者，可以向对象施用用VCX/Y特异性肽脉冲的(或用编码肿瘤抗原的基因转染的)抗原呈递细胞。VCX/Y特异性肽可以是经修饰的或包含一个或更多个突变，例如置换突变。被动免疫治疗包括过继性免疫治疗。过继性免疫治疗通常涉及向对象施用细胞，其中所述细胞(例如细胞毒性T细胞)已经在体外针对VCX/Y特异性肽致敏(参见，例如，US 7910109)。
特别地，可以在短时间时期(例如6至8周)内离体产生患者自身的VCX/Y特异性T细胞用于有效的基于免疫的治疗。可以从自外周血分离的自体或同种异体T细胞(例如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、γδ T细胞和Treg)中分离和扩增T细胞，例如使用四聚体引导的分选和快速扩增方案(REP)。接下来，可将肽或相应的编码多核苷酸加载至HLA-A2阳性树突细胞、LCL、PBMC或人工抗原呈递细胞(artificial antigen presenting cell，aAPC)中，然后通过数轮刺激与T细胞共培养以产生抗原特异性CTL细胞系或克隆。此外，利用对免疫调节参数的操纵，可以增强这些经扩增的抗原特异性T细胞的效应功能和体内长期持久性。这些自体CTL细胞可用于针对VCX/Y和HLA-A2阳性癌症患者的过继性免疫治疗。此外，可以从本公开内容产生的其他VCX/Y特异性细胞包括自体或同种异体NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、间充质干细胞(MSC)和诱导多潜能干(iPS)细胞。这些细胞可以从血液或脐带中分离。
在另一种方法中，可以通过使用本文中提供的VCX54 TCR(例如SEQ ID NO：2至7)或本文中提供的VCY37 TCR(例如SEQ ID NO：15至20)来产生抗原特异性细胞。在该方法中，将TCR序列***至载体(例如逆转录病毒或慢病毒载体)中，将该载体导入到宿主细胞(例如T细胞(例如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、γδ T细胞和Treg)、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、间充质干细胞(MSC)、诱导多潜能干(iPS)细胞和PBMC)中以产生抗原特异性细胞，其可用于针对癌症患者的过继性细胞治疗。
另外，本公开内容提供了可溶性TCR，其可以用于直接治疗HLA-A2阳性癌症患者。通过将VCX54 TCR或VCY37 TCR与CD3特异性Fab片段连接来产生可溶性双特异性T细胞接合分子。可通过呈递相应的肽/MHC复合体和Fab片段使T细胞接合TCR结合肿瘤细胞表面，然后交联在经历抗原的CD8+ T细胞表面上的TCR，引起细胞活化和靶细胞的消除。因此，这种可溶性双特异性TCR构建体可用于直接治疗癌症患者。
最后，可溶性TCR可用作用于肿瘤细胞中的肽/MHC的诊断评价的探针，或者用于将治疗分子指导至肿瘤部位。该可溶性TCR分子也可以用示踪剂(例如荧光探针或放射性探针)进行标记，然后用于肿瘤细胞中肽/MHC的呈递的诊断评价。此外，该可溶性TCR分子可以与例如毒素的治疗分子连接，然后将这些治疗分子引导至肿瘤部位以治疗癌症患者。
I.定义
就特定组分而言，本文中使用的“基本上无”在本文中用于意指特定组分均不被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期污染产生的特定组分的总量远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到特定组分的量的组合物。
如本说明书中所用，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如权利要求书中所用，当与词语“包含/包括/含有”组合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。
除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中的术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义。本文中使用的“另一个/种”可意指至少第二个/种或更多个/种。
在本申请通篇，术语“约/大约”用于表示这样的值，其包括用于确定所述值的装置、方法之误差的固有变化，或者研究对象之间存在的变化。
“治疗(treatment/treating)”是指为了获得疾病或健康相关病症的治疗益处而向对象施用或施加治疗剂或对对象执行某种方法或方式。例如，治疗可包括施用T细胞治疗。
“对象”和“患者”是指人或非人，例如灵长类、哺乳动物和脊椎动物。在特定实施方案中，对象是人。
本申请通篇使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指就药物治疗该病症而言促进或增强对象健康的任何情况。这包括但不限于降低疾病的体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可涉及，例如，降低肿瘤尺寸、降低肿瘤侵袭力、降低癌症生长速率或阻止转移。癌症的治疗还可指代延长患有癌症之对象的存活。
“抗癌”剂能够负面地影响对象中的癌细胞/肿瘤，例如通过促进癌细胞的杀伤、诱导癌细胞的凋亡、降低癌细胞的生长速率、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、降低向肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展或提高患有癌症的对象的寿命。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性即可。
短语“可药用或药理学上可接受的”是指适当时当施用于动物(例如人)时不产生不利反应、变应性反应或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含抗体或其他活性成分的药物组合物的制备对于本领域技术人员将是已知的。此外，对于动物(例如人)施用，应理解，制剂应符合FDA生物标准办公室(FDA Office of BiologicalStandards)所要求的无菌性、致热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。
如本领域普通技术人员将已知的，本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有水性溶剂(例如水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外载剂(例如氯化钠、林格右旋糖等))、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯(例如油酸乙酯))、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等张剂、吸收延迟剂、盐类、药物、药物稳定剂、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、流体和营养补充剂等材料，及其组合。根据公知的参数调节药物组合物中多种组分的pH和精确浓度。
术语“单位剂量”或“剂量”是指适合用于对象中的物理学离散单位，每个单位包含治疗性组合物的预定量，所述预定量经计算产生与其施用(即合适的途径和治疗方案)相关的以上讨论的期望应答。根据治疗数量和单位剂量二者，待施用的量取决于所期望的效果。施用于患者或对象的本发明实施方案的组合物的实际剂量量可通过身体和生理因素(例如对象的体重、年龄、健康状况和性别；待治疗疾病的类型；疾病渗透的程度；先前或同时的治疗性干预；患者的自发病；施用途径；以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性)来确定。例如，剂量还可包含每次施用约1μg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(该这样的范围包括干预剂量)或更多，以及其中可推论出的任何范围。在从来自本文中所列数字可推论出的范围的一些非限制性实例中，可施用约5μg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重等的范围。在任何情况下，负责施用的实施者将确定组合物中活性成分的浓度和个体对象的合适剂量。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞输注的剂量可包含约1亿至约300亿个细胞，例如100亿、150亿或200亿个细胞。
术语“免疫检查点”是指免疫系统中的分子(例如蛋白质)，其向免疫系统的组分提供信号以平衡免疫反应。已知的免疫检查点蛋白包括CTLA-4、PD1及其配体PD-L1和PD-L2，以及另外的LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR。在本领域中认为涉及LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3和KIR的途径构成类似于CTLA-4和PD-1依赖途径的免疫检查点途径(参见例如Pardoll，2012；Mellman等，2011)。
“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点蛋白功能的任何化合物。抑制包括功能降低和完全阻断。特别地，免疫检查点蛋白是人免疫检查点蛋白。因此免疫检查点蛋白抑制剂特别是人免疫检查点蛋白抑制剂。
本文中使用的“保护性免疫应答”是指由哺乳动物宿主的免疫系统针对癌症的应答。保护性免疫应答可提供用于治疗癌症(例如减小肿瘤尺寸或提高存活)的治疗效果。
本文中使用的术语“抗原”是能够被抗体或T细胞受体结合的分子。抗原可通常用于诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，引起B淋巴细胞和/或T淋巴细胞的产生。
术语“肿瘤相关抗原”、“肿瘤抗原”和“癌细胞抗原”在本文中可互换使用。在每种情况下，所述术语是指由癌细胞特异性或优先表达的蛋白质、糖蛋白或碳水化合物。
本文中使用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”可指代例如人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，且涵盖将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的经改造受体。可使用CAR将单克隆抗体的特异性赋予至T细胞上，从而允许产生大量特异性T细胞，例如，用于过继性细胞治疗中。在特定实施方案中，CAR指导细胞针对例如肿瘤相关抗原的特异性。在一些实施方案中，CAR包含胞内活化结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的胞外结构域。在一些特定方面中，CAR包含来源于单克隆抗体的单链可变片段(single-chainvariable fragment，scFv)的与CD3ζ跨膜结构域和内结构域融合的融合物。其他CAR设计的特异性可来源于受体(例如肽)的配体或来源于模式识别受体，例如树凝素(Dectin)。在某些情况下，可以修饰抗原识别结构域的间隔以降低活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，CAR包含用于其他共刺激信号传导的结构域，例如CD3ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在一些情况下，分子可以与CAR共表达，所述分子包括共刺激分子、用于成像(例如用于正电子发射断层摄影术)的报道基因、在添加前药之后有条件地消融T细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
多核苷酸或多核苷酸区域(或者多肽或多肽区域)与另一序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”或“同源性”，意味着在比对时，在比较两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。该比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域中已知的软件程序，例如在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等，编辑，1987)副刊30，7.7.18节，表7.7.1中描述的那些来确定。优选地，默认参数用于比对。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序依据＝HIGH SCORE；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。
II.VCX/Y肽
本公开内容的某些实施方案涉及例如针对VCX/Y肿瘤抗原的肿瘤抗原特异性肽。在特定的实施方案中，肿瘤抗原特异性肽具有VCX/Y肽的氨基酸序列(GAATKMAAV：SEQ IDNO：1；或SEQ ID NO：8，9，12，13，或14)。肿瘤抗原特异性肽可具有与SEQ ID NO：1、8、9、12、13或14的肽序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
本文中使用的术语“肽”涵盖包含以下的氨基酸链：7至35个氨基酸，优选8至35个氨基酸残基，更优选8至25个氨基酸，或者长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸，或其中可推论出的任何范围。例如，在一些实施方案中，本公开内容的VCX/Y肽可包含SEQ ID NO：1的VCX54肽或SEQID NO：8、9、12、13或14的肽，或由其组成。本文中使用的“抗原性肽”是这样的肽：其在引入脊椎动物中时可以刺激在脊椎动物中产生抗体(即是抗原性的)，并且其中该抗体可以选择性地识别和/或结合该抗原性肽。抗原性肽可包含免疫反应性VCX/Y肽，并且可包含另外的序列。另外的序列可来源于天然抗原并且可以是异源的，并且这样的序列可以(但不需要)是免疫原性的。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)可以选择性地与HLA-A2结合，特别是HLA-A*0201。在某些实施方案中，VCX/Y肽的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸，或从其中可推论出的任何范围。优选地，肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的长度为8至35个氨基酸。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的长度为8至10个氨基酸。
如本领域技术人员将理解的，MHC分子可以结合具有多种尺寸的肽，但通常不结合全长蛋白质。尽管MHC I类分子传统地被描述为与8至11个氨基酸长的肽结合，但是已经显示，长度为15个氨基酸的肽可通过在结合位点的中间凸出(bulging)或延伸到MHC I类结合沟之外而与MHC I类分子结合(Guo等，1992；Burrows等，2006；Samino等，2006；Stryhn等，2000；Collins等，1994；Blanchard和Shastri，2008)。此外，最近的研究也表明较长的肽可被更高效地内吞、处理、以及由抗原呈递细胞呈递(Zwaveling等，2002；Bijker等，2007；Melief和van der Burg，2008；Quintarelli等，2011)。如Zwaveling等(2002)中所表明的，长度为多至35个氨基酸的肽可用于选择性结合II类MHC并且是有效的。如技术人员将立刻理解的，天然存在的全长肿瘤抗原(例如VCX/Y)将不可用于选择性结合II类MHC，使得该抗原被内吞并且产生T细胞增殖。一般来说，天然存在的全长肿瘤抗原蛋白不展现这些特性并将因此不可用于这些免疫治疗目的。
在某些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)是免疫原性或抗原性的。如以下实例中所示出的，本公开内容的多种肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)可以促进T细胞的增殖。预期这样的肽可用于诱导一定程度的保护性免疫。
肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)可以是重组肽、合成肽、纯化肽、固定化肽、可检测经标记肽、包封肽或经载体表达肽(例如，由在载体中的核酸编码的肽，所述载体包含与该核酸可操作地连接的异源启动子)。在一些实施方案中，可向对象(例如人患者)施用合成的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)以在对象中诱导免疫应答。与重组表达肽相比，合成肽可展现出某些优点，例如细菌污染的风险降低。肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)还可包含在被配制成用于施用于哺乳动物或人对象的药物组合物(例如疫苗组合物)中。
A.细胞渗透肽
在一些实施方案中，免疫治疗可使用与细胞渗透剂(例如脂质体或细胞渗透肽(cell penetrating peptide，CPP))缔合的本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)。用肽脉冲的抗原呈递细胞(例如树突细胞)可用于增强抗肿瘤免疫(Celluzzi等，1996；Young等，1996)。脂质体和CPP将在以下进一步详细描述。在一些实施方案中，免疫治疗可使用编码本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的核酸，其中所述核酸例如在病毒载体或非病毒载体中递送。
肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)还可与细胞渗透肽(CPP)缔合或共价结合。可与肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)共价结合的细胞渗透肽包括例如HIV Tat、疱疹病毒VP22、果蝇触角足(Drosophila Antennapedia)同源框基因产物、信号序列、融合序列或抗微生物肽I(protegrin I)。使肽与CPP共价结合可延长树突细胞对肽的呈递，由此增强抗肿瘤免疫(Wang和Wang，2002)。在一些实施方案中，本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如包含在肽或多表位串内)(例如VCX/Y肽)可与CPP共价结合(例如通过肽键)以产生融合蛋白。在另外的实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)或编码肿瘤抗原特异性肽的核酸可被包封在脂质体(例如多层、囊泡状或多囊泡状脂质体、胞外囊泡或外泌体)内或与其缔合。
本文中使用的“缔合”意指物理缔合、化学缔合或二者。例如，缔合可以涉及共价键、疏水性相互作用、包封、表面吸附等。
本文中使用的“细胞渗透剂”是指增强肽/多表位串向抗原呈递细胞的胞内递送的组合物或化合物。例如，细胞渗透剂可以是在与肽缔合时增强其穿过质膜之能力的脂质。或者，细胞渗透剂可以是肽。细胞渗透肽(CPP)是本领域中已知的，并且包括例如HIV的Tat蛋白(Frankel和Pabo，1988)、HSV的VP22蛋白(Elliott和O’Hare，1997)和成纤维细胞生长因子(Lin等，1995)。
已从果蝇触角足同源框基因(Drosophila Antennapedia homeobox gene，Antp)的第三螺旋、HIV Tat和疱疹病毒VP22中鉴定出细胞渗透肽(或“蛋白质转导结构域”)，其中的所有均包含富含精氨酸和赖氨酸残基的带正电荷的结构域(Schwarze等，2000；Schwarze等，1999)。此外，来源于信号序列的疏水性肽也已被鉴定为细胞渗透肽(Rojas等，1996；Rojas等，1998；Du等，1998)。已经显示，使这些肽与标志蛋白(例如β-半乳糖苷酶)偶联使标志蛋白被高效地内化到细胞中，并且包含这些肽的嵌合的框内融合蛋白已经被用于在体外和体内二者将蛋白质递送到广谱细胞类型中(Drin等，2002)。这些细胞渗透肽与根据本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的融合可增强多肽的细胞摄取。
在一些实施方案中，通过使脂质(例如硬脂酸酯或豆蔻酸酯)与多肽附接来促进细胞摄取。已经显示，脂化(lipidation)增强了肽向细胞中的进入。脂质部分的附接是本公开内容提高细胞的多肽摄取的另一种方式。细胞摄取在以下进一步讨论。
本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)可包含在脂质体疫苗组合物中。例如，脂质体组合物可以是脂蛋白体组合物(proteoliposomal composition)或包含脂蛋白体组合物。用于产生可与本公开内容一起使用的脂蛋白体组合物的方法例如在Neelapu等(2007)和Popescu等(2007)中描述。在一些实施方案中，脂蛋白体组合物可用于治疗黑素瘤。
通过增强肿瘤抗原特异性多肽的摄取，降低治疗所需的蛋白质或肽的量可以是可行的。这进而可显著降低治疗成本并提高治疗剂的供应。较低的剂量还可以使肽的潜在免疫原性最小化并限制毒性副作用。
在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)可与纳米粒缔合以形成纳米粒-多肽复合体。在一些实施方案中，纳米粒是脂质体或其他基于脂质的纳米粒，例如基于脂质的囊泡(例如，DOTAP：胆固醇囊泡)。在另外的实施方案中，纳米粒是基于铁氧化物的超顺磁性纳米粒。直径为约10nm至100nm的超顺磁性纳米粒足够小以避免被脾隔离(sequester)，但足够大以避免被肝清除。该尺寸的颗粒可以渗透非常小的毛细血管并且可以有效地分布在身体组织中。超顺磁性纳米粒-多肽复合体可以用作MRI造影剂来鉴定和追踪摄取肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的那些细胞。在一些实施方案中，纳米粒是半导体纳米晶体或半导体量子点，其二者均可用于光学成像。在另外的实施方案中，纳米粒可以是在二氧化硅核芯之上包含金层的纳米壳。纳米壳的一个优点是可使用标准化学来使多肽与金层缀合。在另外的实施方案中，纳米粒可以是富勒烯或纳米管(Gupta等，2005)。
肽通过肾从循环中快速除去，并且在血清中对通过蛋白酶的降解敏感。通过使肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)与纳米粒缔合，本公开内容的纳米粒-多肽复合体可针对降解提供保护和/或降低通过肾的清除。这可提高多肽的血清半衰期，从而降低有效治疗的多肽剂量需求。此外，这可降低治疗成本，并且使治疗的免疫学问题和毒性反应最小化。
B.多表位串
在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)包括或包含在多表位串中。多表位串是包含来自连接在一起的一个或更多个抗原的多个抗原表位的肽或多肽。多表位串可用于在对象(例如人对象)中诱导免疫应答。多表位串先前已被用于靶向疟疾和其他病原体(Baraldo等，2005；Moorthy等，2004；Baird等，2004)。多表位串可指核酸(例如，编码包括VCX/Y肽在内的多种抗原的核酸)，或者肽或多肽(例如，包含包括VCX/Y肽在内的多种抗原)。多表位串可包含在癌症疫苗组合物中。
C.生物功能等同物
本公开内容的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)可被修饰以包含不改变其分别与HLA类蛋白(例如HLA-A*0101)结合区的相互作用的氨基酸置换、***和/或缺失。肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的这样的生物功能等同物可以是具有类似特征或在其他方面期望的特征(例如，HLA-A*0201的结合)的分子。作为一个非限制性实例，在本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)中的某些氨基酸可被置换为其他氨基酸而没有可观的相互作用能力的损失，如通过与HLA-A*0201结合的可检测地未改变的肽所表明的。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽在锚定驻留处具有置换突变，例如在以下位置中的一个、两个或全部处具有置换突变：1(P1)；2(P2)；和/或9(P9)。因此应想到，在序列和/或结构上被修饰但生物学效用或活性未改变的本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)(或编码这样的肽的核酸)仍在本文中公开的组合物和方法的范围之内。
技术人员还充分理解的是，生物功能等同肽的定义所固有的是以下概念：存在对可在分子的限定部分中做出的改变的数量限制，同时仍然维持可接受水平的等同生物活性。因此，本文中将生物功能等同肽定义为其中某些(不是大部分或所有)氨基酸可被置换的那些肽。当然，根据本公开内容可容易地制造和使用多种具有不同置换的不同肽。
技术人员还意识到，在显示某些残基(例如在特定表位中的残基)对肽的生物或结构特性特别重要的情况下，这样的残基通常可不进行交换。在本公开内容中可以是这种情况，如本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)中的突变可导致物种特异性的丧失并且进而降低所得肽用于本公开内容的方法中的效用。因此，抗原性的(例如，特异性地结合HLA-A*0201)并且包含保守氨基酸置换的肽被理解为包含在本公开内容中。保守置换最不可能彻底地改变蛋白质的活性。“保守氨基酸置换”是指用化学上类似的氨基酸置换氨基酸，即：用其他非极性氨基酸置换非极性氨基酸；用其他极性氨基酸置换极性氨基酸；用其他酸性氨基酸置换酸性残基，等。
氨基酸置换(例如可用于修饰本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的那些)通常基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。对氨基酸侧链取代基的尺寸、形状和类型的分析揭示，精氨酸、赖氨酸和组氨酸全部是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸全部具有类似的尺寸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸全部具有大致类似的形状。因此，基于这些考虑，本文中将精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸定义为生物功能等同物。在一些实施方案中，突变可增强TCR-pMHC相互作用和/或肽-MHC结合。
本公开内容还考虑了本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的异形体(isoform)。异形体包含与本公开内容的肽相同数目和种类的氨基酸，但异形体具有不同的分子结构。本公开内容所考虑的异形体是与本文中所述的本公开内容的肽具有相同特性的那些。
可通过对现有氨基酸进行化学修饰或通过从头合成本文中公开的肽在蛋白质中并入非标准氨基酸。非标准氨基酸是指在化学结构上与由遗传密码所编码的二十种标准氨基酸不同的氨基酸。
在一些选定实施方案中，本公开内容考虑了本文中公开的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)的化学衍生物。“化学衍生物”是指具有一个或更多个通过功能性侧基的反应而化学衍生化的残基并且保留生物活性和效用的肽。这样的衍生化肽包括，例如，其中游离氨基已被衍生化以形成特定盐或通过烷基化和/或酰化来衍生除其他以外的对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基、甲酰基或乙酰基的那些肽。游离羧基可被衍生化以形成有机或无机盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼并且优选酰胺(伯胺或仲胺)。化学衍生物可包括包含二十种标准氨基酸的一种或更多种天然存在氨基酸衍生物的那些肽。例如，可将4-羟脯氨酸置换为丝氨酸；以及可将鸟氨酸置换为赖氨酸。
应注意，所有氨基酸残基序列在本文中均用其左右取向为氨基末端至羧基末端的常规方向的式来表示。此外，应注意，在氨基酸残基序列的起点或末端的短划线表示与具有一个或更多个氨基酸残基的另外序列的肽键。本文中所述的氨基酸优选是“L”异构体形式。然而，“D”异构体形式的残基可以被置换为任何L-氨基酸残基，只要蛋白质保留本文中所述的期望功能特性即可。
优选的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)或其类似物优选特异性地或优先地结合HLA-A*0201。确定特定肿瘤抗原特异性肽或经标记肽，或其类似物是否结合或以何种程度可结合HLA-A*0201可使用例如如以下的体外测定来进行评估：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、免疫染色、胶乳凝集(latex agglutination)、间接血凝测定(indirect hemagglutination assay，IHA)、补体结合(complement fixation)、间接免疫荧光测定(FA)、浊度法(nephelometry)、流式细胞术测定、化学发光测定、侧流免疫测定、u-捕获测定、质谱法测定、基于颗粒的测定、抑制测定和/或亲合力测定。
D.编码肿瘤抗原特异性肽的核酸
在一个方面中，本公开内容提供了编码分离的抗原特异性肽的核酸，所述抗原特异性肽包含与SEQ ID NO：1、8、9、12、13、或14具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，或者所述肽与SEQ ID NO：1、8、9、12、13、或14相比可具有1、2、3或4个点突变(例如置换突变)。如上所述，这样的肿瘤抗原特异性肽的长度可以是例如8至35个氨基酸，或其中可推论出的任何范围。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性肽对应于肿瘤抗原蛋白的一部分例如VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B或VCY(例如VCX3A；GenBank登录No：AAI26903.1)。术语“核酸”旨在包括DNA和RNA并且可以是双链或单链的。
本公开内容的一些实施方案提供了可特异性地结合HLA-A*0201的重组产生的肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)。因此，可使编码肿瘤抗原特异性肽的核酸与表达载体以及使用分子生物学领域中公知的方法在合适的表达系统中产生的肽可操作地连接。编码本文中公开的肿瘤抗原特异性肽的核酸可并入到确保该肽良好表达的任何表达载体中。可能的表达载体包括但不限于黏粒、质粒或经修饰病毒(例如复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要该载体适合于宿主细胞的转化即可。
“适合于宿主细胞的转化”的重组表达载体意指该表达载体包含本公开内容的核酸分子和与该核酸分子可操作地连接的基于待用于表达的宿主细胞选择的调节序列。术语“有效连接”或“可操作地连接”可互换使用，并且旨在意指核酸以允许该核酸表达的方式与调节序列连接。
因此，本公开内容提供了重组表达载体，其包含编码肿瘤抗原特异性肽的核酸，和用于转录和翻译所***的蛋白质序列的必需调节序列。合适的调节序列可来源于多种来源，包括细菌、真菌或病毒基因(例如参见Goeddel(1990)中描述的调节序列)。
合适调节序列的选择通常取决于所选择的宿主细胞，并且可由本领域普通技术人员容易地实现。这样的调节序列的一些实例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列；核糖体结合序列，其包括翻译起始信号。此外，根据所选择的宿主细胞和所使用的载体，其他序列(例如复制起点、其他DNA限制性位点、增强子和赋予转录可诱导性的序列)也可并入到表达载体中。还将理解的是，必需调节序列可由天然蛋白质和/或其侧翼区提供。
重组表达载体还可包含选择性标志基因，其有利于选择用本文中公开的重组肿瘤抗原特异性肽(例如VCX/Y肽)转化或转染的宿主细胞。选择性标志基因的一些实例是编码例如以下蛋白质的基因：赋予针对某些药物之抗性的G418和潮霉素；β-半乳糖苷酶；氯霉素乙酰转移酶；或萤火虫萤光素酶。选择性标志基因的转录通过选择性标志蛋白(例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶)的浓度改变来监测。如果选择性标志基因编码赋予抗生素抗性(例如新霉素抗性)的蛋白质，则可用G418选择转化体细胞。已经并入选择性标志基因的细胞将存活，而其他细胞将死亡。这使得可以使重组表达载体的表达可视化和对其进行测定，并且特别地可以确定突变对表达和表型的影响。应理解，选择性标志可被引入到来自目的核酸的分离的载体上。
重组表达载体可以被引入到宿主细胞中以产生转化体宿主细胞。术语“转化体宿主细胞”旨在包括已经用本公开内容的重组表达载体转化或转染的原核和真核细胞。术语“用……转化”、“用……转染”、“转化”和“转染”旨在涵盖通过本领域中已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体)引入到细胞中。合适的宿主细胞包括广泛多种的原核和真核宿主细胞。例如，本公开内容的蛋白质可在细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))、昆虫细胞(使用杆状病毒)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。
本公开内容的核酸分子还可使用标准技术来化学合成。化学合成多聚脱氧核苷酸的多种方法是已知的，包括固相合成，其与肽合成类似，已经在可商购的DNA合成仪中完全自动化(参见例如美国专利No.4,598,049；4,458,066；4,401,796；和4,373,071)。
III.抗原特异性细胞治疗
本公开内容的某些实施方案涉及获得抗原特异性细胞(例如自体或同种异体T细胞(例如调节性T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或γδ T细胞)、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、间充质干细胞(MSC)或诱导多潜能干(iPS)细胞)并将其施用于对象作为针对靶向癌细胞的免疫治疗。特别地，所述细胞是抗原特异性T细胞(例如VCX/Y特异性T细胞)。在过去的二十年中已经描述了数种用于功能性抗肿瘤效应T细胞的衍生、活化和扩增的基本方法。这些包括：自体细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)；使用自体DC、淋巴细胞、人工抗原呈递细胞(APC)或包被有T细胞配体和活化抗体的珠离体活化的T细胞，或通过捕获靶细胞膜分离的细胞；天然表达抗宿主肿瘤T细胞受体(TCR)的同种异体细胞；以及经遗传重编程或“重定向”以表达展现出称为“T-体(T-body)”的抗体样肿瘤识别能力的肿瘤反应性TCR或嵌合TCR分子的非肿瘤特异性自体或同种异体细胞。这些方法已经产生了许多用于T细胞制备和免疫的方案，其可用于本文中所述的方法。
A.T细胞制备
在一些实施方案中，T细胞来源于血液、骨髓、淋巴、脐带或淋巴器官。在一些方面中，细胞是人细胞。细胞通常是原代细胞，例如直接从对象分离和/或从对象分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或另一些细胞类型的一个或更多个亚群，例如全部T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞、及其亚群，例如由以下限定的那些：功能、活化状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标志或细胞因子分泌特征、和/或分化程度。与待治疗的对象相关，细胞可以是同种异体的和/或自体的。在一些方面中，例如对于现成技术，细胞是多潜能的(pluripotent)和/或多能的(multipotent)，例如干细胞，例如诱导多潜能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，如本文中所述的，所述方法包括从对象分离细胞、制备、处理、培养和/或改造它们，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入到同一患者中。
T细胞(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞)的亚型和亚群中存在初始T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞，及其亚型，例如干细胞记忆T(TSCM)细胞、中枢记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞或终末分化效应记忆T细胞；肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关不变T(mucosa-associated invariant T，MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助性T细胞(例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞)；α/β T细胞和δ/γ T细胞。
在一些实施方案中，一种或更多种T细胞群富集或耗尽对特定标志(例如表面标志)呈阳性的细胞，或对特定标志呈阴性的细胞。在一些情况下，这样的标志是在某些T细胞群(例如非记忆细胞)上不存在或以相对低的水平表达但是在某些其他T细胞群(例如记忆细胞)上存在或以相对较高的水平表达的那些标志。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(例如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标志(例如CD14)来使T细胞从PBMC样品中分离。在一些方面中，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助性和CD8+细胞毒性T细胞。通过阳性或阴性选择在一种或更多种初始T细胞、记忆T细胞和/或效应T细胞亚群上表达或表达至相对较高程度的标志，这样的CD4+和CD8+群可以进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，CD8+ T细胞进一步富集或耗尽稚细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞和/或中枢记忆干细胞，例如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择。在一些实施方案中，进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集以提高效力，例如以改善在施用之后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面中在这样的亚群中特别强大。参见Terakura等，2012；Wang等，2012。
在一些实施方案中，T细胞是自体T细胞。在该方法中，从患者获得肿瘤样品并获得单细胞悬液。单细胞悬液可以以任何合适的方式，例如机械地(使用例如gentleMACSTM解离器，Miltenyi Biotec，Auburn，Calif.来解离肿瘤)或酶促地(例如胶原酶或DNA酶)获得。肿瘤酶消化物的单细胞悬液在白介素-2(IL-2)中培养。培养细胞直至汇合(例如约2×106个淋巴细胞)，例如约5至约21天，优选约10至约14天。
可以合并培养的T细胞并快速扩增。快速扩增提供了抗原特异性T细胞的数量在约10至约14天的时期内至少约50倍(例如，50、60、70、80、90或100倍或更高)的增加。更优选地，快速扩增提供了在约10至约14天的时期内至少约200倍(例如，200、300、400、500、600、700、800、900倍或更高)的增加。
扩增可以通过本领域中已知的许多方法中的任一种来完成。例如，可以在饲养淋巴细胞和白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)(其中IL-2为优选)的存在下使用非特异性T细胞受体刺激来快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激可包含约30 ng/ml的OKT3(小鼠单克隆抗CD3抗体，可从Raritan，N.J.获得)。或者，可以在T细胞生长因子(例如300 IU/ml IL-2或IL-15，其中IL-2为优选)的存在下，通过用一种或更多种可以任选地由载体(例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽)表达的癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位或细胞)体外刺激PBMC来快速扩增T细胞。通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的同一癌症抗原再刺激来快速扩增体外诱导的T细胞。或者，可以例如用经辐射的自体淋巴细胞或者用经辐射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞以及IL-2来再刺激T细胞。
可以修饰自体T细胞以表达促进自体T细胞的生长和活化的T细胞生长因子。合适的T细胞生长因子包括例如IL-2、IL-7、IL-15和IL-12。合适的修饰方法是本领域中已知的。参见例如，Sambrook等，2001；和Ausubel等，1994。在特定方面中，经修饰的自体T细胞以高水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列，例如IL-12的编码序列，在本领域中是容易获得的，启动子也是如此，其与T细胞生长因子编码序列的可操作连接促进了高水平表达。
B.经遗传改造的抗原受体
可以对本公开内容的细胞(例如自体或同种异体T细胞(例如调节性T细胞，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或γδ T细胞)、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、间充质干细胞(MSC)或诱导多潜能干细胞)进行遗传改造以表达抗原受体，例如经改造的TCR和/或CAR。例如，宿主细胞(例如自体或同种异体T细胞)被修饰以表达对癌症抗原具有抗原特异性的TCR。在特定实施方案中，抗原受体对VCX/Y(例如VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B和VCY、特别是VCX54肽)具有抗原特异性。在某些实施方案中，经改造的TCR具有与SEQ ID NO：2或19具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的α链CDR3和/或与SEQID NO：3或20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的β链CDR3。在一些实施方案中，TCR具有与SEQ ID NO：4、5、15或16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的α链和/或与SEQID NO：6、7、17或18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的β链。合适的修饰方法是本领域中已知的。参见例如Sambrook和Ausubel(同上)。例如，可以使用Heemskerk等，2008和Johnson等，2009中描述的转导技术来转导细胞以表达对癌症抗原具有抗原特异性的TCR。
在一些实施方案中，细胞包含通过遗传改造引入的编码一种或更多种抗原受体的一种或更多种核酸，以及这样的核酸的遗传改造的产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，例如从另一生物体或细胞获得的核酸，例如，其通常不在被改造的细胞和/或这样的细胞所来源的生物体中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，例如未在自然界中发现的核酸(例如嵌合的)。
在一些实施方案中，CAR包含与抗原特异性结合的胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，抗原是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是经处理的肽抗原，例如胞内蛋白的肽抗原，其与TCR类似，在主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex，MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。
示例性抗原受体，包括CAR和重组TCR，以及用于改造受体并将其引入到细胞中的方法，包括例如在以下中描述的那些：国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061；美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337；美国专利No.6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118；和欧洲专利申请号EP2537416；以及/或由以下描述的那些：Sadelain等，2013；Davila等，2013；Turtle等，2012；Wu等，2012。在一些方面中，经遗传改造的抗原受体包括美国专利No.7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开No.：WO/2014055668 A1中描述的那些。
1.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，经改造的抗原受体包括CAR，包括活化或刺激性CAR、共刺激CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等，2013)。CAR通常包含在一些方面中通过接头和/或跨膜结构域与一个或更多个胞内信号传导组分连接的胞外抗原(或配体)结合结构域。这样的分子通常模拟或接近通过天然抗原受体的信号、通过与共刺激受体结合的这样的受体的信号和/或仅通过共刺激受体的信号。
在一些实施方案中，构建具有针对特定抗原(或标志或配体)的特异性的CAR，所述抗原例如在特定细胞类型中表达以被过继性治疗靶向的抗原，例如癌症标志；和/或旨在诱导抑制应答的抗原，例如在正常或非患病细胞类型上表达的抗原。因此，CAR通常在其胞外部分包含一种或更多种抗原结合分子，例如一种或更多种抗原结合片段、结构域，或部分，或者一种或更多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包含抗体分子的一个或更多个抗原结合部分，例如来源于单克隆抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在一些方面中，抗原特异性结合或识别组分与一个或更多个跨膜结构域和胞内信号传导结构域连接。在一些实施方案中，CAR包含与CAR的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸置换来选择或修饰跨膜结构域以避免这样的结构域与具有相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合体的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域来源于天然或合成的来源。在来源是天然的情况下，在一些方面中，结构域来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括来源于以下的那些(即至少包括以下的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS/CD278、GITR/CD357、NKG2D和DAP分子。或者，在一些实施方案中跨膜结构域是合成的。在一些方面中，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面中，将在合成的跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
CAR通常包含至少一种胞内信号传导组分。在一些实施方案中，CAR包含TCR复合体的胞内组分，例如介导T细胞活化和细胞毒性的TCRCD3+链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面中，抗原结合分子与一种或更多种细胞信号传导模件连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模件包括CD3跨膜结构域、CD3胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR还包含一种或更多种其他分子(例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面中，CAR包含CD3ζ(CD3-Q或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
2.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，经遗传改造的抗原受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”是指这样的分子，其包含可变a和β链(也分别称为TCR α和TCR β)或可变γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)，并且能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽。在一些实施方案中，TCR是αβ形式。在某些实施方案中，经改造的TCR具有SEQ IDNO：2的α链CDR3和/或SEQ ID NO：3的β链CDR3。在一些实施方案中，TCR具有SEQ ID NO：4、5、15或16的α链和/或SEQ ID NO：6、7、17或18的β链。
一般来说，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上相似，但表达它们的T细胞可具有不同的结构学位置或功能。TCR可以出现在细胞表面上或是可溶的形式。一般来说，TCR出现在其通常负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合之抗原的T细胞(或T淋巴细胞)表面上。在一些实施方案中，TCR还可以包含恒定结构域、跨膜结构域和/或短的细胞质尾(参见例如，Janeway等，1997)。例如，在一些方面中，TCR的每条链可具有一个N端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和在C末端处的短的细胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合体的不变蛋白质缔合。除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整或全长的TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。
因此，出于本文中的目的，提及TCR包括任何TCR或功能性片段，例如与在MHC分子中结合的特定抗原肽(即MHC-肽复合体)结合的TCR的抗原结合部分。可互换使用的TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指包含TCR的结构性结构域的一部分但与完全TCR结合的抗原(例如MHC-肽复合体)结合的分子。在一些情况下，抗原结合部分包含足以形成用于与特异性MHC-肽复合体结合的结合位点(例如通常在那里每条链包含三个互补决定区)的TCR的可变结构域，例如TCR的可变α链和可变β链。
在一些实施方案中，TCR链的可变结构域缔合以形成环，或类似于免疫球蛋白的互补决定区(complementarity determining region，CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点来赋予抗原识别和确定肽特异性和确定肽特异性。一般来说，与免疫球蛋白类似，CDR由框架区(framework region，FR)分隔开(参见例如Jores等，1990；Chothia等，1988；Lefranc等，2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别经处理抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也已显示出与抗原肽的N端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C端部分相互作用。认为CDR2识别MHC分子。在一些实施方案中，β-链的可变区可包含另外的高变(HV4)区。
在一些实施方案中，TCR链包含恒定结构域。例如，与免疫球蛋白类似，TCR链(例如，a链、β链)的胞外部分可包含两个免疫球蛋白结构域、N端的可变结构域(例如，Va或Vp；通常是基于Kabat编号的第1至116位氨基酸，Kabat等，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Dept.Health and Human Services，Public HealthService National Institutes of Health，1991，第5版)，以及与细胞膜相邻的一个恒定结构域(例如，a链恒定结构域或Ca，通常是基于Kabat的第117至259位氨基酸；β链恒定结构域或Cp，通常是基于Kabat的第117至259位氨基酸)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的胞外部分包含两个近膜端恒定结构域和两个包含CDR的远膜端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域包含短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，在两条链之间形成连接。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中包含两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链可包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链包含细胞质尾。在一些情况下，该结构允许TCR与其他分子(如CD3)缔合。例如，包含具有跨膜区的恒定结构域的TCR可以将蛋白质锚定于细胞膜并与CD3信号传导装置或复合体的不变亚基缔合。
一般来说，CD3是可以具有在哺乳动物中的三条不同链(γ、δ和ε)和ζ链的多蛋白复合体。例如，在哺乳动物中，该复合体可包含CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链，以及CD3ζ链的同二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是包含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链缔合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的胞内尾各自包含单个称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的保守基序，而每个CD3ζ链具有三个。一般来说，ITAM涉及TCR复合体的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区并在将信号从TCR传送到细胞中发挥作用。CD3链和ζ链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合体。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者其可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是包含例如通过一个或更多个二硫键连接的两条独立的链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。在一些实施方案中，鉴定针对靶抗原(例如癌症抗原)的TCR并将其引入细胞中。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可从多种来源获得，例如通过公众可获得的TCR DNA序列的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增。在一些实施方案中，TCR获自生物来源，例如获自细胞，例如获自T细胞(例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可获自体内分离的细胞。在一些实施方案中，可以从患者分离高亲和力的T细胞克隆，并分离TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如人白细胞抗原系统或HLA)改造的转基因小鼠中产生了针对靶抗原的TCR克隆。参见例如肿瘤抗原(参见例如，Parkhurst等，2009和Cohen等，2005)。在一些实施方案中，噬菌体展示用于分离针对靶抗原的TCR(参见例如，Varela-Rohena等，2008和Li，2005)。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可根据TCR序列的知识合成地产生。
3.抗原呈递细胞
抗原呈递细胞，其包括巨噬细胞、B淋巴细胞和树突细胞，通过其特定MHC分子的表达来区分。APC内化抗原并在与其外细胞膜上的MHC分子一起重新表达该抗原的一部分。主要组织相容性复合体(MHC)是具有多个基因座的大的遗传复合体。MHC基因座编码两个主要类别的MHC膜分子，称为I类和II类MHC。T辅助性淋巴细胞通常识别与MHCII类分子相关的抗原，而T细胞毒性淋巴细胞识别与MHC I类分子相关的抗原。在人中，MHC被称为HLA复合体，并且在小鼠中被称为H-2复合体。
在一些情况下，aAPC可用于制备一些实施方案的治疗组合物和细胞治疗产品。对于关于抗原呈递系统的制备和使用的一般指导，参见例如，美国专利No.6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662；美国专利申请公开No.2009/0017000和2009/0004142；以及国际公开No.WO2007/103009。
aAPC系统可包含至少一种外源辅助分子(assisting molecule)。可使用辅助分子的任何合适的数量和组合。辅助分子可选自例如共刺激分子和黏附分子的辅助分子。一些示例性共刺激分子包括CD86、CD64(FcγRI)、41BB配体和IL-21。黏附分子可包括：碳水化合物结合糖蛋白，例如选凝素；跨膜结合糖蛋白，例如整联蛋白；钙依赖性蛋白，例如钙黏素；以及单次跨膜免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)超家族蛋白，例如胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)，其促进例如细胞与细胞或细胞与基质的接触。一些示例性黏附分子包括LFA-3和ICAM，例如ICAM-1。可用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和黏附分子)的技术、方法和试剂在例如美国专利No.6,225,042、6,355,479和6,362,001中例证。
IV.可溶性TCR
在一些实施方案中，本公开内容提供了可溶性TCR，例如本文中提供的VCX/Y TCR。可溶性TCR不仅出于研究特定TCR-pMHC相互作用的目的是有用的，而且潜在地可用作检测感染或用于检测自身免疫病标志的诊断工具。可溶性TCR还可应用于染色，例如用于针对在MHC背景下呈递的特定肽抗原的存在而对细胞进行染色。类似地，可溶性TCR可用于将治疗剂(例如细胞毒性化合物或免疫刺激化合物)递送至呈递特定抗原的细胞。可溶性TCR还可用于抑制T细胞，例如，与自身免疫肽抗原反应的那些。在一些方面中，TCR与将邻近处细胞递送至肿瘤的另一个分子连接。在另一些方面中，TCR将毒素、细胞因子、共刺激配体或抑制剂配体递送至以及将分子、细胞或化合物引导至表达肽-MHC的靶细胞中。
在本申请的上下文中，“溶解度”被定义为在以1mg/ml的浓度下在磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)(KCl 2.7mM、KH2PO4 1.5mM、NaCl 137mM和Na2PO4 8mM，pH 7.1至7.5。Life Technologies，Gibco BRL)中TCR被纯化为单分散异二聚体且在25℃下孵育1小时之后超过90％的所述TCR保持为单分散异二聚体的能力。
在一些方面中，本公开内容提供了可溶性T细胞受体(soluble T cell receptor，sTCR)，其包含：(i)TCR α链(例如SEQ ID NO：4、5、15或16)的全部或部分，除了其跨膜结构域之外，和(ii)TCRβ链(例如，SEQ ID NO：6、7、17、或18)的全部或部分，除了其跨膜结构域之外，其中(i)和(ii)各自包含TCR链的功能可变结构域和至少一部分的恒定结构域，并且通过天然TCR中不存在的恒定结构域残基之间的二硫键连接。
在一些方面中，可溶性TCR包含通过一对C端二聚肽(例如亮氨酸拉链)而分别二聚成TCR β或δ链胞外结构域的TCR α或γ链胞外结构域(国际专利公开No.WO 99/60120；美国专利No.7,666,604)。
本公开内容的可溶性TCR(其优选是人的)可以以基本上纯的形式或作为经纯化或经分离的制剂提供。例如，其可以以基本上不含其他蛋白质的形式提供。
本公开内容的多种可溶性TCR可以多价复合体提供。因此，在一个方面中，本公开内容提供了多价T细胞受体(TCR)复合体，其包含如本文中所述的多种可溶性T细胞受体。所述多种可溶性TCR的每一种优选是相同的。
在其最简单的形式中，根据本公开内容的多价TCR复合体包含优选通过接头分子的两个或三个或四个或更多个T细胞受体分子彼此缔合(例如共价地或以其他方式连接)的多聚体。合适的接头分子包括但不限于多价附接分子，例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和extravidin，它们各自具有四个针对生物素的结合位点。因此，生物素化的TCR分子可以形成到具有多个TCR结合位点的T细胞受体的多聚体中。多聚体中TCR分子的数目将取决于与用于制造该多聚体的接头分子的量相关的TCR的量，而且还取决于是否存在任何其他生物素化的分子。优选的多聚体是二聚体、三聚体或四聚体TCR复合体。
用于本发明方法中的合适的结构包括膜结构，例如脂质体；以及固体结构，其优选颗粒，例如珠(例如胶乳珠)。可以在外部包被有T细胞受体分子的其他结构也是合适的。优选地，所述结构包被有T细胞受体多聚体而不是包被有单独T细胞受体分子。
在脂质体的情况下，T细胞受体分子或其多聚体可以与膜附接或以其他方式与膜缔合。针对于此的技术是本领域技术人员公知的。
标记或另外的部分(例如毒性或治疗部分)可包含在本公开内容的多价TCR复合体中。例如，标记或另外的部分可以包含在混合的分子多聚体中。这种多聚体分子的实例为四聚体，其包含三个TCR分子和一个过氧化物酶分子。这可以通过以3∶1的摩尔比来混合TCR和酶以产生四聚体复合体，并从任何不包含正确比的分子的复合体中分离所期望的复合体来实现。这些经混合的分子不包含任何分子的组合，条件是位阻不会损害或不会显著地损害分子的所期望的功能。由于不太可能发生位阻，链霉抗生物素蛋白分子上的结合位点的定位适合于经混合的四聚体。
本公开内容的TCR(或其多价复合体)可替代地或另外地与治疗剂缔合(例如与其共价地或以其他方式连接)，所述治疗剂可以是例如可用于细胞杀伤中的毒性部分，或者免疫刺激剂(例如白介素或细胞因子)。与非多聚体的T细胞受体异二聚体相比，本公开内容的多价TCR复合体可具有针对TCR配体的增强的结合能力。因此，根据本公开内容的多价TCR复合体特别有益于在体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，并且还有益于作为用于生产具有此类用途的另外的多价TCR复合体的中间体。因此，TCR或多价TCR复合体可以可药用制剂提供以用于体内。
本公开内容还提供了用于将治疗剂递送至靶细胞的方法，所述方法包括使潜在的靶细胞与根据本公开内容的TCR或多价TCR复合体在使TCR或多价TCR复合体与靶细胞附接的情况下接触，所述TCR或多价TCR复合体对TCR配体具有特异性并且具有与之相关的治疗剂。
特别地，可溶性TCR或多价TCR复合体可用于将治疗剂递送至呈递特定抗原的细胞的位置。这在许多情况下将是有用的，特别是针对肿瘤。可以递送治疗剂以使其在局部但不仅在其结合的细胞上发挥其作用。因此，一种特定策略设想了与对肿瘤抗原特异的T细胞受体或多价TCR复合体连接的抗肿瘤分子。
许多治疗剂可用于该用途，例如放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化学治疗剂(例如顺铂)。为了确保在所期望的位置中进行毒性作用，毒素可以在与链霉抗生物素蛋白连接的脂质体内部，使得化合物缓慢地释放。这将防止在体内转运期间的损伤作用，并确保毒素在TCR与相关抗原呈递细胞结合之后具有最大效果。
其他合适的治疗剂包括：
·小分子细胞毒性剂，即具有杀伤分子量为小于700道尔顿的哺乳动物细胞之能力的化合物。这些化合物还可包含能够具有细胞毒性作用的毒性金属。此外，应理解这些小分子细胞毒性剂还包含前药，即衰变或在生理条件下转变以释放细胞毒性剂的化合物。这些药剂的实例包括顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、加利车霉素(calicheamicin)、多烯紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、卟吩姆钠(porfimer sodium，photofrin)II、替莫唑胺、托扑替康、三甲曲沙葡萄糖醛酸酯、奥司他汀E长春新碱和多柔比星；
·肽细胞毒素，即具有杀伤哺乳动物细胞之能力的蛋白质或其片段。一些实例包括蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；
·放射性核素，即元素的不稳定同位素，其随着α或β颗粒或γ射线中的一种或更多种的同时发射而衰变。一些实例包括碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；
·前药，例如抗体导向的酶前药；以及
·免疫刺激剂，即刺激免疫应答的部分。一些实例包括：细胞因子，例如IL-2；趋化因子，例如IL-8；血小板因子4；黑素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，例如抗CD3抗体或其片段；补体激活剂；异种蛋白结构域；同种异体蛋白结构域；病毒/细菌蛋白结构域以及病毒/细菌肽。
本公开内容的可溶性TCR可用于通过与特异性TCR配体结合从而抑制T细胞活化来调节T细胞活化。涉及T细胞介导的炎症和/或组织损伤的自身免疫病(例如I型糖尿病)将适用于该方法。对于该用途，需要了解由相关pMHC呈递的特定肽表位。
还设想了本公开内容的可溶性TCR和/或多价TCR复合体在制备用于治疗癌症或自身免疫病的组合物中的用途。
还提供了治疗癌症或自身免疫病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的本公开内容的可溶性TCR和/或多价TCR复合体。
如在抗癌和自身免疫治疗中常见的，本公开内容的sTCR可以与其他药剂组合使用，用于治疗癌症和自身免疫病以及在类似患者组中发现的其他相关病症。
IV.治疗方法
本文中提供了用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括向个体施用有效量的抗原特异性细胞治疗，例如VCX/Y特异性T细胞治疗。本文中还提供了具有经遗传改造的TCR转导的T细胞(使TCR与其他生物反应性蛋白质(例如抗CD3)缀合)的过继性T细胞治疗。在另外的实施方案中，提供了用于治疗癌症的方法，其包括用经纯化的肿瘤抗原或免疫显性肿瘤抗原特异性肽对对象进行免疫接种。
本文中提供的VCX/Y肽可用于开发癌症疫苗或免疫原(例如肽或具有佐剂的经修饰的肽混合物，编码多核苷酸和相应的表达产物，例如无活性病毒或其他微生物疫苗)。这些肽特异性疫苗或免疫原可用于直接对癌症患者进行免疫接种以在体内诱导抗肿瘤免疫应答，或用于在体外用肽或编码的多核苷酸加载的APC刺激来扩增抗原特异性T细胞。这些大量的T细胞可以过继性地转移至患者中以诱导肿瘤消退。
考虑治疗的癌症的一些实例包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、***癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、***、胃肠癌、淋巴瘤、肺中的肿瘤前病变、结肠癌、黑素瘤和膀胱癌。
在一些实施方案中，T细胞是自体的。然而，所述细胞可以是同种异体的。在一些实施方案中，T细胞是从患者自身分离的，因此该细胞是自体的。如果T细胞是同种异体的，则可以从数个供体汇集T细胞。将细胞以足以控制、降低或消除所治疗的疾病的症状和体征的量施用于目标对象。
在一些实施方案中，对象可以在T细胞治疗之前施用非清髓性淋巴细胞耗竭化学治疗(nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy)。非清髓性淋巴细胞耗竭化学治疗可以是任何合适的这样的治疗：其可以通过任何合适的途径施用。非清髓性淋巴细胞耗竭化学治疗可以包括例如施用环磷酰胺和氟达拉滨，特别地如果癌症是黑素瘤，其可以是转移性的。施用环磷酰胺和氟达拉滨的一个示例性途径是静脉内。同样，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在特定方面中，施用约60mg/kg环磷酰胺持续2天，在此之后施用约25mg/m2氟达拉滨持续5天。
在某些实施方案中，促进自体T细胞生长和活化的T细胞生长因子与自体T细胞同时或在自体T细胞随后施用于对象。T细胞生长因子可以是促进自体T细胞生长和活化的任何合适的生长因子。合适的T细胞生长因子的一些实例包括IL-2、IL-7、IL-15和IL-12，它们可以单独或以多种组合(例如IL-2和IL-7；IL-2和IL-15；IL-7和IL-15；IL-2、IL-7和IL-15；IL-12和IL-7；IL-12和IL-15；或IL-12和IL2)使用。IL-12是优选的T细胞生长因子。
T细胞可以经静脉内、肌内、皮下、表面、经口、经皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。T细胞治疗的合适剂量可基于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的应答以及主治医师的判断来确定。
对于离散的、实体的、可及的肿瘤特别考虑瘤内注射或注射到肿瘤脉管系统中。局部、区域或全身施用也可以是合适的。对于>4cm的肿瘤，待施用的体积将为约4至10ml(特别是10ml)，而对于＜4cm的肿瘤，将使用约1至3ml的体积(特别是3ml)。作为单次剂量递送的多次注射包含约0.1至约0.5ml体积。
A.药物组合物
本文中还提供了包含抗原特异性免疫细胞(例如T细胞)或受体(例如TCR)和可药用载体的药物组合物和制剂。用于在对象中药用的疫苗组合物可包含本文中公开的肿瘤抗原肽(例如VCX/Y)组合物和可药用载体。
如本文中所述的药物组合物和制剂可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如抗体或多肽)与一种或更多种任选的可药用载体混合来制备(Remington’s PharmaceuticalSciences第22版，2012)，呈经冻干的制剂或水性溶液的形式。可药用载体在所使用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁基醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子，例如钠；金属配合物(例如Zn-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括形成空隙的(insterstitial)药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法描述于美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，sHASEGP与一种或更多种另外的糖胺聚糖酶(例如软骨素酶)组合。
B.组合治疗
在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及抗原特异性免疫细胞群或TCR与至少一种另外的治疗组合。另外的治疗可以是放射治疗、手术(例如，肿块切除术和***切除术)、化学治疗、基因治疗、DNA治疗、病毒治疗、RNA治疗、免疫治疗、骨髓移植、纳米治疗、单克隆抗体治疗，或前述的组合。另外的治疗可以是辅助或新辅助治疗的形式。
在一些实施方案中，另外的治疗是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的治疗是施用副作用限制剂(例如旨在降低治疗副作用的发生和/或严重程度的药剂，例如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，另外的治疗是放射治疗。在一些实施方案中，另外的治疗是手术。在一些实施方案中，另外的治疗是放射治疗和手术的组合。在一些实施方案中，另外的治疗是γ辐射。在一些实施方案中，另外的治疗是靶向PBK/AKT/mTOR途径、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防剂的治疗。另外的治疗可以是本领域中已知的一种或更多种化学治疗剂。
免疫细胞治疗可在相对于另外的癌症治疗(例如免疫检查点治疗)之前、期间、之后或以多种组合施用。施用可以在同时至间隔数分钟至数天至数周的间隔内进行。在其中将免疫细胞治疗与另外的治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间相当长的一段时间内不会失效，使得两种化合物仍然能够对患者发挥有利的组合效应。在这种情况下，考虑在彼此相隔约12小时至24小时或72小时内，并且更特别地，在彼此相隔约6至12小时内，可为患者提供抗体治疗和抗癌治疗。在一些情况下，可期望显著地延长治疗的时间周期，其中各自施用之间的间隔由数天(2、3、4、5、6或7)延长至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可使用多种组合。对于以下的实例，抗原特异性免疫细胞治疗、肽或TCR是“A”，并且抗癌治疗是“B”：
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本发明实施方案的任何化合物或治疗将遵循用于施用这样的化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在可归因于组合治疗的监测毒性的步骤。
1.化学治疗
根据本发明实施方案可使用广泛多种的化学治疗剂。术语“化学治疗”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于意指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物通过其在胞内的活性模式(例如其是否影响细胞周期以及在何阶段影响细胞周期)进行分类。或者，可基于药剂直接交联DNA、嵌入到DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝***畸变的能力来表征药剂。
化学治疗剂的一些实例包括：烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱类(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；卡利抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustard)，例如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类(nitrosurea)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；二膦酸盐类(bisphosphonate)，例如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authrarnycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfimromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮(dromostan.olone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺类，例如米托坦(mitotane)和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；氨苯吖啶(amsacrine)；阿莫斯汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptiniumacetate)；埃博霉素类(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(1entinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登素生物碱类(maytansinoid)，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合体)；雷佐生(razoxane)；根毒素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurinA)、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛(docetaxel)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位复合体，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂类；依托泊苷(VP-16)；异磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸(ibandronate)；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨、诺维本、法呢基蛋白转移酶抑制剂、反铂；以及以上任一种的可药用盐、酸或衍生物。
2.放射治疗
导致DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常被称为γ射线、X射线的那些和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束照射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV辐照。最有可能所有这些因素对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持引起广泛的损害。X射线的剂量范围以50至200伦琴日剂量持续一段长时间(3至4周)至2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、放射辐射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
3.免疫治疗
技术人员将理解，另外的免疫治疗可与一些实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子以靶向并破坏癌细胞。利妥昔单抗就是这样的一个实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志特异的抗体。抗体单独可充当治疗的效应物，或者其可募集其他细胞以实际影响细胞杀伤。抗体还可与药物或毒素(化学治疗性、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且充当靶向剂。或者，效应物可以是直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的携带表面分子的淋巴细胞。多种效应物细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
已经出现抗体-药物缀合物作为癌症治疗剂开发的突破性方法。癌症是世界上引起死亡的原因之一。抗体-药物缀合物(Antibody-drug conjugate，ADC)包含与杀伤细胞的药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。该方法将Mab针对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物组合，产生将有效载荷(药物)递送至具有丰富水平抗原的肿瘤细胞的“武装”MAb。药物的靶向递送还使其在正常组织中的暴露最小化，导致毒性降低和治疗指数提高。FDA对两种ADC药物的批准(2011年(维汀-布仑妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年(曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)或T-DM1))验证了该方法。目前存在超过30种ADC药物候选者处于癌症治疗临床试验的多个阶段(Leal等，2014)。随着抗体工程和接头-有效载荷优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合于该方法和靶向Mab产生的新靶标的鉴定和验证。ADC靶标的两个标准是在肿瘤细胞中上调/高水平的表达和强大的内化。
在免疫治疗的一个方面中，肿瘤细胞必须具有可进行靶向的一些标志，即，该标志不存在于大多数其他细胞上。存在许多肿瘤标志，并且这些肿瘤标志中的任一种可能适于本发明实施方案的上下文中的靶向。常见的肿瘤标志包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化的路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层黏连蛋白受体、erb B和p155。免疫治疗的一个替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子例如MIP-1、MCP-1、IL-8和生长因子，例如FLT3配体。
目前正在研究或正在使用的免疫治疗的一些实例是免疫佐剂，例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)；细胞因子治疗，例如干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)；基因治疗，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander，2012；Hanibuchi等，1998；美国专利5,824,311)。考虑一种或更多种抗癌治疗可与本文中所述的抗体治疗一起使用。
在一些实施方案中，免疫治疗可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点调高信号(例如共刺激分子)或调低信号。可通过免疫检查点阻断被靶向的抑制性免疫检查点包括：腺苷A2A受体(A2A receptor，A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减剂(B and Tlymphocyte attenuator，BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(killer-cellimmunoglobulin，KIR)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG3)、程序性死亡1(programmed death 1，PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3，TIM-3)和T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体，或者特别是抗体，例如人抗体(例如国际专利公开WO2015016718；Pardoll，Nat Rev Cancer；12(4)：252-64，2012；二者均通过引用并入本文)。可使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可使用嵌合、人源化或人形式的抗体。如本领域技术人员将知晓的，替代和/或等同名称可用于本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如，已知，lambrolizumab也以替代和等同名称MK-3475和派姆单抗为人所知。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白或寡肽。一些示例性抗体描述于美国专利No.US8735553、US8354509和US8008449中，所有均通过引用并入本文。用于本文中提供的方法的其他PD-1轴拮抗剂在本领域中是已知的，例如描述于美国专利申请No.US20140294898、US2014022021和US20110008369中，所有均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附蛋白(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的胞外或PD-1结合部分的免疫黏附蛋白)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。派姆单抗，也称为MK-3475、Merck3475、lambrolizumab、和SCH-900475，是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT或hBAT-1，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是WO2010/027827和WO201I/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文中提供的方法中被靶向的另一种免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4在T细胞表面上发现并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时用作“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28类似，并且这两种分子与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。胞内CTLA4也在调节性T细胞中发现并且可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达提高。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白或寡肽。
可以使用本领域中公知的方法来产生适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，在以下中公开的抗CTLA-4抗体可用于本文中公开的方法中：US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为曲美目单抗；以前的ticilimumab)，美国专利No.6,207,156；Hurwitz等，(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17)：10067-10071；Camacho等，(2004)J Clin Oncology 22(145)：摘要No.2505(抗体CP-675206)；和Mokyr等，(1998)Cancer Res 58：5301-5304。每个上述公开物的教导在此通过引用并入。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合CTLA-4的抗体。例如，国际专利申请No.WO2001014424、WO2000037504和美国专利No.8,017,114中描述了人源化CTLA-4抗体；所有均通过引用并入本文。
示例性的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和)或其抗原结合片段和变体(参见例如WO 01/14424)。在另一些实施方案中，抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体竞争与CTLA-4上的相同表位结合和/或结合至CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的其他分子包括例如美国专利No.US5844905、US5885796和国际专利申请No.WO1995001994和WO1998042752(所有均通过引用并入本文)中描述的CTLA-4配体和受体，以及例如美国专利No.US8329867(通过引用并入本文)中描述的免疫黏附蛋白。
手术
约60％患有癌症的人将经历某种类型的手术，其包括预防性、诊断性或分期、治愈性和缓解性手术。治愈性手术包括其中全部或一部分癌组织被物理去除、切除和/或破坏的切除术，并且可以与其他治疗(例如本发明实施方案的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗)结合使用。肿瘤切除术是指物理去除至少一部分肿瘤。除肿瘤切除术之外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和用显微镜控制的手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。
在切除一部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤之后，可以在体内形成腔。治疗可通过灌注、直接注射或向该区域局部施用另外的抗癌治疗来实现。这样的治疗可以重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可具有多种剂量。
5.另外的药剂
考虑可以将另外的药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的治疗效力。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体与GAP连接的增量调节的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、提高过度增殖细胞对细胞凋亡诱导剂或其他生物药剂的敏感性的试剂。通过提高GAP连接数提高细胞间信号传导将会提高相邻过度增殖细胞群的抗过度增殖性作用。在另一些实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖效力。考虑细胞黏附抑制剂以提高本发明实施方案的效力。细胞黏附抑制剂的一些实例是黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑提高过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂(例如抗体c225)可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗效力。
VI.制品或药盒
本文中还提供了包含抗原特异性免疫细胞、TCR或抗原肽(例如VCX/Y肽)的制品或药盒。制品或药盒还可以包含包装插页，所述包装插页包含使用抗原特异性免疫细胞以在个体中治疗癌症或延迟癌症进展或增强患有癌症的个体的免疫功能的说明书。本文中所述的任一种抗原特异性免疫细胞可包含在制品或药盒中。合适的容器包括例如瓶、小瓶、袋和注射器。容器可以由多种材料例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(例如不锈钢或哈氏合金(hastelloy))形成。在一些实施方案中，容器容纳制剂，并且容器上或与容器相关的标签可指示使用指导。制品或药盒还可包含从商业和使用者立场来看期望的其他材料，包括另外的缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插页。在一些实施方案中，制品还包含一种或更多种另一种药剂(例如化学治疗剂和抗肿瘤剂)。对于一种或更多种药剂合适的容器包括例如瓶、小瓶、袋和注射器。
VII.实施例
包含以下实施例以示出本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，在随后实施例中公开的技术代表本发明人发现在本发明的实践中工作良好的技术，并因此可被认为构成用于实施本发明的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可对所公开的特定实施方案作出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。
实施例1-肿瘤抗原特异性肽的鉴定和表征
包括BIMAS、SYFPEITHI和NetMHC分析的表位预测工具用于预测VCX3A抗原的HLA限制性的肽表位。VCX3A结合和亲和力预测的结果如表1中所示。
表1：VCX3A的HLA-A*0201肽结合与亲和力预测。
合成预测的肽，并与具有一系列稀释浓度的T2细胞共培养。使用不含肽或具有与HLA-A2肽阴性结合的相同浓度的DMSO作为对照。在孵育18小时之后，通过流式细胞仪检测HLA-A2表达。荧光指数(FI)计算如下：FI＝(含有给定肽的平均荧光-不含肽的平均荧光)/(不含肽的平均荧光)。从结合测定中，发现VCX54肽在3种预测的肽中显示出与HLA-A2等位基因的最强结合(图1A)。VCX54表位存在于包括在多种肺癌细胞中表达的VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B或VCY在内的VCX/Y家族的所有成员中(图1B)。
接下来，从HLA-A*0201健康供体产生VCX54特异性T细胞克隆。在使用VCX3A mRNA脉冲的树突细胞进行2次刺激之后，观察到CD8+和VCX54四聚体+ T细胞群(图2A)。在四聚体引导的分选之后，使用快速扩增方案(REP)扩增细胞。用有限稀释法产生T细胞克隆，并使它们经历2次扩增。观察到超过99％的细胞为CD8+和四聚体+(图2B)。
测试了VCX54特异性T细胞的功能亲合力。将VCX54 CTL克隆与用多种浓度的VCX54肽脉冲的T2细胞以20∶1的效应物与靶标(E∶T)比共培养。用标准51Cr释放测定(CRA)检测细胞毒性裂解(图3)。将VCX54 CTL克隆(C7)与VCX1阳性表达人肺癌细胞系H2023(HLA-A*0201+)或原代支气管上皮细胞NHBE(HLA-A*0201+)以多种E∶T比共培养。用标准51Cr释放测定(CRA)检测细胞毒性裂解。
为了确定通过特异性T细胞的内源性呈递的VCX54肽的识别，测试了一组HLA-A2阳性肺癌细胞系。将VCX54 CTL克隆与所述表达VCY、VCX3A或VCX1的HLA-A2+肺癌细胞系组以多种E∶T比共培养。HLA-A2阳性原代支气管上皮NHBE细胞用于检测CTL克隆对正常肺组织的细胞毒性。用标准51Cr释放测定(CRA)检测特异性细胞毒性裂解。在肺癌细胞中但未在原代支气管上皮NHBE细胞中观察到VCX54 CTL克隆的高水平细胞毒性(图4)。因此，VCX54 CTL克隆对表达VCX抗原的癌细胞具有选择性细胞毒性。
接下来，进行VCX/Y特异性T细胞的HLA等位基因限制性酶切分析。使用CRA测定分析数种HLA-A0201阴性肺癌细胞系，以检测VCX54 CTL克隆的HLA限制性。PC-9细胞系为HLA-A0206/A2402阳性的，H650细胞系为HLA-A2402阳性的。在这两种细胞系中HLA-A0201等位基因的强制表达显著增强了CTL克隆的细胞毒性裂解水平(图5)。H1573是HLA-A0201和HLA-A2402阴性细胞系。HLA-A0201等位基因的强制表达增强了细胞毒性裂解，但不是以高水平。发现HLA-A0201等位基因与VCX3A基因的共转染显著增强了CTL克隆的细胞毒性裂解水平。
另外，证实了VCX特异性T细胞对肺癌细胞的特异性细胞毒性。用冷靶标抑制测定检测VCX54 CTL克隆的内源性呈递肽特异性识别。热靶标是肺癌细胞(HLA-A2阳性或强制表达)。冷靶标是用VCX54肽(10μg/ml)脉冲的T2细胞。将不含任何肽或用M26肽(10μg/ml)脉冲的T2细胞用作阴性对照。E∶T比为10∶1。冷靶标∶热靶标的比为10∶1或20∶1。当以20∶1的冷靶标∶热靶标的比用VCX54肽脉冲T2细胞时，观察到显著的抑制(图6)。
实施例2-VCX54特异性T细胞受体的产生和评价
对实施例1的VCX54克隆C7的T细胞受体进行使用和序列分析。使用PCR鉴定和流式细胞术，对TCR α链(TRAV)TRAV-14和TCR β链(TRBV)TRBV-13进行分析(图7)。确定TRAV-14CDR3氨基酸序列为CAMITSGNTGKLIF(SEQ ID NO：2)，并确定TRBV-13 CDR3氨基酸序列为CASSPPGGGRTEAFF(SEQ ID NO：3)(图8)。
将来自VCX54 CTL C7克隆的TCR构建至逆转录病毒表达载体pMSGV1中。将包含弗林蛋白酶切割位点、SGSG接头和P2A切割位点的接头片段***TCR-β链与TCR-α链之间，以保证两条链在MSCV启动子下同等地表达(图9)。将包含来自VCX54 CTL克隆的TCR序列的逆转录病毒表达载体pMSGV1和包膜载体RD114共转染至包装细胞系GP2-293中。在转染之后2至3天，将包含逆转录病毒的上清液用于感染PBMC，所述PBMC在50ng/mg OKT3和300U/ml IL-2刺激下活化持续2天。在第一次感染的一天之后再一次进行感染。在5天之后，通过流式细胞术检测到清晰的CD8+四聚体+群(图10)。
在感染之后，使用有限稀释法来产生T细胞克隆。使用VCX1+/HLA-A0201+肺癌细胞系H2023和HLA-A0201+永生化正常人小气道上皮细胞系HSAEC2-KT作为对照，用标准51Cr释放测定(CRA)筛选450个克隆。图11中仅示出了显示出针对H2023细胞系超过20％细胞毒性的克隆。选择C13和C119克隆用于进一步表征。
使用快速扩增方案扩增TCR基因经修饰的T细胞克隆C13和C119。使用CRA再次检测CTL克隆对H2023和HSAEC2-KT的细胞毒性。与C13克隆相比，C119 CTL克隆显示出针对H2023肺癌细胞系的更高的细胞毒性。对于正常肺细胞系HSAEC2-KT，C119 CTL克隆显示出非常低的细胞毒性(图12)。此外，C119克隆显示出对原代支气管上皮细胞系NHBE(HLA-A0201+)没有细胞毒性。
因此，通过四聚体染色和四聚体解离测定对C119克隆进行分析。观察到亲本VCX54CTL克隆和TCR基因经修饰的T细胞克隆C119的四聚体染色是相似的(图13A)。四聚体解离测定显示C119克隆的半数最大结合时间(T1/2)高于亲本VCX54 CTL克隆(图13B)。
进行肽滴定测定以检测TCR基因经修饰的T细胞克隆C119的特异性应答。将亲本VCX54 CTL克隆或TCR基因经修饰的T细胞克隆C119与用连续稀释浓度的VCX54肽脉冲的T2细胞以10∶1的效应物与靶标比过夜共培养。用ELISA检测IFN-γ释放(图14)。在高浓度的肽脉冲下，VCX54 CTL克隆或TCR基因经修饰的T细胞克隆C119的特异性应答是相当的。在低浓度的肽脉冲下，与TCR基因经修饰的T细胞克隆C119相比，VCX54 CTL克隆具有更高的非特异性背景。
进行胞内染色测定以评价TCR基因经修饰的CTL克隆C119的特异性应答。将VCX54CTL克隆或TCR基因经修饰的T细胞克隆C119与HLA-A2+/VCX1+肺癌细胞系H2023、HLA-A0201+永生化正常人小气道上皮细胞HSAEC2-KT，或用10μg/ml VCX54肽或对照肽M26脉冲的T2细胞以10∶1的效应物与靶标的比过夜共培养。用流式细胞术检测TNF-α、CD137、IFN-γ和IL-2的胞内水平。当与肿瘤细胞共培养时，与TCR基因经修饰的T细胞克隆C119相比，亲本CTL克隆显示出更高的TNF-α、CD137、IFN-γ和IL-2水平，但与正常肺细胞共培养时具有更高的背景(图15)。当与T2脉冲肽共培养时，TCR基因经修饰的T细胞克隆C119显示出与亲本CTL克隆相当的TNF-α和IFN-γ水平。
对亲本CTL克隆和TCR基因经修饰的T细胞克隆C119的细胞毒性进行比较。将肺癌细胞系H2023、正常肺细胞系HSAEC2-KT和原代肺细胞NHBE用于测定。将亲本CTL克隆和C119克隆与这些细胞系共培养，并用标准51Cr释放测定检测细胞毒性(图16)。亲本CTL克隆对肿瘤细胞显示出更高的细胞毒性，但对正常肺细胞也具有低水平的细胞毒性。与亲本CTL克隆相比，TCR基因经修饰的T细胞克隆C119对肿瘤细胞显示出略低的细胞毒性，但对正常肺细胞没有任何细胞毒性。因此，与正常细胞相比，C119克隆对肿瘤细胞具有更高的选择性细胞毒性。
总之，这些结果表明鉴定了相关的肿瘤相关抗原表位，并且该表位具有足够的免疫原性以从PBMC诱导抗原特异性T细胞。因此，鉴定的抗原特异性VCX54肽可用于产生抗原特异性T细胞，用于治疗实体癌症中的过继性T细胞转移。
实施例3-材料和方法
VCX54特异性CD8 T细胞的产生和扩增：用先前描述的方式(Li，2005)产生肿瘤抗原特异性CTL。通过用肿瘤抗原肽脉冲的自体DC刺激对HLA-A*0201呈阳性的白细胞去除术(leukapheresis)PBMC。对于诱导树突细胞，将黏附PBMC与GM-CSF和IL-4一起在AIM-V培养基(Invitrogen Life Technologies)中培养6天，并且随后添加IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2用于成熟。1天之后，将成熟DC在室温下在3μg/ml β-微球蛋白的存在下以2×106个细胞/ml1％人血清白蛋白(HSA)/PBS用40 μg/ml肽脉冲4小时。在用1％HSA/PBS洗涤之后，将DC以1.5×106细胞/ml/孔与PBMC在48孔板中混合。初始和在培养之后3至4天添加IL-21(30ng/ml)。在第二次刺激之后1天添加IL-2和IL-7以扩增活化的抗原特异性T细胞。
在第二次刺激之后6天，用VCX/Y肽/MHC-PE缀合的四聚体和CD8-APC抗体对细胞进行染色，并随后通过ARIA II对CD8和四聚体阳性细胞进行分选。通过快速扩增方案(REP)利用饲养细胞PBL和LCL在IL-21下扩增分选的VCX/Y特异性CD8 T细胞。
肽-MHC四聚体染色：通过用HLA A*0201的VCX54肽/MHC复合体的四聚体染色证实VCX54特异性CD8 T细胞。将CD8 T细胞与PE缀合的四聚体一起孵育20分钟，洗涤并随后在室温下用APC缀合的CD8抗体染色15分钟。在洗涤之后，通过流式细胞术(LSRFortessa X-20分析仪)分析细胞。
产生T细胞克隆：将全长VCX3A RNA转染至成熟的树突细胞(DC)中。在IL-21存在下，将RNA转染的DC与自身初始T细胞以DC∶T＝1∶10的比共培养。在一周之后，使用RNA转染的DC再次刺激T细胞。在两轮刺激之后，对CD8+和四聚体+双阳性T细胞群进行分选并用快速扩增方案扩增。用有限稀释法产生T细胞克隆。通过肿瘤细胞杀伤测定来筛选高活性CTL克隆。
TCR克隆和逆转录病毒表达载体构建：根据试剂盒手册(ClonTech Laboratories)使用5’-RACE方法克隆TCR(包括α链和β链)。使用IMGT/V-QUEST注释工具鉴定TCR Vα和TCRVβ使用。此外，也用使用TCR Vβ Repertoire试剂盒的流量检测来鉴定TCR Vβ使用。用使用一组与不同TCR Vα的5’端退火的特异性引物的PCR来鉴定TCR Vα使用。对于TCR表达逆转录病毒载体构建，根据TCR Vα或β使用来设计正向引物。根据TCR α或β恒定区的序列来设计反向引物。产生包含由P2A接头肽分隔开的α-和β-TCR链的表达盒，并将全长PCR产物克隆到逆转录病毒载体pMSGV1中。用测序验证经克隆的DNA序列。
确定VCX-54 CTL TCR具有以下序列。对信号肽加下划线，CDR为粗体，并且可变区为斜体。
VCX-37 CTL TCR(SEQ ID NO：4)
VCX-37 TL TCR α链(SEQ ID NO：5)
VCX-37 CTL TCR β链(SEQ ID NO：6)
VCX-37 CTL TCR β链(SEQ ID NO：7)
逆转录病毒产生和感染人外周血淋巴细胞(PBL)：将包含TCR的pMSGV1载体和包膜载体RD114共转染至包装细胞系GP2-293中。在转染6至8小时之后，更新培养基。在24小时之后收获上清液，并将其添加至已用20mg/mL RetroNectin包被的6孔板中，随后在32℃下离心(2000×g)2小时。然后除去上清液，并将用50ng/ml OKT3和300U/mlIL-2活化2天的PBL添加至装载有逆转录病毒的板中，随后在32℃下离心(1000×g)10分钟。然后将细胞在32℃下孵育过夜，并在第二天重复该程序(总共两次转导)。在此之后，使细胞在37℃下在5％CO2培养箱中扩增，并根据需要***(split)。
经TCR改造的T细胞克隆的产生：在感染之后，对CD8+和四聚体+T细胞群进行分选，并用有限稀释法产生T细胞克隆。通过肿瘤细胞杀伤测定来筛选高活性CTL克隆。用REP进一步扩增高肿瘤杀伤活性T细胞克隆。
51Cr释放测定：使用标准51Cr释放测定来测量经TCR改造的T细胞或CTL克隆对裂解HLA-A2肿瘤靶标的杀伤能力。将肿瘤细胞或正常细胞在37℃下用200 MCi的51Cr标记2小时。洗涤经标记的靶细胞，并且随后与效应细胞以不同比在0.2ml完全培养基中于37℃下孵育4小时。使用自动γ计数器计数对收获的上清液进行计数。通过将经标记的靶细胞在台盼(trypan)裂解缓冲液或培养基中于37℃下孵育4小时来测定最大和自发的51Cr释放。每个数据点被确定为一式四孔的平均数。如下计算特异性裂解％：杀伤％＝((特异性释放-自发释放)/(总释放-自发释放))×100。
IFN-γ释放测定：用ELISA方法检测T细胞的IFN-γ释放。将T细胞与靶细胞以10∶1比在含有0.2ml培养基的96孔板中在37℃下孵育。在共培养过夜之后，收获上清液并根据试剂盒手册(Invitrogen Life Technologies)使用ELISA检测IFN-γ浓度。
胞内细胞因子染色(ICS)测定：在布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)存在下，将T细胞与靶细胞以10∶1比在37℃下孵育过夜。在共培养之后，收获T细胞并洗涤。首先用流动抗体抗表面标志染色细胞。在此之后，洗涤细胞并用固定缓冲液固定，并且随后使用透化溶液(eBioscience)进行透化。随后用胞内细胞因子流动抗体染色经透化的细胞。最后，使用FACS分析细胞中细胞因子产生的水平。
统计分析：使用GraphPad prism 6.0e版本进行数据分析。使用参数检验(Anova或非配对t检验)分析正态分布的数据。如果p值＜0.05，则统计学检验差异被认为是显著的。
实施例4-另外的VCX/Y家族肽
进行另外的研究以鉴定VCX/Y家族候选HLA-A2限制性肽。研究结果如表2中所示。
表2：来自VCX/Y家族的候选HLA-A2限制性肽。
合成肽并用具有一系列稀释浓度的T2细胞脉冲18小时。在孵育之后，通过流式细胞术检测T2的HLA-A2表达水平并计算FI指数。将M27肽用作弱结合肽对照并将M26肽用作强结合肽对照。从结合测定中，发现VCX-54肽显示出与HLA-A2等位基因的最强结合(图17A)。VCX-58和VCY-37肽也显示出与HLA-A2等位基因的强结合能力。
接下来，用VCY全长RNA脉冲树突细胞并对HLA-A2+细胞进行刺激。在2轮刺激之后，用VCY-37四聚体和抗CD8抗体染色T细胞。对四聚体+CD8+群进行分选并进行快速扩增。在快速扩增之后，用VCY-37四聚体和抗CD8抗体重复染色CTL。发现超过90％的细胞群为四聚体+CD8+(图17B)。
此外，将VCY-37CTL细胞系与VCX1阳性表达人肺癌细胞系H2023(HLA-A*0201+)或永生化正常小气上皮细胞系HSAEC2-KT(HLA-A*0201+)以多种E∶T比共培养。用标准51Cr释放测定(CRA)检测细胞毒性裂解(图17C)。此外，使用数种HLA-A0201+肺癌细胞系作为靶标以测试VCY-37 CTL杀伤能力。数据显示在肺癌细胞H2023中但未在正常肺细胞HSAEC2-KT中观察到高水平的细胞毒性。这在其他肺癌细胞系中得到验证。
对VCY-37细胞的TCR进行测序，发现其具有以下序列。对信号肽加下划线，CDR为粗体，可变区为斜体。
VCY-37 α链(SEQ ID NO；15)
VCY-37 α链(SEQ ID NO：16)
VCY-37 TCR β链(SEQ ID NO：17)
VCY-37 TCRβ链(SEQ ID NO：18)
***
根据本公开内容，本文中公开且要求保护的所有方法均可在没有过度实验的情况下做出和执行。虽然本发明的组合物和方法已根据一些优选实施方案进行描述，但是对于本领域技术人员来说将明显的是，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对本文中所述方法以及本文所述方法的步骤或步骤顺序作出改变。更具体地，将明显的是，在化学和生理两方面均相关的某些试剂可替代本文中所述的试剂而实现相同或类似的结果。对本领域技术人员而言明显的所有这样的类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念之内。
参考文献
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国际专利公开No.WO2013/123061
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国际专利公开No.WO2013126726
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<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX54肽
<400> 1
Gly Ala Ala Thr Lys Met Ala Ala Val
1 5
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX54 TCR α链CDR3
<400> 2
Cys Ala Met Ile Thr Ser Gly Asn Thr Gly Lys Leu Ile Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX54 TCR β链CDR3
<400> 3
Cys Ala Ser Ser Pro Pro Gly Gly Gly Arg Thr Glu Ala Phe Phe
1 5 10 15
<210> 4
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX54 CTL克隆-7 TCR α链
<400> 4
atgtcacttt ctagcctgct gaaggtggtc acagcttcac tgtggctagg acctggcatt 60
gcccagaaga taactcaaac ccaaccagga atgttcgtgc aggaaaagga ggctgtgact 120
ctggactgca catatgacac cagtgatcca agttatggtc tattctggta caagcagccc 180
agcagtgggg aaatgatttt tcttatttat caggggtctt atgaccagca aaatgcaaca 240
gaaggtcgct actcattgaa tttccagaag gcaagaaaat ccgccaacct tgtcatctcc 300
gcttcacaac tgggggactc agcaatgtat ttctgtgcaa tgataacctc tggcaacaca 360
ggcaaactaa tctttgggca agggacaact ttacaagtaa aaccagatat ccagaaccct 420
gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 480
accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 540
gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 600
agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 660
accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa 720
acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg 780
aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg a 831
<210> 5
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX54 CTL克隆-7 TCR α链
<400> 5
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Pro Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Ile Thr Ser Gly Asn Thr Gly Lys Leu Ile Phe Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Leu Gln Val Lys Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
130 135 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
180 185 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
195 200 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
210 215 220
Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225 230 235 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
245 250 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
260 265 270
Leu Trp Ser Ser
275
<210> 6
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX54 CTL克隆-7 TCR β链
<400> 6
atgcttagtc ctgacctgcc tgactctgcc tggaacacca ggctcctctg ccgtgtcatg 60
ctttgtctcc tgggagcagg ttcagtggct gctggagtca tccagtcccc aagacatctg 120
atcaaagaaa agagggaaac agccactctg aaatgctatc ctatccctag acacgacact 180
gtctactggt accagcaggg tccaggtcag gacccccagt tcctcatttc gttttatgaa 240
aagatgcaga gcgataaagg aagcatccct gatcgattct cagctcaaca gttcagtgac 300
tatcattctg aactgaacat gagctccttg gagctggggg actcagccct gtacttctgt 360
gccagcagcc ccccgggcgg ggggcggact gaagctttct ttggacaagg caccagactc 420
acagttgtag aggacctgaa caaggtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca 480
gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc acactggtgt gcctggccac aggcttcttc 540
cctgaccacg tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc 600
acggacccgc agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc 660
agccgcctga gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa 720
gtccagttct acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc 780
acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt agagcagact gtggctttac ctcggtgtcc 840
taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc ctctatgaga tcctgctagg gaaggccacc 900
ctgtatgctg tgctggtcag cgcccttgtg ttgatggcca tggtcaagag aaaggatttc 960
tag 963
<210> 7
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX54 CTL克隆-7 TCR β链
<400> 7
Met Leu Ser Pro Asp Leu Pro Asp Ser Ala Trp Asn Thr Arg Leu Leu
1 5 10 15
Cys Arg Val Met Leu Cys Leu Leu Gly Ala Gly Ser Val Ala Ala Gly
20 25 30
Val Ile Gln Ser Pro Arg His Leu Ile Lys Glu Lys Arg Glu Thr Ala
35 40 45
Thr Leu Lys Cys Tyr Pro Ile Pro Arg His Asp Thr Val Tyr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Asp Pro Gln Phe Leu Ile Ser Phe Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Met Gln Ser Asp Lys Gly Ser Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Gln
85 90 95
Gln Phe Ser Asp Tyr His Ser Glu Leu Asn Met Ser Ser Leu Glu Leu
100 105 110
Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Pro Pro Gly Gly Gly
115 120 125
Arg Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu
130 135 140
Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
145 150 155 160
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
165 170 175
Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
180 185 190
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
195 200 205
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
210 215 220
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
245 250 255
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
260 265 270
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
275 280 285
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
290 295 300
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305 310 315 320
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX37肽
<400> 8
Lys Val Ala Lys Lys Gly Lys Ala Val
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX178肽
<400> 9
Ser Glu Met Glu Glu Leu Pro Ser Val
1 5
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX54 CTL克隆-7 TCR α链跨膜结构域
<400> 10
Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
1 5 10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX54 CTL克隆-7 TCR β链跨膜结构域
<400> 11
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCY-37
<400> 12
Lys Val Ala Glu Lys Gly Glu Ala Val
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX-58
<400> 13
Lys Met Ala Ala Val Glu Ala Pro Glu Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCX-59
<400> 14
Met Ala Ala Val Glu Ala Pro Glu Ala
1 5
<210> 15
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VCY-37 CTL TCR α链
<400> 15
atgctgactg ccagcctgtt gagggcagtc atagcctcca tctgtgttgt atccagcatg 60
gctcagaagg taactcaagc gcagactgaa atttctgtgg tggagaagga ggatgtgacc 120
ttggactgtg tgtatgaaac ccgtgatact acttattact tattctggta caagcaacca 180
ccaagtggag aattggtttt ccttattcgt cggaactctt ttgatgagca aaatgaaata 240
agtggtcggt attcttggaa cttccagaaa tccaccagtt ccttcaactt caccatcaca 300
gcctcacaag tcgtggactc agcagtatac ttctgtgctc tgagcttact atcttataac 360
accgacaagc tcatctttgg gactgggacc agattacaag tctttccaaa tatccagaac 420
cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta 480
ttcaccgatt ttgattctca aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc 540
acagacaaaa ctgtgctaga catgaggtct atggacttca agagcaacag tgctgtggcc 600
tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa 660
gacaccttct tccccagccc agaaagttcc tgtgatgtca agctggtcga gaaaagcttt 720
gaaacagata cgaacctaaa ctttcaaaac ctgtcagtga ttgggttccg aatcctcctc 780
ctgaaagtgg ccgggtttaa tctgctcatg acgctgcggc tgtggtccag ctga 834
<210> 16
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCY-37 CTL TCR α链
<400> 16
Met Leu Thr Ala Ser Leu Leu Arg Ala Val Ile Ala Ser Ile Cys Val
1 5 10 15
Val Ser Ser Met Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Thr Glu Ile Ser
20 25 30
Val Val Glu Lys Glu Asp Val Thr Leu Asp Cys Val Tyr Glu Thr Arg
35 40 45
Asp Thr Thr Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Gly Glu
50 55 60
Leu Val Phe Leu Ile Arg Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn Glu Ile
65 70 75 80
Ser Gly Arg Tyr Ser Trp Asn Phe Gln Lys Ser Thr Ser Ser Phe Asn
85 90 95
Phe Thr Ile Thr Ala Ser Gln Val Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Leu Ser Tyr Asn Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Thr
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Gln Val Phe Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
130 135 140
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
145 150 155 160
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
180 185 190
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
195 200 205
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
210 215 220
Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
225 230 235 240
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe
245 250 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
260 265 270
Arg Leu Trp Ser Ser
275
<210> 17
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VCY-37 CTL TCR β链
<400> 17
atgggcacca gcctcctctg ctggatggcc ctgtgtctcc tgggggcaga tcacgcagat 60
actggagtct cccaggaccc cagacacaag atcacaaaga ggggacagaa tgtaactttc 120
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agtgatcggt tctctgcaga gaggcctaag ggatctttct ccaccttgga gatccagcgc 300
acagagcagg gggactcggc catgtatctc tgtgccagca gcacccccgg gccctctggg 360
gccaacgtcc tgactttcgg ggccggcagc aggctgaccg tgctggagga cctgaaaaac 420
gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 480
aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttcttccctg accacgtgga gctgagctgg 540
tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacgg acccgcagcc cctcaaggag 600
cagcccgccc tcaatgactc cagatactgc ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 660
ttctggcaga acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 720
aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 780
tggggtagag cagactgtgg ctttacctcg gtgtcctacc agcaaggggt cctgtctgcc 840
accatcctct atgagatcct gctagggaag gccaccctgt atgctgtgct ggtcagcgcc 900
cttgtgttga tggccatggt caagagaaag gatttctga 939
<210> 18
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCY-37 CTL TCR β链
<400> 18
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr
20 25 30
Lys Arg Gly Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His
35 40 45
Asn Arg Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe
50 55 60
Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu
65 70 75 80
Ser Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Glu Ile Gln Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Thr Pro Gly Pro Ser Gly Ala Asn Val Leu Thr Phe Gly Ala
115 120 125
Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro
130 135 140
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg
195 200 205
Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
210 215 220
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
225 230 235 240
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
245 250 255
Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser
260 265 270
Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
275 280 285
Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met
290 295 300
Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305 310
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCY-37 CTL TCR α链 CDR3
<400> 19
Ala Leu Ser Leu Leu Ser Tyr Asn Thr Asp Lys Leu Ile
1 5 10
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VCY-37 CTL TCR β链 CDR3
<400> 20
Ala Ser Ser Thr Pro Gly Pro Ser Gly Ala Asn Val Leu Thr
1 5 10
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