用于产生生物工程化的神经元类器官(beno)的方法及其用途
阅读说明：本技术 用于产生生物工程化的神经元类器官(beno)的方法及其用途 (Methods for producing bioengineered neuronal organoids (BENO) and uses thereof ) 是由 W-H·齐默尔曼 M·P·扎菲里奥 于 2018-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及神经组织(特别是大脑)的体外3D建模领域。需要开发反映神经组织的生理方面的神经组织的细胞培养模型。本发明提供了产生形成功能性神经元网络的生物工程化的神经元类器官(BENO)的方法。本发明还涉及例如在药物筛选和个性化药物领域中所产生的BENO的用途和应用。(The present invention relates to the field of in vitro 3D modeling of neural tissue, in particular the brain. There is a need to develop cell culture models of neural tissue that reflect physiological aspects of neural tissue. The present invention provides methods for generating bioengineered neuronal organoids (BENO) that form functional neuronal networks. The invention also relates to the use and application of the produced BENO, for example in the field of drug screening and personalized medicine.)
背景技术
神经组织，特别是源自哺乳动物的脑(如人脑)组织的体外3D建模，代表了一种强大的组织生物工程化工具，可用于研究复杂的神经元细胞系统。通常，与相应的2D培养系统相比，3D细胞培养系统提供更快的细胞分化、更高的细胞复杂性和寿命。用于神经组织体外3D建模的一种有前途的方法包括多能干细胞(PSC)的使用，其已用于各种人组织和器官的建模中。3D建模方法的这些优点与最近使用的技术(例如，将患者成纤维细胞重编程为诱导的PSC)相结合，共同为阐明负责多种基于人神经元疾病的潜在分子机制提供了新的视野。
文献中存在许多诱导人干细胞神经分化的方案。一种这样的方法包括在培养中通过双重SMAD(Sma和Mad Related Family)信号传导通路抑制(即，通过BMP和TGFβ抑制)诱导神经外胚层约8-12天(Chambers,Fasano等人,Nat.Biotechnol.,2009)。在这个时间点，大多数干细胞转化为神经祖细胞(NPC)。第12天后，几种方案(Lancaster和Knoblich,Science,2014)允许细胞自发分化为各种神经元和神经胶质细胞，而其他方案(Qian,Nguyen等人,Cell,2016；Birey,Andersen等人,Nature,2017)应用各种模式因子来模式化组织、或应用神经营养因子(BDNF，GDNF)来增强神经元存活。此外，已观察到dbcAMP添加或DAPT对notch的抑制可增强此类多能细胞的神经元分化(Crawford和Roelink,Dev.Dyn.,2007；Kriks,Shim等人，Nature,2011)。用于神经诱导和分化的因子以及治疗时间安排的差异定义了这些程序提供的分化潜力。在另一份报告中，人大脑类器官生产为小头畸形的模型，小头畸形是使用小鼠模型不易再现的疾病(Lancaster等人,Nature,2013,Qian,Nguyen等人，Cell,2016)。
尽管人神经元类器官的产生取得了进步，但是仍然存在许多缺陷，限制了现有神经元类器官的应用。例如，已知方法缺乏对神经元类器官的精确定义；因此，此类类器官通常表现出高表型变异性。这部分是由于常规使用的作为神经发生支持底物的Matrigel。
与已知方法相关的另一个缺点是所产生的类器官缺乏神经元网络功能，因此显著限制了对神经元功能和可塑性的任何研究。由于已知产生的神经元类器官结构与正常脑组织相比的远程表型相似性，也限制了疾病建模和药物开发。
因此，需要基于使用确定的化学成分产生神经元类器官的方法，以允许所产生的结构的一致性。此外，需要产生能够形成功能性神经元网络的神经元类器官，以有意义地模仿天然神经结构。
本发明提供了在定义明确的3D细胞培养系统中允许稳健和可再现的神经分化的方法，其进一步为研究功能性神经元网络的形成和可塑性特征提供了良好的基础。
本发明的类器官在药物开发中进一步提供了有价值的工具。例如，此类类器官可以有意义地降低与临床前和临床药物开发相关的通常过高的成本，至少是由于减少了对基于动物的实验的需求，并且减少了预测上市结果后的临床试验所需患者的数量。另外，可以在人模型中有效地测试新的生物制剂(例如，非编码RNA治疗剂)和基因组编辑(例如，使用基于CRISPR的平台)。因此，该领域的快速发展得益于高预测性人类器官模型的可用性，如本发明提供的模型。
发明内容
本发明涉及一种从多能干细胞(PSC)生产生物工程化的神经元类器官(BENO)的方法，该方法包括：
(A)提供PSC来源；
(B)培养步骤(A)的PSC，将其包埋在浸没在细胞培养介质中的基质中；
(C)在包含Rho相关激酶抑制剂(ROCKi)和FGF-2的细胞培养介质中培养步骤(B)的所述基质中的PSC；
(D)在包含视黄酸和一种或多种SMAD信号传导抑制剂的细胞培养介质中培养源自步骤(C)的PSC和基质的形成的BENO，以诱导神经发生；
(E)在包含TGF-β和FGF-2的细胞培养介质中培养步骤(D)的形成的BENO，以增强基质细胞的发生和神经发生；
(F)在包含TGF-β和一种或多种notch信号传导抑制剂的细胞培养介质中培养步骤(E)的形成的BENO，以增强基质细胞的发生和神经分化。
在一些实施方案中，基质不包含Matrigel。在其他实施方案中，基质不包含Matrigel或具有不确定组分的天然来源的其他成分。在优选的实施方案中，基质包含胶原蛋白。在最优选的实施方案中，基质包含I型胶原蛋白。在一些实施方案中，基质是胶原蛋白。在一些实施方案中，基质是胶原蛋白I。
在一些实施方案中，在3D环境内产生BENO，优选其中3D环境由基质限定。
在一些实施方案中，基质细胞包含神经胶质细胞。
在一些实施方案中，步骤(D)的介质包含至少两种SMAD信号传导抑制剂，优选其中SMAD信号传导抑制剂包括头蛋白(noggin)和SB 431542。在一些实施方案中，SMAD信号传导抑制剂是头蛋白和SB 431542。
在一些实施方案中，步骤F的notch信号传导抑制剂是DAPT。
在一个实施方案中，SMAD信号传导抑制剂是头蛋白和SB 431542，并且步骤F的notch信号传导抑制剂是DAPT。
在一些实施方案中，基质是胶原蛋白，其以0.05mg/ml至50mg/ml，优选0.1mg/ml至10mg/ml，更优选0.5mg/ml至5mg/ml的浓度使用，最优选以1mg/ml的浓度使用。
在一些实施方案中，视黄酸以0.01μM至100μM，优选0.1μM至10μM，更优选0.5μM至5μM的有效浓度使用，最优选以1μM的浓度使用。在一些实施方案中，头蛋白以0.1ng/ml-1μg/ml，优选1ng/ml-500ng/ml，更优选10ng/ml-200ng/ml，最优选50ng/ml的有效浓度使用。在一些实施方案中，SB 431542以0.1μM-1mM，优选1μM-100μM，更优选5μM至50μM，最优选10μM的有效浓度使用。在一些实施方案中，TGF-β以0.1ng/ml至100ng/ml，优选0.3ng/ml至30ng/ml，更优选1ng/ml至10ng/ml有效浓度使用，最优选以5ng/ml的浓度使用。在一些实施方案中，FGF-2以0.1ng/ml至1μg/ml，优选1ng/ml至100ng/ml，更优选5ng/ml至50ng/ml的有效浓度使用，最优选以10ng/ml的浓度使用。在一些实施方案中，DAPT以0.01μM至100μM，优选0.1μM至10μM，更优选0.5μM至5μM的有效浓度使用，最优选以2.5μM的浓度使用。
在一些实施方案中，视黄酸以0.5μM至5μM的浓度使用，头蛋白以10ng/ml-200ng/ml的浓度使用，SB 431542以5μM至50μM的浓度使用，TGF-β以1ng/ml至10ng/ml的浓度使用，FGF-2以5ng/ml至50ng/ml的浓度使用，DAPT以0.5μM至5μM的浓度使用。
在一些实施方案中，视黄酸以0.5μM至5μM的浓度使用，头蛋白以10ng/ml至200ng/ml的浓度使用，SB 431542以5μM至50μM的浓度使用，TGF-β以1ng/ml至10ng/ml的浓度使用，FGF-2以5ng/ml至50ng/ml的浓度使用，DAPT以0.5μM至5μM的浓度使用，并且基质是以0.1mg/ml至10mg/ml的浓度使用的胶原蛋白。
在一些实施方案中，视黄酸以1μM的浓度使用，头蛋白以50ng/ml的浓度使用，SB431542以10μM的浓度使用，TGF-β以5ng/ml的浓度使用，FGF-2以10ng/ml的浓度使用，并且DAPT以2.5μM的浓度使用。
在一些实施方案中，视黄酸以1μM的浓度使用，头蛋白以50ng/ml的浓度使用，SB431542以10μM的浓度使用，TGF-β以5ng/ml的浓度使用，FGF-2以10ng/ml的浓度使用，DAPT以2.5μM的浓度使用，并且基质是以0.5mg/ml至5mg/ml的浓度使用的胶原蛋白。
在一些实施方案中，PSC是动物细胞。在一些实施方案中，PSC是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，PSC是啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)或人细胞。在优选的实施方案中，PSC是人PSC。本发明的PSC不是使用涉及修饰人种系遗传特性或涉及使用用于工业或商业目的人胚胎的方法生产的。
本发明的不同步骤进行不同的时间。在一个实施方案中，步骤(A)和步骤(B)在第-1天进行。在一个实施方案中，步骤(C)在第-1天到第0天进行。在一个实施方案中，步骤(D)在第0天到第8天进行。在一个实施方案中，步骤(E)在第8天到第15天进行。在一个实施方案中，步骤(F)在第15天到至少第28天进行。在一个实施方案中，步骤(A)和步骤(B)在第-1天进行，步骤(C)在第-1天到第0天进行。在一个实施方案中，步骤(A)和步骤(B)在第-1天进行，步骤(C)在第-1天到第0天进行，步骤(D)在第0天到第8天进行。在一个实施方案中，步骤(A)和步骤(B)在第-1天进行，步骤(C)在第-1天到第0天进行，步骤(D)在第0天到第8天进行，步骤(E)在第8天到第15天进行。在一个实施方案中，步骤(A)和步骤(B)在第-1天进行，步骤(C)在第-1天到第0天进行，步骤(D)在第0天到第8天进行，步骤(E)在第8天到第15天进行，步骤(F)在第15天到至少第28天进行。在一个实施方案中，步骤(A)和步骤(B)在第-1天进行，步骤(C)在第-1天到第0天进行，步骤(D)在第0天到第10天进行，步骤(E)在第10天到第15天进行，步骤(F)在第15天到至少第28天进行。
一方面，本发明提供了神经元类器官，例如生物工程化的神经元类器官(BENO)，其特征在于神经元类器官的神经元细胞被组织在功能性神经元网络中。一方面，本发明提供了通过本发明的方法产生的生物工程化的神经元类器官(BENO)。
在一些方面，本发明涉及通过本发明的方法产生的BENO作为疾病模型的用途。在一些实施方案中，本发明涉及通过本发明的方法产生的BENO作为与神经组织相关的疾病模型的用途。在一些实施方案中，本发明涉及通过本发明的方法产生的BENO作为疾病模型的用途，所述疾病选自中风、脑炎症性病症、神经退行性疾病、神经炎性疾病、创伤性损伤、离子通道病和精神病。在一些实施方案中，本发明涉及通过本发明的方法产生的BENO作为疾病模型的用途，所述疾病选自神经退行性疾病(如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病)、神经炎性疾病(例如多发性硬化症)、创伤性损伤(例如，脑外科手术引起的损伤)、离子通道病(例如，癫痫)和精神病(例如，自闭症、精神***症)。
在其他方面，本发明涉及通过本发明的方法产生的BENO作为疾病模型的用途，其中BENO与其他组织工程化平台共培养。在一些实施方案中，其他组织工程化平台选自EHM(工程化的心肌)、BSM(生物工程化的骨骼肌)、ESM(工程化的骨骼肌)、ELT(工程化的肝组织)和ECT(工程化的***)。在其他实施方案中，其他组织工程化的平台选自肿瘤模型(例如，肿瘤脑侵袭、转移扩散)和白细胞浸润模型(例如，自身免疫疾病)。
在一些方面，本发明涉及通过本发明的方法产生的BENO在药物筛选中的用途，如通过表型药物筛选进行药物发现和药物精制。BENO的这种用途包括但不限于发现和精制可以在脑和神经组织中诱导或增强修复、再生、保护和疾病预防的药物。
在其他方面，本发明涉及用于实施本发明方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含PSC、基质、合适的介质和所需的补充剂(ROCKi、FGF-2、视黄酸、一种或多种SMAD信号传导的抑制剂、TGF-β和一种或多种notch信号传导的抑制剂)。在其他实施方案中，试剂盒包含基质、合适的介质和所需的补充剂(ROCKi、FGF-2、视黄酸、一种或多种SMAD信号传导的抑制剂、TGF-β和一种或多种notch信号传导的抑制剂)。在其他实施方案中，试剂盒包含基质和所需的补充剂(ROCKi、FGF-2、视黄酸、一种或多种SMAD信号传导的抑制剂、TGF-β和一种或多种notch信号传导的抑制剂)。在其他实施方案中，试剂盒包含基质和至少4种所需的补充剂(ROCKi、FGF-2、视黄酸、一种或多种SMAD信号传导的抑制剂、TGF-β和一种或多种notch信号传导的抑制剂)。
附图说明
图1典型的从干细胞神经分化的方案。
图2在双重SMAD信号传导通路抑制下增强的神经发生。图2A，仅使用头蛋白或头蛋白和SB431542处理的组织的IF分析。使用针对神经丝的抗体(FITC-绿色)和带有DAPI的细胞核(蓝色)来可视化神经元。柱状图表示10μm。右图显示了来自整个组织的平均荧光比的定量。图2B，对神经元标记物PAX6和MAP2的qPCR分析显示，在SB431542处理后，两种标记物均增加21倍(n＝4个组织/组)。
图3FGF-2增强神经元分化。图3A，多能干细胞输入增加导致在BENO培养的第28天，神经丝染色增强。图3B，FGF-2对干细胞和NPC的增殖作用。在第8-15天、在用FGF-2处理的组织中用神经丝染色观察到组织内部神经元数量以及网络复杂性更高。
图4BDNF和GDNF处理后的神经元转录物分析。从第10天到第28天，在培养物中添加BDNF和GDNF后，PAX6和MAP2的表达均未增强。在第28天对BENO进行了分析。
图5通过notch抑制增强神经发生。从第15天到第28天进行的DAPT处理增加了PAX6转录物的丰度，因此表明更高数量的神经元存在(commitment)。
图6评价不同方案的神经生成和神经胶质生成的潜能。图6A，总结了在实施例1的各个方案中进行的处理方案。图6B，BENO产生的转录组时间过程分析。使用OCT4作为干细胞标记物、使用GFAP作为神经胶质标记物、使用PAX6作为NPC和神经元标记物、最后使用MAP2、GRIN1和GABBR2作为成熟神经元标记物。将数据针对GAPDH进行归一化。图6C，在第60天进行BENO的全组织标本包埋(whole mount)IF分析。神经丝、MAP2、突触素(Synaptophysin)和GFAP分别用于染神经元、成熟神经元、突触和神经胶质。图6D，通过检测组织的5个区域中记录的钙活性计算出的BENO活性。
图7在发育的时间过程中RNAseq分析的热图，其显示BENO中神经发生和成熟的RNAseq数据。图7A，描绘干细胞分化为神经元和神经胶质细胞的不同状态的标记物。图7B，不同神经元标识的标记物。图7C，皮质层标记物。图7D，作为受体、离子通道和突触相关蛋白的不同的成熟蛋白。与Rashi Haider博士/A.Fischer教授合作完成(DZNE)。
图8BENO中的皮质层发育。TBR2+室管膜下区祖细胞从类器官的中间同心地迁移到周围。在那里，CTIP2标记深层神经元。
图9BENO含有抑制性和兴奋性神经元。图9A，GABA强烈表达在GABA能神经元轴突(***)的核周体(中心)和突触结中。图9B，发现GABBR2受体在神经元核周体(中心)中表达。图9C，在与GABA位置类似的类器官的中心和周围发现酪氨酸羟化酶(TH)标记的多巴胺能神经元。图9D，突触素染色表明在类器官的周围存在非常紧密的突触网络。神经丝、MAP2和DAPI分别用于染轴突、成熟神经元和细胞核。柱状图：除非另有说明，否则为10μm。
图10BENO中的神经元网络功能表明整合的和分层的突触功能。左图显示了Fura-4染色的神经元。对不同感兴趣(ROI)区域的Matlab分析表明右图中所示的12条不同的迹线。在GABAR抑制之前，将ROI(2,3)、ROI(4,5)、ROI(6，7)和ROI(11,12)同步。GABAR抑制导致细胞不同步，冲洗10分钟后，细胞再次同步。与Guobin Bao博士/D.Schild教授(UMG)合作完成。
图11与NCM和NPEM孵育的优化持续时间。图11A，使用方案中指示的操作，在BENO生成后15天进行相对PAX6转录物表达的qPCR分析。图11B，限定使用NCM进行的BENO处理的最大持续时间(步骤D)。使用方案中指示的操作，在BENO生成后15天进行相对PAX6转录物表达的qPCR分析。图11C，PAX6/ki67阳性细胞的免疫荧光分析，以标记增殖性神经元祖细胞。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“类器官”是指形成三维组装的组织培养物，其至少部分地模拟器官(如人器官)的结构和/或功能。可以从多能干细胞在例如三维(3D)环境中生成类器官。用于类器官的一种这样的3D环境是球形3D环境。类器官可以进一步被认为是器官的小型化和简化形式。
如本文所用，术语“生物工程化的神经元类器官”(BENO)是衍生自根据本发明的方法产生的神经组织的类器官。BENO可被视为神经器官(包括脑)或存在于器官内或控制器官的神经组织的小型化和简化模型，例如，心脏中存在的神经组织(例如，交感神经系统)和骨骼肌中存在的神经组织(例如骨骼神经肌肉接头处的烟碱能神经末梢)。
如本文所用，“形成的BENO”是处于发育为BENO的过程中的细胞和基质的组合物。形成的BENO的特征在于，其细胞和基质材料已经经历了本发明方法的步骤C，但是尚未经历本发明方法的步骤F或步骤F尚未完成。
如本文所使用的术语“3D环境”表示在空间的所有三个维度上延伸的结构。在细胞培养的情况下，3D环境对应于这样一种结构，其中细胞相对于彼此在三维空间中排列。3D环境的一个示例是球形排列。与3D环境不同的是2D环境，其中细胞在单层中排列，例如，在细胞之间空间关系的维度之一上没有差异。
如本文所用，术语“3D细胞培养系统”是指至少最初在由3D基质限定的3D环境中的细胞培养。
如本文所用，术语“多能干细胞”(PSC)是具有自我复制性质并且倾向于分化成在三个胚层(内胚层、外胚层和中胚层)中存在的细胞的细胞。PSC以未分化状态存在，其特征是大量表达干性因子，如Oct-3/4、SSEA-4和TRA1-60，具有自我复制的特性以及倾向于分化为三个胚层(内胚层、外胚层和中胚层)的细胞。PSC可以源自许多来源，包括但不限于诱导的多能干细胞(iPSC)、孤雌生殖的干细胞、由细胞核转移产生的干细胞和胚胎干细胞(ESC)及其组合。ESC可以来自现有的ESC系。本发明的PSC不是使用涉及修饰人种系遗传特性的方法或涉及将人胚胎用于工业或商业目的的应用的方法产生的。PSC进一步包括PSC细胞系。如本文使用的PSC的来源没有特别限制，但是优选哺乳动物来源的细胞，更优选人来源的细胞。
如本文所用，术语“重编程”是指一种方法，其中可以将更专门化的细胞或处于发育晚期的某些其他形式的细胞转化为多能细胞。
如本文所用，术语“分化的细胞”是指已经从非专门化的前体表型发育成专门化的表型的细胞。例如，胚胎细胞可以分化成内衬肠的上皮细胞。例如，可以从胎儿或活体动物分离分化的细胞。
如本文所用，“诱导的多能干细胞”(iPSC)是指从非多能细胞、通常是成体细胞人工衍生的一种多能干细胞类型。例如，在某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、加倍时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、可行的嵌合体形成和潜力和可分化性方面，认为诱导的多能干细胞与天然多能干细胞(包括胚胎干细胞)相似，即使不完全相同。
如本文所用，术语“神经祖细胞”(NPC)是指衍生自PSC的细胞，所述PSC具有细胞增殖能力，以再生成精确拷贝的其自身(自我更新)并产生独特分化的细胞的细胞后代。NPC的后代可以是神经元细胞(如神经元前体或成熟神经元)或神经胶质细胞(如神经胶质细胞前体、成熟星形胶质细胞或成熟少突胶质细胞)。NPC自身进行体外培养时，通常不产生其他胚胎胚芽层的后代，除非例如，它们以某种方式去分化或重编程。与PSC等干细胞不同，NPC的增殖能力有限，因此其不显示自我维持的能力。
本文所用的术语“Matrigel”是衍生自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤的组合物(Kleinman等人，Biochemistry，1982)。Matrigel是一种在化学上没有明确定义的混合物，但通常包含层粘连蛋白、胶原蛋白IV、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白和生长因子。Matrigel通常用作细胞培养的基质。
本文所用的术语“化学上定义明确的”或“定义明确的”是指其化学组成以足够精确的程度已知的组合物。例如，组合物总含量的至多10％，优选至多5％是化学未表征的或在组合物的不同样品中是变化的。
如本文所用，“具有不确定组成的天然来源的组分”涉及从天然来源分离的组合物(来自动物、植物、真菌和原生生物细胞或病毒的细胞或组织)，其在化学上没有精确定义。例如，组合物总含量的至少10％必须是未表征的，或在组合物的不同样品中是变化的。具有“不确定组分”的天然来源的成分的示例包括血清和Matrigel。
本文所用的术语“成纤维细胞生长因子-2”(FGF-2)是成纤维细胞生长因子家族的成员。FGF-2由FGF2基因编码。FGF-2也称为“碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)”。术语FGF-2和bFGF在本文中可互换使用。
本文所用的“神经元网络”代表一组一个或多个相互连接的神经元。神经元网络中神经元之间的连接允许信息从一个神经元传输到另一个神经元。在神经元网络中，神经元之间的连接可以通过突触进行。例如，通过使用神经元的钙成像，可以容易地确认神经元网络的存在。
本文使用的“神经元网络组织”是指一组作为神经元网络的神经元的组织。作为神经元网络的神经元的这种组织可以创建分层网络。
如本文所用，“功能性神经元网络”是指显示电化学信息从一个神经元传输到另一神经元的神经元网络。功能性神经元网络需要功能性突触的形成。功能性神经元网络的特征在于网络的活动模式，其可以包括网络中多于一个神经元的同步电活动，或者特征在于显示网络中神经元之间的功能相互依赖性的模式，包括神经元激活或抑制模式。可以例如通过神经元的钙成像来确认神经元网络的存在。特别地，一组神经元对信号传导分子的反应或信号传导分子的受体(例如，GABA受体)抑制可以确认功能性神经元网络的存在。证明功能性神经元网络的一个示例是，网络中的神经元显示出同步的钙信号(例如钙尖峰)，其在加入抑制神经元信号传导分子的受体抑制剂后变得不同步，并随后在抑制剂去除后重新同步。
本文所用的“神经元网络功能”是将电化学信息从一个神经元传输到另一神经元。
如本文所用，术语“诱导”是指起始和/或增强特定的生理作用，如细胞增殖或细胞分化。
如本文所用，“神经发生”是指细胞向不能进一步分化的完全分化神经细胞的分化和/或增殖。因此，神经发生包括PSC向NPC的分化、NPC的增殖、NPC向分化程度更高的神经细胞的分化，例如向神经元细胞(如神经元前体或成熟神经元)或神经胶质细胞(如神经胶质细胞前体、成熟的星形胶质细胞或成熟的少突胶质细胞)分化、或分化程度更高的神经细胞的增殖。
如本文所用，术语“神经分化”是指神经细胞向不能进一步分化的完全分化的神经细胞的分化。因此，神经分化包括NPC分化为分化程度更高的神经细胞，例如神经元细胞(如神经元前体或成熟的神经元)或神经胶质细胞(如神经胶质细胞前体、成熟的星形胶质细胞或成熟的少突胶质细胞)、或分化程度更高的神经细胞分化为分化程度甚至更高的神经细胞，例如从神经元前体分化为成熟神经元。
如本文所用，“细胞在基质中的包埋”是指细胞与基质的相互作用和/或细胞与基质的附着。该过程受细胞-基质相互作用的调节，例如通过包括整联蛋白的细胞受体的调节。
如本文所用，术语“基质”是指可以产生适合于包埋细胞的3D环境的材料。优选地，本发明的基质形成水凝胶结构。示例性的合适基质包括胶原蛋白或合成的胶原蛋白模拟物。
如本文所用，“水凝胶”是指包含水的亲水性聚合物的网络，但它不是水溶性的。水凝胶分子例如通过共价键或离子键或缠结而发生化学和/或物理连接，从而形成3D环境。水凝胶网络也可以是天然或合成的聚合物网络。
如本文所用，术语“基质细胞”是指不是神经元细胞的神经细胞。特别地，示例性基质细胞包括神经胶质细胞，如神经胶质细胞前体、成熟的星形胶质细胞或成熟的少突胶质细胞。
如本文所用，术语“信号传导”是指细胞内或两个或更多个细胞之间信息(信号)的传输。信号传递可以通过化学反应方式(如磷酸化、蛋白质裂解)、通过释放信号传导分子(包括离子、神经递质)，或者通过直接电化学势能中的变化发生。
如本文所用，“组织工程化的平台”是指细胞的体外组装，其被设计为模拟组织，优选人组织的结构和/或功能特征。
如本文所用，术语“表型药物筛选”是指基于新药或现有药物对模型系统表型的影响来筛选新药或现有药物的适用性。
如本文所用，术语“生物工程化”和“生物工程化的”是指操纵生物系统和生物材料的方法。生物工程化的示例是分子克隆、转染、转导和使用化学物质或其他物质影响细胞。
如本文所用，术语“疾病建模”是指生成至少部分地模拟疾病的一些或全部特征的疾病模型的方法。疾病模型可用于评估化合物(如药物)对疾病或疾病某些特征的影响。示例性疾病模型是细胞培养物、类器官和小鼠模型。
本文中未具体定义的所有术语应根据生物学和医学领域中(特别是干细胞和类器官研究领域中)的惯用含义理解。
发明原理
本发明提供了在化学确定的条件下生产生物工程化的神经元类器官(BENO)的方法，该方法是可重现的并且产生一致的产物。用于增强神经发生的视黄酸和FGF-2与用于支持神经胶质细胞发生的TGF-β存在下分阶段的SMAD和notch抑制，代表了在基质环境中神经发生的生物学活性的独特结合，导致了功能性神经元网络的形成。本发明的一种示例性的合适基质是胶原蛋白水凝胶。在本发明之时，尚不能预测是否可以在本身不诱导神经发生的基质环境中使用确定的因子来控制神经和神经胶质细胞发生；这与例如Matrigel基质是不同的，自从Kleinman及其同事在1990年代引入Matrigel基质以来，已知该基质诱导神经发生(例如，Jucker等人,J Neurosci Res.1991)。
本发明的方法是通过几次迭代开发的，例如，如实施例1所公开的，其产生显示出明显的神经元网络组织和功能的结构，该结构被共同发育的基质细胞如神经胶质细胞支持。网络组织和功能，例如，本文公开的神经元类器官的不同神经元细胞之间的功能性突触的形成(因此，如实施例5中所述的功能等级)，提供了优于常规类器官结构的许多优点。特别地，本文公开的神经元类器官可以由于限定的培养条件而显示出高度一致性、包含功能性神经元网络、并且可以在短时间内(例如，PSC和基质混合后29天)产生。
本发明当前公开的方法包括许多实施步骤。这些步骤是：
(A)提供PSC的来源；
(B)培养步骤(A)的PSC，将其包埋在浸没在细胞培养介质中的基质中；
(C)在包含Rho相关激酶抑制剂(ROCKi)和FGF-2的细胞培养介质中培养步骤(B)的所述基质中的PSC；
(D)在包含视黄酸和一种或多种SMAD信号传导抑制剂的细胞培养介质中培养源自步骤(C)的PSC和基质的形成的BENO，以诱导神经发生；
(E)在包含TGF-β和FGF-2的细胞培养介质中培养步骤(D)的形成的BENO以增强基质细胞的发生和神经发生；
(F)在包含TGF-β和一种或多种notch信号传导抑制剂的细胞培养介质中培养步骤(E)的形成的BENO，以增强基质细胞的发生和神经分化。
提供多能干细胞(PSC)(步骤A)
本发明涉及从多能干细胞(PSC)生产生物工程化的神经元类器官(BENO)。多能干细胞可从多种来源获得，包括但不限于诱导的多能干细胞(iPSC)(可通过对包括成纤维细胞、角质形成细胞、骨髓来源的细胞或血液来源的细胞(如脐带血来源的细胞)的细胞类型进行重编程来产生)、孤雌生殖干细胞、通过核转移产生的干细胞、以及胚胎干细胞和/或它们的混合物。本发明的PSC不是在涉及修饰人种系遗传特性的方法或涉及工业或商业目的的人胚胎应用的方法中产生的。本发明的方法也可以使用PSC细胞系进行，例如Tibury等人,Circulation,2017中描述的iPSC-G1细胞系。
PSC的特征在于在大量表达未分化状态下的干性因子(如Oct-3/4、SSEA-4和TRAl-60)自我复制的特性以及分化为三胚层细胞的倾向(内胚层、外胚层和中胚层)。PSC也可以是诱导的PSC(iPSC)。
在用于当前要求保护的方法中之前，PSC在本领域已知的合适条件下培养。必要时，可以根据标准的维持程序培养PSC，例如在如Matrigel的维持支持物上生长。PSC在本领域已知的任何合适的细胞培养介质中生长。示例性的细胞培养介质是TeSR-E8基础介质(Stemcell)，其任选地包含Rho相关蛋白激酶抑制剂(ROCKi)，例如浓度为5μM或10μM。在Stover和Schwartz,Methods Mol Biol.2011中报道了PSC的示例性培养方法。
在将PSC用于本发明中时，例如通过EDTA处理将PSC从其维持支持物例如Matrigel上分离。EDTA可以0.1-10mM的浓度使用，优选0.5-2mM。EDTA处理进行1-10分钟，优选4-6分钟。优选的EDTA处理条件是在室温下0.5mM EDTA持续5-10分钟，在室温下2mM EDTA持续5-8分钟。
培养包埋在浸没在细胞培养介质的基质中的PSC(“步骤B”)
随后，将上述提供的PSC与基质进行培养，该基质允许将PSC包埋到由基质限定的3D环境中。在这种3D环境中PSC的包埋和自组织为生成本发明的类器官提供了基础。优选地，细胞应以均匀的方式包埋基质中。
本发明的基质构成了3D环境，其促进了PSC和源自PSC的细胞的自组织和分化。通过各个基质分子的相互作用(例如蛋白质-蛋白质相互作用)而稳定基质的结构。最优选地，本发明的基质形成水凝胶结构。
本发明的示例性合适基质是胶原蛋白、胶原蛋白模拟物、藻酸盐、纤维蛋白、Matrigel和壳聚糖。优选的基质是胶原蛋白和胶原蛋白模拟物。最优选的基质基于I型胶原蛋白。基于I型胶原蛋白的基质可含有痕量其他胶原蛋白，如III型胶原蛋白。优选地，基于I型胶原蛋白的基质包含大于80％，大于85％，大于90％，大于95％或100％的I型胶原蛋白。
在一个优选的实施方案中，本发明的基质不包含Matrigel。在更优选的实施方案中，本发明的基质不包含Matrigel或天然来源的具有一种或多种组分的不确定或不明确组成的其他组分。这一点特别重要，因为使用不确定或不明确的化学混合物(如Matrigel)不可避免地会导致生成的类器官的较大表型差异。例如Tiburcy等人Circulation,2017中证实了这一观察。众所周知，Matrigel是一种不确定的混合物，其包含层粘连蛋白、胶原蛋白IV、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白和衍生自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤的生长因子组分，其中批次间的成分百分比显示高的可变性(Kleinman等人，Biochemistry，1982)。
将PSC和基质元素在适合于PSC培养的细胞培养介质中混合。这种细胞培养介质的示例是TeSR-E8基础介质(Stemcell)和StemFlex介质(Gibco)。细胞培养介质可以补充有其他成分，如FGF-2和ROCKi。这些成分可以增强细胞在基质中的存活和增殖。一种示例性介质是补充有20ng/ml FGF-2和10μM ROCKi的TeSR-E8基础介质。可以添加到细胞培养介质中的其他成分包括DMEM细胞培养介质或用于pH中和的NaOH。
基质(如胶原蛋白基质)以有效浓度使用。在一些实施方案中，基质的浓度为0.05mg/ml和50mg/ml。在其他优选的实施方案中，基质的浓度为0.1mg/ml至10mg/ml。在更优选的实施方案中，基质的浓度为0.5mg/ml至5mg/ml。在最优选的实施方案中，基质的浓度为1mg/ml。
与介质和基质混合后，PSC的密度可以为每ml 0.1-10×106个细胞的范围。优选的范围是每ml 0.5-6×106个细胞。更优选的范围是每毫升1-4×106个细胞。一种示例性的合适值为每ml 3×10 6个细胞。
本培养步骤在以下部分中公开的培养步骤之前进行。在包含Rho相关激酶抑制剂(ROCKi)和FGF-2的细胞培养介质中培养细胞的培养步骤(“步骤C”)之前，进行本培养步骤(其中PSC包埋在基质中；“步骤B”)。步骤B到步骤C转变的特征通常在于将步骤C的成分添加到现有细胞培养介质中。
在一些实施方案中，该培养步骤B进行1分钟至1天的时间段。在优选的实施方案中，步骤B进行5分钟至5小时。在更优选的实施方案中，步骤B进行10分钟至1小时。在甚至更优选的实施方案中，步骤B进行15分钟至30分钟。在最优选的实施方案中，步骤B进行20分钟。
与生产本发明类器官相关的本方案，将步骤B的时间点称为“第-1天”。
步骤B在合适的细胞培养容器中进行。示例性的合适的细胞培养容器是具有U形底部和低附着特性的96孔板。
步骤B在适合PSC存活的条件下进行。示例性的适合条件是37℃，5％CO2，例如在细胞培养箱中。
在包含Rho相关激酶抑制剂(ROCKi)和FGF-2的细胞培养介质中培养步骤B的所述 基质中的PSC(“步骤C”)
在包含Rho相关激酶抑制剂(ROCKi)和成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)的培养介质中培养步骤B的基质中的PSC。
合适的ROCKi变体包括Y27632(Stemgent)、Fasudil、Ripasudil、RKI-1447、GSK429286A、Y-30141、以及在Feng等人,J Med Chem.,2016中综述的其他成分。ROCKi以有效浓度使用。优选的ROCKi是Y27632。在一些实施方案中，Y27632的浓度为0.1μM至1mM。在优选的实施方案中，Y27632的浓度为1μM至100μM。在更优选的实施方案中，Y27632的浓度为5μM至50μM。在最优选的实施方案中，Y27632的浓度为10μM。
FGF-2(也称为bFGF)以有效浓度使用。在一些实施方案中，FGF-2的浓度为0.1ng/ml至1μg/ml。在优选的实施方案中，FGF-2的浓度为1ng/ml至100ng/ml。在更优选的实施方案中，FGF-2的浓度为5ng/ml至50ng/ml。在最优选的实施方案中，FGF-2的浓度为10ng/ml。尽管本发明优选地使用FGF-2，但是本发明也可以使用与FGF-2具有相同或相似的信号传导活性的FGF-2模拟物来进行，其特征在于与FGF-受体结合从而引起FGF-受体-介导的信号传导，其中这种活性是FGF-2对每个FGF受体的信号传导活性的至少10％。
在该培养步骤C中，在适合于PSC培养的细胞培养介质中培养PSC。合适的细胞培养介质的示例包括TeSR-E8基础介质(Stemcell)和StemFlex介质(Gibco)。
该培养步骤在以上公开的步骤B之后进行。步骤B到步骤C的转变的特征通常在于向包含PSC和步骤B基质的现有细胞培养介质中添加步骤C的成分。步骤C在步骤D之前进行，如下所述。步骤C到步骤D的转变的特征在于细胞培养介质的部分或全部交换，或者可选地，将步骤D的成分添加到现有的细胞培养介质中。
在一些实施方案中，步骤C进行6小时至4天的时间段。在一些优选的实施方案中，步骤C进行12小时至3天。在更优选的实施方案中，步骤C进行1天至2天。在最优选的实施方案中，步骤C进行1天。
步骤C应该在生产类器官的方案的第-1天开始。根据其持续时间，此步骤可能会延长到本方案的第0、1、2或3天。在最优选的实施方案中，步骤C延长到方案的第0天。
步骤C在合适的细胞培养容器中进行。示例性的合适的细胞培养容器是具有U形底部和低附着特性的96孔板。通常，当进行本文公开的步骤B和C时，细胞培养容器将不会改变。
步骤C在适合PSC存活的条件下进行。示例性的合适条件包括37℃，5％CO2，例如在细胞培养箱中。
在包含视黄酸和一种或多种SMAD信号传导抑制剂的细胞培养介质中培养源自步 骤(C)的PSC和基质的形成的BENQ，以诱导神经发生(“步骤D”)
在基质中根据步骤C处理的PSC构成形成的BENO。在包含视黄酸和一种或多种SMAD信号传导通路抑制剂的介质中培养源自步骤C的PSC和基质的这种形成的BENO。这种处理诱导神经发生。
视黄酸被用作信号传导激活分子。优选地，采用全反式视黄酸[(2E，4E，6E，8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯酸]。但是，本发明也可以使用具有与全反式视黄酸相同或相似的信号传导活性的视黄酸衍生物来进行，其特征通常在于与视黄酸受体结合从而引起视黄酸受体介导的信号传导，其中此种活性是全反式视黄酸的信号传导活性的至少10％。视黄酸以有效浓度使用。在一些实施方案中，视黄酸的浓度为0.01μM至100μM。在优选的实施方案中，视黄酸的浓度为0.1μM至10μM。在更优选的实施方案中，视黄酸的浓度为0.5μM至5μM。在最优选的实施方案中，视黄酸的浓度为1μM。
使用SMAD抑制剂抑制抗生物皮肤生长因子(Mothers against decapentaplegic)同源(SMAD)蛋白(例如SMAD-1至SMAD-9)介导的信号传导。抑制SMAD介导的信号传导诱导神经发生。合适的SMAD抑制剂包括头蛋白蛋白质、SB431542(Tocris)、dorsomorphin和LDN-193189(Tocris)。以有效浓度使用SMAD抑制剂。例如，头蛋白可以以0.1ng/ml-1μg/ml，优选1ng/ml-500ng/ml，更优选10ng/ml-200ng/ml，最优选50ng/ml的浓度使用。SB 431542可以以0.1μM-1mM，优选1μM-100μM，更优选5μM至50μM，最优选10μM的浓度使用。使用多于一种SMAD抑制剂可以对诱导神经发生具有积极作用(实施例1)。SMAD抑制剂的一种优选组合包括头蛋白和SB 431542。SMAD抑制剂的更优选组合由头蛋白和SB 431542组成。SMAD抑制剂的最优选组合由头蛋白(50ng/ml)和SB 431542(10μM)组成。
在适合PSC培养的任何细胞培养介质中培养形成的BENO。示例性细胞培养介质包括Stemdiff神经元分化介质(Stemcell)、基础神经细胞介质(Neurobasal Medium)(Gibco)和实施例2中使用的介质。
所公开的方法的步骤D通常在步骤C之后进行。步骤C到步骤D的转变的特征在于细胞培养介质的部分或完全交换，或者可选地，将步骤D的成分添加到现有的细胞培养介质中。如本文所述，步骤D通常在步骤E之前进行。步骤D到步骤E的转变的特征在于细胞培养介质的部分或完全交换，或者可选地，将步骤E的组分添加到现有的细胞培养介质中。
在一些实施方案中，步骤D进行2天至16天的时间段。在一些优选的实施方案中，步骤D进行4天至12天。在更优选的实施方案中，步骤D进行6天至10天。在最优选的实施方案中，步骤D进行8天。已经发现，与进行3或6天相比，步骤D进行8天是有利的(参见实施例8)。步骤D进行10天比进行8天甚至更有利，而进一步延长步骤D并没有显著改善结果(请参见实施例8)。因此，在另一个特别优选的实施方案中，步骤D进行至少8天或10天。
进行此步骤的日期“指定”取决于先前进行的步骤B、C和D的持续时间。通常，步骤D的起点在第0天和第3天之间。步骤D的结束通常在第2天和第19天之间。在最优选的实施方案中，步骤D从第0天延长到第8天。在另一个特别优选的实施方案中，步骤D从第0天延长到第10天。
使用任何合适的细胞培养容器进行步骤D。示例性的合适的细胞培养容器包括具有U形底部和低附着性的96孔板或6孔板或定制的3D打印或用于单个或多个类器官培养的铸模容器。细胞培养容器通常在步骤C和D之间不会改变。进行步骤D时可以改变细胞培养容器。一种这样的示例性容器变化是从96孔板放大到6孔板。
在适于形成的BENO存活的条件下进行步骤D。示例性的合适条件是37℃，5％CO2，例如在细胞培养箱中。
在包含TGF-β和FGF-2的细胞培养介质中培养步骤D的形成的BENO，以增强基质细 胞的发生和神经发生(“步骤E”)
在包含转化生长因子(TGF)β和成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)的介质中培养步骤D之后提供的形成的BENO。TGF-β处理增强基质细胞的发生，而FGF-2增强神经发生。
TGF-β处理增强新出现的类器官中基质细胞的发生和功能。基质细胞是神经组织的基质细胞。示例性基质细胞包括神经胶质细胞。用于本发明的TGF-β可以是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3或其混合物。本发明还可以使用具有与TGF-β相同或相似的信号传导活性的TGF-β模拟物来进行，其特征在于与TGF-β受体结合从而引起TGF-β-受体介导的信号传导，其中此类活性是TGF-β1信号传导活性的至少10％。优选地，用于本发明的TGF-β是TGF-β1。TGF-β以有效浓度使用。在一些实施方案中，TGF-β的浓度为0.1ng/ml至100ng/ml。在优选的实施方案中，TGF-β的浓度为0.3ng/ml至30ng/ml。在更优选的实施方案中，TGF-β的浓度为1ng/ml至10ng/ml。在最优选的实施方案中，TGF-β的浓度为5ng/ml。
FGF-2(也称为bFGF)以有效浓度使用。在一些实施方案中，FGF-2的浓度为0.1ng/ml至1μg/ml。在一些优选的实施方案中，FGF-2的浓度为1ng/ml至100ng/ml。在更优选的实施方案中，FGF-2的浓度为5ng/ml至50ng/ml。在最优选的实施方案中，FGF-2的浓度为10ng/ml。尽管本发明优选地使用FGF-2，但是本发明也可以使用与FGF-2具有相同或相似的信号传导活性的FGF-2模拟物来进行，其特征在于与FGF-受体结合从而引起FGF-受体-介导的信号传导，其中这种活性是FGF-2对每个FGF受体的信号传导活性的至少10％。
在所公开方法的这一步骤中，在适合于培养PSC的细胞培养介质中培养形成的BENO。示例性的细胞培养介质包括Stemdiff神经元分化介质(Stemcell)、基础神经细胞介质(Gibco)和实施例2中使用的介质。
步骤E通常在步骤D之后进行。步骤D到步骤E的转变的特征在于细胞培养介质的部分或完全交换，或者可选地，将步骤E的成分添加到现有的细胞培养介质中。通常，在步骤F之前进行步骤E，如下所述。步骤E到步骤F的转变的特征在于细胞培养介质的部分或完全交换，或者可选地，将步骤F的成分添加到现有的细胞培养介质中。
在一些实施方案中，步骤E进行2天至16天的时间段。在优选的实施方案中，步骤E进行4天至12天。在更优选的实施方案中，步骤E进行6天至10天。在最优选的实施方案中，步骤E进行7天。已发现与进行7天相比，步骤E进行5天并没有明显的劣势；相反，步骤E进行2天导致较差的BENO聚集(condensation)(参见实施例8)。因此，在另一个特别优选的实施方案中，步骤E最多进行7天或5天。
进行此步骤的日期“指定”取决于先前进行的步骤B、C、D和E的持续时间。通常，步骤E的起点在第3天到第15天。步骤E的结束是在第5天到第20天。在最优选的实施方案中，步骤E从第8天延长到第15天。在另一个特别优选的实施方案中，步骤E从第10天到第15天进行。
使用任何合适的细胞培养容器进行步骤E。示例性的合适的细胞培养容器包括6孔或定制的3D打印或用于单个或多个类器官培养的铸模容器。通常在步骤D和E之间不改变细胞培养容器。进行步骤E时，可以改变细胞培养容器。
步骤E在适于形成的BENO存活的条件下进行。示例性的合适条件是37℃，5％CO2，例如在细胞培养箱中。
在包含TGF-β和一种或多种notch信号传导抑制剂的细胞培养介质中培养步骤E的 形成的BENO，以增强基质细胞发生和神经分化(“步骤F”)。
在包含转化生长因子β(TGF-β)和一种或多种notch信号传导抑制剂的培养介质中，培养步骤E之后提供的形成的BENO。用TGF-β处理增强基质细胞的发生，而抑制notch信号传导增强神经分化。
用TGF-β处理增强新出现的类器官中基质细胞的发生和功能。基质细胞是神经组织的基质细胞。示例性基质细胞包括神经胶质细胞。用于本发明的TGF-β可以是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3或其混合物。本发明还可以使用与TGF-β具有相同或相似的信号传导活性的TGF-β模拟物进行，其特征在于与TGF-β受体结合从而引起TGF-β-受体介导的信号传导，其中此类活性是TGF-β1信号传导活性的至少10％。TGF-β以有效浓度使用。在一些实施方案中，TGF-β的浓度为0.1ng/ml至100ng/ml。在优选的实施方案中，TGF-β的浓度为0.3ng/ml至30ng/ml。在更优选的实施方案中，TGF-β的浓度为1ng/ml至10ng/ml。在最优选的实施方案中，TGF-β的浓度为5ng/ml。
Notch信号抑制剂被用于抑制由notch受体(例如，notch 1至notch 4受体)介导的细胞信号传导。Notch信号传导的抑制增强神经分化。合适的notch信号传导抑制剂包括N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸-1,1-二甲基乙基酯(DAPT)、化合物E(Stem cell technologies)和γ-分泌酶抑制剂，如Olsauskas-Kuprys等人,OncoTargetsand Therapy,2013中所述的那些抑制剂。Notch信号传导抑制剂以有效浓度使用。本发明的优选的notch信号传导抑制剂是DAPT。在一些实施方案中，DAPT的浓度为0.01μM至100μM。在一些优选的实施方案中，DAPT的浓度为0.1μM至10μM。在更优选的实施方案中，DAPT的浓度为0.5μM至5μM。在最优选的实施方案中，DAPT的浓度为2.5μM。
在所公开方法的这一步骤中，在适合于其培养的细胞培养介质中培养形成的BENO。示例性细胞培养基包括Stemdiff神经元分化介质(Stemcell)、基础神经细胞介质(Gibco)和实施例2中使用的介质。
步骤F通常在步骤E后进行。步骤E到步骤F的转变的特征在于细胞培养介质的部分或完全交换，或者可选地，将步骤F的成分添加至现有的细胞培养介质。
在一些实施方案中，步骤F进行5天至95天的时间段。在优选的实施方案中，步骤F进行7天至50天。在更优选的实施方案中，步骤F进行10天至20天。在最优选的实施方案中，步骤F进行13天。
进行此步骤的日期“指定”取决于先前进行的步骤B、C、D、E和F的持续时间。通常，步骤F的起点在第4天到第35天之间。步骤F的结束是在第9天到第100天之间。在最优选的实施方案中，步骤F从第15天延长到第28天。
使用任何合适的细胞培养容器进行步骤F。一个示例性的合适的细胞培养容器是6孔板或定制的3D打印或用于单个或多个类器官培养的铸模容器。通常在步骤E和F之间不改变细胞培养容器。
在适合于形成的BENO存活的条件下进行步骤F。示例性的适合条件是37℃，5％CO2，例如在细胞培养箱中。
本文公开的方法的步骤F的完成提供了BENO。在步骤F之后，根据期望的BENO的应用，可以在合适的条件下进一步培养或扩增BENO。额外的培养可以导致BENO的其他特性的发展和/或优化神经发生。
根据本发明的方法产生的神经元类器官的特性和优点。
通过本文公开的方法产生的神经元类器官(即BENO)表现出皮质发育、神经发生和神经胶质细胞发生。BENO包括神经元细胞和基质细胞。基质细胞(如神经胶质细胞)对于提供促进神经发生的环境是重要的，该环境在实践所公开的方法时产生。通过本文公开的确定的生长因子和小分子同时发生神经发生和神经胶质细胞发生，有效地重建了人脑的多细胞复杂性。
通过公开的方法产生的神经元类器官显示出以前未显示的独特特征。例如，本文所述的BENO形成以神经元功能为特征的功能性神经元网络，包括功能性突触的形成、分层网络的形成、GABA能网络以及神经元的同步(实施例5)。这些神经元功能代表了优于常规神经元类器官的至少一项重要优势。特别地，BENO可包含兴奋性和抑制性神经元以及兴奋性和抑制性神经元网络。
而且，通过本发明的方法产生的BENO优选在完全限定的条件下(例如，无血清)生产。这意味着可以可靠地再现BENO，因为消除了源自不确定或不明确的化学成分的变化。
BENO的应用
通过本发明的方法产生的BENO可以用于所谓的表型药物筛选。与靶标特异性药物筛选技术不同，表型药物筛选的重点不是候选分子与特定靶标的结合，而是靶标分子对表型的作用。这种表型药物筛选的前提是存在可以模拟所研究疾病表型的合适模型。当研究与神经组织相关的各种疾病时，本公开的BENO可以提供这种疾病模型。本发明可为其提供合适的药物筛选模型的疾病包括中风、脑炎性疾病、神经退行性疾病(例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病，如实施例6)、神经炎性疾病(例如多发性硬化症)、创伤性损伤(例如脑外科手术引起的损伤)、离子通道病(例如癫痫)和精神病(包括自闭症和精神***症，如实施例7)。
BENO可用于通过表型药物筛选发现和精制药物。BENO的这种用途包括发现和精制可诱导或增强脑和神经组织的修复、再生、保护和疾病预防的药物。
可从健康个体或患病患者获得可用于此类BENO模型的PSC。或者，可以应用多能干细胞的基因编辑来创建任何感兴趣的遗传和表观遗传修饰。因此，在根据本公开的方法从PSC生产BENO组合物之后，BENO允许具有高预测价值的表型组织筛选。由于神经组织的更高程度的成熟、细胞复杂性和分层的网络功能，使用根据本发明的BENO比常规模型提供许多优点。此外，所公开的用于BENO生产的方法的简单性使得容易实现高通量表型筛选。可以使健康和疾病模型化的BENO进行疾病模拟(例如，低氧诱导中风样损伤)。表型读数包括对BENO中特定细胞类型的组织形成、电连接、细胞死亡和细胞增殖的作用。表型药物筛选可以定义和验证各种药物靶标。因此，这可以为随后的化合物筛选提供基础，以鉴定例如具有再生、修复、疾病改变或保护性生物学活性的化合物。
根据本公开的方法生产的BENO还可用于药物安全性筛选，以测试例如物质在神经组织中诱导电干扰(癫痫发作)、变性、细胞死亡或其他细胞异常的潜能。
通过本发明的方法产生的BENO还可以用于涉及药物的作用方式研究，例如，在与临床试验平行进行的临床前试验中。
通过本发明的方法产生的BENO也可以用于个性化医疗的目的。例如，患者来源的iPSC可用于模拟疾病和测试个性化疗法。本发明的BENO可特别用于测试对与神经组织相关的疾病(例如神经退行性疾病或神经炎性疾病)的疗法。可以使用所描述的BENO探索和测试所有可能的疗法选择，例如通过药物、生物制剂(如抗体或非编码RNA)、基因编辑或其组合进行的疗法。
BENO还可以用于在BENO与其他组织工程化平台的共培养中生成逐渐复杂的组织模型。在一些实施方案中，用EHM(工程化的心肌)和BSM(生物工程化的骨骼肌)的共培养可用于研究神经肌肉接头(junction)的发育。具体而言，BENO与EHM的共培养可用于研究神经元和起搏器或神经元和心肌细胞的相互作用。然后，该模型可用于研究心律失常的发展。在其他实施方案中，将BENO与ESM(工程化的骨骼肌)、ELT(工程化的肝组织)或ECT(工程化的***)共培养。在其他实施方案中，使用BENO-肿瘤模型来研究肿瘤-脑相互作用(例如，肿瘤脑侵袭、转移扩散)或使用BENO-白细胞浸润模型来研究神经炎症(例如，自身免疫疾病)。通常，这样的共培养模型代表了针对药物作用和相互作用的平行多器官筛选的重要步骤。共培养模型可以进一步用作疾病模型，如帕金森氏病和其他神经退行性疾病，例如，以测试其作为个性化治疗的功效。
本发明的BENO还可以提供用于科学或治疗目的的再生组织。例如，可以损伤BENO以研究药物或生物物理(例如电调理)治疗后的修复和再生。或者，可以构建具有特定脑功能(如多巴胺产生和释放以对抗帕金森氏病)的BENO。可以进一步将BENO连接到器官或用作机器-器官界面以实现对衰弱(enervated)器官的控制(例如，控制骨骼肌)。
试剂盒
本发明的试剂盒包含用于实施本公开的方法的成分。在一些实施方案中，试剂盒包含PSC、基质、合适的介质和所需的补充剂(ROCKi、FGF-2、视黄酸、一种或多种SMAD信号传导的抑制剂、TGF-β和一种或多种notch信号传导的抑制剂)。在其他实施方案中，试剂盒包含基质、合适的介质和所需的补充剂(ROCKi、FGF-2、视黄酸、一种或多种SMAD信号传导的抑制剂、TGF-β和一种或多种notch信号传导的抑制剂)。在其他实施方案中，试剂盒包含基质和所需的补充剂(ROCKi、FGF-2、视黄酸、一种或多种SMAD信号传导的抑制剂、TGF-β和一种或多种notch信号传导的抑制剂)。在其他实施方案中，试剂盒包含基质和至少4种所需的补充剂(ROCKi、FGF-2、视黄酸、一种或多种SMAD信号传导的抑制剂、TGF-β和一种或多种notch信号传导的抑制剂)。
实施例
生产BENO的通用方案
以下方案提供了可用于从PSC来源生成BENO的步骤。
材料
在实施例中体现的实验中使用了以下材料清单：
-TeSRTM-E8TM试剂盒，Stemcell Technologies#05940
-EDTA溶液0.5M，pH 8，AppliChem#A4892.0500
-Matrigel(降低生长因子的)，BD Bioscience#354230
-Neurobasal-A，Thermofischer#10888-022
-100×青霉素/链霉素(P/S)，Thermofischer#15140-122
-100×谷氨酰胺，Thermofischer#25030-024
-FGF-2，Miltenyi Biotech#130-093-841
-B27，Thermofischer#17504-044
-N2，Thermoscientific#17502-048
-DMSO，Sigma，#276855
-头蛋白，R&D systems#6057-NG-025
-L-抗坏血酸2磷酸倍半镁盐水合物(ASC-2-P)，Sigma#A8960-5G
-全反式视黄酸，Sigma，R2625-50MG
-TGF-β1(TGFB1)，Peprotech，#100-21
-ROCKi(Y27632)，Stemgent，#04-0012
-SB 431542，Tocris，#1614
-DAPT，Tocris，#2634
-96孔板(U形底部，低附着性)，Sarstedt#83.1837.500
-T25烧瓶，Sarstedt#83.3910.002
-6孔板，Greiner#657160
储备溶液(-20℃)
-根据制造商的说明制备的10μg/ml的FGF-2储备液
-根据制造商的说明制备的250μg/ml的头蛋白储备液
-200mM ASC-2-P在水中的储备液
-根据制造商的说明制备的10μg/ml TGFB1储备液
-10mM ROCKi在DMSO中的储备液
-10mM SB 431542在DMSO中的储备液
-100mM DAPT在DMSO中的储备液
-10mM视黄酸的DMSO溶液
工作溶液(4℃)
0.5mM EDTA溶液
将500μl 0.5M EDTA储备溶液(pH 8.0)添加到500ml含0.45g NaCl的无钙/镁的PBS中。无菌过滤(0.22um)，等分并在4℃下保存6个月。
1:30的Matrigel溶液
使用预冷的吸头将1ml Matrigel在29ml冰冷的PBS中稀释，以防止Matrigel聚合。如果溶液不清，在冰箱中过夜存放，然后再次混合。
TeSRTM-E8TM介质
根据制造商的说明制备，添加1％P/S
基础介质
Neurobasal-A补充有：
1％100x谷氨酰胺，1％100x P/S，2％B27，1％N2，200μM，ASC-2-P
神经定向介质(Neural Commitment Medium，NCM)
基础介质(50ml)，补充有：
50ng/ml头蛋白(10μl)；在一些实验中，使用10μM SB 431542(50μl)，1μMRA(5μl)。
神经祖细胞扩增介质(NPEM)
基础介质(50ml)，补充有：
10ng/ml FGF-2(50μl)；在某些实验中，使用5ng/ml TGFB1；在某些实验中，使用BDNF(20ng/ml)和GDNF(10ng/ml)。
神经分化介质(NDM)
基础介质(50ml)，补充有：
在一些实验中，2.5μM DAPT(1.25μl)；在一些实验中，5ng/ml TGFB1(25μl)；在一些实验中，2.5μM DAPT(1.25μl)和5ng/ml TGFB1(25μl)
实验方法
第-4天(多能干细胞的标准维持培养，作为制备细胞的实施例使用)
Matrigel包被
生长因子降低的Matrigel以1：120在冰冷的PBS中稀释，并立即包被板(150μl/cm2)。然后将包被的板在冰箱中保存最多2周。在使用之前，将包被的板用乙醇消毒，并在37℃的培养箱中放置30-60分钟。
EDTA传代(给出用于T-25***体积)
在加入3ml(120μl/cm2)0.5mM EDTA之前，将细胞用2ml(80μl/cm2)0.5mMEDTA洗涤两次。将细胞在室温孵育5-10分钟。当在Matrigel上生长时，某些细胞系可能需要2mM EDTA处理5-8分钟。孵育后，小心吸出EDTA溶液。然后将含有10μM ROCKi的3ml新鲜E8培养介质添加至细胞中，随后使用含有5μMROCKi的5ml介质将其接种在合适的新烧瓶中(50,000/cm2)。在第二天，将介质更改为没有ROCKi的介质。
第-1天(铸塑BENO)
下图表示了每个为30μl体积的10BENO的配方(加上20％的体积作为移液储备)：
以50μl I型胶原蛋白(来自6.9mg/ml储备液，最终浓度为1mg/ml)、与50μl2XDMEM、9.5μl 0.1M NaOH和、含有900,000未分化的多能干细胞(例如，iPSC-G1系；Tiburcy等人,Circulation,2017)的补充有20ng/ml FGF和10μM ROCKi的E8介质中的238μl细胞悬浮液开始。如上所述，通过EDTA孵育使细胞脱离。然后将30μl的悬浮液吸移到96孔板的孔中(U形底部，低附着性)，并置于37℃的培养箱中放置20分钟，以增强胶原蛋白的固结(均匀的细胞捕获)。20分钟后，将具有10ng/ml FGF和10μM ROCKi的250μl E8添加到每个孔中，并返回到培养箱中。
第0天、第1天和第2天(介质交换)
除去200μl介质，并添加200μl NCM/孔。
第3天(介质交换和BENO转移)
使用宽口吸头移液器将10BENO转移到含有5ml NCM的6孔板中。
第六天(介质交换)
除去4ml介质，每孔加入5ml新鲜NCM。
第8、10和13天(介质交换)
当在选定的实验方案中使用NPEM时，除去4ml介质，每孔添加5ml新鲜NPEM。如果不使用NPEM，则将细胞维持在基础介质中。
第15、17、20、22、24和27天(介质交换)
当在选定的实验方案中使用NDM时，除去4ml介质，并每孔添加5ml新鲜NDM。如果不使用NPEM，则将细胞维持在基础介质中。在第28天评估细胞。如果延长培养时间，则将细胞保持在基础介质中，由此如上所述每隔二天更换一次介质。
实施例1：优化生产BENO的方案
为了优化所公开的用于神经诱导、NPC量和神经元分化的方案，进行了以下研究。所得数据允许建立用于生产BENO的最佳方案(实施例2)。
神经诱导优化
在最初的尝试中，采用单一的SMAD通路抑制作用(使用头蛋白)来引发神经诱导，同时添加视黄酸(RA)。在本研究中，测试了在神经诱导阶段(第0-8天)使用头蛋白和SB431542双重SMAD信号传导通路抑制是否可能进一步增强神经发生，例如在第28天。因此，分别研究了仅包含头蛋白的NCM或包含头蛋白和SB431542的NCM。如通过免疫荧光分析(图2A)和PAX6和MAP2的转录物分析(图2B)所证实的，清楚地观察到双重SMAD抑制对于所得的成熟神经元的量是有利的。
NPC数量增加
在组织铸塑时增加起始输入的多能干细胞(PSC)的量导致神经元的数量明显更高(图3A)。因此，通过用FGF-2处理类器官(第8-15天)来增加组织内的神经祖细胞(NPC)的量似乎是有利的。这对应于在以上方案中使用NPEM。为了测试FGF-2的使用是否有利，在两个不同的时间点用10ng/ml FGF-2处理组织(3000细胞/μl)；第-2天到第0天(在干细胞阶段进行神经诱导之前)，和在NPC阶段的第8天到第15天(图3B)。与未处理的组织相比，在第-2-0天进行FGF-2处理似乎没有提供任何优势。但是，在第8-15天使用FGF-2处理细胞(即使用NPEM)显著诱导了包括NPC的细胞的增殖，导致在第28天更复杂的神经元网络，如通过神经丝的IF全组织标本包埋染色所观察到的(图3B)。双重处理(第-2-0天和第8-15天)似乎不比单一治疗(第8-15天)有利。
神经分化优化
文献中的许多常规方案采用神经营养因子BDNF和GDNF来改善分化和成熟阶段的神经元存活。因此，测试了在培养第10-28天期间向NPEM中添加BDNF(20ng/ml)和GDNF(10ng/ml)是否会导致到第28天有更多数量的成熟神经元(图4)。
这些结果表明，BDNF和GDNF不增加神经元标记物PAX 6或成熟标记物MAP2的量。因此，方案中未采用BDNF或GDNF处理。另一方面，向NDM中添加notch抑制剂DAPT(2.5μM，第15-28天)导致PAX6转录物的增加，表明积极的作用(图5)。
优化实验
在优化的最后阶段，为了鉴定最有效的神经分化方案，对五个不同的方案进行了测试和比较。在所有方案中，分化均在补充有B27和N2的基础神经细胞介质中进行。在双重SMAD抑制(头蛋白&SB431542)和额外的视黄酸(RA)补充以模拟在胚胎神经发生过程中发生的信号传导的情况下，对hiPS细胞进行神经外胚层诱导(第0-8天)。在方案2中，测试了FGF-2(第8-15天)在神经祖细胞(NPC)中的增殖作用。在方案3中，测试了Notch抑制剂DAPT对NPC神经元定向(commitment)的作用(第15-28天)。在方案4中，测试了TGF-β1对神经胶质细胞的增殖作用(第8-28天)。在方案5中，将TGF-β1和DAPT处理组合以测试是否可以同时增强神经胶质细胞和神经元的发育。在图6A中总结了不同的方案。
为了评估不同方案提供的神经生成和神经胶质细胞生成潜能，在第-1、0、3、8、15、28和40天(3-6个组织/时间点)收集组织。由于直到第8天对于所有方案的处理都是相同的，因此直到该时间点仅从方案1中收集组织。用FGF-2的处理(方案2)在任何时间点都不会显著影响不同标记物的水平，这结果是出乎意料的。然而，用DAPT处理(方案3和5)显著增加了神经元标记物PAX6、MAP2、GRIN1和GABBR2的量。与其他3种方案相比，到第40天，用TGF-β1处理(方案4和5)显示出更高量的神经胶质细胞标记物GFAP(图6B)。由于用DAPT处理(方案3和5)明显支持神经发生，而TGF-β1似乎支持神经胶质细胞发生，因此对方案3(DAPT)和方案5(DAPT和TGF-β1)的时程分析进行了延长。在两种方案中，在第50天和第60天神经元标记物的表达均随时间下降，这表明可能会出现其他类型的细胞，这是预期的结果，因为从第28天起，组织不再接受处理。有趣的是，方案5明确支持神经胶质细胞发生，这由GFAP转录物增加10倍得到证明。总的来说，所测试的不同方案的转录时程分析表明，方案5优于其他方案，可有效产生神经发生和神经胶质细胞发生。
为了验证转录物分析数据，使用抗神经丝(神经元)、GFAP(神经胶质细胞)、突触素(神经元突触)和MAP2(成熟神经元)的抗体对经历方案3和方案5的第60天的组织染色(图6C)。来自方案5的组织比来自方案3的那些组织包含更多的胶质细胞，而成熟神经元的数量似乎相同。
神经胶质细胞的存在对于神经元活动很重要。因此，通过测量自发钙的活性进一步探索了方案5中BENO活性增强的最初假设。为了以系统的方式对此进行分析，在用FURA-4对组织(n＝3/组)进行染色后，然后通过共聚焦成像在五个不同区域/组织中可视化钙活性(如图6D所示)。该图表示了在这五个区域中每个区域观察到的平均钙活性。用TGF-β1和DAPT(方案5)处理的组织显示出更多的组织区域显示钙活性。
总而言之，汇总的数据支持这样的结论：在RA存在下双重SMAD抑制后，FGF-2处理增强NPC，DAPT支持神经发生，而TGF-β支持神经胶质细胞发生。因此，优化的分化方案(实施例2)结合了使用所有上述因子(图6A中指示的时间点)进行处理。
实施例2：用于生成人生物工程化的神经元类器官(BENO)的优化方案
以下研究建立了生产人生物工程化的神经元类器官(BENO)的最佳方案。
材料
这些实验中使用的材料与实施例1中使用的材料相同。
储备溶液(-20℃)
这些实验中使用的储备溶液与实施例1中使用的储备溶液相同。
工作溶液(4℃)
这些实验中使用的EDTA 0.5mM溶液、1:30的Matrigel溶液、TeSRTM-E8TM介质和基础介质与实施例1中使用的相同。
神经存在介质(NCM)
基础介质(50ml)补充有10μM SB 431542(50μl)、50ng/ml头蛋白(10μl)和1μM RA(5μl)。
神经祖细胞扩增介质(NPEM)
基础介质(50ml)，补充有10ng/ml FGF-2(50μl)和5ng/ml TGFB1。
神经分化介质(NDM)
基础介质(50ml)，补充有2.5μM DAPT(1.25μl)和5ng/ml TGFB1(25μl)。
实验方法
第-4天(多能干细胞的标准维持培养，作为制备细胞的实施例使用)
这些实验中使用的Matrigel包被和EDTA传代(用于T-25烧瓶)与实施例1中所使用的相同。
第-1天(铸塑BENOS)
与实施例1中使用的方案相同。
第0天、第1天和第2天(介质交换)
除去200μl介质，并添加200μl NCM/孔。
第3天(介质交换和BENQ转移)
使用宽口吸头移液器将10BENO转移到含有5ml NCM的6孔板中。
第6天(介质交换)
除去4ml介质，每孔加入5ml新鲜NCM。
第8天、10天和13天(介质交换)
除去4ml介质，每孔加入5ml新鲜NPEM。
第15、17、20、22、24和27天(介质交换)
除去4ml介质，每孔加入5ml新鲜NDM。在第28天评估细胞。如果延长培养时间，则将细胞维持在基础介质中，由此如上所述每隔二天更换一次介质。
实施例3：BENO的高通量转录组分析
为了表征在BENO组织生产过程中不同时间点(例如，第-1、0、3、8、15、28、40、50和60天)出现的细胞类型，将细胞进行RNAseq分析；每个时间点3-6个组织)。
首先，测试在细胞培养的时程中细胞的分化状态。如所预期的，干细胞标记物NANOG和POUF5A1在第-1天和第0天高表达，但是在神经诱导后3天，这些标记物的表达显著降低。相反，既是干细胞标记物又是NPC标记物的SOX2在这些时间点没有显示任何降低，但在第15天与其他神经外胚层和NPC标记物一起达到了最大表达。这些数据与已知的FGF-2的增殖作用一致。大多数神经元结构标记物(MAP2、MAPT、NFASC、TUBA1A)在第28至40天时显著增加。一旦神经发生完成，就开始神经胶质细胞发生(第50-60天)。在第8天在大多数干细胞被认定(commit)为祖细胞时，也观察到放射状神经胶质细胞标记物PDGFR-α强烈表达(图7A)。
为了表征存在于细胞培养物中的不同类型的神经元细胞，研究了在血清素能、GABA能、谷氨酸能、多巴胺能和胆碱能神经元中表达的特异性标记物，结果如图7B所示。从第28天起，发现所有这些神经元类型的标记物都存在于神经组织中。有趣的是，尽管发现神经元结构转录物从第50天起减少，但单个神经元标记物却增加或维持，因此表明尽管细胞成熟仍在进行，但神经元的分化可能至第40天完成。
类似地，对不同皮质层标记物的分析表明，所有三层都存在于类器官中(图7C)。
最后，为了检查分化方案期间BENO中包含的神经元的成熟状态，分析了神经元受体表达(GABA、DOPA、红藻氨酸、AMPA、NMDA)、离子通道表达(K+、Ca2+、Na+)和突触蛋白表达(SYN1、SYT4、SYP、SYNPO)。在第28天观察到编码这些蛋白的转录物表达增加，并且直到第60天一直保持稳定或保持增加。这一发现支持以下结论，即尽管分化在第40天时停止，但神经元成熟和神经胶质细胞发生一直持续到分化方案结束。
实施例4：通过全组织标本包埋IF验证转录组分析的发现结果
为了验证BENO模型是否模拟正常的皮质发育，通过免疫染色方法分析了标记物CTIP2(V-VI层神经元)、TBR2(室管膜下区前体细胞)和SOX2(神经干细胞)。在第40天，未检测到SOX2阳性细胞。另一方面，如在皮质发生期间观察到的，TBR2细胞和CTIP2细胞相对于彼此同心地分布(图8)。
使用IF分析，验证了BENO中GABA能中间神经元的强烈存在。对GABA能标记物GABA和相应的受体GABBR2进行染色(图9A，图9B)。GABA在GABA能神经元轴突的细胞体区以及突触结中强烈表达。观察到GABBR2在神经核核周体中表达。此外，用TH对复杂的多巴胺能网络进行了免疫染色，从而表明了中脑身份。与GABA相似，在细胞体以及在类器官周围延伸的神经元轴突中均检测到TH(图9C)。最后，突触素染色表明神经元上有大量的突触结，因此暗示了功能性神经元网络的存在(图9D)。
实施例5：神经元活性：GABA能网络
本文公开的数据(例如，在实施例1-4中)证明了BENO可以有效地模拟正常皮质层的发育，并且还包含多种神经元和神经胶质。随后使用钙成像对这些产生的神经元的功能进行了研究，钙成像可以识别神经元网络。
为了测试神经元网络活性，在GABA能抑制下对BENO(第30-60天)进行钙成像(使用58μM苦味毒(picrotoxin)；330μM沙氯芬(saclofen)进行；n＝3)。GABAR抑制导致先前自发同步的神经元(4对细胞)非同步。冲洗抑制剂后，相同的神经元重新同步，从而表明存在功能性GABA能网络(图10)。功能性神经元网络未在其他神经元类器官中发生，这表明用于增强细胞复杂性的分阶段定向分化方案(实施例2)不仅在结构意义上而且在分层网络功能方面模拟人脑发育。
总之，本发明的实施例1-5令人信服地证明了用于从人多能干细胞工程化电活性神经元网络的新型基于胶原蛋白的、无血清、阶段特异性的定向分化方法。
实施例6：BENO作为神经元再生的模型
为了研究损伤反应和组织修复机制，将BENO暴露于损伤。例如，通过N2冷却的金属针、压缩或解剖、在亚临界0％的氧气中培养以及暴露于谷氨酸、多巴胺、乙醇、河豚毒素、肉毒杆菌或破伤风毒素，可以产生冷冻、机械、低氧或神经毒素诱导的整体或局部损伤。特异地研究了从损伤中的恢复，包括细胞特异性反应(例如，通过神经元和神经胶质细胞)。研究了例如通过诱导神经元增殖的修复和再生、以及例如通过使用抗氧化剂或药理调节剂的对损伤的保护。BENO用作模型来鉴定和验证新的疾病修饰靶标，包括神经元保护、修复和再生。BENO用于不同的发育阶段，例如，用作增殖的神经元(实施例2方案的第15天、第28天)和有丝***后的神经元(实施例2方案的第40天、第60天)。
实施例7：BENO作为个性化疾病模型，例如精神***症
由多能干细胞产生BENO，例如通过重编程或例如通过CRISPR/Cas或TALEN技术进行遗传工程化而从患者获得。如上所述，使用钙活性评估、免疫荧光分析或电生理学方法(例如，刺穿电极测量、多电极阵列/场电势测量)对BENO进行表型分析。平行地进行RNA测序和蛋白质组分析以用于表型-基因型相关研究。
BENO的一种用途是对精神***症领域进行建模。从精神***症患者获得的iPSC细胞中产生BENO。随后，对这些患者的BENO进行表型分析，以分析与健康对照受试者之间的表型差异。设计其他研究以研究源自患有自闭症、常见的偏瘫和癫痫患者的BENO。
实施例8：步骤C和D中神经元诱导和扩增的进一步优化
为了测试步骤D和E的最佳持续时间，进行了实施例2的方案，仅改变了步骤D和E的持续时间(图11)。随后，通过确定作为神经元定向参数的神经元标记物PAX6的mRNA表达来评估每种方案的结果。
这些实验表明，实施例2的标准方案，用NCM孵育8天(步骤D)优于较短的孵育时间(如3或6天)(图11A)。与孵育8天相比，用NCM孵育10天产生的PAX6 mRNA表达略高(图11B)，而更长的孵育并没有进一步增加PAX6mRNA的表达(图11B)。该结果表明10天是用NCM孵育的最佳持续时间(步骤D)。
这些实验还表明，与实施例2中的7天标准时间相比，NPEM孵育缩短至2或5天(步骤E)没有对PAX6 mRNA表达产生负面影响(图11A)。通过免疫荧光分析研究了在持续不同时间时用NPEM所孵育的BENO的其他特性(图11C)。发现NPEM孵育至少5天是优选的，因为BENO仅在NPEM孵育5天后才显示出稳健的组织聚集和神经元增殖。该结果表明5至7天是用NPEM孵育的最佳持续时间(步骤E)。
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