稳定的抗体制剂
阅读说明：本技术 稳定的抗体制剂 (Stable antibody formulations ) 是由 Q·胡 D·刘 于 2018-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供稳定的药物制剂,其包含特异性结合人程序性死亡-1蛋白(PD-1)的人抗体。在某些实施方案中,除抗PD-1抗体外,所述制剂还含有缓冲剂、氨基酸、非离子表面活性剂和糖。本发明的药物制剂在应激和储存后表现出相当程度的抗体稳定性。(The present invention provides a stable pharmaceutical formulation comprising a human antibody that specifically binds to human programmed death-1 protein (PD-1). In certain embodiments, the formulation contains, in addition to the anti-PD-1 antibody, a buffer, an amino acid, a nonionic surfactant, and a sugar. The pharmaceutical formulations of the present invention exhibit a considerable degree of antibody stability after stress and storage.)
本申请作为PCT国际专利申请于2018年3月23日提交，并要求2017年4月6日提交的美国临时专利申请号62/482,270的优先权，其公开内容通过整体引用在此作为参考。
技术领域
本发明涉及治疗性抗体制剂的领域。更具体地，本发明涉及药物制剂的领域，所述药物制剂包含特异性结合人程序性死亡-1(PD-1)蛋白的人抗体。
背景技术
治疗性大分子(例如抗体)必须以如下方式配制，即不仅使分子适于向患者施用，而且还在储存和随后使用期间保持其稳定性。例如，液体溶液中的治疗性抗体易于降解、聚集或不希望的化学修饰，除非适当地配制溶液。抗体在液体制剂中的稳定性不仅取决于制剂中使用的赋形剂的种类，还取决于赋形剂相对于彼此的量和比例。此外，在制备液体抗体制剂时必须考虑除稳定性之外的其他因素。这些额外的考虑因素的实例包括溶液的粘度和给定制剂可以容纳的抗体浓度，以及制剂的视觉质量或吸引力。因此，当配制治疗性抗体时，必须非常小心地得到这样的制剂，其保持稳定、含有足够的抗体浓度、并且具有合适的粘度以及使制剂能够方便地施用给患者的其他性质。
人程序性死亡-1蛋白(PD-1)的抗体是需要适当制剂的治疗相关大分子的一个实例。抗PD-1抗体在临床上可用于治疗癌症(例如，肺癌、黑素瘤和脑癌)和病毒感染和自身免疫性疾病。示例性抗PD-1抗体尤其描述于美国专利/公开号7101550、7595048、7488802、7563869、8008449、8168757、8216996、20110008369、20130017199、20130022595，以及WO2006121168、WO2009114335、WO2012145493、WO2013014668、WO2009101611、EP2262837和EP2504028中。US20140234296描述了抗PD-1抗体的冻干制剂。
尽管抗PD-1抗体是已知的，但本领域仍需要足够稳定且适于施用给患者的包含抗PD-1抗体的新型药物制剂。
本发明通过提供包含特异性结合人程序性死亡-1蛋白(PD-1)的人抗体的稳定药物制剂来满足上述需要。
在一个方面，提供了低粘度的稳定液体药物制剂，其包含：(i)特异性结合人程序性死亡蛋白(PD-1)的人抗体；(ii)缓冲剂；(iii)有机助溶剂；(iv)稳定剂；(v)粘度调节剂。
在各种实施方案中，抗体以约5±0.75mg/mL至约250±37.5mg/mL的浓度提供。在一个实施方案中，抗体以12.5mg/mL±1.85mg/mL、或约12.5mg/mL的浓度提供。在一个实施方案中，抗体以25mg/mL±3.75mg/mL、或约25mg/mL的浓度提供。在另一个实施方案中，抗体以50mg/mL±7.5mg/mL、或约50mg/mL的浓度提供。在另一个实施方案中，抗体以100mg/mL±15mg/mL、或约100mg/mL的浓度提供。在一个实施方案中，抗体以150mg/mL±22.5mg/mL、或约150mg/mL的浓度提供。在另一个实施方案中，抗体以175mg/mL±26.25mg/mL、或约175mg/mL的浓度提供。在另一个实施方案中，抗体以200mg/mL±30mg/mL、或约200mg/mL的浓度提供。
在某些实施方案中，所述制剂包含美国专利申请公开号：20150203579中公开的抗PD-1抗体中的任一种，该美国专利申请以其整体并入本文。在某些实施方案中，抗PD-1抗体包含(a)重链可变区(HCVR)，其包含重链互补决定区1、2和3(HCDR1-HCDR2-HCDR3)，每个重链互补决定区分别包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的序列；和(b)轻链可变区(LCVR)，其包含轻链互补决定区1、2和3(LCDR1-LCDR2-LCDR3)，每个轻链互补决定区分别包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列。在一个实施方案中，抗体包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述LCVR包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO：9和11的氨基酸序列；所述轻链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：1具有90％序列同一性的HCVR。在一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：2具有90％序列的LCVR。在一个实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO：1具有90％序列同一性的HCVR和与SEQ IDNO：2具有90％序列同一性的LCVR。
在一个实施方案中，液体制剂的pH为pH6.0±0.5、pH6.0±0.4、pH6.0±0.3、pH6.0±0.2、pH6.0±0.1、pH6.0±0.05、pH6.0±0.01、或pH 6.0。在一个实施方案中，液体制剂的pH为约pH 6.0±0.3。
在一个实施方案中，缓冲剂包含组氨酸。在某些实施方案中，组氨酸缓冲剂的浓度为5mM±1mM至50mM±10mM，优选5mM±1mM至25mM±5mM。在一个实施方案中，组氨酸缓冲剂的浓度为10mM±2mM或约10mM。在一个实施方案中，组氨酸缓冲剂的浓度为20mM±4mM或约20mM。在一个实施方案中，组氨酸缓冲剂的浓度为40nM±8mM或约40nM。在某些实施方案中，组氨酸缓冲剂包含L-组氨酸和L-组氨酸单盐酸盐一水合物。在一个实施方案中，L-组氨酸的浓度为2mM±0.4mM至25mM±5mM，优选4mM±0.8mM至20mM±4mM。在一个实施方案中，L-组氨酸单盐酸盐一水合物的浓度为2mM±0.4mM至25mM±5mM，优选4mM±0.8mM至20mM±4mM。在一个实施方案中，缓冲剂包含浓度为4.8mM±0.96mM的L-组氨酸和浓度为5.2mM±1.04mM的L-组氨酸单盐酸盐一水合物。在一个实施方案中，缓冲剂包含浓度为10mM±2mM的组氨酸，其中组氨酸包含浓度为4.8mM±0.96mM的L-组氨酸和浓度为5.2mM±1.04mM的L-组氨酸单盐酸盐一水合物。
在某些实施方案中，有机助溶剂是含有聚氧乙烯部分的非离子聚合物。在一个实施方案中，有机溶剂是表面活性剂。在一些实施方案中，有机助溶剂是聚山梨醇酯、泊洛沙姆188和聚乙二醇3350中的任何一种或多种。在一个实施方案中，有机助溶剂是聚山梨醇酯80。在一个实施方案中，有机助溶剂是聚山梨醇酯20。
在一个实施方案中，有机助溶剂的浓度为约0.01％±0.005％至约1％±0.5％“重量/体积”或“w/v”，其中，例如，0.1g/ml＝10％，0.01g/ml＝1％。在某些实施方案中，有机溶剂是浓度为0.05％±0.025％至0.5％±0.25％(w/v)的聚山梨醇酯。在一个实施方案中，有机助溶剂是聚山梨醇酯80，其浓度为0.2％±0.1％w/v、或约0.2％。在另一个实施方案中，有机助溶剂是聚山梨醇酯80，其浓度为0.1％±0.05％w/v、或约0.1％w/v。在一个实施方案中，有机助溶剂是聚山梨醇酯20，其浓度为0.2％±0.1％w/v、或约0.2％。在另一个实施方案中，有机助溶剂是聚山梨醇酯20，其浓度为0.1％±0.05％w/v、或约0.1％w/v。
在某些实施方案中，稳定剂是糖。在一个实施方案中，糖是蔗糖。在各种实施方案中，稳定剂的浓度为1％±0.2％w/v至20％±4％w/v、5％±1％w/v至15％±3％w/v、或1％±0.2％至10％±2％w/v。在一个实施方案中，稳定剂是浓度为5％±1％w/v或约5％w/v的蔗糖。在另一个实施方案中，稳定剂是浓度为9％±1.8％w/v或约9％w/v的蔗糖。在另一个实施方案中，稳定剂是浓度为10％±2％w/v或约10％w/v的蔗糖。
在一个实施方案中，粘度调节剂是氨基酸。在一个实施方案中，粘度调节剂是L-脯氨酸。在某些实施方案中，粘度调节剂的浓度为1％±0.2％至5％±1％w/v。在一个实施方案中，粘度调节剂是浓度为1.5％±0.3％或约1.5％的脯氨酸。在一个实施方案中，粘度调节剂是浓度为3％±0.6％、或约3％的脯氨酸。
在某些实施方案中，液体药物制剂在25℃下的粘度小于或等于约15cPoise±10％。在某些实施方案中，25℃下的粘度为1.0cPoise±10％至20cPoise±10％。在某些实施方案中，液体药物制剂的粘度≤15cPoise。在某些实施方案中，液体药物制剂的粘度≤20cPoise。在某些实施方案中，液体药物制剂的粘度≤10cPoise。在某些实施方案中，25℃下的粘度为5cPoise±10％、6.0cPoise±10％、7.0cPoise±10％、7.1cPoise±10％、7.2cPoise±10％、7.9cPoise±10％、8.3cPoise±10％、9.0cPoise±10％、9.6cPoise±10％、10.0cPoise±10％、10.6cPoise±10％、11.4cPoise±10％、11.6cPoise±10％、11.8cPoise±10％、12.0cPoise±10％、13.0cPoise±10％、14.0cPoise±10％、15.0cPoise±10％、或16cPoise±10％。
在一个方面，提供了低粘度的稳定液体药物制剂，其包含：(i)5±0.75mg/ml至250±37.5mg/ml特异性结合人PD-1的人抗体；(ii)0mM至40±8mM组氨酸缓冲剂；(iii)0％至0.5％±0.25％(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)0％至15％±3％(w/v)蔗糖；和(v)0至5％±1％脯氨酸，pH为约5.3至约6.7；其中抗PD-1抗体包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，使得HCVR/LCVR组合包含重链和轻链互补决定区(HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其分别包含SEQ ID NO：3-4-5/SEQ ID NO：6-7-8的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗PD-1抗体包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其分别包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗PD1抗体包含选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型的Fc区。在一个实施方案中，抗体包含人IgG4同种型。在一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO：9和11的氨基酸序列；所述轻链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链和含有SEQ IDNO：10的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQID NO：11的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗体具有143kDa±5kDa的分子量。
在某些实施方案中，提供稳定的低粘度液体药物制剂，其包含：(i)5±0.75mg/ml至250±37.5mg/ml特异性结合人PD-1的人抗体；(ii)0mM至40±8mM组氨酸缓冲剂；(iii)0％至0.5％±0.25％(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)0％至15％±3％(w/v)蔗糖；和(v)0至5％±1％脯氨酸，pH为约5.3至约6.7；其中抗PD-1抗体包含HCVR和LCVR，其中HCVR与SEQ ID NO：1具有90％的序列同一性和/或LCVR与SEQ ID NO：2具有90％的序列同一性。在一个实施方案中，抗PD-1抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HCVR和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LCVR。在一个实施方案中，抗PD-1抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO：9和11的氨基酸序列；所述轻链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
在某些实施方案中，提供稳定的低粘度液体药物制剂，其包含：(i)5±0.75mg/ml至250±37.5mg/ml特异性结合人PD-1的人抗体；(ii)0mM至40±8mM组氨酸缓冲剂；(iii)0％至0.5％±0.25％(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)0％至15％±3％(w/v)蔗糖；和(v)0至5％±1％脯氨酸，pH为约5.3至约6.7；其中抗PD-1抗体包含HCVR和LCVR，其中所述HCVR包含具有不超过5个氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且其中所述LCVR包含具有不超过两个氨基酸取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗PD-1抗体包含含有SEQID NO：1的氨基酸序列的HCVR和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LCVR。在一个实施方案中，抗PD-1抗体包含重链和轻链，所述重链包含选自SEQ ID NO：9和11的氨基酸序列；所述轻链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
在某些实施方案中，任何前述方面的制剂具有选自以下的属性：(i)如本文所述，制剂在25℃、5℃、-20℃、-30℃和-80℃下稳定地长期储存；(ii)如本文所述，制剂对搅拌应激是稳定的；(iii)制剂是低粘度的(粘度小于20cPoise，优选小于15cPoise)；(iii)如本文所述，即使制剂赋形剂浓度变化高达±50％，制剂也是稳定的；(iv)制剂是等渗于生理条件的；(v)制剂对静脉内递送装置和步骤是稳定的并且与之相容；和(vi)制剂在玻璃小瓶或预装注射器中稳定地长期储存。
在该方面的某些实施方案中，提供稳定的液体制剂，其包含：(i)5±0.75mg/ml至250±37.5mg/ml特异性结合人PD-1的人抗体；(ii)5mM±1mM至20±4mM组氨酸缓冲剂；(iii)0.05％±0.025％至0.3％±0.15％(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)1％±0.2％至10％±2％(w/v)蔗糖；和(v)1％±0.2％至5％±1％脯氨酸，pH约6.0，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对。在一个实施方案中，该方面的稳定液体制剂具有小于15cP的粘度。在一个实施方案中，≥90％的抗体具有143kDa±1kDa的分子量。在一个实施方案中，药物制剂具有小于20cP、小于15cP、或小于10cP的粘度。在一个实施方案中，超过96％的抗体在5℃下储存12个月后具有天然构象。在一个实施方案中，至少97％或更多的抗体在-80℃、-30℃和/或-20℃下储存6个月后具有天然构象。
在该方面的一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)25±3.75mg/mL抗PD-1抗体；(ii)10±2mM组氨酸缓冲剂；(iii)0.2％±0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸；和(v)5％±1％(w/v)蔗糖，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对。
在该方面的一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)25±3.75mg/mL抗PD-1抗体；(ii)4.8mM±0.96mM L-组氨酸；(iii)5.2mM±1.04mM L-组氨酸单盐酸盐一水合物；(iv)0.2％±0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；(v)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸；和(vi)5％±1％(w/v)蔗糖，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对。
在该方面的一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)50±7.5mg/mL抗PD-1抗体；(ii)10±2mM组氨酸缓冲剂；(iii)0.2％±0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸；和(v)5％±1％(w/v)蔗糖，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对。在该特定制剂的一个实施方案中，粘度小于10cPoise。
在该方面的一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)50±7.5mg/mL抗PD-1抗体；(ii)4.8mM±0.96mM L-组氨酸；(iii)5.2mM±1.04mM L-组氨酸单盐酸盐一水合物；(iv)0.2％±0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；(v)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸；和(vi)5％±1％(w/v)蔗糖，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对。
在一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)100±15mg/mL抗PD-1抗体；(ii)10±2mM组氨酸缓冲剂；(iii)0.2％±0.1％(w/v)(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸；和(v)5％±1％(w/v)蔗糖，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ IDNO：1/2的氨基酸序列对。在该特定制剂的一个实施方案中，粘度小于10cPoise。
在该方面的一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)100±15mg/mL抗PD-1抗体；(ii)4.8mM±0.96mM L-组氨酸；(iii)5.2mM±1.04mM L-组氨酸单盐酸盐一水合物；(iv)0.2％±0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；(v)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸；和(vi)5％±1％(w/v)蔗糖，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对。
在一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)150±22.5mg/mL抗PD-1抗体；(ii)10±2mM组氨酸缓冲剂；(iii)0.2％±0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)10％±2％(w/v)蔗糖；和(v)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ IDNO：1/2的氨基酸序列对。在该特定制剂的一个实施方案中，粘度小于20cPoise，优选小于15cPoise。
在该方面的一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)150±22.5mg/mL抗PD-1抗体；(ii)4.8mM±0.96mM L-组氨酸；(iii)5.2mM±1.04mM L-组氨酸单盐酸盐一水合物；(iv)0.2％±0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；(v)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸；和(vi)5％±1％(w/v)蔗糖，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对。
在该方面的一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)175±26.25mg/mL抗PD-1抗体；(ii)10±2mM组氨酸缓冲剂；(iii)0.2％±0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)5％±1％(w/v)蔗糖；和(v)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对。在该特定制剂的一个实施方案中，粘度小于20cPoise，优选小于15cPoise。
在该方面的一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)175±26.25mg/mL抗PD-1抗体；(ii)4.8mM±0.96mM L-组氨酸；(iii)5.2mM±1.04mM L-组氨酸单盐酸盐一水合物；(iv)0.2％±0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；(v)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸；和(vi)5％±1％(w/v)蔗糖，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对。
在该方面的一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)200±30.00mg/mL抗PD-1抗体；(ii)10±2mM组氨酸缓冲剂；(iii)0.2％±0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)5％±1％(w/v)蔗糖；和(v)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对。在该特定制剂的一个实施方案中，粘度小于20cPoise。
在该方面的一个实施方案中，稳定的液体制剂包含(i)200±30.00mg/mL抗PD-1抗体；(ii)4.8mM±0.96mM L-组氨酸；(iii)5.2mM±1.04mM L-组氨酸单盐酸盐一水合物；(iv)0.2％±0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；(v)1.5％±0.3％(w/v)脯氨酸；和(vi)5％±1％(w/v)蔗糖，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对。
在一个实施方案中，将制剂在45℃下储存28天后，≥90％的抗体是天然的，≥35％的抗体是主电荷(main charge)形式。在一个实施方案中，将制剂在25℃下储存三个月后，>94％的抗体是天然的，并且≥44％的抗体是主电荷形式。在一个实施方案中，将制剂以5℃下储存12个月后，>96％的抗体是天然的，并且>50％的抗体是主电荷形式。在一个实施方案中，将制剂在-20℃下储存12个月后，>96％的抗体是天然的，>40％的抗体是主电荷形式。在一个实施方案中，将制剂在-30℃下储存12个月后，>96％的抗体是天然的，>40％的抗体是主电荷形式。在一个实施方案中，将制剂在-80℃下储存12个月后，>96％的抗体是天然的，>40％的抗体是主电荷形式。在一个实施方案中，在5℃下储存12个月后，超过96％的抗体具有天然构象。在一个实施方案中，在-80℃、-30℃和/或-20℃下储存6个月后，至少97％或更多的抗体具有天然构象。
在一个方面，本发明提供稳定的液体制剂，其包含：(i)高达100mg/mL抗PD-1抗体；(ii)2mM±0.4mM至20mM±4mM组氨酸缓冲剂；(iii)高达20％±4％(w/v)蔗糖；和(iv)高达0.2％±0.1％w/v聚山梨醇酯，pH为6.0±0.3。在一个实施方案中，稳定的液体制剂包含25mg/mL抗PD-1抗体。在一个实施方案中，稳定的液体制剂包含50mg/mL抗PD-1抗体。在一个实施方案中，稳定的液体制剂包含75mg/mL抗PD-1抗体。在一个实施方案中，稳定的液体制剂包含10mM±2mM组氨酸缓冲剂。在一个实施方案中，稳定的液体制剂包含5％蔗糖。在一个实施方案中，稳定的液体制剂包含6％蔗糖。在一个实施方案中，稳定的液体制剂包含9％蔗糖。在一个实施方案中，稳定的液体制剂包含10％蔗糖。在一个实施方案中，稳定的液体制剂包含0.1％聚山梨醇酯。在一个实施方案中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。在一个实施方案中，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO：1/2的HCVR/LCVR。
在一个方面，在容器中提供任何前述方面的稳定的液体药物制剂。在一个实施方案中，容器是聚碳酸酯小瓶。在一个实施方案中，容器是玻璃小瓶。在一个实施方案中，玻璃小瓶是1型硼硅酸盐玻璃小瓶，其具有涂覆碳氟化合物的丁基橡胶塞。在一个实施方案中，容器是微量输液器。在一个实施方案中，容器是注射器。在一个实施方案中，容器是预装注射器。在一个实施方案中，注射器包含涂覆碳氟化合物的塞子。在某些实施方案中，注射器是1mL或2.25mL长玻璃注射器，其含有少于约十亿分之500(500ppb)的钨，配备有27-G的针、涂覆碳氟化合物的丁基橡胶塞和不含乳胶的非细胞毒性橡胶尖端帽。在一个实施方案中，注射器是1mL长的玻璃注射器，其配备27-G薄壁针、涂覆FLUROTEC的4023/50橡胶塞和FM 27橡胶尖端帽。在一个实施方案中，注射器是装有针的1mL、2mL、3mL、5mL或10mL塑料注射器。
在一个方面，提供了试剂盒，其包含前述方面中任一项的稳定的药物组合物、容器和说明书。在一个实施方案中，容器是玻璃小瓶。在一个实施方案中，容器是预装注射器。在一个实施方案中，注射器是1mL或2.25mL长的玻璃注射器，其配备27-G薄壁针、涂覆FLUROTEC的4023/50橡胶塞和FM27橡胶尖端帽。在一个实施方案中，注射器是装有针的1mL、2mL、3mL、5mL或10mL塑料注射器。
在某些实施方案中，本发明提供了包含稳定液体药物制剂的预装注射器，所述稳定液体药物制剂包含：(i)5±0.75mg/ml至250±37.5mg/ml特异性结合人PD-1的人抗体；(ii)5mM±1mM至20±4mM组氨酸缓冲剂；(iii)0.05％±0.025％至0.3％±0.15％(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)1％±0.2％至10％±2％(w/v)蔗糖；和(v)1％±0.2％至5％±1％脯氨酸，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对；其中所述制剂具有选自以下的属性：(i)在5℃下储存12个月后，≥98％的抗体是天然形式的；(ii)在5℃下储存12个月后，≥53％的抗体是主电荷变体；(iii)在25℃下储存6个月后，≥97％的抗体是天然形式的；(iv)制剂对搅拌应激是稳定的，其中在预装注射器中120分钟的搅拌应激后，≥98％的抗体是天然形式的；(v)超过90％的抗体具有143kDa±1kDa的分子量；(vi)药物制剂具有小于20cP、小于15cP、或小于10cP的粘度；(vii)在5℃下储存12个月后，超过96％的抗体具有天然构象；和(viii)在-80℃、-30℃和/或-20℃下储存6个月后，至少97％或更多的抗体具有天然构象。
在某些实施方案中，本发明提供了一种玻璃小瓶，其包含稳定的液体药物制剂，所述稳定的液体药物制剂包含：(i)5±0.75mg/ml至250±37.5mg/ml特异性结合人PD-1的人抗体；(ii)5mM±1mM至20±4mM组氨酸缓冲剂；(iii)0.05％±0.025％至0.3％±0.15％(w/v)聚山梨醇酯80；(iv)1％±0.2％至10％±2％(w/v)蔗糖；和(v)1％±0.2％至5％±1％脯氨酸，pH为6.0±0.3，其中抗体包含HCVR/LCVR，其包含SEQ ID NO：1/2的氨基酸序列对；其中所述制剂具有选自以下的属性：(i)制剂对于储存和玻璃小瓶中的应激是稳定的；(ii)制剂对于IV递送装置是稳定的并且兼容；(iii)对于用本领域已知的标准稀释剂稀释(例如，0.9％氯化钠或5％右旋糖)，制剂在化学和物理上是稳定的；(iv)制剂对于由玻璃或聚合物塑料(例如聚氯乙烯、邻苯二甲酸酯、聚烯烃或聚丙烯)制成的IV袋是稳定的；(v)制剂与标准输液泵(例如蠕动泵、流体驱替泵)兼容；(vi)≥90％的抗体具有143kDa±1kDa的分子量；(vii)药物制剂具有小于20cP、小于15cP、或小于10cP的粘度；(viii)在5℃下储存12个月后，超过96％的抗体具有天然构象；和(ix)在-80℃、-30℃和/或-20℃下储存6个月后，至少97％或更多的抗体具有天然构象。
通过阅读随后的详细描述，其他实施方案将变得显而易见。
附图说明
图1是显示pH对150mg/mL mAb1在45℃下孵育28天的稳定性的影响的表。aSE-UPLC和CEX-UPLC“起始材料”结果是所有制剂起始材料的平均值。
图2显示了三种制剂F1、F2和F3的储存稳定性，其中F1包含210mg/mL mAb1、10mM组氨酸和3％脯氨酸，pH 6.0；F2包含210mg/mL mAb1、10mM组氨酸和3％蔗糖，pH 6.0；F3包含210mg/mL mAb1、10mM组氨酸和5％蔗糖，pH6.0。通过在-80℃(A)、-30℃(B)和-20℃(C)下储存至多9个月后产生的％高分子量物质(HMW)来测量储存稳定性，并通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行分析。
图3显示了三种制剂F1、F2和F3的储存稳定性，其中F1包含150mg/mL mAb1、10mM组氨酸、9％蔗糖和0.2％聚山梨醇酯80(PS80)，pH6.0；F2包含175mg/mL mAb1、10mM组氨酸、3％脯氨酸和0.2％PS80，pH6.0；F3包含175mg/mL mAb1、10mM组氨酸、5％蔗糖、1.5％脯氨酸和0.2％PS80，pH6.0。通过在-80℃(A)、-30℃(B)和-20℃(C)下储存至多6个月后产生的％高分子量物质(HMW)来测量储存稳定性，并通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行分析。
图4是显示添加赋形剂和粘度调节剂的150mg/mL mAb1的粘度的表。
图5是显示粘度调节剂对175mg/mL mAb1在45℃下孵育14天的稳定性的影响的表。apH，SE-UPLC和CEX-UPLC“起始材料”结果是所有制剂的起始材料的平均值。
详细说明
在描述本发明方法之前，应理解本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如本文所用，当用于提及具体列举的数值或数值范围时，术语“约”意指该值可以与所列举的值相差不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101以及它们之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。尽管在实践或测试本发明时可以使用与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料，现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用整体并入本文。
如本文所用，表述“药物制剂”是指至少一种活性成分(例如，小分子、大分子、化合物等，其能够在人或非人动物中发挥生物学作用)和至少一种非活性成分的组合，当所述至少一种非活性成分与活性成分或一种或多种另外的非活性成分组合时，其适合于对人或非人动物的治疗性施用。除非另外特别说明，否则本文所用的术语“制剂”是指“药物制剂”。本发明提供了包含至少一种治疗性多肽的药物制剂。根据本发明的某些实施方案，治疗性多肽是抗体、或其抗原结合片段，其特异性结合人程序性死亡-1(PD-1)蛋白质。更具体地，本发明包括药物制剂，其包含：(i)特异性结合人PD-1的人抗体；(ii)组氨酸缓冲剂；(iii)作为非离子表面活性剂的有机助溶剂；(iv)碳水化合物的稳定剂；和任选地，(v)为氨基酸的粘度调节剂。本发明包括的具体示例性成分和制剂在以下详细描述。
特异性结合PD-1的抗体
本发明的药物制剂可包含人抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人PD-1。如本文所用，术语“PD-1”意指人程序性死亡-1蛋白。人PD-1的抗体描述于例如美国专利/公开号8008449、8168757、20110008369、20130017199、20130022595、20150203579，以及WO2006121168、WO2009114335、WO2012145493、WO2013014668、WO2009101611、WO2015112800、EP2262837和EP2504028中。
如本文所用，术语“抗体”通常意指包含四条多肽链的免疫球蛋白分子(其中两条重(H)链和两条轻(L)链通过二硫键相互连接)以及其多聚体(例如，IgM)；然而，仅由重链组成的免疫球蛋白分子(即，缺少轻链)也包括在术语“抗体”的定义内。每条重链包含重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒链区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布在称为框架区(FR)的较保守的区域间。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
除非另外特别说明，否则本文所用的术语“抗体”应理解为包括完整的抗体分子及其抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称“抗体部分”或“抗体片段”)是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合人PD-1或其表位的能力。
如本文所用，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合人PD-1的分离的抗体基本上不含特异性结合人PD-1以外的抗原的抗体)。
术语“特异性结合”等是指抗体或其抗原结合片段在生理条件下与抗原形成相对稳定的复合物。特异性结合可以通过至少约1×10-8M或更大的解离常数来表征。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域公知的，包括例如平衡透析、表面等离子共振等。然而，特异性结合人PD-1的分离的抗体可以与其他抗原(如来自其他物种的PD-1分子)(直向同源物)具有交叉反应性。在本发明的上下文中，结合人PD-1以及一种或多种其他抗原的多特异性(例如，双特异性)抗体被认为“特异性结合”人PD-1。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质或化学物质。
可以包括在本发明的药物制剂中的示例性抗人PD-1抗体在专利申请公开US20150203579和WO2015112800中提出，其公开内容通过引用整体并入。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：3的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：4的HCDR2和SEQ ID NO：5的HCDR3。在某些实施方案中，抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1的HCVR。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：6的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ IDNO：8的LCDR3。在某些实施方案中，抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：2的LCVR。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％、98％或99％序列同一性的HCVR。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：2具有90％、95％、98％或99％序列同一性的LCVR。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含HCVR，其包含具有不超过5个氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含LCVR，其包含具有不超过2个氨基酸取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
可以通过本领域已知的任何方法(例如，GAP、BESTFIT和BLAST)测量序列同一性。
本发明还包括含有抗PD-1抗体的制剂，其中抗PD-1抗体包含本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体，具有一个或多个保守氨基酸取代。例如，本发明包括含有抗PD-1抗体的制剂，所述抗PD-1抗体具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗PD1抗体包含选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型的Fc区。
本文实施例中使用的非限制性示例性抗体称为“mAb1”。该抗体在US 20150203579中也称为H2M7798N或H4H7798N，并且也称为“REGN2810”或“cemiplimab”。mAb1(H4H7798N)包含具有SEQ ID NO：1/2的HCVR/LCVR氨基酸序列对，以及由SEQ ID NO：3-4-5/SEQ ID NO：6-7-8表示的HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：9的重链和SEQ ID NO：10的轻链。
本领域众所周知，氨基酸的末端切割可发生在抗体的产生过程中(参见，例如，Wang等人2007,J.Pharma.Sci.96:1-26)。因此，在某些实施方案中，抗PD-1抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。SEQ ID NO：11包含重链氨基酸序列，其中C末端赖氨酸相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列缺失。在某些实施方案中，本发明的制剂含有约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或更多的抗PD-1抗体，其中不存在C-末端赖氨酸。
本发明的药物制剂中包含的抗体或其抗原结合片段的量可以根据所需的制剂特定性质以及预期使用制剂的具体情况和目的而变化。在某些实施方案中，药物制剂是液体制剂，其可含有5±0.75mg/mL至250±37.5mg/mL抗体；10±1.5mg/mL至240±36mg/mL抗体；20±3.0mg/mL至230±34.5mg/mL抗体；25±3.75mg/mL至240±36mg/mL抗体；50±7.5mg/mL至230±34.5mg/mL抗体；60±9mg/mL至240±36mg/mL抗体；70±10.5mg/mL至230±34.5mg/mL抗体；80±12mg/mL至220±33mg/mL抗体；90±13.5mg/mL至210±31.5mg/mL抗体；100±15mg/mL至200±30mg/mL抗体；110±16.5mg/mL至190±28.5mg/mL抗体；120±18mg/mL至180±27mg/mL抗体；130±19.5mg/mL至170±25.5mg/mL抗体；140±21mg/mL至160±24mg/mL抗体；150±22.5mg/mL抗体；或175±26.25mg/mL。例如，本发明的制剂可包含约5mg/mL；约10mg/mL；约15mg/mL；约20mg/mL；约25mg/mL；约30mg/mL；约35mg/mL；约40mg/mL；约45mg/mL；约50mg/mL；约55mg/mL；约60mg/mL；约65mg/mL；约70mg/mL；约75mg/mL；约80mg/mL；约85mg/mL；约90mg/mL；约95mg/mL；约100mg/mL；约105mg/mL；约110mg/mL；约115mg/mL；约120mg/mL；约125mg/mL；约130mg/mL；约135mg/mL；约140mg/mL；约145mg/mL；约150mg/mL；约155mg/mL；约160mg/mL；约165mg/mL；约170mg/mL；约175mg/mL；约180mg/mL；约185mg/mL；约190mg/mL；约195mg/mL；约200mg/mL；约205mg/mL；约210mg/mL；约215mg/mL；约220mg/mL；约225mg/mL；约230mg/mL；约235mg/mL；约240mg/mL；约245mg/mL；或约250mg/mL特异性结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段。
赋形剂和pH值
本发明的药物制剂包含一种或多种赋形剂。如本文所用，术语“赋形剂”是指添加到制剂中以提供所需稠度、粘度或稳定效果的任何非治疗剂。
在某些实施方案中，本发明的药物制剂包含至少一种有机助溶剂，其类型和量能在粗率处理或搅拌条件下(例如涡旋)稳定人PD-1抗体。在一些实施方案中，“稳定”是指防止在粗率处理过程中形成超过抗体总量的3％的聚集抗体(以摩尔计)。在一些实施方案中，粗率处理是涡旋含有抗体和有机助溶剂的溶液约60分钟或约120分钟。
在某些实施方案中，有机助溶剂是非离子表面活性剂，如烷基聚(环氧乙烷)。可包括在本发明制剂中的特定非离子表面活性剂包括，例如，聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81和聚山梨醇酯85；泊洛沙姆如泊洛沙姆181、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407；或聚乙二醇(PEG)。聚山梨醇酯20也称为TWEEN 20，脱水山梨糖醇单月桂酸酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯。泊洛沙姆188也称为PLURONIC F68。
本发明的药物制剂中包含的非离子表面活性剂的量可以根据制剂所需的特定性质以及意图使用制剂的具体情况和目的而变化。在某些实施方案中，制剂可含有0.01％±0.005％至0.5％±0.25％表面活性剂。例如，本发明的制剂可含有约0.005％；约0.01％；约0.02％；约0.03％；约0.04％；约0.05％；约0.06％；约0.07％；约0.08％；约0.09％；约0.1％；约0.11％；约0.12％；约0.13％；约0.14％；约0.15％；约0.16％；约0.17％；约0.18％；约0.19％；约0.20％；约0.21％；约0.22％；约0.23％；约0.24％；约0.25％；约0.26％；约0.27％；约0.28％；约0.29％；约0.30％；约0.35％；约0.40％；约0.45％；约0.46％；约0.47％；约0.48％；约0.49％；约0.50％；约0.55％；或约0.575％聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
本发明的药物制剂还可以包含一种或多种稳定剂，其类型和量在热应激条件下稳定人PD-1抗体。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和热稳定剂的溶液在约45℃保持长达约28天时，大于约91％的抗体维持天然构象。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和热稳定剂的溶液在约45℃保持长达约28天时，其中少于约6％的抗体聚集。如本文所用，“天然”是指通过尺寸排阻的抗体的主要形式，其通常是抗体的完整单体。术语“天然”还指抗体的非聚集和非降解形式。
在某些实施方案中，热稳定剂是糖，如蔗糖，制剂中包含的糖的量可以根据使用制剂的具体情况和预期目的而变化。在某些实施方案中，制剂可含有约1％至约15％的糖；约2％至约14％的糖；约3％至约13％的糖；约4％至约12％的糖；约5％至约12％的糖；约6％至约11％的糖；约7％至约10％的糖；约8％至约11％的糖；或约9％至约11％的糖。例如，本发明的药物制剂可包含4％±0.8％；5％±1％；6％±1.2％；7％±1.4％；8％±1.6％；9％±1.8％；10％±2％；11％±2.2％；12％±2.4％；13％±2.6％；或约14％±2.8％的糖(例如蔗糖)。
本发明的药物制剂还可包含缓冲剂或缓冲剂系统，其用于维持稳定的pH并有助于稳定人PD-1抗体。如本文所用的术语“缓冲剂”表示药学上可接受的缓冲剂，其维持溶液稳定的pH或抵抗溶液pH的变化。在优选的实施方案中，缓冲剂包含组氨酸。在本公开的上下文中，“组氨酸缓冲剂”或“包含组氨酸的缓冲液”是包含氨基酸组氨酸的缓冲剂。组氨酸缓冲剂的实例包括组氨酸氯化物、组氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐和组氨酸硫酸盐。在一个优选的实施方案中，通过以限定的量和比例溶解L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐(例如作为一水合物)来制备组氨酸缓冲液。在一个实施方案中，通过用稀盐酸滴定L-组氨酸(游离碱，固体)来制备组氨酸缓冲液。在整个本公开中，术语“组氨酸”可与“组氨酸缓冲剂”互换使用。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约45℃保持长达约28天时，小于4.5％±0.5％的抗体聚集。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约37℃保持长达约28天时，小于3％±0.5％或小于2.5％±0.5％的抗体聚集。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约45℃保持长达约28天时，其中至少93％±0.5％或至少94％±0.5％的抗体处于其天然构象，如通过尺寸排阻色谱法测定的。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约37℃保持长达约28天时，其中至少94％±0.5％或至少95％±0.5％的抗体处于其天然构象，如通过尺寸排阻色谱法测定的。“天然”或“天然构象”是指未聚集或降解的抗体级分。这通常通过测量抗体实体的相对大小的测定法来确定，如尺寸排阻色谱测定法。非聚集和非降解的抗体以等同于天然抗体的级分洗脱，并且通常是主要的洗脱级分。聚集的抗体以比天然抗体更大的尺寸的级分洗脱。降解的抗体以比天然抗体小的尺寸的级分洗脱。
在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约45℃保持长达约28天时，其中至少35％±0.5％的抗体处于其主电荷形式，如通过阳离子交换色谱法所测定的。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约37℃保持长达约28天时，其中至少46％±0.5％或至少39％±0.5％的抗体处于其主电荷形式，如通过阳离子交换色谱法所测定的。“主电荷”或“主电荷形式”是指从离子交换树脂洗脱在主峰中的抗体级分，通常主峰一侧为更“碱性”的峰，其另一侧为更“酸性”的峰。
本发明的药物制剂可具有约5.2至约6.4的pH。例如，本发明的制剂可具有约5.5；约5.6；约5.7；约5.8；约5.9；约6.0；约6.1；约6.2；约6.3；约6.4；或约6.5的pH。在一些实施方案中，pH为6.0±0.4；6.0±0.3；6.0±0.2；6.0±0.1；约6.0；或6.0。
在一些实施方案中，缓冲剂或缓冲剂系统包含至少一种缓冲剂，其具有的缓冲范围完全或部分地与pH5.5-7.4的范围重叠。在某些实施方案中，缓冲剂包含组氨酸缓冲剂。在某些实施方案中，组氨酸缓冲剂存在的浓度为5mM±1mM至15mM±3mM；6mM±1.2mM至14mM±2.8mM；7mM±1.4mM至13mM±2.6mM；8mM±1.6mM至12mM±2.4mM；9mΜ±1.8mM至11mM±2.2mM；10mM±2mM；或约10mM。在某些实施方案中，缓冲系统包含10m±2mM的组氨酸，pH6.0±0.3。在优选的实施方案中，组氨酸缓冲剂包含L-组氨酸和L-组氨酸单盐酸盐一水合物。在一个实施方案中，组氨酸缓冲剂包含浓度为4.8mM±0.96mM的L-组氨酸。在一个实施方案中，组氨酸缓冲剂包含浓度为5.2mM±1.04mM的L-组氨酸单盐酸盐一水合物。在一个实施方案中，组氨酸缓冲剂包含浓度为4.8mM±0.96mM的L-组氨酸和浓度为5.2mM±1.04mM的L-组氨酸单盐酸盐一水合物。
本发明的药物制剂还可包含一种或多种赋形剂，其用于维持降低的粘度或降低含有高浓度抗PD-1抗体药物物质(例如，通常≥150mg/ml抗体)的制剂的粘度。在某些实施方案中，粘度调节剂是氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸是脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的药物制剂含有脯氨酸，优选L-脯氨酸，浓度为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。在整个本公开中，术语“脯氨酸”与“L-脯氨酸”可互换使用。在一些实施方案中，制剂包含脯氨酸的量足以使液体制剂的粘度维持在小于20±3cPoise、小于15±2.25cPoise或小于11±1.65cPoise。在一些实施方案中，制剂包含脯氨酸的量足以使粘度维持在等于或低于15±2.25cPoise。在某些实施方案中，制剂可含有约1％至约5％的脯氨酸；约2％至约4％的脯氨酸；或约3％的脯氨酸。例如，本发明的药物制剂可包含1％±0.2％；1.5％±0.3％；2％±0.4％；2.5％±0.5％；3％±0.6％；3.5％±0.7％；4％±0.8％；4.5％±0.9％；或约5％±1％的脯氨酸。
在抗体纯化过程中，可能需要或必须将一种缓冲剂交换成另一种缓冲剂以获得合适的赋形剂浓度、抗体浓度、pH等。缓冲剂交换可以通过例如超滤/渗滤(UF/DF)完成，例如使用半渗透切向流过滤膜。然而，使用这些技术有可能引起Gibbs-Donnan效应[Bolton等人,2011,Biotechnol.Prog.27(1):140-152]。在蛋白质浓缩期间膜的产物侧上正电荷的增强通过阳离子优先移动到膜的相对侧而在电学上抵消。这种现象的潜在后果是某些成分(例如，组氨酸、L-脯氨酸等)的最终浓度可能低于这些成分的预期目标浓度，这是由于在UF/DF步骤中带正电荷的渗滤缓冲剂赋形剂对带正电的抗体蛋白的静电排斥。因此，本发明包括这样的制剂，其中例如组氨酸和/或L-脯氨酸的浓度由于Gibbs-Donnan效应而不同于本文所述的量或范围。
体积排除描述了高浓度样品的行为，其中溶液总体积的很大一部分被溶质占据，尤其是大分子如蛋白质，从该空间除去溶剂。然后，这减少了其他溶质待溶于其中的可用溶剂的总体积，这可能导致跨超滤膜的不等同分配。因此，本发明包括这样的制剂，其中例如组氨酸和/或L-脯氨酸的浓度可以由于体积排除效应而不同于本文所述的量或范围。
在制备本发明制剂的过程中，可能发生制剂组成的变化。这些变化可包括活性成分的浓度、赋形剂的浓度和/或制剂的pH。由于这些参数的任何变化都可能潜在地影响药物产品的稳定性或效力，因此进行了验证的可接受范围(PAR)的研究，以评估组合物在限定范围内的变化是否会影响抗体的稳定性或效力。因此，本发明包括含有抗PD-1抗体的制剂，其在高达50％的赋形剂浓度变化中是稳定的并且保持效力。例如，本文包括抗PD-1抗体制剂，其中所述制剂的稳定性和效力不受抗体、蔗糖、组氨酸缓冲剂和/或聚山梨醇酯浓度中±10％、±20％、±30％、±40％或±50％变化的影响。
药物制剂的稳定性和粘度
本发明的药物制剂通常表现出高水平的稳定性。如本文所用，关于药物制剂的术语“稳定”是指药物制剂中的抗体在限定条件下储存后保持可接受程度的化学结构或生物学功能。即使制剂中包含的抗体在限定时间内储存后，不能维持其100％的化学结构或生物学功能，该制剂也可以是稳定的。在某些情况下，在限定时间内储存后维持约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的抗体结构或功能，可视为“稳定”。
尤其可以通过测定在限定温度下储存限定时间后制剂中保留的天然抗体的百分比来测量稳定性。天然抗体的百分比尤其可以通过尺寸排阻色谱法(例如，尺寸排阻超高效液相色谱法[SE-UPLC])测定，其中天然意指非聚集和非降解的。如本文所用的短语“可接受的稳定性”是指在给定温度下储存限定时间后，可以在制剂中检测到至少90％天然形式的抗体。在某些实施方案中，在限定温度下储存限定时间后，可以在制剂中检测到至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％天然形式的抗体。在其后测量稳定性的限定时间可以是在至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更长时间。在评估稳定性时药物制剂可以在限定温度下储存，所述限定温度可以是约-80℃至约45℃的任何温度，例如，储存在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃或约45℃。例如，如果在5℃下储存6个月后，SE-UPLC检测到大于约95％、96％、97％或98％的天然抗体，则可以认为药物制剂是稳定的。如果在25℃下储存6个月后，通过SE-UPLC检测到大于约95％、96％、97％或98％的天然抗体，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在45℃下储存28天后，通过SE-UPLC检测到大于约89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％的天然抗体，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在-20℃下储存12个月后，通过SE-UPLC检测到大于约96％、97％或98％的天然抗体，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在-30℃下储存12个月后，通过SE-UPLC检测到大于约96％、97％或98％的天然抗体，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在-80℃下储存12个月后，通过SE-UPLC检测到大于约96％、97％或98％的天然抗体，则也可以认为药物制剂是稳定的。
尤其可以通过在限定温度下储存限定时间后，测定在制剂中形成聚集体的抗体的百分比来测量稳定性，其中稳定性与形成聚集体的百分比成反比。尤其可以通过尺寸排阻色谱法(例如，尺寸排阻超高效液相色谱法[SE-UPLC])来测定聚集抗体的百分比。如本文所用的短语“可接受的稳定程度”是指在给定的温度下储存限定的时间后，在制剂中检测到至多5％的抗体呈聚集形式(也称为高分子量-HMW-形式)。在某些实施方案中，可接受的稳定程度是指在给定的温度下储存限定的时间后，在制剂中检测到至多约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体呈聚集形式。在限定时间后测量稳定性，其可以是在至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更长时间后测量。在评估稳定性时药物制剂可以储存在约-80℃至约45℃的任何温度下，例如，储存在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃或约45℃下。例如，如果在5℃下储存12个月后，检测到少于约2％、1％、0.5％或0.1％的抗体为聚集形式，则可以认为药物制剂是稳定的。如果在25℃下储存三个月后，检测到少于约4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体为聚集形式，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在45℃下储存28天后，检测到小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的抗体为聚集形式，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在-20℃、-30℃或-80℃下储存三个月后，检测到小于约3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体为聚集形式，则也可以认为药物制剂是稳定的。
尤其可以通过测定在离子交换期间迁移在比抗体的主要级分(“主电荷形式”)更酸性的级分(“酸性形式”)中的抗体的百分比来测量稳定性，其中稳定性与酸性形式的抗体级分成反比。虽然不希望受理论束缚，但抗体的脱酰胺作用可能导致抗体变得更加带负电荷，因此相对于非脱酰胺的抗体更具酸性(参见例如，Robinson,N.,Protein Deamidation,PNAS,2002年4月16日,99(8):5283-5288)。“酸化”抗体的百分比尤其可以通过离子交换色谱法(例如，阳离子交换超高效液相色谱法[CEX-UPLC])测定。如本文所用的短语“可接受的稳定程度”是指在限定的温度下储存限定的时间后，在制剂中检测到至多45％的抗体为更酸性形式。在某些实施方案中，可接受的稳定程度是指在给定的温度下储存限定的时间后，在制剂中检测到至多约40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体为酸性形式。在一个实施方案中，可接受的稳定程度是指在给定的温度下储存限定的时间后，在制剂中检测到少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体为酸性形式。在限定的时间后测量稳定性，其可以是在至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更长时间后测量。在评估稳定性时可以在约-80℃至约45℃的任何温度下储存药物制剂，例如，在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃或约45℃下储存。例如，如果在-80℃、-30℃或-20℃下储存三个月后，少于约30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体是更酸性的形式，则可认为药物制剂是稳定的。如果在5℃下储存六个月后，少于约32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体是更酸性的形式，则也可认为药物制剂是稳定的。如果在25℃下储存六个月后，少于约43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体是更酸性的形式，则也可认为药物制剂是稳定的。如果在45℃下储存28天后，检测到少于约49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体是更酸性的形式，则也可认为药物制剂是稳定的。
可以使用其他方法来评估本发明制剂的稳定性，例如使用差示扫描量热法(DSC)以确定热稳定性，使用受控的搅拌以确定机械稳定性，以及使用在约350nm或约405nm处的吸光度以确定溶液浊度。例如，如果在约5℃至约25℃下储存6个月或更长时间后，与时间为0时的制剂OD405相比，制剂的OD405变化小于约0.05(例如，0.04、0.03、0.02、0.01或更小)，则可以认为本发明的制剂是稳定的。
也可以使用测量抗体对其靶标的生物活性或结合亲和力来评估稳定性。例如，如果在例如5℃、25℃、45℃等下储存限定的时间(例如，1至12个月)后，制剂中包含的抗PD-1抗体与PD-1结合的亲和力为所述储存前抗体结合亲和力的至少90％、95％或更高，则可认为本发明的制剂是稳定的。结合亲和力可以通过例如ELISA或表面等离子体共振来测定。生物活性可以通过PD-1活性测定法来测定，例如使表达PD-1的细胞与包含抗PD-1抗体的制剂接触。例如可以通过FACS分析直接测量抗体与这种细胞的结合。或者，可以在抗体存在下测量PD-1系统的下游活性，并与不存在抗体时PD-1系统的活性进行比较。在一些实施方案中，PD-1对于细胞可以是内源的。在其他实施方案中，PD-1可以在细胞中异位表达。
在下面列出的实施例中证明了用于评估制剂中抗体稳定性的其他方法。
在某些实施方案中，本发明的液体药物制剂可显示低至中等水平的粘度。本文所用的“粘度”可以是“运动学上的粘度”或“绝对粘度”。“运动学上的粘度”是在重力影响下流体流动阻力的量度。当相同体积的两种流体置于相同的毛细管粘度计中并允许通过重力流动时，粘性流体比粘性较低流体需要更长的时间流过毛细管。例如，如果一种流体需要200秒完成其流动而另一种流体需要400秒，则第二种流体的粘度在运动学上的粘度标度上是第一种的两倍。“绝对粘度”有时称为动态粘度或简单粘度，其是运动学上的粘度和流体密度的乘积(绝对粘度＝运动学上的粘度×密度)。运动学上的粘度的维度为L2/T，其中L是长度，T是时间。通常，运动学上的粘度用厘沲(cSt)表示。运动学上的粘度的SI单位是mm2/s，即1cSt。绝对粘度用单位厘泊(cP)表示。绝对粘度的SI单位是milliPascal-秒(mPa-s)，其中1cP＝1mPa-s。
如本文所用，关于本发明的流体制剂，低水平粘度将表现出小于约20cPoise(cP)的绝对粘度。例如，如果使用标准粘度测量技术测量时，制剂表现出约20cP、约19cP、约18cP、约15cP、约12cP、约10cP、约9cP、约8cP或更低的绝对粘度，则认为本发明的流体制剂具有“低粘度”。如本文所用，关于本发明的流体制剂，中等水平的粘度将表现出约35cP至约20cP之间的绝对粘度。例如，如果使用标准粘度测量技术测量时，制剂表现出约34cP、约33cP、约32cP、约31cP、约30cP、约29cP、约28cP、约27cP、约26cP、约25cP、约24cP、约23cP、约22cP、约21cP、约20cP、约19cP、18cP、约17cP、约16cP、或约15.1cP的绝对粘度，则认为本发明的流体制剂具有“中等粘度”。
如以下实施例中所示，本发明人令人惊讶地发现通过将抗体与约1％至约5％的脯氨酸和约5％的蔗糖配制，可以获得包含高浓度抗人PD-1抗体(例如，从约50mg/ml高至250mg/mL)的低粘度液体制剂。这些制剂在处理过程中对应激是稳定的，并且在45℃至-80℃(本文所示)的温度下储存是稳定的，并具有低粘度(粘度范围为7至15cP)。
示例性制剂
根据本发明的一个方面，药物制剂是稳定的、低粘度的、通常是生理学上等渗的液体制剂，其包含：(i)浓度高达250mg/mL±45mg/mL的特异性结合人PD-1的人抗体(例如，H4H7798N)；(ii)组氨酸缓冲系统，其在约pH6.0±0.3时提供足够的缓冲；(iii)有机助溶剂，其保护抗体的结构完整性；(iv)作为糖的热稳定剂；(iv)作为氨基酸的粘度调节剂，其用于在方便皮下施用的体积中维持易于注射的粘度。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度高达200mg/ml±30mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)0.2％w/v±0.1％w/v的聚山梨醇酯80；(iv)5％±1％w/v的蔗糖；和(v)1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度为175mg/ml±26.25mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)0.2％w/v±0.1％w/v的聚山梨醇酯80；(iv)5％±1％w/v的蔗糖；和(v)1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度为150mg/ml±22.5mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)0.2％w/v±0.1％w/v的聚山梨醇酯80；(iv)5％±1％w/v的蔗糖；和(v)1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度为100mg/ml±15mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)5％w/v±1％w/v的蔗糖；(iv)0.2％w/v±0.1％w/v的聚山梨醇酯80；和(v)1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度为50mg/ml±7.5mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)5％w/v±1％w/v的蔗糖；(iv)0.2％w/v±0.1％的聚山梨醇酯80；和1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度为25mg/ml±3.75mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)5％w/v±1％w/v的蔗糖；(iv)0.2％w/v±0.1％的聚山梨醇酯80；和1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
本发明包括的药物制剂的其他非限制性实例在本文其他地方列出，包括下面给出的工作实施例。
容器和施用方法
本发明的药物制剂可以包含在适于储存药物和其他治疗组合物的任何容器中。例如，药物制剂可以包含在具有限定体积的密封和灭菌的塑料或玻璃容器中，如小瓶、安瓿、注射器、药筒或瓶子。不同类型的小瓶可用于包含本发明的制剂，包括例如透明和不透明(例如琥珀色)玻璃或塑料小瓶。同样，任何类型的注射器都可用于包含或施用本发明的药物制剂。
本发明的药物制剂可以包含在“常规钨”注射器或“低钨”注射器中。如本领域普通技术人员所理解的，制造玻璃注射器的过程通常包括使用热钨棒，其用于刺穿玻璃，从而形成孔，液体可从该孔中抽出并从注射器中排出。该过程导致在注射器的内表面上沉积痕量的钨。随后的洗涤和其他处理步骤可用于减少注射器中钨的量。如本文所用，术语“常规钨”是指注射器含有大于或等于十亿分之500(500ppb)的钨。术语“低钨”是指注射器含有少于500ppb的钨。例如，根据本发明的低钨注射器可包含少于约490、480、470、460、450、440、430、420、410、390、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或更少ppb的钨。
可以涂覆注射器中使用的橡胶塞和用于封闭小瓶开口的橡胶塞，以防止注射器或小瓶的药物内容物被污染，或者保持其稳定性。因此，根据某些实施方案，本发明的药物制剂可以包含在包含涂覆塞子的注射器内，或者包含在用涂覆的橡胶塞密封的小瓶内。例如，塞子或塞可涂覆有碳氟化合物膜。适用于含有本发明药物制剂的小瓶和注射器的涂覆塞子或塞的实例在例如，美国专利号4,997,423；5,908,686；6,286,699；6,645,635；和7,226,554中提及了，其内容通过引用整体并入本文。可用于本发明上下文的特定示例性涂覆的橡胶塞和塞子可以从West Pharmaceutical Services,Inc.(Lionville,PA)商购获得，商品名为
根据本发明的某些实施方案，药物制剂可以包含在低钨注射器中，所述低钨注射器包括涂覆碳氟化合物的塞子。
药物制剂可以通过肠胃外途径施用于患者，如注射(例如，皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内等)或经皮、粘膜、鼻、肺或口服施用。许多可重复使用的笔或自动注射器递送装置可用于皮下递送本发明的药物制剂。实例包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI,II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPENJUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,FranklinLakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)。应用于皮下递送本发明药物组合物的一次性笔或自动注射器递送装置的实例包括但不限于SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)、和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs,AbbottPark,IL)。
本文还考虑了使用微量输注器来递送本发明的药物制剂。如本文所用，术语“微量输注器”是指设计用于在延长的时间期间(例如，约10、15、20、25、30分钟或更长时间)内缓慢施用大体积(例如，多达约2.5mL或更多)治疗制剂的皮下递送装置。参见，例如，U.S.6,629,949；US 6,659,982；和Meehan等人,J.Controlled Release 46:107-116(1996)。微量输注器特别适用于递送高浓度(例如，约100、125、150、175、200或更高mg/mL)或粘性溶液中含有的大剂量治疗性蛋白质。
在某些实施方案中，任何前述方面的稳定液体药物制剂包含在无菌玻璃小瓶中并作为IV输注施用。
在一个实施方案中，容器是20mL 1型透明硼硅酸盐玻璃小瓶。在某些实施方案中，容器是2mL、5mL或10mL 1型硼硅酸盐玻璃小瓶，其具有氯化丁基橡胶塞，所述氯化丁基橡胶塞具有
在一个实施方案中，静脉内施用包含约25mg/mL或50mg/mL mAb1的本发明的液体药物制剂，并且可以将其包含在玻璃小瓶中。
在某些实施方案中，本发明提供了一种自动注射器，其包含本文所述的任何液体制剂。在一些实施方案中，本发明提供了一种自动注射器，其包含稳定的液体制剂，所述液体制剂包含约50mg/mL、约100mg/mL、约150mg/mL或约175mg/mL mAb1，约10mM的组氨酸，约pH 6.0，约5％蔗糖，约1.5％脯氨酸和约0.2％聚山梨醇酯80。
在某些实施方案中，本发明提供了预装注射器，其包含本文所述的任何液体制剂。在一些实施方案中，本发明提供了一种预装注射器，其包含稳定的液体制剂，所述液体制剂包含约50mg/mL、约100mg/mL、约150mg/mL或约175mg/mL的mAb1，约10mM的组氨酸，约pH0.6，约5％蔗糖，约1.5％脯氨酸和约0.2％聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，注射器是1mL或2.25mL的长玻璃注射器，其配有27号薄壁针、涂覆碳氟化合物的橡胶塞和橡胶针护罩。
在一个实施方案中，含有约175mg/mL±26.25mg/mL mAb1的液体药物制剂在预装注射器中以约高达2mL的体积施用。在某些实施方案中，注射器是1mL或2.25mL的长玻璃注射器，其配有27号薄壁针、涂覆碳氟化合物的橡胶塞和橡胶针护罩。在一个实施方案中，注射器是OMPI 1mL的长玻璃注射器，其配有27号针、FM27橡胶针护罩和涂覆
在一个实施方案中，含有约150mg/mL±22.5mg/mL抗PD-1抗体的液体药物制剂在预装注射器中以约高达2mL的体积施用。在一个实施方案中，注射器是1mL或2.25mL的长玻璃注射器，其配有27号薄壁针、涂覆碳氟化合物的橡胶塞和橡胶针护罩。在一个实施方案中，注射器是OMPI 1mL的长玻璃注射器，其配有27号针、FM27橡胶针护罩和涂覆
药物制剂的治疗用途
本发明的药物制剂尤其可用于治疗、预防或改善与PD-1活性相关的任何疾病或病症，包括由PD-1介导的疾病或病症。可通过施用本发明的药物制剂治疗或预防的示例性非限制性疾病和病症包括病毒感染、自身免疫性疾病和各种癌症，例如脑癌、肺癌、***癌、结肠直肠癌、头颈癌、皮肤癌、各种血癌和子宫内膜癌。
实施例
提供以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并不旨在限制本发明人认为的本发明的范围。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是摩尔份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
实施例1：抗PD-1抗体制剂的开发
配置制剂的目标是开发具有以下属性的制剂：
·具有抗PD-1抗体的液体制剂，所述抗PD-1抗体的浓度足以通过静脉内输注递送250mg或更多的剂量；
·近等渗制剂，用常用稀释剂稀释后其是稳定的，例如0.9％氯化钠注射液或5％右旋糖注射液，用于静脉输注；
·与作为包装的1型透明玻璃小瓶和标准血清塞子(serum stopper)相容且在其中是稳定的制剂；和
·无菌药物产品(DP)溶液，其支持长期稳定性；
ο最大限度地减少受到处理和热应激时抗体高分子量(HMW)种类的制剂；
ο最大限度地减少受到热应激时抗体带电荷物质相对分布的变化的制剂；和
ο受到处理和热应激时保持生物活性的制剂。
在整个制剂开发过程中，采用三种主要蛋白应激条件(代表抗体药物产品在处理、制造、运输、储存和贴标签期间的极端处理条件，超出此条件则抗体药物产品不会经受)来开发和优化抗体制剂并评估潜在现实世界应激对药物产品稳定性的影响。这些应激条件包括：
·在室温下搅拌(涡旋)蛋白质溶液。在玻璃小瓶中的涡旋超过了在处理和制造蛋白质期间发生的搅拌。
·相对建议的DP储存条件(2℃-8℃)，在升高的温度(37℃、40℃或45℃)下孵育蛋白质溶液。
·使蛋白质经历多次冻融循环。由于蛋白质在DP的制造过程中将经历至少一次冻融循环，因此多次冻融循环模拟并超过蛋白质预期经历的实际应激。
初始制剂开发工作具有四个主要目标：
1.缓冲剂和pH的选择：缓冲剂和pH的选择对蛋白质的稳定性具有很大影响，因此决定最佳缓冲剂种类和pH是一个重要的过程。在表明选择抗体的最佳缓冲剂和pH的基本原理的部分中给出这些研究。
2.表面活性剂或有机助溶剂的选择：通常需要表面活性剂或有机助溶剂，如聚山梨醇酯，以防止在搅拌时蛋白质沉淀或聚集。当处理、过滤、混合、制造、运输和施用可溶性蛋白质时，其可经受搅拌。简单缓冲溶液中的抗体药物物质可能在过度搅拌下变得明显混浊。因此，使蛋白质对处理和搅拌稳定是重要的。
3.稳定/张力(tonicifying)赋形剂的鉴定/选择：检查添加糖、盐和氨基酸改善抗体对热应激的稳定性和增加DP货架期的能力。包括这些热稳定剂的基本原理以及鉴定最终制剂中最佳浓度的研究在本文中给出。
4.抗体浓度的选择：检查抗体浓度对具有所选赋形剂的药物产品稳定性的影响。
使用5-50mg/mL的抗PD-1抗体进行初始制剂开发活动，包括筛选抗PD-1抗体的液体制剂中的有机助溶剂、热稳定剂和缓冲剂以鉴定这样的赋形剂，所述赋形剂与蛋白质相容并增强其稳定性，同时保持用于静脉内和皮下注射的接近生理的渗透压和低粘度。还检查了缓冲条件以确定最大蛋白质稳定性的最佳pH(在本文实施例4、6和7中描述)。
该初始制剂开发工作的结果用于开发适合于1期临床研究的初始制剂。1期制剂还为优化后期临床和商业制剂提供了参考。
利用从初始制剂开发中获得的知识，后期制剂开发活动包括优化pH、表面活性剂浓度和稳定剂以鉴定在低和高蛋白质浓度(高达175mg/mL mAb1)下增强蛋白质稳定性的赋形剂(在实施例5、8、9和10中描述)。
在整个制剂开发过程中，评估制剂的应激和储存稳定性。用于评估制剂开发研究中的稳定性的方法描述于本文的实施例3中。实施例11和12描述了制剂的储存和应激稳定性。
实施例13描述了当赋形剂在特定范围内变化时制剂的稳定性。
由这些研究产生的结果用于开发适合临床使用的稳定的液体制剂，其用于静脉内(IV)或皮下施用(SC)。实施例14描述了用于本文制剂的容器。实施例15、16和17描述了制剂在玻璃小瓶、预装注射器和静脉内递送装置中的相容性和稳定性。这些制剂符合制剂开发所限定的目标：
·开发的制剂适用于开发剂量；
·与生理条件等渗的张力；
ο50mg/mL制剂的重量摩尔渗透压浓度为约318mOsm/kg；
·无菌DP溶液，其支持液态中的长期稳定性；
ο在2-8℃长期储存时，抗体HMW种类的形成最少；
ο在2-8℃长期储存时，抗体带电荷种类的相对分布中极小变化至没有变化；和
ο在加速储存和应激条件下，以及在5℃下储存12个月后，在抗体DP中观察到不可肉眼可见颗粒的形成最少。
根据本文的描述，制剂的其他属性将是显而易见的。
抗PD-1抗体：抗PD-1抗体描述于US20150203579中，其以其整体并入本文。以下实施例中使用的示例性抗体是全人抗PD-1抗体H4H7798N(如US20150203579中所公开，称为“REGN2810”或“cemiplimab”)，其包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链和含有SEQ IDNO：10的氨基酸序列的轻链；包含SEQ ID NO：1/2的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和包含SEQ IDNO：3-8的重链和轻链CDR序列；并且在本文中称为“mAb1”。
实施例2：示例性制剂
在某些实施方案中，将mAb1配制成含有5mg/ml±0.75mg/ml至250mg/ml±45.0mg/ml mAb1、10mM±2mM组氨酸缓冲剂、0.2％±0.1％w/v聚山梨醇酯、1％±0.2％至10％±2％w/v蔗糖、和1％±0.02％至5％±1％w/v脯氨酸的水性经缓冲的制剂，pH6.0±0.3。
示例性制剂包括：
·稳定的低粘度药物制剂，其包含：25mg/ml±3.75mg/mL mAb1、10±2mM组氨酸缓冲剂、0.2％±0.1％w/v聚山梨醇酯80、5％±1％w/v蔗糖、和1.5％±0.3％w/v L-脯氨酸，pH6.0±0.3。
·稳定的低粘度药物制剂，其包含：50mg/ml±7.5mg/mL mAb1、10±2mM组氨酸缓冲剂、0.2％±0.1％w/v聚山梨醇酯80、5％±1％w/v蔗糖、和1.5％±0.3％w/v L-脯氨酸，pH6.0±0.3。
·稳定的低粘度药物制剂，其包含：150mg/ml±23mg/mL mAb1、10±2mM组氨酸缓冲剂、0.2％±0.1％w/v聚山梨醇酯80、5％±1％w/v蔗糖、和1.5％±0.3％w/v L-脯氨酸，pH6.0±0.3。
·稳定的低粘度药物制剂，其包含：175mg/ml±27mg/mL mAb1、10±2mM组氨酸缓冲剂、0.2％±0.1％w/v聚山梨醇酯80、5％±1％w/v蔗糖、和1.5％±0.3％w/v L-脯氨酸，pH6.0±0.3。
实施例3：用于评估制剂稳定性的方法
应用以下测定法评估制剂稳定性：
·目视检查的颜色和外观
·pH
·通过在405nm处OD的增加或通过比浊法测量浊度
·通过微流成像(MFI)进行的颗粒物质分析(报告为按原样获得的颗粒计数)和不透光度(HIAC)
·通过反相超高效液相色谱法(RP-UPLC)测定的蛋白质浓度
·通过尺寸排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)、或通过还原和非还原微芯片毛细管电泳十二烷基硫酸钠(MCE-SDS)PAGE测定的纯度
·通过阳离子交换色谱-超高效液相色谱法(CEX-UPLC)或通过成像毛细管等电聚焦(iCIEF)进行的电荷变体分析
·通过生物测定法测定的效力：使用生物测定法测定每个样品的相对效力，并定义为(IC50参考样品/IC50样品)*100％。测量的储存稳定性样品的效力必须在测量的参考标准效力的50％至150％之内。
制剂的物理稳定性是指如颜色、外观、pH、浊度和蛋白质浓度的性质。可通过目视检查检测溶液中可见颗粒的存在。如果为透明至略微乳白色、基本上没有可见颗粒、无色至淡黄色，则溶液通过目视检查。此外，通过在405nm处OD测量的浊度也可用于检测溶液中的颗粒。在405nm处OD的增加可指示测试物品中存在颗粒、乳白色增加或颜色变化。MFI用于测量尺寸≥2μm的不可肉眼可见颗粒。通过RP-UPLC测定法测量mAb1的蛋白质浓度，并报告为相对于起始材料的蛋白质回收百分比。在RP-UPLC测定法中，mAb1作为单峰从RP柱洗脱。通过比较mAb1总峰面积与使用mAb1标准产生的校准曲线，确定蛋白质浓度。根据相对于起始蛋白质浓度测得的蛋白质浓度计算回收百分比。
化学稳定性是指形成蛋白质的共价修饰形式(例如共价聚集体、切割产物或电荷变体形式)和非共价修饰形式(例如非共价聚集体)。可以通过SE-UPLC和MCE-SDS方法从天然mAb1分离更高和更低分子量的降解产物。SE-UPLC和MCE-SDS方法中降解的mAb1的百分比由所有非天然峰的面积与所有mAb1峰的总面积的比率计算。使用CEX-UPLC和iCIEF解析mAb1的电荷变体形式。在CEX-UPLC方法中，保留时间早于主峰保留时间的峰标记为“酸性”峰；保留时间晚于主峰保留时间的峰标记为“碱性”峰。在iCIEF方法中，聚焦到低于主峰pI的pI的峰标记为“酸性”峰，而聚焦到高于主峰pI的pI的峰标记为“碱性”峰。
实施例4：不同缓冲剂和pH的影响
通过在不同pH范围的一系列缓冲系统中、在45℃下孵育5mg/mL mAb1 28天，在液体制剂中检查缓冲剂和pH对mAb1热稳定性的影响。研究了以下pH和缓冲系统：乙酸盐(pH4.5、5.0、5.5)，组氨酸(pH 5.5、6.0、6.5)和磷酸盐(pH 6.0、6.5、7.0)。根据SE-UPLC分析的结果，当在组氨酸缓冲剂中pH6.0至6.5配制mAb1时观察到最大的蛋白质稳定性(表1)。
表1：缓冲剂和pH对在45℃下孵育28天的5mg/mL mAb1的稳定性的影响
a报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有制剂中，起始材料(无孵育)含有≥97.2％的通过SE-UPLC测定的天然峰，并且含有≥49.0％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
CEX＝阳离子交换；DS＝药物；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；OD＝光密度；RP＝反相；SE＝尺寸排阻；UPLC＝超高效液相色谱法；
根据来自CEX-UPLC分析的结果，当mAb1配制在pH5.5至6.0的组氨酸缓冲剂或pH5.0至5.5的乙酸盐缓冲剂中时，观察到最大的蛋白质稳定性。这些分析还揭示了聚集(即HMW种类的形成)、片段化(即LMW种类的形成)和电荷变体形成是主要的降解途径。选择组氨酸缓冲剂作为制剂缓冲剂，是因为在HMW和LMW种类形成和电荷变体形成方面其提供了最佳的蛋白质稳定性的总体水平。选择pH 6.0用于制剂，是因为在该pH下，作为主要降解途径的HMW种类和电荷变体的形成被最小化。基于这些结果，选择pH6.0的10mM组氨酸缓冲剂用于mAb1制剂。
实施例5：组氨酸缓冲剂中的pH筛选
在高浓度液体制剂中检查了缓冲剂和pH对mAb1的热稳定性的影响。将150mg/mLmAb1在45℃下在pH范围为5.3、5.5、5.8、6.0和6.3的一系列组氨酸缓冲剂中培养28天，所述组氨酸缓冲剂包含或不包含热稳定剂。使用9％蔗糖，基于SE-UPLC分析的结果，当在pH5.8至6.3的组氨酸缓冲剂中配制mAb1时，观察到最大的蛋白质稳定性(图1)。基于来自CEX-UPLC分析的结果，当在pH 5.3和6.0的组氨酸缓冲剂中配制mAb1时，观察到最大的蛋白质稳定性(表2)。
表2：pH对在45℃下孵育28天的150mg/mL mAb1稳定性的影响
a报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有制剂中，起始材料(无孵育)含有≥94.0％的通过SE-UPLC测定的天然峰，并且含有≥48.7％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
b凝胶化的样品。没有进行进一步的分析。NA＝不适用
CEX，阳离子交换；HMW，高分子量；LMW，低分子量；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法
这些分析还揭示聚集(即形成HMW种类)和电荷变体的形成是主要的降解途径。选择pH 6.0用于DP制剂，是因为在该pH下，作为主要降解途径的HMW种类和电荷变体的形成被最小化。基于这些结果，选择pH6.0的10mM组氨酸缓冲剂用于mAb1高浓度DP制剂。
实施例6：选择针对搅拌应激的保护剂
通常将稳定剂如表面活性剂和有机助溶剂加入到抗体制剂中以保护蛋白质免受搅动诱导的聚集。在液体制剂中检查了有机助溶剂和表面活性剂对5mg/mL mAb1的搅拌应激稳定性和热稳定性的影响。评价以下助溶剂和表面活性剂：0.1％聚山梨醇酯20、0.1％聚山梨醇酯80和1.0％PEG3350。搅拌应激稳定性研究的结果总结在表3中。
表3：有机助溶剂和表面活性剂对搅拌(涡旋120分钟)后5mg/mL mAb1稳定性的影响
a报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有5个制剂中，起始材料(无孵育)含有≥98.2％的通过SE-UPLC测定的天然峰，并且含有≥49.1％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
b制剂中还含有5％蔗糖。
CEX＝阳离子交换；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；OD＝光密度；RP＝反相；SE＝尺寸排阻；UPLC＝超高效液相色谱法；
不存在有机助溶剂或表面活性剂的情况下通过涡旋120分钟搅拌后，mAb1是不稳定的。不存在助溶剂或表面活性剂的情况下通过涡旋搅拌后，溶液变浑浊，呈现实质上的浊度增加，并且通过SE-UPLC测定的聚集体增加15.3％，以及通过RP-UPLC的蛋白质回收率损失24％(表3)。1％PEG3350不能提供在涡旋120分钟后足够的mAb1稳定性。在1％PEG3350存在下，溶液变浑浊，并呈现出浊度增加(表3)。相反，0.1％聚山梨醇酯20和0.1％聚山梨醇酯80均在相同程度上保护mAb1免受搅动诱导的不稳定性(表3)。
然而，在45℃孵育时，与含有0.1％聚山梨醇酯20的制剂相比，含有0.1％聚山梨醇酯80的制剂呈现出聚集物的量减少(表4)。选择0.1％聚山梨醇酯80作为mAb1 DP制剂的表面活性剂，是因为其针对搅拌应激稳定蛋白质，对蛋白质热稳定性的负面影响小于聚山梨醇酯20(如通过SE-UPLC和CEX-UPLC分析所测定)，以及其在单克隆抗体制剂中具有安全的使用历史。
实施例7：选择针对热应激的保护剂
通常将如蔗糖的稳定剂添加到抗体制剂中以增加蛋白质在液体制剂中的热稳定性。当用5％蔗糖配制并在加速条件下孵育时，液体制剂中的五(5)mg/mL mAb1表现出改善的稳定性(表4)。
表4：有机助溶剂和表面活性剂对在45℃下孵育29天的5mg/mL mAb1稳定性的影响
a报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有5个制剂中，起始材料(无孵育)含有≥98.2％的通过SE-UPLC测定的天然峰，并且含有≥49.1％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
b制剂中还含有5％蔗糖。
CEX＝阳离子交换；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；OD＝光密度；RP＝反相；SE＝尺寸排阻；UPLC＝超高效液相色谱法；
在45℃孵育29天后，含有5％蔗糖的制剂中HMW种类的相对量增加1.7％，而不含蔗糖的对照制剂中增加2.8％。因此，选择蔗糖作为热稳定剂。为了使制剂等渗并使热稳定性最大化，对于mAb1制剂，蔗糖浓度增加至10％。
实施例8：稳定剂的优化
优化热稳定剂的目的是鉴定可用于开发支持抗体浓度高达200mg/mL的DP制剂的稳定组分。在初始制剂中选择10％蔗糖。发现使用10％蔗糖，mAb1的粘度在20℃下为约20cP，认为这对于稳健的后期阶段商业产品而言过高。因此，需要改进的mAb1制剂，其表现出有利的稳定性和较低的粘度。
在低浓度制剂开发期间，选择蔗糖作为mAb1的热稳定剂。对于高浓度制剂开发，针对在25℃(表5)和40℃下持续1个月的150和175mg/mL浓度的mAb1的稳定性和粘度，评估了不同浓度的蔗糖和L-脯氨酸。当制剂在40℃下孵育28天时，HMW种类的形成随着蔗糖浓度的增加而降低。3％L-脯氨酸提供与5％蔗糖类似的稳定，用9％蔗糖观察到最大的稳定。
虽然与3％L-脯氨酸相比，9％蔗糖提供稍好的稳定性，但它也增加了制剂粘度。在175mg/mL时，含有9％蔗糖的mAb1制剂具有27厘泊的粘度，这对制造和施用提出了挑战。含有3％脯氨酸的175mg/mL mAb1制剂具有约20厘泊的粘度，这在目前的制造方法中是易管理的。
表5：具有热稳定剂的高浓度mAb1在25℃下持续1个月的加速稳定
apH、SE-UPLC和CEX-UPLC'起始原料'结果是起始制剂的平均值
然而，基于-20℃、-30℃和-80℃的储存稳定性，发现具有3％脯氨酸的制剂不如具有蔗糖的制剂稳定(图2)。如图2所示，制剂F3(具有5％蔗糖)在-20℃、-30℃和-80℃稳定，HMW种类≤3％。
用50mg/mL制剂检查了L-脯氨酸对稳定mAb1的作用。在45℃孵育28天后，相对于不含L-脯氨酸的制剂，具有L-脯氨酸的制剂显示出较低水平的HMW种类，表明L-脯氨酸使50mg/mL浓度的抗体稳定(表6)。此外，通过生物物理技术(傅立叶变换红外光谱、CD光谱、荧光发射光谱和差示扫描量热法)检查了L-脯氨酸对抗体蛋白质结构的影响。结果显示L-脯氨酸不扰乱抗体的二级和三级结构。
表6：稳定剂对在45℃下孵育28天后的50mg/ml mAb1稳定性的影响
a)报告为相对于起始材料的纯度变化。在所有三种制剂中，起始材料(无孵育)含有≥98.5％的通过SE-UPLC测定的单体峰，以及≥52.8％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；LMW，低分子量；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
在液体制剂中进一步检查了不同稳定剂对高浓度(150和175mg/mL)mAb1的热稳定性的影响。评价的稳定剂是9％(w/v)蔗糖、3％(w/v)L-脯氨酸和5％(w/v)蔗糖+1.5％(w/v)L-脯氨酸。加速稳定性研究的结果总结在表7中。
表7：稳定剂对在25℃和40℃孵育后的mAb1稳定性的影响
a)报告为相对于起始材料的纯度变化。在所有三种制剂中，起始材料(无孵育)包含≥97.3％的通过SE-UPLC测定的天然峰，以及≥49.6％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
CEX，阳离子交换；HMW，高分子量；LMW，低分子量；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
在40℃孵育28天后，9％蔗糖提供最佳的稳定并且在高浓度制剂中具有最高粘度。在40℃下28天后，5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸制剂的稳定性排名第二。在25℃孵育3个月后，mAb1的稳定性在所有检测的制剂中几乎相同；然而，具有5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸的制剂略好于其他两种制剂。然而，在-20℃、-30℃和-80℃孵育后，5％和9％的蔗糖提供比3％脯氨酸更好的稳定性(图3)。具有5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸的175mg/mL mAb1的粘度在20℃下为14cP的粘度。为了提供产生等渗溶液并在稳定性和粘度之间达到最佳平衡的制剂，选择5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸用于开发抗体后期DP制剂。
实施例9：粘度调节剂的选择
随着蛋白质浓度增加，蛋白质制剂的粘度呈指数增加。当粘度在20℃时开始超过约10至15cP时，开发制剂时必须考虑制剂的粘度：这仅仅是因为粘度与通过预装注射器(PFS)或其他基于针的递送装置的注射容易性相关；更重要的是，保持合理的低粘度对于开发递送装置(如自动注射器)是至关重要的。在具有以下潜在粘度调节剂的液体制剂中检查了赋形剂对制剂粘度的影响：脯氨酸、精氨酸HCl、组氨酸HCl、乙酸镁和NaCl。图4总结了具有粘度调节剂的150mg/mL mAb1的粘度。25-100mM的精氨酸HCl、组氨酸HCl、乙酸镁和NaCl降低150mg/mL mAb1制剂的粘度。
还检查了粘度调节剂对mAb1制剂稳定性的影响。制备具有粘度调节剂如精氨酸HCl、组氨酸HCl、乙酸镁和NaCl的150mg/mL mAb1制剂，并在45℃孵育28天。结果显示在图5中。发现当没有粘度调节剂配制mAb1时，观察到最大的蛋白质稳定性；所有这些改变粘度的盐都对mAb1稳定性产生负面影响。因此，盐不包括在最终制剂中。
作为稳定剂的L-脯氨酸使浓度等于或高于50mg/mL的抗体溶液的粘度最小。具有不同量的L-脯氨酸(含有和不含蔗糖)的高浓度抗体的加速稳定性研究结果总结在表7中。在25℃下孵育3个月后，含有5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸的制剂相对于其他两种制剂，在HMW种类形成方面提供稍改善的稳定性。在40℃孵育28天后，含有9％蔗糖的制剂提供了最好的稳定性，含有5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸制剂的制剂排名第二。含有9％蔗糖的175mg/mL抗体制剂的粘度为20cP，而含有5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸的175mg/mL制剂的粘度为20℃下14cP的粘度。向制剂中添加L-脯氨酸对于降低蛋白质浓度升高时的粘度以及稳定抗体是重要的。
总之，对于50mg/mL和高浓度抗体制剂，选择5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸。这种赋形剂组合在所有测试的抗体浓度(高达175mg/mL)下实现了具有可接受的稳定性和粘度的等渗制剂。
实施例10：聚山梨醇酯(PS)浓度的优化
在制剂开发期间，在没有表面活性剂的情况下搅拌mAb1制剂时，观察到更高阶分子量种类形成和浊度增加。通过添加聚山梨醇酯80(PS 80)使蛋白质对搅拌稳定。在高浓度mAb1液体制剂的开发期间，更高阶分子量种类增加时，观察到对搅拌的不稳定性。进行了一项研究，确定保护高达175mg/mL mAb1免受搅拌诱导的不稳定性需要最低量的聚山梨醇酯80。该研究中的制剂含有5％蔗糖和1.5％L-脯氨酸，因此可以用更能代表最终制剂的制剂组合物研究聚山梨醇酯80的作用。研究中包括的标称聚山梨醇酯80的浓度为0％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.15％和0.2％(w/v)。不存在聚山梨醇酯80的情况下，通过涡旋搅拌后，溶液变浑浊并且呈现浊度的实质性增加。观察到搅拌120分钟后聚山梨醇酯80浓度依赖性降低的HMW％的量。发现针对搅拌诱导的聚集，浓度为0.15-0.2％的聚山梨醇酯80足以使150mg/mL和175mg/mL mAb1稳定(表8)。添加0.2％(w/v)(标称值)聚山梨醇酯80完全阻止了在搅拌120分钟后，HMW种类的形成。
表8：搅拌120分钟后具有PS 80的150mg/mL和175mg/mL mAb1的稳定性
表9详述了聚山梨醇酯80浓度对搅拌(涡旋120分钟)后175mg/mL mAb1稳定性的影响。
表9：聚山梨醇酯80浓度对搅拌(涡旋120分钟)后175mg/mL mAb1稳定性的影响
a)报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有制剂中，起始材料(无孵育)包含≥97.4％的通过SE-UPLC测定的天然峰，以及≥48.2％的通过CEX UPLC测定的主峰。
CEX，阳离子交换；HMW，高分子量；LMW，低分子量；NA，无可用；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
通过另一项研究证实0.2％(w/v)聚山梨醇酯80保护mAb1免受搅拌诱导的不稳定性的能力，其中最终制剂为50mg/mL(表10)。
表10：PS80浓度对搅拌(涡旋120分钟)后50mg/mL mAb1稳定性的影响
a报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有五种制剂中，起始材料(无孵育)包含≥98.5％的通过SE-UPLC测定的单体峰，以及≥52.8％的通过CEX UPLC测定的主峰。
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；LMW，低分子量；NA，无可用；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
基于这些结果，选择0.2％(w/v)聚山梨醇酯80作为表面活性剂，因为其提供了足够的稳定性以防止在搅拌应激下形成HMW种类。
实施例11：示例性制剂的储存和应激稳定性
表11和表12中显示了50mg/mL和175mg/mL mAb1制剂在玻璃小瓶中的储存稳定性，来自两种制剂的加速和应激稳定性数据分别显示在表13和表14中。研究的稳定性研究表明，玻璃小瓶中的50mg/mL和175mg/mL mAb1制剂在2℃至8℃下储存时至少24个月稳定。此外，50mg/mL mAb1制剂在加速和应激条件下也表现出优异的稳定性。当在25℃下储存至少3个月和40℃下储存至少7天时，该制剂是稳定的，表明50mg/mL制剂与主要容器封闭组件的相容性。没有观察到通过SE-UPLC或CEX-UPLC和iCIEF测量的颜色或外观、浊度、颗粒物质、pH、蛋白质浓度、纯度中的明显变化，并且在这些条件下保持效力。
表11：在2-8℃下储存的50mg/mL制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；单体，完整抗体；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表12：在2-8℃下储存的175mg/mL制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；单体，完整抗体；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表13：在加速和应激条件下储存的50mg/mL制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；单体，完整抗体；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表14：在加速和应激条件下储存的175mg/mL制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；单体，完整抗体；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
实施例12：包含组氨酸缓冲剂、蔗糖和聚山梨醇酯的mAb1制剂的稳定性
表15-24总结了包含10mM组氨酸缓冲剂，pH6.0、蔗糖和聚山梨醇酯的示例性mAb1制剂的储存稳定性。
表15：在-80℃下储存的mAb1制剂的稳定性研究
CEX＝阳离子交换；HMW＝高分子量；iCIEF＝成像毛细管等电聚焦；LMW＝低分子量；MCE-SDS＝微芯片毛细管电泳-十二烷基硫酸钠；MFI＝微流成像；NR＝不是必需的；OD＝光密度；RH＝相对湿度；RP＝反相；SE＝尺寸排阻；UPLC＝超高效液相色谱法；
表16：在-30℃下储存的mAb1制剂的稳定性研究
表17：在-20℃下储存的mAb1制剂的稳定性研究
表18：mAb1制剂的稳定性研究-加速条件的影响
表19：在-80℃储存的mAb1制剂的稳定性研究
表20：在-30℃储存的mAb1制剂的稳定性研究
表21：在-20℃储存的mAb1制剂的稳定性研究
表22：mAb1制剂的稳定性研究-加速条件的影响
表23：在-5℃储存的mAb1制剂的稳定性研究
表24：在加速条件下储存的mAb1制剂的稳定性研究
表25-27总结了示例性制剂的应激稳定性。
表25:mAb1制剂的稳定性研究–应激条件的影响
表26：mAb1制剂的稳定性研究-应激条件的影响
表27：mAb1制剂的稳定性研究-应激条件的影响
表28：50mg/mL和25mg/mL mAb1制剂的加速和应激稳定性
实施例13：验证的可接受范围(PAR)的研究
在mAb1药物产品(DP)的制造期间，可能发生DP组成的变化。这些变化可包括活性成分的浓度、赋形剂的浓度和/或制剂的pH。由于任何这些参数的变化都可能潜在影响药物产品的稳定性或效力，因此进行了验证的可接受范围(PAR)的研究，以评估在限定范围内DP组成的变化是否会影响mAb1 DP的稳定性或效力。
两个实验设计(DOE)研究用于评估每个制剂参数以及相互作用对制剂稳定性的影响：
·部分因子设计Pre-PAR研究，其使用加速和应激稳定性评估以鉴定可影响mAb1 DP稳定性的关键制剂参数；
·全因子设计PAR研究，包括从Pre-PAR研究中鉴定的关键制剂参数，其使用长期货架期稳定性以证明制剂参数的可接受范围。
Pre-PAR研究设计
为了评估DP组成中对于产品质量可能是重要的关键和/或相互作用的制剂参数，应用部分因子DOE通过改变所有制剂参数(包括蛋白质浓度(±10％)、缓冲剂和稳定剂浓度(±20％)、表面活性剂浓度(±50％)和pH(±0.3单位))来检查制剂的加速和应激稳定性。测试的制剂参数范围被定义为等于或宽于规范验收标准和制造经验。该研究使用统计软件设计，使用2^(6-2)分辨率IV部分因子实验。连同四个作为中心点的靶标制剂，该研究包括20次运行，如表29所示。
表29：在Pre-PAR研究中测试的制剂
在加速条件和应激条件(25℃、37℃、冻/融[F/T]和搅拌)下，对所有20种制剂进行表征并评估其物理/化学性质和稳定性，包括目视检查、pH、浊度、重量摩尔渗透压浓度、电导率、纯度、蛋白质浓度和回收率、电荷变化分析和不可肉眼可见颗粒分析。
Pre-PAR研究结果
搅拌或F/T应激后，所有20种制剂均未显示变化。通过回归模型(具有标准最小二乘个性和强调效应杠杆的JMP拟合模型)分析了25℃和37℃孵育的结果。针对关键质量属性对所有实验制剂的主要和相互作用变量的统计学分析表明，pH、蛋白质浓度和蔗糖浓度对产品质量至关重要。受影响的两个产品质量属性是HMW种类和酸性电荷变体。发现在测试范围内的其他制剂参数(包括组氨酸、脯氨酸或聚山梨醇酯80浓度)对产品质量没有统计学上的显著影响。在加速条件下，没有影响制剂稳定性的次级或更高级的相互作用。Pre-PAR研究结果表明，pH、mAb1浓度和蔗糖浓度对mAb1制剂的稳定性至关重要，并被视为50mg/mLmAb1制剂的关键制剂参数。
尽管将pH、mAb1浓度和蔗糖浓度鉴定为关键制剂参数，但这三个因子对质量属性的影响最小。根据统计学分析，pH范围5.7-6.3、mAb1范围45-55mg/mL和/或蔗糖范围4-6％内的变化可能对HMW种类和酸性电荷变体形成的影响小于15％。
为了确认在推荐的DP储存条件下对长期储存稳定性的影响，在长期储存稳定性的PAR研究中进一步评估了以下三个关键的制剂参数：pH、mAb1浓度和蔗糖浓度。
PAR研究设计
应用全因子DOE设计来检查具有不同pH(±0.3单位)、蛋白质浓度(±10％)和蔗糖浓度(±20％)的制剂的长期货架期储存稳定性，导致在八个实验运行中进行(表30)；包括作为中心点制剂的参考制剂(制剂3，表30中的靶标制剂)。
表30：PAR研究中测试的制剂
全因子研究设计允许评估所有主效应项以及相互作用项。测试的制剂参数范围(限定为等于或宽于规范验收标准和制造经验)保持与Pre-PAR研究中相同。
将实验制剂的稳定性与pH6.0的参考制剂的稳定性进行比较，所述参考制剂含有其标称浓度(F3)的所有制剂组分。PAR研究使用通过代表性商业制造方法制造的mAb1 DS批次。将DP制剂装入到10mL Schott 1型硼硅酸盐玻璃小瓶中，其具有20mm涂覆
表31：PAR研究的分析计划
PAR研究结果
对HMW种类形成的影响
对于所有9种制剂，如通过SE-UPLC测量的，在2-8℃下长达12个月％HMW没有有意义的增加。所有值都远低于规范上限，并且随着时间没有观察到％HMW的显著增加。
发现在2-8℃下50mg/mL mAb1 DP的HMW种类形成极其缓慢。长达12个月，9种制剂中％HMW的相对量的最大变化为～0.2％。由于％HMW的变化是最小的，并且单体浓度可以被认为是不变的，因此从单体到HMW种类的聚集可以简化为零阶反应。因此，使用简化的线性模型来分析％HMW稳定性数据。通过随时间线性拟合％HMW，得到每种制剂的HMW种类形成速率。
使用回归模型(具有标准最小二乘个性和强调效果杠杆的JMP拟合模型)针对主要因子以及所有相互作用项分析速率。得到的回归模型具有统计学显著性，R2为0.74。mAb1浓度、pH和时间在统计学上是显著的，但对％HMW种类形成的影响在统计学上是不显著的，仅贡献至多0.1％。
因此，这些因子：pH 5.7-6.3、mAb1浓度45-55mg/mL、蔗糖浓度4-6％，与2-8℃下的％HMW稳定性无实际相关性。
在长达12个月的时间点，所有9种制剂中的％HMW远低于4％的限定的接受标准极限，因此在规范货架期的发布和终止内。此外，线性模型预测，在2℃-8℃储存货架期的24个月后，％HMW(0.6％至0.8％)也远低于规范限值。
根据长期储存稳定性数据，发现研究范围内的关键制剂参数的变化对mAb1制剂稳定性没有显著影响。在测试的制剂组成的范围内，在HMW种类形成方面，50mg/mL mAb1制剂是稳健的。
对酸性电荷变体形成的影响
对于所有9种制剂，在2-8℃下长达12个月测量的％酸性电荷变体没有有意义的增加。所有值均低于规范上限，并且没有观察到％酸性电荷变体随时间的显著增加。
在测试的制剂组成范围内，在酸性电荷变体形成方面，mAb1制剂被认为是稳健的。
对一般质量属性的影响
研究了pH、mAb1浓度和蔗糖以及储存时间对其他DP一般质量属性的影响，包括外观、pH、浊度、不可肉眼可见颗粒、蛋白质回收、通过SEC检测的单体％和LMW％、通过iCIEF检测的主要电荷变体％和碱性电荷变体％和生物活性。所有值均在规范范围内，并且没有观察到随时间的有意义的变化或PAR制剂之间的差异：
·通过目视检查或浊度测量(405nm处的OD和比浊法)未检测到沉淀或可见颗粒；
·在蛋白质回收中没有观察到统计学上的显著变化(RP-UPLC)；
·制剂的pH值稳定；
·没有观察到不可肉眼可见颗粒中有意义的增加，没有观察到PAR研究制剂之间的不可肉眼可见颗粒计数中的有意义的差异。
ο对于通过HIAC测量的不可肉眼可见颗粒，所有值均低于USP<788>设定的可接受限度，并且没有观察到制剂之间不可肉眼可见颗粒中的有意义的变化。
ο此外，还通过MFI测量不可肉眼可见颗粒。没有观察到制剂之间不可肉眼可见颗粒中的有意义的变化。
·对于储存期间的所有制剂，生物测定法结果在规范限度内。
结果表明，研究范围内的关键制剂参数(pH、mAb1浓度和蔗糖浓度)的变化对mAb1制剂稳定性没有显著影响。在测试的制剂组合物范围内，在一般质量属性方面，50mg/mLmAb1制剂是稳健的。
冻融对PAR制剂稳定性的影响
在两次冻融循环后检查50mg/mL mAb1制剂的物理和化学稳定性，其不受关键制剂参数变化(即相对于参考mAb1，±0.3pH单位变化，mAb1浓度±10％变化，和/或蔗糖±20％变化)的影响。
观察到以下影响：
·通过目视检查或浊度测量(405nm处的OD)没有检测到沉淀；
·没有观察到蛋白质损失(RP-UPLC)；
·制剂的pH保持恒定；
·通过研究制剂之间的不透光度(HIAC)或微流成像(MFI)测定的不可肉眼可见颗粒计数中没有观察到有意义的差异。在2个循环的F/T后，不可肉眼可见颗粒略有增加，这可以在装入DP之前通过0.22μm过滤器过滤来除去。
·在两次冻融循环后，在所有制剂中均未观察到SE-UPLC测定的纯度中的明显变化；
·在两次冻融循环后，在所有制剂中均未观察到iCIEF测定的电荷变体分布中的明显变化。
·生物测定法结果表明，经历2个循环的冻融的所有制剂维持mAb1活性。
结论
使用基于实验设计(DOE)的pre-PAR和PAR研究来评估制剂参数以及相互作用对制剂稳定性的影响。使用加速和应激稳定性的pre-PAR研究鉴定了pH、mAb1浓度和蔗糖浓度为关键制剂参数。使用长期货架期稳定性的全因子PAR研究表明，关键制剂参数在研究范围内的变化不影响mAb1 DP质量。
具体地，在5℃下储存12个月的50mg/mL mAb1 DP的稳定性和效力不受蛋白质浓度±10％的变化，蔗糖、L-脯氨酸和/或组氨酸浓度±20％的变化，和/或聚山梨醇酯80浓度±50％的变化，和/或±0.3pH单位变化的影响。
PAR研究证明了mAb1制剂的稳健性。总体而言，pre-PAR和PAR研究的结果支持mAb1制剂组成在研究范围内的变化不会对推荐的储存条件(2至8℃)下mAb1 DP的稳定性产生不利影响。
在两个冻融循环(-30℃冻结和室温解冻)后，50mg/mL mAb1 FDS样品是稳定的。mAb1 FDS对冻/融应激的稳定性不受相对于对照mAb1FDS(50mg/mL)，mAb1浓度±10％的变化、蔗糖±20％的变化、和/或±0.3pH单位变化的影响。这些冻/融研究的结果提供了以下支持，即在mAb1 DP的制造过程中可以冻融50mg/mL mAb1 FDS，而不会不利地影响FDS的稳定性。
实施例14：容器
mAb1制剂在玻璃小瓶中开发(用于通过静脉内输注递送)。旨在用于后续临床开发和产品商业化的mAb1药物产品的容器也是预装注射器，其作为用于自我注射的独立注射器或者结合到用于自我施用的自动注射器装置中。
实施例15：mAb1制剂在玻璃小瓶中的稳定性
表32-35总结了示例性mAb1制剂在10mL玻璃小瓶中的稳定性。
表32：在2-8℃下储存的mAb1制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表33：mAb1制剂在加速和应激条件下的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表34：在2-8℃下储存的mAb1制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表35：mAb1制剂在加速和应激条件下的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
发现不同装入体积的两种制剂对应激(40℃/75％RH)稳定(数据未显示)。
实施例16：mAb1制剂在预装注射器中的稳定性
表36-38总结了高浓度mAb1制剂在预装注射器中的稳定性。
表36：在5℃下储存的预装注射器(PFS)中mAb1药物产品的稳定性研究
表37：在加速条件下储存的预装注射器(PFS)中mAb1药物产品的稳定性研究
表38：mAb1药物产品在预装注射器(PFS)中的稳定性研究–应激条件的影响
实施例17：mAb1制剂在静脉内(IV)递送装置中的相容性
为了相容性评估，将50mg/mL mAb1制剂加入到含有0.9％氯化钠注射液或5％右旋糖注射液的100mL IV袋中，以评估静脉内递送时mAb1是否稳定。为了支持患者体重的变化，在该研究中检查了两种混合物浓度，1.0mg/mL mAb1和25mg/mL mAb1，以反映低剂量和高剂量给药条件。在相容性研究期间使用以下IV混合物组分：
·药物产品
ο50mg/mL mAb1 DP
·稀释剂
ο0.9％氯化钠注射液
ο5％右旋糖注射液
·IV袋
ο预装0.9％氯化钠注射液的聚氯乙烯(PVC)与邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)制成的IV袋
ο预装5％右旋糖注射液的聚氯乙烯(PVC)与DEHP制成的IV袋
ο预装0.9％氯化钠注射液的聚烯烃(PO)制成的IV袋
ο预装5％右旋糖注射液的聚烯烃(PO)制成的IV袋
ο预装0.9％氯化钠注射液的聚丙烯制成的IV袋
ο预装0.9％氯化钠注射液的聚丙烯制成的IV瓶
·IV泵
ο蠕动泵
ο流体驱替泵(Fluid displacement pump)
·IV输液器
οPVC与DEHP制成的IV器
οPVC与对苯二甲酸二辛酯(DEHT)制成的IV器
οPVC与偏苯三酸三辛酯(TOTM)制成的IV器
ο内衬PVC的聚乙烯制成的IV器
ο聚氨酯制成的IV器
·过滤器
ο0.2μm聚醚砜内联过滤器
ο1.2μm聚醚砜内联过滤器
ο5μm聚醚砜内联过滤器
ο15μm聚醚砜内联过滤器。
在该研究中使用的DP是使用代表性DP商业制造方法制造的GMP。含有混合物的IV袋最初在5℃下保持24小时；然后将袋子在25℃下孵育至少8小时。在这些孵育后，将每个输液器连接到IV袋，用混合物预处理(primed)并在环境室温下保持1小时。然后将每种混合物以25mL/h和500mL/h的速率通过相应的输液器泵送。
用于评估混合物相容性的方法：使用以下测定法评估mAb1混合物与IV递送装置中使用的材料的相容性：
·目视检查颜色和外观
·pH值
·通过在405nm处光密度(OD)的增加来测量浊度
·通过不透光度(HIAC)对混合物进行不可肉眼可见颗粒分析
·通过反相超高效液相色谱法(RP-UPLC)测定mAb1的蛋白质浓度
·通过SE-UPLC测定纯度
·通过CEX-UPLC测定电荷变体分析
·通过生物测定法的效力：使用生物测定法测定每个样品的相对效力，并定义为：(IC50参考样品/IC50样品)*100％。测量的储存稳定性样品的效力必须在测量的参考标准效力的50-150％之内。
结果和结论：在0.9％氯化钠注射液或5％右旋糖注射液中稀释至浓度为1.0mg/mL或25mg/mL的50mg/mL mAb1制剂在建议剂量范围和施用条件内的所有测试条件下都是物理和化学稳定的。这些数据支持以下有关mAb1DP的剂量制备和IV施用的结论：
·PVC与DEHP、PO和聚丙烯制成的0.9％氯化钠注射液和5％右旋糖注射液IV袋与mAb1IV施用相容。
·在用于IV施用的含有0.9％氯化钠或5％右旋糖的PVC、PO或聚丙烯IV袋中，mAb1 DP可稀释至低至1.0mg/mL的浓度。
·在用于IV施用的含有0.9％氯化钠或5％右旋糖的PVC、PO或聚丙烯IV袋中，mAb1 DP可稀释至高达25.0mg/mL的浓度。
·在5℃下在PVC、PO或聚丙烯IV袋中孵育长达24小时、以及在25℃下孵育8小时后，0.9％氯化钠或5％右旋糖中的mAb1混合物是稳定的。稀释的mAb1DP可在制备后6小时内施用。
·稀释的mAb1可以使用标准输液泵施用。
·稀释的mAb1可以用含有DEHP的PVC、含有TOTM的PVC、聚乙烯或聚氨酯组成的输液器施用。
·mAb1与内联0.2μm-5μm聚醚砜过滤器的使用相容。
·稀释的mAb1可以25至500mL/小时的速率施用。
本发明不限于本文描述的具体实施方案的范围内。实际上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述和附图中变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
具体实施方式
图1是显示pH对150mg/mL mAb1在45℃下孵育28天的稳定性的影响的表。aSE-UPLC和CEX-UPLC“起始材料”结果是所有制剂起始材料的平均值。
图2显示了三种制剂F1、F2和F3的储存稳定性，其中F1包含210mg/mL mAb1、10mM组氨酸和3％脯氨酸，pH 6.0；F2包含210mg/mL mAb1、10mM组氨酸和3％蔗糖，pH 6.0；F3包含210mg/mL mAb1、10mM组氨酸和5％蔗糖，pH6.0。通过在-80℃(A)、-30℃(B)和-20℃(C)下储存至多9个月后产生的％高分子量物质(HMW)来测量储存稳定性，并通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行分析。
图3显示了三种制剂F1、F2和F3的储存稳定性，其中F1包含150mg/mL mAb1、10mM组氨酸、9％蔗糖和0.2％聚山梨醇酯80(PS80)，pH6.0；F2包含175mg/mL mAb1、10mM组氨酸、3％脯氨酸和0.2％PS80，pH6.0；F3包含175mg/mL mAb1、10mM组氨酸、5％蔗糖、1.5％脯氨酸和0.2％PS80，pH6.0。通过在-80℃(A)、-30℃(B)和-20℃(C)下储存至多6个月后产生的％高分子量物质(HMW)来测量储存稳定性，并通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行分析。
图4是显示添加赋形剂和粘度调节剂的150mg/mL mAb1的粘度的表。
图5是显示粘度调节剂对175mg/mL mAb1在45℃下孵育14天的稳定性的影响的表。apH，SE-UPLC和CEX-UPLC“起始材料”结果是所有制剂的起始材料的平均值。
详细说明
在描述本发明方法之前，应理解本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如本文所用，当用于提及具体列举的数值或数值范围时，术语“约”意指该值可以与所列举的值相差不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101以及它们之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。尽管在实践或测试本发明时可以使用与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料，现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用整体并入本文。
如本文所用，表述“药物制剂”是指至少一种活性成分(例如，小分子、大分子、化合物等，其能够在人或非人动物中发挥生物学作用)和至少一种非活性成分的组合，当所述至少一种非活性成分与活性成分或一种或多种另外的非活性成分组合时，其适合于对人或非人动物的治疗性施用。除非另外特别说明，否则本文所用的术语“制剂”是指“药物制剂”。本发明提供了包含至少一种治疗性多肽的药物制剂。根据本发明的某些实施方案，治疗性多肽是抗体、或其抗原结合片段，其特异性结合人程序性死亡-1(PD-1)蛋白质。更具体地，本发明包括药物制剂，其包含：(i)特异性结合人PD-1的人抗体；(ii)组氨酸缓冲剂；(iii)作为非离子表面活性剂的有机助溶剂；(iv)碳水化合物的稳定剂；和任选地，(v)为氨基酸的粘度调节剂。本发明包括的具体示例性成分和制剂在以下详细描述。
特异性结合PD-1的抗体
本发明的药物制剂可包含人抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人PD-1。如本文所用，术语“PD-1”意指人程序性死亡-1蛋白。人PD-1的抗体描述于例如美国专利/公开号8008449、8168757、20110008369、20130017199、20130022595、20150203579，以及WO2006121168、WO2009114335、WO2012145493、WO2013014668、WO2009101611、WO2015112800、EP2262837和EP2504028中。
如本文所用，术语“抗体”通常意指包含四条多肽链的免疫球蛋白分子(其中两条重(H)链和两条轻(L)链通过二硫键相互连接)以及其多聚体(例如，IgM)；然而，仅由重链组成的免疫球蛋白分子(即，缺少轻链)也包括在术语“抗体”的定义内。每条重链包含重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒链区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布在称为框架区(FR)的较保守的区域间。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
除非另外特别说明，否则本文所用的术语“抗体”应理解为包括完整的抗体分子及其抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称“抗体部分”或“抗体片段”)是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合人PD-1或其表位的能力。
如本文所用，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合人PD-1的分离的抗体基本上不含特异性结合人PD-1以外的抗原的抗体)。
术语“特异性结合”等是指抗体或其抗原结合片段在生理条件下与抗原形成相对稳定的复合物。特异性结合可以通过至少约1×10-8M或更大的解离常数来表征。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域公知的，包括例如平衡透析、表面等离子共振等。然而，特异性结合人PD-1的分离的抗体可以与其他抗原(如来自其他物种的PD-1分子)(直向同源物)具有交叉反应性。在本发明的上下文中，结合人PD-1以及一种或多种其他抗原的多特异性(例如，双特异性)抗体被认为“特异性结合”人PD-1。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质或化学物质。
可以包括在本发明的药物制剂中的示例性抗人PD-1抗体在专利申请公开US20150203579和WO2015112800中提出，其公开内容通过引用整体并入。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：3的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：4的HCDR2和SEQ ID NO：5的HCDR3。在某些实施方案中，抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1的HCVR。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：6的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ IDNO：8的LCDR3。在某些实施方案中，抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：2的LCVR。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％、98％或99％序列同一性的HCVR。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO：2具有90％、95％、98％或99％序列同一性的LCVR。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含HCVR，其包含具有不超过5个氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含LCVR，其包含具有不超过2个氨基酸取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
可以通过本领域已知的任何方法(例如，GAP、BESTFIT和BLAST)测量序列同一性。
本发明还包括含有抗PD-1抗体的制剂，其中抗PD-1抗体包含本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体，具有一个或多个保守氨基酸取代。例如，本发明包括含有抗PD-1抗体的制剂，所述抗PD-1抗体具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗PD1抗体包含选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型的Fc区。
本文实施例中使用的非限制性示例性抗体称为“mAb1”。该抗体在US 20150203579中也称为H2M7798N或H4H7798N，并且也称为“REGN2810”或“cemiplimab”。mAb1(H4H7798N)包含具有SEQ ID NO：1/2的HCVR/LCVR氨基酸序列对，以及由SEQ ID NO：3-4-5/SEQ ID NO：6-7-8表示的HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域。
根据本发明的某些实施方案，抗人PD-1或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：9的重链和SEQ ID NO：10的轻链。
本领域众所周知，氨基酸的末端切割可发生在抗体的产生过程中(参见，例如，Wang等人2007,J.Pharma.Sci.96:1-26)。因此，在某些实施方案中，抗PD-1抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。SEQ ID NO：11包含重链氨基酸序列，其中C末端赖氨酸相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列缺失。在某些实施方案中，本发明的制剂含有约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或更多的抗PD-1抗体，其中不存在C-末端赖氨酸。
本发明的药物制剂中包含的抗体或其抗原结合片段的量可以根据所需的制剂特定性质以及预期使用制剂的具体情况和目的而变化。在某些实施方案中，药物制剂是液体制剂，其可含有5±0.75mg/mL至250±37.5mg/mL抗体；10±1.5mg/mL至240±36mg/mL抗体；20±3.0mg/mL至230±34.5mg/mL抗体；25±3.75mg/mL至240±36mg/mL抗体；50±7.5mg/mL至230±34.5mg/mL抗体；60±9mg/mL至240±36mg/mL抗体；70±10.5mg/mL至230±34.5mg/mL抗体；80±12mg/mL至220±33mg/mL抗体；90±13.5mg/mL至210±31.5mg/mL抗体；100±15mg/mL至200±30mg/mL抗体；110±16.5mg/mL至190±28.5mg/mL抗体；120±18mg/mL至180±27mg/mL抗体；130±19.5mg/mL至170±25.5mg/mL抗体；140±21mg/mL至160±24mg/mL抗体；150±22.5mg/mL抗体；或175±26.25mg/mL。例如，本发明的制剂可包含约5mg/mL；约10mg/mL；约15mg/mL；约20mg/mL；约25mg/mL；约30mg/mL；约35mg/mL；约40mg/mL；约45mg/mL；约50mg/mL；约55mg/mL；约60mg/mL；约65mg/mL；约70mg/mL；约75mg/mL；约80mg/mL；约85mg/mL；约90mg/mL；约95mg/mL；约100mg/mL；约105mg/mL；约110mg/mL；约115mg/mL；约120mg/mL；约125mg/mL；约130mg/mL；约135mg/mL；约140mg/mL；约145mg/mL；约150mg/mL；约155mg/mL；约160mg/mL；约165mg/mL；约170mg/mL；约175mg/mL；约180mg/mL；约185mg/mL；约190mg/mL；约195mg/mL；约200mg/mL；约205mg/mL；约210mg/mL；约215mg/mL；约220mg/mL；约225mg/mL；约230mg/mL；约235mg/mL；约240mg/mL；约245mg/mL；或约250mg/mL特异性结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段。
赋形剂和pH值
本发明的药物制剂包含一种或多种赋形剂。如本文所用，术语“赋形剂”是指添加到制剂中以提供所需稠度、粘度或稳定效果的任何非治疗剂。
在某些实施方案中，本发明的药物制剂包含至少一种有机助溶剂，其类型和量能在粗率处理或搅拌条件下(例如涡旋)稳定人PD-1抗体。在一些实施方案中，“稳定”是指防止在粗率处理过程中形成超过抗体总量的3％的聚集抗体(以摩尔计)。在一些实施方案中，粗率处理是涡旋含有抗体和有机助溶剂的溶液约60分钟或约120分钟。
在某些实施方案中，有机助溶剂是非离子表面活性剂，如烷基聚(环氧乙烷)。可包括在本发明制剂中的特定非离子表面活性剂包括，例如，聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81和聚山梨醇酯85；泊洛沙姆如泊洛沙姆181、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407；或聚乙二醇(PEG)。聚山梨醇酯20也称为TWEEN 20，脱水山梨糖醇单月桂酸酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯。泊洛沙姆188也称为PLURONIC F68。
本发明的药物制剂中包含的非离子表面活性剂的量可以根据制剂所需的特定性质以及意图使用制剂的具体情况和目的而变化。在某些实施方案中，制剂可含有0.01％±0.005％至0.5％±0.25％表面活性剂。例如，本发明的制剂可含有约0.005％；约0.01％；约0.02％；约0.03％；约0.04％；约0.05％；约0.06％；约0.07％；约0.08％；约0.09％；约0.1％；约0.11％；约0.12％；约0.13％；约0.14％；约0.15％；约0.16％；约0.17％；约0.18％；约0.19％；约0.20％；约0.21％；约0.22％；约0.23％；约0.24％；约0.25％；约0.26％；约0.27％；约0.28％；约0.29％；约0.30％；约0.35％；约0.40％；约0.45％；约0.46％；约0.47％；约0.48％；约0.49％；约0.50％；约0.55％；或约0.575％聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
本发明的药物制剂还可以包含一种或多种稳定剂，其类型和量在热应激条件下稳定人PD-1抗体。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和热稳定剂的溶液在约45℃保持长达约28天时，大于约91％的抗体维持天然构象。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和热稳定剂的溶液在约45℃保持长达约28天时，其中少于约6％的抗体聚集。如本文所用，“天然”是指通过尺寸排阻的抗体的主要形式，其通常是抗体的完整单体。术语“天然”还指抗体的非聚集和非降解形式。
在某些实施方案中，热稳定剂是糖，如蔗糖，制剂中包含的糖的量可以根据使用制剂的具体情况和预期目的而变化。在某些实施方案中，制剂可含有约1％至约15％的糖；约2％至约14％的糖；约3％至约13％的糖；约4％至约12％的糖；约5％至约12％的糖；约6％至约11％的糖；约7％至约10％的糖；约8％至约11％的糖；或约9％至约11％的糖。例如，本发明的药物制剂可包含4％±0.8％；5％±1％；6％±1.2％；7％±1.4％；8％±1.6％；9％±1.8％；10％±2％；11％±2.2％；12％±2.4％；13％±2.6％；或约14％±2.8％的糖(例如蔗糖)。
本发明的药物制剂还可包含缓冲剂或缓冲剂系统，其用于维持稳定的pH并有助于稳定人PD-1抗体。如本文所用的术语“缓冲剂”表示药学上可接受的缓冲剂，其维持溶液稳定的pH或抵抗溶液pH的变化。在优选的实施方案中，缓冲剂包含组氨酸。在本公开的上下文中，“组氨酸缓冲剂”或“包含组氨酸的缓冲液”是包含氨基酸组氨酸的缓冲剂。组氨酸缓冲剂的实例包括组氨酸氯化物、组氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐和组氨酸硫酸盐。在一个优选的实施方案中，通过以限定的量和比例溶解L-组氨酸和L-组氨酸盐酸盐(例如作为一水合物)来制备组氨酸缓冲液。在一个实施方案中，通过用稀盐酸滴定L-组氨酸(游离碱，固体)来制备组氨酸缓冲液。在整个本公开中，术语“组氨酸”可与“组氨酸缓冲剂”互换使用。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约45℃保持长达约28天时，小于4.5％±0.5％的抗体聚集。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约37℃保持长达约28天时，小于3％±0.5％或小于2.5％±0.5％的抗体聚集。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约45℃保持长达约28天时，其中至少93％±0.5％或至少94％±0.5％的抗体处于其天然构象，如通过尺寸排阻色谱法测定的。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约37℃保持长达约28天时，其中至少94％±0.5％或至少95％±0.5％的抗体处于其天然构象，如通过尺寸排阻色谱法测定的。“天然”或“天然构象”是指未聚集或降解的抗体级分。这通常通过测量抗体实体的相对大小的测定法来确定，如尺寸排阻色谱测定法。非聚集和非降解的抗体以等同于天然抗体的级分洗脱，并且通常是主要的洗脱级分。聚集的抗体以比天然抗体更大的尺寸的级分洗脱。降解的抗体以比天然抗体小的尺寸的级分洗脱。
在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约45℃保持长达约28天时，其中至少35％±0.5％的抗体处于其主电荷形式，如通过阳离子交换色谱法所测定的。在一些实施方案中，“稳定”是指当含有抗体和缓冲剂的溶液在约37℃保持长达约28天时，其中至少46％±0.5％或至少39％±0.5％的抗体处于其主电荷形式，如通过阳离子交换色谱法所测定的。“主电荷”或“主电荷形式”是指从离子交换树脂洗脱在主峰中的抗体级分，通常主峰一侧为更“碱性”的峰，其另一侧为更“酸性”的峰。
本发明的药物制剂可具有约5.2至约6.4的pH。例如，本发明的制剂可具有约5.5；约5.6；约5.7；约5.8；约5.9；约6.0；约6.1；约6.2；约6.3；约6.4；或约6.5的pH。在一些实施方案中，pH为6.0±0.4；6.0±0.3；6.0±0.2；6.0±0.1；约6.0；或6.0。
在一些实施方案中，缓冲剂或缓冲剂系统包含至少一种缓冲剂，其具有的缓冲范围完全或部分地与pH5.5-7.4的范围重叠。在某些实施方案中，缓冲剂包含组氨酸缓冲剂。在某些实施方案中，组氨酸缓冲剂存在的浓度为5mM±1mM至15mM±3mM；6mM±1.2mM至14mM±2.8mM；7mM±1.4mM至13mM±2.6mM；8mM±1.6mM至12mM±2.4mM；9mΜ±1.8mM至11mM±2.2mM；10mM±2mM；或约10mM。在某些实施方案中，缓冲系统包含10m±2mM的组氨酸，pH6.0±0.3。在优选的实施方案中，组氨酸缓冲剂包含L-组氨酸和L-组氨酸单盐酸盐一水合物。在一个实施方案中，组氨酸缓冲剂包含浓度为4.8mM±0.96mM的L-组氨酸。在一个实施方案中，组氨酸缓冲剂包含浓度为5.2mM±1.04mM的L-组氨酸单盐酸盐一水合物。在一个实施方案中，组氨酸缓冲剂包含浓度为4.8mM±0.96mM的L-组氨酸和浓度为5.2mM±1.04mM的L-组氨酸单盐酸盐一水合物。
本发明的药物制剂还可包含一种或多种赋形剂，其用于维持降低的粘度或降低含有高浓度抗PD-1抗体药物物质(例如，通常≥150mg/ml抗体)的制剂的粘度。在某些实施方案中，粘度调节剂是氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸是脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的药物制剂含有脯氨酸，优选L-脯氨酸，浓度为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。在整个本公开中，术语“脯氨酸”与“L-脯氨酸”可互换使用。在一些实施方案中，制剂包含脯氨酸的量足以使液体制剂的粘度维持在小于20±3cPoise、小于15±2.25cPoise或小于11±1.65cPoise。在一些实施方案中，制剂包含脯氨酸的量足以使粘度维持在等于或低于15±2.25cPoise。在某些实施方案中，制剂可含有约1％至约5％的脯氨酸；约2％至约4％的脯氨酸；或约3％的脯氨酸。例如，本发明的药物制剂可包含1％±0.2％；1.5％±0.3％；2％±0.4％；2.5％±0.5％；3％±0.6％；3.5％±0.7％；4％±0.8％；4.5％±0.9％；或约5％±1％的脯氨酸。
在抗体纯化过程中，可能需要或必须将一种缓冲剂交换成另一种缓冲剂以获得合适的赋形剂浓度、抗体浓度、pH等。缓冲剂交换可以通过例如超滤/渗滤(UF/DF)完成，例如使用半渗透切向流过滤膜。然而，使用这些技术有可能引起Gibbs-Donnan效应[Bolton等人,2011,Biotechnol.Prog.27(1):140-152]。在蛋白质浓缩期间膜的产物侧上正电荷的增强通过阳离子优先移动到膜的相对侧而在电学上抵消。这种现象的潜在后果是某些成分(例如，组氨酸、L-脯氨酸等)的最终浓度可能低于这些成分的预期目标浓度，这是由于在UF/DF步骤中带正电荷的渗滤缓冲剂赋形剂对带正电的抗体蛋白的静电排斥。因此，本发明包括这样的制剂，其中例如组氨酸和/或L-脯氨酸的浓度由于Gibbs-Donnan效应而不同于本文所述的量或范围。
体积排除描述了高浓度样品的行为，其中溶液总体积的很大一部分被溶质占据，尤其是大分子如蛋白质，从该空间除去溶剂。然后，这减少了其他溶质待溶于其中的可用溶剂的总体积，这可能导致跨超滤膜的不等同分配。因此，本发明包括这样的制剂，其中例如组氨酸和/或L-脯氨酸的浓度可以由于体积排除效应而不同于本文所述的量或范围。
在制备本发明制剂的过程中，可能发生制剂组成的变化。这些变化可包括活性成分的浓度、赋形剂的浓度和/或制剂的pH。由于这些参数的任何变化都可能潜在地影响药物产品的稳定性或效力，因此进行了验证的可接受范围(PAR)的研究，以评估组合物在限定范围内的变化是否会影响抗体的稳定性或效力。因此，本发明包括含有抗PD-1抗体的制剂，其在高达50％的赋形剂浓度变化中是稳定的并且保持效力。例如，本文包括抗PD-1抗体制剂，其中所述制剂的稳定性和效力不受抗体、蔗糖、组氨酸缓冲剂和/或聚山梨醇酯浓度中±10％、±20％、±30％、±40％或±50％变化的影响。
药物制剂的稳定性和粘度
本发明的药物制剂通常表现出高水平的稳定性。如本文所用，关于药物制剂的术语“稳定”是指药物制剂中的抗体在限定条件下储存后保持可接受程度的化学结构或生物学功能。即使制剂中包含的抗体在限定时间内储存后，不能维持其100％的化学结构或生物学功能，该制剂也可以是稳定的。在某些情况下，在限定时间内储存后维持约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的抗体结构或功能，可视为“稳定”。
尤其可以通过测定在限定温度下储存限定时间后制剂中保留的天然抗体的百分比来测量稳定性。天然抗体的百分比尤其可以通过尺寸排阻色谱法(例如，尺寸排阻超高效液相色谱法[SE-UPLC])测定，其中天然意指非聚集和非降解的。如本文所用的短语“可接受的稳定性”是指在给定温度下储存限定时间后，可以在制剂中检测到至少90％天然形式的抗体。在某些实施方案中，在限定温度下储存限定时间后，可以在制剂中检测到至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％天然形式的抗体。在其后测量稳定性的限定时间可以是在至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更长时间。在评估稳定性时药物制剂可以在限定温度下储存，所述限定温度可以是约-80℃至约45℃的任何温度，例如，储存在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃或约45℃。例如，如果在5℃下储存6个月后，SE-UPLC检测到大于约95％、96％、97％或98％的天然抗体，则可以认为药物制剂是稳定的。如果在25℃下储存6个月后，通过SE-UPLC检测到大于约95％、96％、97％或98％的天然抗体，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在45℃下储存28天后，通过SE-UPLC检测到大于约89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％的天然抗体，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在-20℃下储存12个月后，通过SE-UPLC检测到大于约96％、97％或98％的天然抗体，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在-30℃下储存12个月后，通过SE-UPLC检测到大于约96％、97％或98％的天然抗体，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在-80℃下储存12个月后，通过SE-UPLC检测到大于约96％、97％或98％的天然抗体，则也可以认为药物制剂是稳定的。
尤其可以通过在限定温度下储存限定时间后，测定在制剂中形成聚集体的抗体的百分比来测量稳定性，其中稳定性与形成聚集体的百分比成反比。尤其可以通过尺寸排阻色谱法(例如，尺寸排阻超高效液相色谱法[SE-UPLC])来测定聚集抗体的百分比。如本文所用的短语“可接受的稳定程度”是指在给定的温度下储存限定的时间后，在制剂中检测到至多5％的抗体呈聚集形式(也称为高分子量-HMW-形式)。在某些实施方案中，可接受的稳定程度是指在给定的温度下储存限定的时间后，在制剂中检测到至多约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体呈聚集形式。在限定时间后测量稳定性，其可以是在至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更长时间后测量。在评估稳定性时药物制剂可以储存在约-80℃至约45℃的任何温度下，例如，储存在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃或约45℃下。例如，如果在5℃下储存12个月后，检测到少于约2％、1％、0.5％或0.1％的抗体为聚集形式，则可以认为药物制剂是稳定的。如果在25℃下储存三个月后，检测到少于约4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体为聚集形式，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在45℃下储存28天后，检测到小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的抗体为聚集形式，则也可以认为药物制剂是稳定的。如果在-20℃、-30℃或-80℃下储存三个月后，检测到小于约3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体为聚集形式，则也可以认为药物制剂是稳定的。
尤其可以通过测定在离子交换期间迁移在比抗体的主要级分(“主电荷形式”)更酸性的级分(“酸性形式”)中的抗体的百分比来测量稳定性，其中稳定性与酸性形式的抗体级分成反比。虽然不希望受理论束缚，但抗体的脱酰胺作用可能导致抗体变得更加带负电荷，因此相对于非脱酰胺的抗体更具酸性(参见例如，Robinson,N.,Protein Deamidation,PNAS,2002年4月16日,99(8):5283-5288)。“酸化”抗体的百分比尤其可以通过离子交换色谱法(例如，阳离子交换超高效液相色谱法[CEX-UPLC])测定。如本文所用的短语“可接受的稳定程度”是指在限定的温度下储存限定的时间后，在制剂中检测到至多45％的抗体为更酸性形式。在某些实施方案中，可接受的稳定程度是指在给定的温度下储存限定的时间后，在制剂中检测到至多约40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体为酸性形式。在一个实施方案中，可接受的稳定程度是指在给定的温度下储存限定的时间后，在制剂中检测到少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体为酸性形式。在限定的时间后测量稳定性，其可以是在至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更长时间后测量。在评估稳定性时可以在约-80℃至约45℃的任何温度下储存药物制剂，例如，在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃或约45℃下储存。例如，如果在-80℃、-30℃或-20℃下储存三个月后，少于约30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体是更酸性的形式，则可认为药物制剂是稳定的。如果在5℃下储存六个月后，少于约32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体是更酸性的形式，则也可认为药物制剂是稳定的。如果在25℃下储存六个月后，少于约43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体是更酸性的形式，则也可认为药物制剂是稳定的。如果在45℃下储存28天后，检测到少于约49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体是更酸性的形式，则也可认为药物制剂是稳定的。
可以使用其他方法来评估本发明制剂的稳定性，例如使用差示扫描量热法(DSC)以确定热稳定性，使用受控的搅拌以确定机械稳定性，以及使用在约350nm或约405nm处的吸光度以确定溶液浊度。例如，如果在约5℃至约25℃下储存6个月或更长时间后，与时间为0时的制剂OD405相比，制剂的OD405变化小于约0.05(例如，0.04、0.03、0.02、0.01或更小)，则可以认为本发明的制剂是稳定的。
也可以使用测量抗体对其靶标的生物活性或结合亲和力来评估稳定性。例如，如果在例如5℃、25℃、45℃等下储存限定的时间(例如，1至12个月)后，制剂中包含的抗PD-1抗体与PD-1结合的亲和力为所述储存前抗体结合亲和力的至少90％、95％或更高，则可认为本发明的制剂是稳定的。结合亲和力可以通过例如ELISA或表面等离子体共振来测定。生物活性可以通过PD-1活性测定法来测定，例如使表达PD-1的细胞与包含抗PD-1抗体的制剂接触。例如可以通过FACS分析直接测量抗体与这种细胞的结合。或者，可以在抗体存在下测量PD-1系统的下游活性，并与不存在抗体时PD-1系统的活性进行比较。在一些实施方案中，PD-1对于细胞可以是内源的。在其他实施方案中，PD-1可以在细胞中异位表达。
在下面列出的实施例中证明了用于评估制剂中抗体稳定性的其他方法。
在某些实施方案中，本发明的液体药物制剂可显示低至中等水平的粘度。本文所用的“粘度”可以是“运动学上的粘度”或“绝对粘度”。“运动学上的粘度”是在重力影响下流体流动阻力的量度。当相同体积的两种流体置于相同的毛细管粘度计中并允许通过重力流动时，粘性流体比粘性较低流体需要更长的时间流过毛细管。例如，如果一种流体需要200秒完成其流动而另一种流体需要400秒，则第二种流体的粘度在运动学上的粘度标度上是第一种的两倍。“绝对粘度”有时称为动态粘度或简单粘度，其是运动学上的粘度和流体密度的乘积(绝对粘度＝运动学上的粘度×密度)。运动学上的粘度的维度为L2/T，其中L是长度，T是时间。通常，运动学上的粘度用厘沲(cSt)表示。运动学上的粘度的SI单位是mm2/s，即1cSt。绝对粘度用单位厘泊(cP)表示。绝对粘度的SI单位是milliPascal-秒(mPa-s)，其中1cP＝1mPa-s。
如本文所用，关于本发明的流体制剂，低水平粘度将表现出小于约20cPoise(cP)的绝对粘度。例如，如果使用标准粘度测量技术测量时，制剂表现出约20cP、约19cP、约18cP、约15cP、约12cP、约10cP、约9cP、约8cP或更低的绝对粘度，则认为本发明的流体制剂具有“低粘度”。如本文所用，关于本发明的流体制剂，中等水平的粘度将表现出约35cP至约20cP之间的绝对粘度。例如，如果使用标准粘度测量技术测量时，制剂表现出约34cP、约33cP、约32cP、约31cP、约30cP、约29cP、约28cP、约27cP、约26cP、约25cP、约24cP、约23cP、约22cP、约21cP、约20cP、约19cP、18cP、约17cP、约16cP、或约15.1cP的绝对粘度，则认为本发明的流体制剂具有“中等粘度”。
如以下实施例中所示，本发明人令人惊讶地发现通过将抗体与约1％至约5％的脯氨酸和约5％的蔗糖配制，可以获得包含高浓度抗人PD-1抗体(例如，从约50mg/ml高至250mg/mL)的低粘度液体制剂。这些制剂在处理过程中对应激是稳定的，并且在45℃至-80℃(本文所示)的温度下储存是稳定的，并具有低粘度(粘度范围为7至15cP)。
示例性制剂
根据本发明的一个方面，药物制剂是稳定的、低粘度的、通常是生理学上等渗的液体制剂，其包含：(i)浓度高达250mg/mL±45mg/mL的特异性结合人PD-1的人抗体(例如，H4H7798N)；(ii)组氨酸缓冲系统，其在约pH6.0±0.3时提供足够的缓冲；(iii)有机助溶剂，其保护抗体的结构完整性；(iv)作为糖的热稳定剂；(iv)作为氨基酸的粘度调节剂，其用于在方便皮下施用的体积中维持易于注射的粘度。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度高达200mg/ml±30mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)0.2％w/v±0.1％w/v的聚山梨醇酯80；(iv)5％±1％w/v的蔗糖；和(v)1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度为175mg/ml±26.25mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)0.2％w/v±0.1％w/v的聚山梨醇酯80；(iv)5％±1％w/v的蔗糖；和(v)1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度为150mg/ml±22.5mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)0.2％w/v±0.1％w/v的聚山梨醇酯80；(iv)5％±1％w/v的蔗糖；和(v)1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度为100mg/ml±15mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)5％w/v±1％w/v的蔗糖；(iv)0.2％w/v±0.1％w/v的聚山梨醇酯80；和(v)1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度为50mg/ml±7.5mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)5％w/v±1％w/v的蔗糖；(iv)0.2％w/v±0.1％的聚山梨醇酯80；和1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
根据一个实施方案，稳定的低粘度药物制剂包含：(i)浓度为25mg/ml±3.75mg/mL的特异性结合人PD-1的人IgG4抗体，其包含SEQ ID NO：3的HCDR1、SEQ ID NO：4的HCDR2、SEQ ID NO：5的HCDR3、SEQ ID NO：6的LCDR1、SEQ ID NO：7的LCDR2和SEQ ID NO：8的LCDR3；(ii)10mM±2mM的组氨酸缓冲剂，其在pH6.0±0.3下缓冲；(iii)5％w/v±1％w/v的蔗糖；(iv)0.2％w/v±0.1％的聚山梨醇酯80；和1.5％(w/v)±0.3％的L-脯氨酸。
本发明包括的药物制剂的其他非限制性实例在本文其他地方列出，包括下面给出的工作实施例。
容器和施用方法
本发明的药物制剂可以包含在适于储存药物和其他治疗组合物的任何容器中。例如，药物制剂可以包含在具有限定体积的密封和灭菌的塑料或玻璃容器中，如小瓶、安瓿、注射器、药筒或瓶子。不同类型的小瓶可用于包含本发明的制剂，包括例如透明和不透明(例如琥珀色)玻璃或塑料小瓶。同样，任何类型的注射器都可用于包含或施用本发明的药物制剂。
本发明的药物制剂可以包含在“常规钨”注射器或“低钨”注射器中。如本领域普通技术人员所理解的，制造玻璃注射器的过程通常包括使用热钨棒，其用于刺穿玻璃，从而形成孔，液体可从该孔中抽出并从注射器中排出。该过程导致在注射器的内表面上沉积痕量的钨。随后的洗涤和其他处理步骤可用于减少注射器中钨的量。如本文所用，术语“常规钨”是指注射器含有大于或等于十亿分之500(500ppb)的钨。术语“低钨”是指注射器含有少于500ppb的钨。例如，根据本发明的低钨注射器可包含少于约490、480、470、460、450、440、430、420、410、390、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或更少ppb的钨。
可以涂覆注射器中使用的橡胶塞和用于封闭小瓶开口的橡胶塞，以防止注射器或小瓶的药物内容物被污染，或者保持其稳定性。因此，根据某些实施方案，本发明的药物制剂可以包含在包含涂覆塞子的注射器内，或者包含在用涂覆的橡胶塞密封的小瓶内。例如，塞子或塞可涂覆有碳氟化合物膜。适用于含有本发明药物制剂的小瓶和注射器的涂覆塞子或塞的实例在例如，美国专利号4,997,423；5,908,686；6,286,699；6,645,635；和7,226,554中提及了，其内容通过引用整体并入本文。可用于本发明上下文的特定示例性涂覆的橡胶塞和塞子可以从West Pharmaceutical Services,Inc.(Lionville,PA)商购获得，商品名为
根据本发明的某些实施方案，药物制剂可以包含在低钨注射器中，所述低钨注射器包括涂覆碳氟化合物的塞子。
药物制剂可以通过肠胃外途径施用于患者，如注射(例如，皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内等)或经皮、粘膜、鼻、肺或口服施用。许多可重复使用的笔或自动注射器递送装置可用于皮下递送本发明的药物制剂。实例包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI,II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPENJUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,FranklinLakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)。应用于皮下递送本发明药物组合物的一次性笔或自动注射器递送装置的实例包括但不限于SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)、和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs,AbbottPark,IL)。
本文还考虑了使用微量输注器来递送本发明的药物制剂。如本文所用，术语“微量输注器”是指设计用于在延长的时间期间(例如，约10、15、20、25、30分钟或更长时间)内缓慢施用大体积(例如，多达约2.5mL或更多)治疗制剂的皮下递送装置。参见，例如，U.S.6,629,949；US 6,659,982；和Meehan等人,J.Controlled Release 46:107-116(1996)。微量输注器特别适用于递送高浓度(例如，约100、125、150、175、200或更高mg/mL)或粘性溶液中含有的大剂量治疗性蛋白质。
在某些实施方案中，任何前述方面的稳定液体药物制剂包含在无菌玻璃小瓶中并作为IV输注施用。
在一个实施方案中，容器是20mL 1型透明硼硅酸盐玻璃小瓶。在某些实施方案中，容器是2mL、5mL或10mL 1型硼硅酸盐玻璃小瓶，其具有氯化丁基橡胶塞，所述氯化丁基橡胶塞具有
在一个实施方案中，静脉内施用包含约25mg/mL或50mg/mL mAb1的本发明的液体药物制剂，并且可以将其包含在玻璃小瓶中。
在某些实施方案中，本发明提供了一种自动注射器，其包含本文所述的任何液体制剂。在一些实施方案中，本发明提供了一种自动注射器，其包含稳定的液体制剂，所述液体制剂包含约50mg/mL、约100mg/mL、约150mg/mL或约175mg/mL mAb1，约10mM的组氨酸，约pH 6.0，约5％蔗糖，约1.5％脯氨酸和约0.2％聚山梨醇酯80。
在某些实施方案中，本发明提供了预装注射器，其包含本文所述的任何液体制剂。在一些实施方案中，本发明提供了一种预装注射器，其包含稳定的液体制剂，所述液体制剂包含约50mg/mL、约100mg/mL、约150mg/mL或约175mg/mL的mAb1，约10mM的组氨酸，约pH0.6，约5％蔗糖，约1.5％脯氨酸和约0.2％聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，注射器是1mL或2.25mL的长玻璃注射器，其配有27号薄壁针、涂覆碳氟化合物的橡胶塞和橡胶针护罩。
在一个实施方案中，含有约175mg/mL±26.25mg/mL mAb1的液体药物制剂在预装注射器中以约高达2mL的体积施用。在某些实施方案中，注射器是1mL或2.25mL的长玻璃注射器，其配有27号薄壁针、涂覆碳氟化合物的橡胶塞和橡胶针护罩。在一个实施方案中，注射器是OMPI 1mL的长玻璃注射器，其配有27号针、FM27橡胶针护罩和涂覆
在一个实施方案中，含有约150mg/mL±22.5mg/mL抗PD-1抗体的液体药物制剂在预装注射器中以约高达2mL的体积施用。在一个实施方案中，注射器是1mL或2.25mL的长玻璃注射器，其配有27号薄壁针、涂覆碳氟化合物的橡胶塞和橡胶针护罩。在一个实施方案中，注射器是OMPI 1mL的长玻璃注射器，其配有27号针、FM27橡胶针护罩和涂覆
药物制剂的治疗用途
本发明的药物制剂尤其可用于治疗、预防或改善与PD-1活性相关的任何疾病或病症，包括由PD-1介导的疾病或病症。可通过施用本发明的药物制剂治疗或预防的示例性非限制性疾病和病症包括病毒感染、自身免疫性疾病和各种癌症，例如脑癌、肺癌、***癌、结肠直肠癌、头颈癌、皮肤癌、各种血癌和子宫内膜癌。
实施例
提供以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并不旨在限制本发明人认为的本发明的范围。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是摩尔份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
实施例1：抗PD-1抗体制剂的开发
配置制剂的目标是开发具有以下属性的制剂：
·具有抗PD-1抗体的液体制剂，所述抗PD-1抗体的浓度足以通过静脉内输注递送250mg或更多的剂量；
·近等渗制剂，用常用稀释剂稀释后其是稳定的，例如0.9％氯化钠注射液或5％右旋糖注射液，用于静脉输注；
·与作为包装的1型透明玻璃小瓶和标准血清塞子(serum stopper)相容且在其中是稳定的制剂；和
·无菌药物产品(DP)溶液，其支持长期稳定性；
ο最大限度地减少受到处理和热应激时抗体高分子量(HMW)种类的制剂；
ο最大限度地减少受到热应激时抗体带电荷物质相对分布的变化的制剂；和
ο受到处理和热应激时保持生物活性的制剂。
在整个制剂开发过程中，采用三种主要蛋白应激条件(代表抗体药物产品在处理、制造、运输、储存和贴标签期间的极端处理条件，超出此条件则抗体药物产品不会经受)来开发和优化抗体制剂并评估潜在现实世界应激对药物产品稳定性的影响。这些应激条件包括：
·在室温下搅拌(涡旋)蛋白质溶液。在玻璃小瓶中的涡旋超过了在处理和制造蛋白质期间发生的搅拌。
·相对建议的DP储存条件(2℃-8℃)，在升高的温度(37℃、40℃或45℃)下孵育蛋白质溶液。
·使蛋白质经历多次冻融循环。由于蛋白质在DP的制造过程中将经历至少一次冻融循环，因此多次冻融循环模拟并超过蛋白质预期经历的实际应激。
初始制剂开发工作具有四个主要目标：
1.缓冲剂和pH的选择：缓冲剂和pH的选择对蛋白质的稳定性具有很大影响，因此决定最佳缓冲剂种类和pH是一个重要的过程。在表明选择抗体的最佳缓冲剂和pH的基本原理的部分中给出这些研究。
2.表面活性剂或有机助溶剂的选择：通常需要表面活性剂或有机助溶剂，如聚山梨醇酯，以防止在搅拌时蛋白质沉淀或聚集。当处理、过滤、混合、制造、运输和施用可溶性蛋白质时，其可经受搅拌。简单缓冲溶液中的抗体药物物质可能在过度搅拌下变得明显混浊。因此，使蛋白质对处理和搅拌稳定是重要的。
3.稳定/张力(tonicifying)赋形剂的鉴定/选择：检查添加糖、盐和氨基酸改善抗体对热应激的稳定性和增加DP货架期的能力。包括这些热稳定剂的基本原理以及鉴定最终制剂中最佳浓度的研究在本文中给出。
4.抗体浓度的选择：检查抗体浓度对具有所选赋形剂的药物产品稳定性的影响。
使用5-50mg/mL的抗PD-1抗体进行初始制剂开发活动，包括筛选抗PD-1抗体的液体制剂中的有机助溶剂、热稳定剂和缓冲剂以鉴定这样的赋形剂，所述赋形剂与蛋白质相容并增强其稳定性，同时保持用于静脉内和皮下注射的接近生理的渗透压和低粘度。还检查了缓冲条件以确定最大蛋白质稳定性的最佳pH(在本文实施例4、6和7中描述)。
该初始制剂开发工作的结果用于开发适合于1期临床研究的初始制剂。1期制剂还为优化后期临床和商业制剂提供了参考。
利用从初始制剂开发中获得的知识，后期制剂开发活动包括优化pH、表面活性剂浓度和稳定剂以鉴定在低和高蛋白质浓度(高达175mg/mL mAb1)下增强蛋白质稳定性的赋形剂(在实施例5、8、9和10中描述)。
在整个制剂开发过程中，评估制剂的应激和储存稳定性。用于评估制剂开发研究中的稳定性的方法描述于本文的实施例3中。实施例11和12描述了制剂的储存和应激稳定性。
实施例13描述了当赋形剂在特定范围内变化时制剂的稳定性。
由这些研究产生的结果用于开发适合临床使用的稳定的液体制剂，其用于静脉内(IV)或皮下施用(SC)。实施例14描述了用于本文制剂的容器。实施例15、16和17描述了制剂在玻璃小瓶、预装注射器和静脉内递送装置中的相容性和稳定性。这些制剂符合制剂开发所限定的目标：
·开发的制剂适用于开发剂量；
·与生理条件等渗的张力；
ο50mg/mL制剂的重量摩尔渗透压浓度为约318mOsm/kg；
·无菌DP溶液，其支持液态中的长期稳定性；
ο在2-8℃长期储存时，抗体HMW种类的形成最少；
ο在2-8℃长期储存时，抗体带电荷种类的相对分布中极小变化至没有变化；和
ο在加速储存和应激条件下，以及在5℃下储存12个月后，在抗体DP中观察到不可肉眼可见颗粒的形成最少。
根据本文的描述，制剂的其他属性将是显而易见的。
抗PD-1抗体：抗PD-1抗体描述于US20150203579中，其以其整体并入本文。以下实施例中使用的示例性抗体是全人抗PD-1抗体H4H7798N(如US20150203579中所公开，称为“REGN2810”或“cemiplimab”)，其包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链和含有SEQ IDNO：10的氨基酸序列的轻链；包含SEQ ID NO：1/2的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和包含SEQ IDNO：3-8的重链和轻链CDR序列；并且在本文中称为“mAb1”。
实施例2：示例性制剂
在某些实施方案中，将mAb1配制成含有5mg/ml±0.75mg/ml至250mg/ml±45.0mg/ml mAb1、10mM±2mM组氨酸缓冲剂、0.2％±0.1％w/v聚山梨醇酯、1％±0.2％至10％±2％w/v蔗糖、和1％±0.02％至5％±1％w/v脯氨酸的水性经缓冲的制剂，pH6.0±0.3。
示例性制剂包括：
·稳定的低粘度药物制剂，其包含：25mg/ml±3.75mg/mL mAb1、10±2mM组氨酸缓冲剂、0.2％±0.1％w/v聚山梨醇酯80、5％±1％w/v蔗糖、和1.5％±0.3％w/v L-脯氨酸，pH6.0±0.3。
·稳定的低粘度药物制剂，其包含：50mg/ml±7.5mg/mL mAb1、10±2mM组氨酸缓冲剂、0.2％±0.1％w/v聚山梨醇酯80、5％±1％w/v蔗糖、和1.5％±0.3％w/v L-脯氨酸，pH6.0±0.3。
·稳定的低粘度药物制剂，其包含：150mg/ml±23mg/mL mAb1、10±2mM组氨酸缓冲剂、0.2％±0.1％w/v聚山梨醇酯80、5％±1％w/v蔗糖、和1.5％±0.3％w/v L-脯氨酸，pH6.0±0.3。
·稳定的低粘度药物制剂，其包含：175mg/ml±27mg/mL mAb1、10±2mM组氨酸缓冲剂、0.2％±0.1％w/v聚山梨醇酯80、5％±1％w/v蔗糖、和1.5％±0.3％w/v L-脯氨酸，pH6.0±0.3。
实施例3：用于评估制剂稳定性的方法
应用以下测定法评估制剂稳定性：
·目视检查的颜色和外观
·pH
·通过在405nm处OD的增加或通过比浊法测量浊度
·通过微流成像(MFI)进行的颗粒物质分析(报告为按原样获得的颗粒计数)和不透光度(HIAC)
·通过反相超高效液相色谱法(RP-UPLC)测定的蛋白质浓度
·通过尺寸排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)、或通过还原和非还原微芯片毛细管电泳十二烷基硫酸钠(MCE-SDS)PAGE测定的纯度
·通过阳离子交换色谱-超高效液相色谱法(CEX-UPLC)或通过成像毛细管等电聚焦(iCIEF)进行的电荷变体分析
·通过生物测定法测定的效力：使用生物测定法测定每个样品的相对效力，并定义为(IC50参考样品/IC50样品)*100％。测量的储存稳定性样品的效力必须在测量的参考标准效力的50％至150％之内。
制剂的物理稳定性是指如颜色、外观、pH、浊度和蛋白质浓度的性质。可通过目视检查检测溶液中可见颗粒的存在。如果为透明至略微乳白色、基本上没有可见颗粒、无色至淡黄色，则溶液通过目视检查。此外，通过在405nm处OD测量的浊度也可用于检测溶液中的颗粒。在405nm处OD的增加可指示测试物品中存在颗粒、乳白色增加或颜色变化。MFI用于测量尺寸≥2μm的不可肉眼可见颗粒。通过RP-UPLC测定法测量mAb1的蛋白质浓度，并报告为相对于起始材料的蛋白质回收百分比。在RP-UPLC测定法中，mAb1作为单峰从RP柱洗脱。通过比较mAb1总峰面积与使用mAb1标准产生的校准曲线，确定蛋白质浓度。根据相对于起始蛋白质浓度测得的蛋白质浓度计算回收百分比。
化学稳定性是指形成蛋白质的共价修饰形式(例如共价聚集体、切割产物或电荷变体形式)和非共价修饰形式(例如非共价聚集体)。可以通过SE-UPLC和MCE-SDS方法从天然mAb1分离更高和更低分子量的降解产物。SE-UPLC和MCE-SDS方法中降解的mAb1的百分比由所有非天然峰的面积与所有mAb1峰的总面积的比率计算。使用CEX-UPLC和iCIEF解析mAb1的电荷变体形式。在CEX-UPLC方法中，保留时间早于主峰保留时间的峰标记为“酸性”峰；保留时间晚于主峰保留时间的峰标记为“碱性”峰。在iCIEF方法中，聚焦到低于主峰pI的pI的峰标记为“酸性”峰，而聚焦到高于主峰pI的pI的峰标记为“碱性”峰。
实施例4：不同缓冲剂和pH的影响
通过在不同pH范围的一系列缓冲系统中、在45℃下孵育5mg/mL mAb1 28天，在液体制剂中检查缓冲剂和pH对mAb1热稳定性的影响。研究了以下pH和缓冲系统：乙酸盐(pH4.5、5.0、5.5)，组氨酸(pH 5.5、6.0、6.5)和磷酸盐(pH 6.0、6.5、7.0)。根据SE-UPLC分析的结果，当在组氨酸缓冲剂中pH6.0至6.5配制mAb1时观察到最大的蛋白质稳定性(表1)。
表1：缓冲剂和pH对在45℃下孵育28天的5mg/mL mAb1的稳定性的影响
a报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有制剂中，起始材料(无孵育)含有≥97.2％的通过SE-UPLC测定的天然峰，并且含有≥49.0％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
CEX＝阳离子交换；DS＝药物；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；OD＝光密度；RP＝反相；SE＝尺寸排阻；UPLC＝超高效液相色谱法；
根据来自CEX-UPLC分析的结果，当mAb1配制在pH5.5至6.0的组氨酸缓冲剂或pH5.0至5.5的乙酸盐缓冲剂中时，观察到最大的蛋白质稳定性。这些分析还揭示了聚集(即HMW种类的形成)、片段化(即LMW种类的形成)和电荷变体形成是主要的降解途径。选择组氨酸缓冲剂作为制剂缓冲剂，是因为在HMW和LMW种类形成和电荷变体形成方面其提供了最佳的蛋白质稳定性的总体水平。选择pH 6.0用于制剂，是因为在该pH下，作为主要降解途径的HMW种类和电荷变体的形成被最小化。基于这些结果，选择pH6.0的10mM组氨酸缓冲剂用于mAb1制剂。
实施例5：组氨酸缓冲剂中的pH筛选
在高浓度液体制剂中检查了缓冲剂和pH对mAb1的热稳定性的影响。将150mg/mLmAb1在45℃下在pH范围为5.3、5.5、5.8、6.0和6.3的一系列组氨酸缓冲剂中培养28天，所述组氨酸缓冲剂包含或不包含热稳定剂。使用9％蔗糖，基于SE-UPLC分析的结果，当在pH5.8至6.3的组氨酸缓冲剂中配制mAb1时，观察到最大的蛋白质稳定性(图1)。基于来自CEX-UPLC分析的结果，当在pH 5.3和6.0的组氨酸缓冲剂中配制mAb1时，观察到最大的蛋白质稳定性(表2)。
表2：pH对在45℃下孵育28天的150mg/mL mAb1稳定性的影响
a报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有制剂中，起始材料(无孵育)含有≥94.0％的通过SE-UPLC测定的天然峰，并且含有≥48.7％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
b凝胶化的样品。没有进行进一步的分析。NA＝不适用
CEX，阳离子交换；HMW，高分子量；LMW，低分子量；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法
这些分析还揭示聚集(即形成HMW种类)和电荷变体的形成是主要的降解途径。选择pH 6.0用于DP制剂，是因为在该pH下，作为主要降解途径的HMW种类和电荷变体的形成被最小化。基于这些结果，选择pH6.0的10mM组氨酸缓冲剂用于mAb1高浓度DP制剂。
实施例6：选择针对搅拌应激的保护剂
通常将稳定剂如表面活性剂和有机助溶剂加入到抗体制剂中以保护蛋白质免受搅动诱导的聚集。在液体制剂中检查了有机助溶剂和表面活性剂对5mg/mL mAb1的搅拌应激稳定性和热稳定性的影响。评价以下助溶剂和表面活性剂：0.1％聚山梨醇酯20、0.1％聚山梨醇酯80和1.0％PEG3350。搅拌应激稳定性研究的结果总结在表3中。
表3：有机助溶剂和表面活性剂对搅拌(涡旋120分钟)后5mg/mL mAb1稳定性的影响
a报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有5个制剂中，起始材料(无孵育)含有≥98.2％的通过SE-UPLC测定的天然峰，并且含有≥49.1％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
b制剂中还含有5％蔗糖。
CEX＝阳离子交换；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；OD＝光密度；RP＝反相；SE＝尺寸排阻；UPLC＝超高效液相色谱法；
不存在有机助溶剂或表面活性剂的情况下通过涡旋120分钟搅拌后，mAb1是不稳定的。不存在助溶剂或表面活性剂的情况下通过涡旋搅拌后，溶液变浑浊，呈现实质上的浊度增加，并且通过SE-UPLC测定的聚集体增加15.3％，以及通过RP-UPLC的蛋白质回收率损失24％(表3)。1％PEG3350不能提供在涡旋120分钟后足够的mAb1稳定性。在1％PEG3350存在下，溶液变浑浊，并呈现出浊度增加(表3)。相反，0.1％聚山梨醇酯20和0.1％聚山梨醇酯80均在相同程度上保护mAb1免受搅动诱导的不稳定性(表3)。
然而，在45℃孵育时，与含有0.1％聚山梨醇酯20的制剂相比，含有0.1％聚山梨醇酯80的制剂呈现出聚集物的量减少(表4)。选择0.1％聚山梨醇酯80作为mAb1 DP制剂的表面活性剂，是因为其针对搅拌应激稳定蛋白质，对蛋白质热稳定性的负面影响小于聚山梨醇酯20(如通过SE-UPLC和CEX-UPLC分析所测定)，以及其在单克隆抗体制剂中具有安全的使用历史。
实施例7：选择针对热应激的保护剂
通常将如蔗糖的稳定剂添加到抗体制剂中以增加蛋白质在液体制剂中的热稳定性。当用5％蔗糖配制并在加速条件下孵育时，液体制剂中的五(5)mg/mL mAb1表现出改善的稳定性(表4)。
表4：有机助溶剂和表面活性剂对在45℃下孵育29天的5mg/mL mAb1稳定性的影响
a报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有5个制剂中，起始材料(无孵育)含有≥98.2％的通过SE-UPLC测定的天然峰，并且含有≥49.1％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
b制剂中还含有5％蔗糖。
CEX＝阳离子交换；HMW＝高分子量；LMW＝低分子量；OD＝光密度；RP＝反相；SE＝尺寸排阻；UPLC＝超高效液相色谱法；
在45℃孵育29天后，含有5％蔗糖的制剂中HMW种类的相对量增加1.7％，而不含蔗糖的对照制剂中增加2.8％。因此，选择蔗糖作为热稳定剂。为了使制剂等渗并使热稳定性最大化，对于mAb1制剂，蔗糖浓度增加至10％。
实施例8：稳定剂的优化
优化热稳定剂的目的是鉴定可用于开发支持抗体浓度高达200mg/mL的DP制剂的稳定组分。在初始制剂中选择10％蔗糖。发现使用10％蔗糖，mAb1的粘度在20℃下为约20cP，认为这对于稳健的后期阶段商业产品而言过高。因此，需要改进的mAb1制剂，其表现出有利的稳定性和较低的粘度。
在低浓度制剂开发期间，选择蔗糖作为mAb1的热稳定剂。对于高浓度制剂开发，针对在25℃(表5)和40℃下持续1个月的150和175mg/mL浓度的mAb1的稳定性和粘度，评估了不同浓度的蔗糖和L-脯氨酸。当制剂在40℃下孵育28天时，HMW种类的形成随着蔗糖浓度的增加而降低。3％L-脯氨酸提供与5％蔗糖类似的稳定，用9％蔗糖观察到最大的稳定。
虽然与3％L-脯氨酸相比，9％蔗糖提供稍好的稳定性，但它也增加了制剂粘度。在175mg/mL时，含有9％蔗糖的mAb1制剂具有27厘泊的粘度，这对制造和施用提出了挑战。含有3％脯氨酸的175mg/mL mAb1制剂具有约20厘泊的粘度，这在目前的制造方法中是易管理的。
表5：具有热稳定剂的高浓度mAb1在25℃下持续1个月的加速稳定
apH、SE-UPLC和CEX-UPLC'起始原料'结果是起始制剂的平均值
然而，基于-20℃、-30℃和-80℃的储存稳定性，发现具有3％脯氨酸的制剂不如具有蔗糖的制剂稳定(图2)。如图2所示，制剂F3(具有5％蔗糖)在-20℃、-30℃和-80℃稳定，HMW种类≤3％。
用50mg/mL制剂检查了L-脯氨酸对稳定mAb1的作用。在45℃孵育28天后，相对于不含L-脯氨酸的制剂，具有L-脯氨酸的制剂显示出较低水平的HMW种类，表明L-脯氨酸使50mg/mL浓度的抗体稳定(表6)。此外，通过生物物理技术(傅立叶变换红外光谱、CD光谱、荧光发射光谱和差示扫描量热法)检查了L-脯氨酸对抗体蛋白质结构的影响。结果显示L-脯氨酸不扰乱抗体的二级和三级结构。
表6：稳定剂对在45℃下孵育28天后的50mg/ml mAb1稳定性的影响
a)报告为相对于起始材料的纯度变化。在所有三种制剂中，起始材料(无孵育)含有≥98.5％的通过SE-UPLC测定的单体峰，以及≥52.8％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；LMW，低分子量；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
在液体制剂中进一步检查了不同稳定剂对高浓度(150和175mg/mL)mAb1的热稳定性的影响。评价的稳定剂是9％(w/v)蔗糖、3％(w/v)L-脯氨酸和5％(w/v)蔗糖+1.5％(w/v)L-脯氨酸。加速稳定性研究的结果总结在表7中。
表7：稳定剂对在25℃和40℃孵育后的mAb1稳定性的影响
a)报告为相对于起始材料的纯度变化。在所有三种制剂中，起始材料(无孵育)包含≥97.3％的通过SE-UPLC测定的天然峰，以及≥49.6％的通过CEX-UPLC测定的主峰。
CEX，阳离子交换；HMW，高分子量；LMW，低分子量；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
在40℃孵育28天后，9％蔗糖提供最佳的稳定并且在高浓度制剂中具有最高粘度。在40℃下28天后，5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸制剂的稳定性排名第二。在25℃孵育3个月后，mAb1的稳定性在所有检测的制剂中几乎相同；然而，具有5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸的制剂略好于其他两种制剂。然而，在-20℃、-30℃和-80℃孵育后，5％和9％的蔗糖提供比3％脯氨酸更好的稳定性(图3)。具有5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸的175mg/mL mAb1的粘度在20℃下为14cP的粘度。为了提供产生等渗溶液并在稳定性和粘度之间达到最佳平衡的制剂，选择5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸用于开发抗体后期DP制剂。
实施例9：粘度调节剂的选择
随着蛋白质浓度增加，蛋白质制剂的粘度呈指数增加。当粘度在20℃时开始超过约10至15cP时，开发制剂时必须考虑制剂的粘度：这仅仅是因为粘度与通过预装注射器(PFS)或其他基于针的递送装置的注射容易性相关；更重要的是，保持合理的低粘度对于开发递送装置(如自动注射器)是至关重要的。在具有以下潜在粘度调节剂的液体制剂中检查了赋形剂对制剂粘度的影响：脯氨酸、精氨酸HCl、组氨酸HCl、乙酸镁和NaCl。图4总结了具有粘度调节剂的150mg/mL mAb1的粘度。25-100mM的精氨酸HCl、组氨酸HCl、乙酸镁和NaCl降低150mg/mL mAb1制剂的粘度。
还检查了粘度调节剂对mAb1制剂稳定性的影响。制备具有粘度调节剂如精氨酸HCl、组氨酸HCl、乙酸镁和NaCl的150mg/mL mAb1制剂，并在45℃孵育28天。结果显示在图5中。发现当没有粘度调节剂配制mAb1时，观察到最大的蛋白质稳定性；所有这些改变粘度的盐都对mAb1稳定性产生负面影响。因此，盐不包括在最终制剂中。
作为稳定剂的L-脯氨酸使浓度等于或高于50mg/mL的抗体溶液的粘度最小。具有不同量的L-脯氨酸(含有和不含蔗糖)的高浓度抗体的加速稳定性研究结果总结在表7中。在25℃下孵育3个月后，含有5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸的制剂相对于其他两种制剂，在HMW种类形成方面提供稍改善的稳定性。在40℃孵育28天后，含有9％蔗糖的制剂提供了最好的稳定性，含有5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸制剂的制剂排名第二。含有9％蔗糖的175mg/mL抗体制剂的粘度为20cP，而含有5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸的175mg/mL制剂的粘度为20℃下14cP的粘度。向制剂中添加L-脯氨酸对于降低蛋白质浓度升高时的粘度以及稳定抗体是重要的。
总之，对于50mg/mL和高浓度抗体制剂，选择5％蔗糖/1.5％L-脯氨酸。这种赋形剂组合在所有测试的抗体浓度(高达175mg/mL)下实现了具有可接受的稳定性和粘度的等渗制剂。
实施例10：聚山梨醇酯(PS)浓度的优化
在制剂开发期间，在没有表面活性剂的情况下搅拌mAb1制剂时，观察到更高阶分子量种类形成和浊度增加。通过添加聚山梨醇酯80(PS 80)使蛋白质对搅拌稳定。在高浓度mAb1液体制剂的开发期间，更高阶分子量种类增加时，观察到对搅拌的不稳定性。进行了一项研究，确定保护高达175mg/mL mAb1免受搅拌诱导的不稳定性需要最低量的聚山梨醇酯80。该研究中的制剂含有5％蔗糖和1.5％L-脯氨酸，因此可以用更能代表最终制剂的制剂组合物研究聚山梨醇酯80的作用。研究中包括的标称聚山梨醇酯80的浓度为0％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.15％和0.2％(w/v)。不存在聚山梨醇酯80的情况下，通过涡旋搅拌后，溶液变浑浊并且呈现浊度的实质性增加。观察到搅拌120分钟后聚山梨醇酯80浓度依赖性降低的HMW％的量。发现针对搅拌诱导的聚集，浓度为0.15-0.2％的聚山梨醇酯80足以使150mg/mL和175mg/mL mAb1稳定(表8)。添加0.2％(w/v)(标称值)聚山梨醇酯80完全阻止了在搅拌120分钟后，HMW种类的形成。
表8：搅拌120分钟后具有PS 80的150mg/mL和175mg/mL mAb1的稳定性
表9详述了聚山梨醇酯80浓度对搅拌(涡旋120分钟)后175mg/mL mAb1稳定性的影响。
表9：聚山梨醇酯80浓度对搅拌(涡旋120分钟)后175mg/mL mAb1稳定性的影响
a)报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有制剂中，起始材料(无孵育)包含≥97.4％的通过SE-UPLC测定的天然峰，以及≥48.2％的通过CEX UPLC测定的主峰。
CEX，阳离子交换；HMW，高分子量；LMW，低分子量；NA，无可用；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
通过另一项研究证实0.2％(w/v)聚山梨醇酯80保护mAb1免受搅拌诱导的不稳定性的能力，其中最终制剂为50mg/mL(表10)。
表10：PS80浓度对搅拌(涡旋120分钟)后50mg/mL mAb1稳定性的影响
a报告为相对于起始材料的纯度的相对变化。在所有五种制剂中，起始材料(无孵育)包含≥98.5％的通过SE-UPLC测定的单体峰，以及≥52.8％的通过CEX UPLC测定的主峰。
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；LMW，低分子量；NA，无可用；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
基于这些结果，选择0.2％(w/v)聚山梨醇酯80作为表面活性剂，因为其提供了足够的稳定性以防止在搅拌应激下形成HMW种类。
实施例11：示例性制剂的储存和应激稳定性
表11和表12中显示了50mg/mL和175mg/mL mAb1制剂在玻璃小瓶中的储存稳定性，来自两种制剂的加速和应激稳定性数据分别显示在表13和表14中。研究的稳定性研究表明，玻璃小瓶中的50mg/mL和175mg/mL mAb1制剂在2℃至8℃下储存时至少24个月稳定。此外，50mg/mL mAb1制剂在加速和应激条件下也表现出优异的稳定性。当在25℃下储存至少3个月和40℃下储存至少7天时，该制剂是稳定的，表明50mg/mL制剂与主要容器封闭组件的相容性。没有观察到通过SE-UPLC或CEX-UPLC和iCIEF测量的颜色或外观、浊度、颗粒物质、pH、蛋白质浓度、纯度中的明显变化，并且在这些条件下保持效力。
表11：在2-8℃下储存的50mg/mL制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；单体，完整抗体；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表12：在2-8℃下储存的175mg/mL制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；单体，完整抗体；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表13：在加速和应激条件下储存的50mg/mL制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；单体，完整抗体；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表14：在加速和应激条件下储存的175mg/mL制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；单体，完整抗体；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
实施例12：包含组氨酸缓冲剂、蔗糖和聚山梨醇酯的mAb1制剂的稳定性
表15-24总结了包含10mM组氨酸缓冲剂，pH6.0、蔗糖和聚山梨醇酯的示例性mAb1制剂的储存稳定性。
表15：在-80℃下储存的mAb1制剂的稳定性研究
CEX＝阳离子交换；HMW＝高分子量；iCIEF＝成像毛细管等电聚焦；LMW＝低分子量；MCE-SDS＝微芯片毛细管电泳-十二烷基硫酸钠；MFI＝微流成像；NR＝不是必需的；OD＝光密度；RH＝相对湿度；RP＝反相；SE＝尺寸排阻；UPLC＝超高效液相色谱法；
表16：在-30℃下储存的mAb1制剂的稳定性研究
表17：在-20℃下储存的mAb1制剂的稳定性研究
表18：mAb1制剂的稳定性研究-加速条件的影响
表19：在-80℃储存的mAb1制剂的稳定性研究
表20：在-30℃储存的mAb1制剂的稳定性研究
表21：在-20℃储存的mAb1制剂的稳定性研究
表22：mAb1制剂的稳定性研究-加速条件的影响
表23：在-5℃储存的mAb1制剂的稳定性研究
表24：在加速条件下储存的mAb1制剂的稳定性研究
表25-27总结了示例性制剂的应激稳定性。
表25:mAb1制剂的稳定性研究–应激条件的影响
表26：mAb1制剂的稳定性研究-应激条件的影响
表27：mAb1制剂的稳定性研究-应激条件的影响
表28：50mg/mL和25mg/mL mAb1制剂的加速和应激稳定性
实施例13：验证的可接受范围(PAR)的研究
在mAb1药物产品(DP)的制造期间，可能发生DP组成的变化。这些变化可包括活性成分的浓度、赋形剂的浓度和/或制剂的pH。由于任何这些参数的变化都可能潜在影响药物产品的稳定性或效力，因此进行了验证的可接受范围(PAR)的研究，以评估在限定范围内DP组成的变化是否会影响mAb1 DP的稳定性或效力。
两个实验设计(DOE)研究用于评估每个制剂参数以及相互作用对制剂稳定性的影响：
·部分因子设计Pre-PAR研究，其使用加速和应激稳定性评估以鉴定可影响mAb1 DP稳定性的关键制剂参数；
·全因子设计PAR研究，包括从Pre-PAR研究中鉴定的关键制剂参数，其使用长期货架期稳定性以证明制剂参数的可接受范围。
Pre-PAR研究设计
为了评估DP组成中对于产品质量可能是重要的关键和/或相互作用的制剂参数，应用部分因子DOE通过改变所有制剂参数(包括蛋白质浓度(±10％)、缓冲剂和稳定剂浓度(±20％)、表面活性剂浓度(±50％)和pH(±0.3单位))来检查制剂的加速和应激稳定性。测试的制剂参数范围被定义为等于或宽于规范验收标准和制造经验。该研究使用统计软件设计，使用2^(6-2)分辨率IV部分因子实验。连同四个作为中心点的靶标制剂，该研究包括20次运行，如表29所示。
表29：在Pre-PAR研究中测试的制剂
在加速条件和应激条件(25℃、37℃、冻/融[F/T]和搅拌)下，对所有20种制剂进行表征并评估其物理/化学性质和稳定性，包括目视检查、pH、浊度、重量摩尔渗透压浓度、电导率、纯度、蛋白质浓度和回收率、电荷变化分析和不可肉眼可见颗粒分析。
Pre-PAR研究结果
搅拌或F/T应激后，所有20种制剂均未显示变化。通过回归模型(具有标准最小二乘个性和强调效应杠杆的JMP拟合模型)分析了25℃和37℃孵育的结果。针对关键质量属性对所有实验制剂的主要和相互作用变量的统计学分析表明，pH、蛋白质浓度和蔗糖浓度对产品质量至关重要。受影响的两个产品质量属性是HMW种类和酸性电荷变体。发现在测试范围内的其他制剂参数(包括组氨酸、脯氨酸或聚山梨醇酯80浓度)对产品质量没有统计学上的显著影响。在加速条件下，没有影响制剂稳定性的次级或更高级的相互作用。Pre-PAR研究结果表明，pH、mAb1浓度和蔗糖浓度对mAb1制剂的稳定性至关重要，并被视为50mg/mLmAb1制剂的关键制剂参数。
尽管将pH、mAb1浓度和蔗糖浓度鉴定为关键制剂参数，但这三个因子对质量属性的影响最小。根据统计学分析，pH范围5.7-6.3、mAb1范围45-55mg/mL和/或蔗糖范围4-6％内的变化可能对HMW种类和酸性电荷变体形成的影响小于15％。
为了确认在推荐的DP储存条件下对长期储存稳定性的影响，在长期储存稳定性的PAR研究中进一步评估了以下三个关键的制剂参数：pH、mAb1浓度和蔗糖浓度。
PAR研究设计
应用全因子DOE设计来检查具有不同pH(±0.3单位)、蛋白质浓度(±10％)和蔗糖浓度(±20％)的制剂的长期货架期储存稳定性，导致在八个实验运行中进行(表30)；包括作为中心点制剂的参考制剂(制剂3，表30中的靶标制剂)。
表30：PAR研究中测试的制剂
全因子研究设计允许评估所有主效应项以及相互作用项。测试的制剂参数范围(限定为等于或宽于规范验收标准和制造经验)保持与Pre-PAR研究中相同。
将实验制剂的稳定性与pH6.0的参考制剂的稳定性进行比较，所述参考制剂含有其标称浓度(F3)的所有制剂组分。PAR研究使用通过代表性商业制造方法制造的mAb1 DS批次。将DP制剂装入到10mL Schott 1型硼硅酸盐玻璃小瓶中，其具有20mm涂覆
表31：PAR研究的分析计划
PAR研究结果
对HMW种类形成的影响
对于所有9种制剂，如通过SE-UPLC测量的，在2-8℃下长达12个月％HMW没有有意义的增加。所有值都远低于规范上限，并且随着时间没有观察到％HMW的显著增加。
发现在2-8℃下50mg/mL mAb1 DP的HMW种类形成极其缓慢。长达12个月，9种制剂中％HMW的相对量的最大变化为～0.2％。由于％HMW的变化是最小的，并且单体浓度可以被认为是不变的，因此从单体到HMW种类的聚集可以简化为零阶反应。因此，使用简化的线性模型来分析％HMW稳定性数据。通过随时间线性拟合％HMW，得到每种制剂的HMW种类形成速率。
使用回归模型(具有标准最小二乘个性和强调效果杠杆的JMP拟合模型)针对主要因子以及所有相互作用项分析速率。得到的回归模型具有统计学显著性，R2为0.74。mAb1浓度、pH和时间在统计学上是显著的，但对％HMW种类形成的影响在统计学上是不显著的，仅贡献至多0.1％。
因此，这些因子：pH 5.7-6.3、mAb1浓度45-55mg/mL、蔗糖浓度4-6％，与2-8℃下的％HMW稳定性无实际相关性。
在长达12个月的时间点，所有9种制剂中的％HMW远低于4％的限定的接受标准极限，因此在规范货架期的发布和终止内。此外，线性模型预测，在2℃-8℃储存货架期的24个月后，％HMW(0.6％至0.8％)也远低于规范限值。
根据长期储存稳定性数据，发现研究范围内的关键制剂参数的变化对mAb1制剂稳定性没有显著影响。在测试的制剂组成的范围内，在HMW种类形成方面，50mg/mL mAb1制剂是稳健的。
对酸性电荷变体形成的影响
对于所有9种制剂，在2-8℃下长达12个月测量的％酸性电荷变体没有有意义的增加。所有值均低于规范上限，并且没有观察到％酸性电荷变体随时间的显著增加。
在测试的制剂组成范围内，在酸性电荷变体形成方面，mAb1制剂被认为是稳健的。
对一般质量属性的影响
研究了pH、mAb1浓度和蔗糖以及储存时间对其他DP一般质量属性的影响，包括外观、pH、浊度、不可肉眼可见颗粒、蛋白质回收、通过SEC检测的单体％和LMW％、通过iCIEF检测的主要电荷变体％和碱性电荷变体％和生物活性。所有值均在规范范围内，并且没有观察到随时间的有意义的变化或PAR制剂之间的差异：
·通过目视检查或浊度测量(405nm处的OD和比浊法)未检测到沉淀或可见颗粒；
·在蛋白质回收中没有观察到统计学上的显著变化(RP-UPLC)；
·制剂的pH值稳定；
·没有观察到不可肉眼可见颗粒中有意义的增加，没有观察到PAR研究制剂之间的不可肉眼可见颗粒计数中的有意义的差异。
ο对于通过HIAC测量的不可肉眼可见颗粒，所有值均低于USP<788>设定的可接受限度，并且没有观察到制剂之间不可肉眼可见颗粒中的有意义的变化。
ο此外，还通过MFI测量不可肉眼可见颗粒。没有观察到制剂之间不可肉眼可见颗粒中的有意义的变化。
·对于储存期间的所有制剂，生物测定法结果在规范限度内。
结果表明，研究范围内的关键制剂参数(pH、mAb1浓度和蔗糖浓度)的变化对mAb1制剂稳定性没有显著影响。在测试的制剂组合物范围内，在一般质量属性方面，50mg/mLmAb1制剂是稳健的。
冻融对PAR制剂稳定性的影响
在两次冻融循环后检查50mg/mL mAb1制剂的物理和化学稳定性，其不受关键制剂参数变化(即相对于参考mAb1，±0.3pH单位变化，mAb1浓度±10％变化，和/或蔗糖±20％变化)的影响。
观察到以下影响：
·通过目视检查或浊度测量(405nm处的OD)没有检测到沉淀；
·没有观察到蛋白质损失(RP-UPLC)；
·制剂的pH保持恒定；
·通过研究制剂之间的不透光度(HIAC)或微流成像(MFI)测定的不可肉眼可见颗粒计数中没有观察到有意义的差异。在2个循环的F/T后，不可肉眼可见颗粒略有增加，这可以在装入DP之前通过0.22μm过滤器过滤来除去。
·在两次冻融循环后，在所有制剂中均未观察到SE-UPLC测定的纯度中的明显变化；
·在两次冻融循环后，在所有制剂中均未观察到iCIEF测定的电荷变体分布中的明显变化。
·生物测定法结果表明，经历2个循环的冻融的所有制剂维持mAb1活性。
结论
使用基于实验设计(DOE)的pre-PAR和PAR研究来评估制剂参数以及相互作用对制剂稳定性的影响。使用加速和应激稳定性的pre-PAR研究鉴定了pH、mAb1浓度和蔗糖浓度为关键制剂参数。使用长期货架期稳定性的全因子PAR研究表明，关键制剂参数在研究范围内的变化不影响mAb1 DP质量。
具体地，在5℃下储存12个月的50mg/mL mAb1 DP的稳定性和效力不受蛋白质浓度±10％的变化，蔗糖、L-脯氨酸和/或组氨酸浓度±20％的变化，和/或聚山梨醇酯80浓度±50％的变化，和/或±0.3pH单位变化的影响。
PAR研究证明了mAb1制剂的稳健性。总体而言，pre-PAR和PAR研究的结果支持mAb1制剂组成在研究范围内的变化不会对推荐的储存条件(2至8℃)下mAb1 DP的稳定性产生不利影响。
在两个冻融循环(-30℃冻结和室温解冻)后，50mg/mL mAb1 FDS样品是稳定的。mAb1 FDS对冻/融应激的稳定性不受相对于对照mAb1FDS(50mg/mL)，mAb1浓度±10％的变化、蔗糖±20％的变化、和/或±0.3pH单位变化的影响。这些冻/融研究的结果提供了以下支持，即在mAb1 DP的制造过程中可以冻融50mg/mL mAb1 FDS，而不会不利地影响FDS的稳定性。
实施例14：容器
mAb1制剂在玻璃小瓶中开发(用于通过静脉内输注递送)。旨在用于后续临床开发和产品商业化的mAb1药物产品的容器也是预装注射器，其作为用于自我注射的独立注射器或者结合到用于自我施用的自动注射器装置中。
实施例15：mAb1制剂在玻璃小瓶中的稳定性
表32-35总结了示例性mAb1制剂在10mL玻璃小瓶中的稳定性。
表32：在2-8℃下储存的mAb1制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表33：mAb1制剂在加速和应激条件下的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表34：在2-8℃下储存的mAb1制剂的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
表35：mAb1制剂在加速和应激条件下的稳定性研究
CEX，阳离子交换；DS，药物；HMW，高分子量；iCIEF，成像毛细管等电聚焦，LMW，低分子量；MFI，微流成像；NR，不是必需的；OD，光密度；RP，反相；SE，尺寸排阻；UPLC，超高效液相色谱法；
发现不同装入体积的两种制剂对应激(40℃/75％RH)稳定(数据未显示)。
实施例16：mAb1制剂在预装注射器中的稳定性
表36-38总结了高浓度mAb1制剂在预装注射器中的稳定性。
表36：在5℃下储存的预装注射器(PFS)中mAb1药物产品的稳定性研究
表37：在加速条件下储存的预装注射器(PFS)中mAb1药物产品的稳定性研究
表38：mAb1药物产品在预装注射器(PFS)中的稳定性研究–应激条件的影响
实施例17：mAb1制剂在静脉内(IV)递送装置中的相容性
为了相容性评估，将50mg/mL mAb1制剂加入到含有0.9％氯化钠注射液或5％右旋糖注射液的100mL IV袋中，以评估静脉内递送时mAb1是否稳定。为了支持患者体重的变化，在该研究中检查了两种混合物浓度，1.0mg/mL mAb1和25mg/mL mAb1，以反映低剂量和高剂量给药条件。在相容性研究期间使用以下IV混合物组分：
·药物产品
ο50mg/mL mAb1 DP
·稀释剂
ο0.9％氯化钠注射液
ο5％右旋糖注射液
·IV袋
ο预装0.9％氯化钠注射液的聚氯乙烯(PVC)与邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)制成的IV袋
ο预装5％右旋糖注射液的聚氯乙烯(PVC)与DEHP制成的IV袋
ο预装0.9％氯化钠注射液的聚烯烃(PO)制成的IV袋
ο预装5％右旋糖注射液的聚烯烃(PO)制成的IV袋
ο预装0.9％氯化钠注射液的聚丙烯制成的IV袋
ο预装0.9％氯化钠注射液的聚丙烯制成的IV瓶
·IV泵
ο蠕动泵
ο流体驱替泵(Fluid displacement pump)
·IV输液器
οPVC与DEHP制成的IV器
οPVC与对苯二甲酸二辛酯(DEHT)制成的IV器
οPVC与偏苯三酸三辛酯(TOTM)制成的IV器
ο内衬PVC的聚乙烯制成的IV器
ο聚氨酯制成的IV器
·过滤器
ο0.2μm聚醚砜内联过滤器
ο1.2μm聚醚砜内联过滤器
ο5μm聚醚砜内联过滤器
ο15μm聚醚砜内联过滤器。
在该研究中使用的DP是使用代表性DP商业制造方法制造的GMP。含有混合物的IV袋最初在5℃下保持24小时；然后将袋子在25℃下孵育至少8小时。在这些孵育后，将每个输液器连接到IV袋，用混合物预处理(primed)并在环境室温下保持1小时。然后将每种混合物以25mL/h和500mL/h的速率通过相应的输液器泵送。
用于评估混合物相容性的方法：使用以下测定法评估mAb1混合物与IV递送装置中使用的材料的相容性：
·目视检查颜色和外观
·pH值
·通过在405nm处光密度(OD)的增加来测量浊度
·通过不透光度(HIAC)对混合物进行不可肉眼可见颗粒分析
·通过反相超高效液相色谱法(RP-UPLC)测定mAb1的蛋白质浓度
·通过SE-UPLC测定纯度
·通过CEX-UPLC测定电荷变体分析
·通过生物测定法的效力：使用生物测定法测定每个样品的相对效力，并定义为：(IC50参考样品/IC50样品)*100％。测量的储存稳定性样品的效力必须在测量的参考标准效力的50-150％之内。
结果和结论：在0.9％氯化钠注射液或5％右旋糖注射液中稀释至浓度为1.0mg/mL或25mg/mL的50mg/mL mAb1制剂在建议剂量范围和施用条件内的所有测试条件下都是物理和化学稳定的。这些数据支持以下有关mAb1DP的剂量制备和IV施用的结论：
·PVC与DEHP、PO和聚丙烯制成的0.9％氯化钠注射液和5％右旋糖注射液IV袋与mAb1IV施用相容。
·在用于IV施用的含有0.9％氯化钠或5％右旋糖的PVC、PO或聚丙烯IV袋中，mAb1 DP可稀释至低至1.0mg/mL的浓度。
·在用于IV施用的含有0.9％氯化钠或5％右旋糖的PVC、PO或聚丙烯IV袋中，mAb1 DP可稀释至高达25.0mg/mL的浓度。
·在5℃下在PVC、PO或聚丙烯IV袋中孵育长达24小时、以及在25℃下孵育8小时后，0.9％氯化钠或5％右旋糖中的mAb1混合物是稳定的。稀释的mAb1DP可在制备后6小时内施用。
·稀释的mAb1可以使用标准输液泵施用。
·稀释的mAb1可以用含有DEHP的PVC、含有TOTM的PVC、聚乙烯或聚氨酯组成的输液器施用。
·mAb1与内联0.2μm-5μm聚醚砜过滤器的使用相容。
·稀释的mAb1可以25至500mL/小时的速率施用。
本发明不限于本文描述的具体实施方案的范围内。实际上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述和附图中变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
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