阅读说明：本技术 一种组织培养体系及其在动物脑组织培养中的应用 (Tissue culture system and application thereof in animal brain tissue culture ) 是由 王鹏 马康 陈章平 黄卓群 万定 牛建国 任双来 顾金海 张燕 任晓璠 王峰 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种组织培养体系,本发明中的组织培养体系主要用于动物脑组织的培养,包括以下体积百分比的组分：BME基础培养基23～26％,MEM基础培养基0.8～1.2％,Neurobasal基础培养基44～46％,马血清24～26％,B27无血清添加剂1～1.5％,葡萄糖糖液1.2～1.5％,谷氨酸0.8～1.2％和双抗0.8～1.2％。采用本发明的培养体系,可使动物脑组织在体外长期培养,可为癫痫、脑神经发育及多种退行性神经疾病研究提供研究模型。(The invention discloses a tissue culture system, which is mainly used for culturing animal brain tissues and comprises the following components in percentage by volume: 23-26% of BME basal medium, 0.8-1.2% of MEM basal medium, 44-46% of Neurobasal medium, 24-26% of horse serum, 1-1.5% of B27 serum-free additive, 1.2-1.5% of glucose liquid, 0.8-1.2% of glutamic acid and 0.8-1.2% of double antibody. The culture system of the invention can culture animal brain tissue in vitro for a long time, and can provide a research model for the research of epilepsy, cranial nerve development and various degenerative nerve diseases.)

一种组织培养体系及其在动物脑组织培养中的应用

技术领域

本发明属组织培养于技术领域，具体涉及一种组织培养体系以及该培养体系在动物脑组织培养中的应用。

背景技术

1970年和1972年，Wolf和Hauw等第一次发表小脑组织培养的研究。1971年，Boyd报告了详细的组织培养技术，并在细胞培养玻片大量培养组织。1973年，Ansevin和Lipps改进此方法，可在组织培养板中培养组织。1981年至2001年

和Victorov研究组利用一种称为roller tube技术培养脑组织。1991年，Stoppini等利用半透膜培养脑组织。但是现有技术中还没有关于脑神经发育及多种退行性神经疾病研究模型专用培养基的记载。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种新组织培养体系，为动物脑组织在体外长期培养，脑神经发育及多种退行性神经疾病研究模型提供一套支撑体系。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种组织培养体系，包括以下体积百分比的组分：

BME基础培养基23～26％，MEM基础培养基0.8～1.2％，Neurobasal基础培养基44～46％，马血清24～26％，B27无血清添加剂1～1.5％，葡萄糖糖液1.2～1.5％，谷氨酸0.8～1.2％和双抗0.8～1.2％。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，本发明中的组织培养体系，包括以下体积百分比的组分：

BME基础培养基25％，MEM基础培养基1％，Neurobasal基础培养基45％，马血清25％，B27无血清添加剂1％，葡萄糖糖液1％，谷氨酸1％和双抗1％。

本发明中的组织培养基主要用于动物脑组织培养，进行动物脑组织培养时，具体操作如下：

S1：用组织切片机将动物脑组织切割成厚度为100～450μm的切片；

S2：将动物脑组织切片放入膜插件后，放入组织培养体系中培养；每两天更换一次组织培养体系；培养在37℃、5％CO₂条件下进行。

本发明的有益效果是：采用本发明的培养体系，可使动物脑组织在体外长期培养，可以为癫痫、脑神经发育及多种退行性神经疾病研究模型制备提供新的途径。

附图说明

图1为动物脑组织用培养体系一体外培养28天后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片；

图2为动物脑组织用培养体系一体外培养15天后制备的神经轴突脱髓鞘模型免疫荧光的图片；

图3为动物脑组织用培养体系一体外培养28天后的小胶质细胞免疫荧光图片；

图4为动物脑组织用培养体系一体外培养15天后制备的神经轴突脱髓鞘模型中小胶质细胞免疫荧光的图片；

图5为动物脑组织用培养体系四体外培养28天后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片；

图6为动物脑组织用培养体系四体外培养15天后的神经轴突和髓鞘化免疫荧光图片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。1.本发明中所用MEM培养基的成分如表1所示：

表1 MEM培养基成分表

成分	含量(mg/L)
		氯化钙	200
氯化钾	400
		无水硫酸镁	97.67
氯化钠	6800
		无水磷酸二氢钠	121.74
L-精氨酸盐酸盐	126
		L-胱氨酸盐酸盐	31.29
L-谷氨酰胺	292
		L-组氨酸盐酸盐	42
L-异亮氨酸	52
		L-亮氨酸	52
L-赖氨酸盐酸盐	72.5
		L-蛋氨酸	15
L-苯丙氨酸	32
		L-苏氨酸	48
L-色氨酸	10
		L-络氨酸	36
L-缬氨酸	46
		D-葡萄糖	1000
酚红	10
		D-泛酸钙	1
氯化胆碱	1
		叶酸	1
i-肌醇	2
		烟酰胺	1
盐酸吡哆醛	1
		核黄素	0.1
盐酸硫胺	1
		pH	5.9±0.3
渗透压	250±5％

2.本发明中所用BME培养基的成分如表2所示：

表2 BME培养基成分表

3.本发明中所用BME培养基的成分如表3所示：

表2 BME培养基成分表

4.本发明中所用双抗为含有青霉素(10000IU)和链霉素(10000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液；其配制方法如下：

用20mL空针抽16mL三蒸水，溶160万单位/瓶的青霉素G钠一支，过滤除菌；用10mL空针抽10mL三蒸水，溶一支100万单位/瓶的硫酸链霉素一支，过滤除菌。双抗浓度：青霉素G钠，100～1000U/mL；硫酸链霉素，100～1000μg/mL(100万单位＝1g)。

5.马血清、B27无血清添加剂、葡萄糖糖液和谷氨酸为商品化试剂。

实施例一：配制培养体系

取BME基础培养基、MEM基础培养基、Neurobasal基础培养基、马血清、B27无血清添加剂、葡萄糖糖液、谷氨酸和双抗，将它们按表4中的体积配比进行混合，得到不同的培养体系。

表4不同培养体系的组成

	培养体系一	培养体系二	培养体系三	培养体系四
					BME基础培养基	25	24	26	24
MEM基础培养基	1	1.2	0.8	49
					Neurobasal基础培养基	45	45.8	43.2	——
马血清	25	24	26	24
					B27无血清添加剂	1	1.5	1	——
葡萄糖糖液	1	1.5	1	1
					谷氨酸	1	0.8	1.2	1
双抗	1	1.2	0.8	1

实施例二：脑组织培养

1.将新生动物大脑利用组织切片机均匀切割成厚度为100～450μm的切片；

2.解剖显微镜下选取含有完整大脑结构的脑切片，放入组织培养插件，然后加入培养体系进行培养。培养分为以下三组：

组一：用培养体系四培养脑组织；培养方式为：在此培养体系中持续培养28天。

组二：用培养体系四培养脑组织；培养方式为：先将脑组织在培养体系中培养15天，然后加入溶血磷脂酰胆碱(50μg/mL)，继续培养17小时，然后更换培养体系继续培养12天。

组三：用培养体系一培养脑组织；培养方式为：在此培养体系中持续培养28天。

组四：用培养体系一培养脑组织；培养方式为：先将脑组织在培养体系中培养15天，然后加入溶血磷脂酰胆碱(50μg/mL)，继续培养17小时，然后更换培养体系继续培养12天。

实施例三：培养结果分析

髓鞘化的检测方法：

免疫荧光化学鉴定：神经丝蛋白(Neurofilament)和髓鞘碱蛋白(MBP)是轴突和髓鞘的标记物，抗Neurofilament和MBP抗体购买于Abcam和Millipore，二抗抗体488绿色和546红色标记山羊抗兔购买于Jackson。荧光化学鉴定结果如图1、2和5所示。

小胶质细胞的检测方法：

免疫荧光化学鉴定：Iba1是小胶质细胞的标记物，抗Iba1抗体购买于Abcam，二抗抗体488绿色标记山羊抗兔购买于Jackson。小胶质细胞检测结果如图3、4和6所示。

如图1所示，动物脑组织在培养体系一中培养28天后经免疫荧光化学染色，轴突成线型结构；髓鞘成线段式围绕轴突。

如图2所示，动物脑组织在培养体系一中培养并用溶血磷脂酰胆碱处理后，经免疫荧光化学染色，髓鞘包裹轴突数量减少，轴突表现为脱髓鞘。

如图3至图4所示，动物脑组织在培养体系一中培养后经小胶质细胞免疫荧光化学染色，小胶质细胞胞体较小，分枝较多。

如图5所示，动物脑组织在培养体系四中培养28天后经免疫荧光化学染色，轴突几乎未见；髓鞘未成线段式围绕轴突。

如图6所示，动物脑组织在培养体系四中培养并用溶血磷脂酰胆碱处理后，经免疫荧光化学染色后，轴突未见，髓鞘未见。

从上述结果可以得知，本发明所申请的培养体系可支持培养的脑组织髓鞘化及髓鞘再生，且小胶质细胞形态表现为支持髓鞘再生的细胞形态。

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。