一种长喙壳菌外源基因转化的方法
阅读说明：本技术 一种长喙壳菌外源基因转化的方法 (Method for transforming exogenous gene of shell fungus longrostone ) 是由 李健强 张治萍 李迎宾 罗来鑫 于 2019-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了属于生物技术领域的一种长喙壳菌外源基因转化的方法。本发明的方法通过将长喙壳菌的原生质体与适量的含有筛选标记的外源DNA片段和含有向导RNA(SgRNA)的质粒载体进行混合,然后利用PEG介导的原生质体的转化及转化子筛选,从而将含有筛选标记的外源DNA片段转入长喙壳菌基因组中,实现了PEG介导的长喙壳菌原生质体转化,建立了一套完整的遗传转化、筛选方法,易获得表达潮霉素抗性蛋白且稳定遗传的转化菌株,转化效率较高。(The invention discloses a method for transforming exogenous genes of a shell bacterium longum, belonging to the technical field of biology. The method of the invention mixes the protoplast of the long coracoid shell bacterium with a proper amount of exogenous DNA segment containing a screening marker and a plasmid vector containing guide RNA (SgRNA), and then utilizes the PEG-mediated transformation of the protoplast and the screening of transformants, thereby transferring the exogenous DNA segment containing the screening marker into the genome of the long coracoid shell bacterium, realizing the PEG-mediated transformation of the protoplast of the long coracoid shell bacterium, establishing a set of complete genetic transformation and screening methods, easily obtaining a transformation strain expressing hygromycin resistance protein and stably inheriting, and having higher transformation efficiency.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种长喙壳菌外源基因转化的方法。
背景技术
长喙壳菌是一种分布广泛且危害严重的病原真菌，可侵染14个属30余种木本及草本植物。在我国已有该菌危害甘薯、石榴、桉树、芋头、枇杷、天南星、芒果等作物的报道。其中在石榴和芒果上引起严重的维管束病害，生产上称之为“癌症病害”。
由于目前对该类真菌的研究多集中于传统生物学方面，鲜有其分子机制方面的研究，检索国内外相关文献未见其遗传转化方法相关报道。为了进行长喙壳菌分子生物学方面的研究，建立一个高效的遗传转化体系是必需的，也是深入研究该菌对经济林木及草本植物的致病分子机制以及菌株自身生长发育的前提。因此，建立一种简单、高效、稳定的遗传转化方法对研究石榴枯萎病、芒果枯萎病等该类病害的致病机理具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种简单、高效、稳定的长喙壳菌的遗传转化方法。
为此，本发明的技术方案如下：
一种长喙壳菌转化的方法，包括以下步骤：
(1)制备长喙壳菌的原生质体悬浮液，然后将原生质体悬浮液、外源DNA片段或其质粒、和表达CRISPR/Cas9-sgRNA质粒混合，加入肝素钠后，静置处理，离心；
(2)离心后弃上清液，将沉淀加入培养基中进行再生培养，后转入平板进行生长培养，筛选后，得转化子。
上述方法中，所述外源DNA片段包含要敲除的目的基因上、下游800-1200bp，例如包含目的基因上、下游800bp、900bp、1000bp、1100bp或1200bp。
上述方法中，所述外源DNA片段还包含筛选或标记基因，例如，潮霉素基因。
上述方法中，所述筛选或标记基因可以为双筛选或双标记基因。
上述方法中，进一步，所述外源DNA片段还可以包含要***的外源基因片段。
上述方法中，可选的，所述外源DNA片段依次包含要敲除的目的基因上游800-1200bp、筛选或标记基因、或外源基因和要敲除的目的基因下游800-1200bp。
上述方法中，所述含有外源DNA片段的质粒，其原始骨架，可选的，为PSK(-)质粒。
上述方法中，所述原生质体悬浮液的制备方法包括：用缓冲液重悬原生质体，制备原生质体悬浮液，浓度为(1-10)×107个/mL。
上述方法中，所述外源DNA片段或其质粒、表达CRISPR/Cas9-sgRNA质粒加入的量分别为0.1-10μg/100μL。可选的，加入的量分别为0.5-5μg/100μL，或者，加入的量分别为2-5μg/100μL。
上述方法中，所述表达CRISPR/Cas9-sgRNA质粒，可选的，其原始质粒为pCRISPR/Cas-U6-1，构建方法参考文章“Tailor-Made CRISPR/Cas System for Highly EfficientTargeted Gene Replacement in the Rice Blast Fungus”。其中sgRNA根据目的基因设计和制备。
上述方法中，所述静置处理包括：加入肝素钠后，于冰上静置，再加入PTC溶液、静置、用缓冲液重悬。
上述方法中，所述PTC溶液为含有PEG4000和氯化钙的25mM Tris-HCl溶液，其pH值为7.5，其中PEG4000的含量为60-66％，氯化钙的浓度为50mM；PTC溶液加入量为：与原生质体悬浮液的体积比为25:1-2；
所述肝素钠为肝素钠溶液，浓度为5mg/mL，加入量与原生质体悬浮液的体积比为1:20-40。
上述方法中，所述缓冲液为STC缓冲液，所述STC缓冲液为含有山梨醇和氯化钙的25mM Tris-HCl溶液，其pH值为7.5，其中山梨醇的浓度为1.0M，氯化钙的浓度为50mM。
上述方法中，所述再生培养的方法包括：培养基为OCM培养基，室温培养6-8h，所述OCM培养基的组成包括：麦芽提取物5g/L、酵母5g/L、磷酸铵1.32g/L和蔗糖0.6M。
上述方法中，所述生长培养的方法包括：涂布于Bottom Agar平板，室温培养1-2天后，将未凝固的Top Agar培养基覆盖到Bottom Agar平板上，培养至转化子长出。
上述方法中，所述Bottom agar平板培养基组成包括：麦芽提取物5g/L、酵母5g/L、磷酸铵1.32g/L、琼脂16g/L和蔗糖0.6M；所述Top Agar平板培养基组成包括：麦芽提取物20g/L、酵母2g/L、琼脂糖10g/L和潮霉素50mg/L。
本发明的有益效果：
本发明通过将长喙壳菌的原生质体与适量的含有筛选标记的外源DNA片段和含有向导RNA(SgRNA)的质粒载体进行混合，然后利用PEG介导的原生质体的转化及转化子筛选，从而将含有筛选标记的外源DNA片段转入长喙壳菌基因组中，实现了PEG介导的长喙壳菌原生质体转化，建立了一套完整的遗传转化、筛选方法，易获得表达潮霉素抗性蛋白且稳定遗传的转化菌株，转化效率较高。本发明的方法可应用于长喙壳菌的分子生物学研究，如研究该菌对经济林木及草本植物的致病分子机制以及该菌的生长发育等。
附图说明
图1为长喙壳菌菌株MG-1-7阳性转化子的菌落形态图。
图2为长喙壳菌菌株MG-1-7部分转化子的琼脂糖电泳图；图中M：DNA marker，1：MG-1-7野生型菌株的扩增结果，2-3：潮霉素抗性基因的阳性对照，4-15：MG-1-7菌株部分转化子的扩增结果，N：阴性对照(ddH2O)。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。
以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。
实施例1长喙壳菌原生质体的转化
本实施例中的缓冲液STC为：含有山梨醇和氯化钙的25mM Tris-HCl溶液，其pH值为7.5，其中山梨醇的浓度为1.0M，氯化钙的浓度为50mM。
本实施例中的PTC溶液为：含有PEG4000和氯化钙的25mM Tris-HCl溶液，其pH值为7.5，其中PEG4000的含量为60％，氯化钙的浓度为50mM。
本实施例中的OCM培养基的组成为：麦芽提取物5g/L、酵母5g/L、磷酸铵1.32g/L和蔗糖0.6M。
本实施例中的Bottom agar平板培养基组成为：麦芽提取物5g/L、酵母5g/L、磷酸铵1.32g/L、琼脂16g/L和蔗糖0.6M。
本实施例中的Top Agar平板培养基组成为：麦芽提取物20g/L、酵母2g/L、琼脂糖10g/L和潮霉素50mg/L。
一、长喙壳菌原生质体的制备
长喙壳菌原生质体可以按中国专利文献CN109161485A中的方法制备，具体方法如下：
1)菌株活化培养：将保存的长喙壳菌株(Ceratocystis fimbriata)重新活化至MYEA平板，在25℃条件下培养7天；
2)菌丝体制备及收集：用打孔器取长喙壳菌株(菌株编号MG-1-10)菌落边缘生长新鲜的5mm菌丝块8个，加入装有200ml CM液体培养基的500ml锥形瓶中，在25℃条件下120rpm/min摇床培养48h，用包好一层Miracloth滤膜的200ml烧杯过滤收集菌丝；
3)酶解及原生质体收集：将收集好的菌丝体用4℃预冷的0.5M MgSO4溶液冲洗后转至50ml无菌管中，加入10ml已过滤灭菌的酶解液，在25℃、120rpm/min下酶解5h，用0.6MKCl溶液洗涤两次，4℃、4000rpm离心15min去除酶解液，再用STC溶液洗涤一次，4℃、4000rpm离心20min收集原生质体，血球计数板计数，加入4ml STC溶液重悬原生质体，浓度为6.5×107个/ml。
其中的MYEA平板培养基组成为：麦芽提取物20g/L、酵母2g/L、琼脂16g/L和100mg/L氯霉素。液体CM培养基的组分为：硫酸铵1.32g/L、麦芽提取物5g/L和酵母5g/L。酶解液为含有25mg/ml崩溃酶和20mg/ml裂解酶的0.5M MgSO4溶液，其中裂解酶为哈茨木霉的裂解酶(Sigma L1412)。
二、外源DNA片段或质粒、和表达CRISPR/Cas9-sgRNA质粒的制备含有外源DNA片段的质粒的构建：
使用的重组质粒的骨架为PSK(-)质粒，利用In-Fusion的方法(具体方法参考Takara公司In-
CRISPR/Cas9-sgRNA质粒制备：
质粒骨架为pCRISPR/Cas-U6-1，sgRNA是根据靶标菌的目的基因序列所设计的，具体方法参考2015年Takayuki Arazoe等人发表的文章“Tailor-Made CRISPR/Cas Systemfor Highly Efficient Targeted Gene Replacement in the Rice Blast Fungus”。具体过程为：将单链的SgRNA序列(序列如下如SEQ ID NO.2和3所示)去磷酸化后融合成双链，随后再利用T4连接酶将其连接到质粒pCRISPR/Cas-U6-1上，并通过热激转化的方法转入大肠杆菌，后续即可通过质粒提取试剂盒在上述大肠杆菌中提取CRISPR/Cas9-sgRNA质粒，备用。
sgRNA序列：链1(SEQ ID NO.2)：TTCGTGGCGCTGGCAATCATGGGT；
链2(SEQ ID NO.3)：AAACACCCATGATTGCCAGCGCCA。
三、转化方法如下：
(1)将长喙壳菌MG-1-7的原生质体用缓冲液STC悬浮，在显微镜下通过血球计数板计数，调整至5×107个/mL；
(2)含有200μL原生质体悬浮液的50mL离心管中加入5μg用于转化的带有潮霉素抗性基因的外源DNA片段(包含目的基因上游800-1200bp+‘3.5-hph–hsv-tk’(含有潮霉素筛选标记的基因片段，长度3.5kb)+目的基因下游800-1200bp)、5μg含有向导RNA(SgRNA)的质粒载体溶液、5μL 5mg/mL肝素钠，混匀后冰上静置20min，再缓慢加入2.5mL PTC后静置15min，最后加入25mL缓冲液STC重悬；
(3)将步骤(2)中得到的培养物4℃、4000rpm离心15-20min，弃上清液，加入1mLOCM培养基，混匀，室温再生培养6h，取100μL培养物涂布于Bottom Agar平板，室温培养1.5天后，将未凝固的Top Agar培养基覆盖到Bottom Agar平板上，培养至转化子长出。
(4)挑取单个转化子到含有50mg/L潮霉素的MYEA培养基上，筛选培养，得到阳性转化子。如图1所示。
实施例2长喙壳菌转化子的检测
(1)转化子DNA的提取：
A、分别将长喙壳菌MG-1-7野生型菌株及实施例1制备的转化子的菌丝放置在2ml离心管里，加入钢珠，用球磨仪打碎菌丝；
B、用北京博迈德基因技术有限公司生产的广谱植物基因组提取试剂盒提取步骤A中菌株的DNA，保存备用。
(2)转化子的PCR扩增
A、根据转化入长喙壳菌菌株MG-1-7的DNA片段中潮霉素抗性基因的序列，设计一对特异性引物：
Hph-F:ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG
Hph-R:CTATTCCTTTGCCCTCGGACGA
B、PCR反应体系和反应程序为：
PCR反应体系：
PCR反应程序：95℃预变性5min；随后94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸70s，进行35个循环；72℃延伸10min，置于4℃保持。
C、转化子的验证：PCR扩增后产物用质量分数1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，除MG-1-7野生型菌株未见扩增产物外，阳性对照及所有转化子均有潮霉素基因的扩增片段(1026bp)，与预期目标条带大小相同，则可确定其均为阳性转化子。阳性转化子比例(转化率)为43/70，转化率的计算方法，最后验证为阳性转化子的数量/总计计挑取得疑似转化子的数量。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种长喙壳菌外源基因转化的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5482
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttggtctg tcgacccttg aaacatttca tgcccggcca ctcactggaa catctcatac 60
gagcgaaaac gtcgttgtca cccggcaaac agccggggtt tgcgggtgtt tttagggaca 120
tttgggacat ctcgtgtggg cggcctggta catgacaggc ggaaataata ctggactgat 180
tttattggtg cttttattca tcttttgtcg tcctatagag gggtggtgcc atgaggcact 240
tactacctgt gtgttcatgt atcaacaccc actggatgga tagcttaggg ctggcctcgg 300
tcactggtag catgctgtgc ctttgcatct ttctacgcct ggaatcaagc tgacgcccca 360
tgtagaccaa tggagggctc gttttcattg cctagtgtgg gttgaagtgc ttcgctcctc 420
tcccgagcct accgtgctta attccaagga ctactcttca tacagagcat ttggcccccg 480
cgcttgcatt gatgctcgct gtgattccaa ctctcgtata tgtgcgtttc ggacggctac 540
taactttagt caacactacg tcggtaccca agctcccacc ccaccccctc ccaacaagac 600
cctgtggggc caggcaaagg acaacgccaa aggagccgaa gcgaagtggt ttgctaggtc 660
caagtgccgg gaagggcaaa gctagcagca ggtagataga tacattcccc tgtacagtac 720
agcacacgac aaacgatccc gaagcagtat gcctacagca gcagcaatgt tgaaggaggc 780
ttgagcaacc tttgggtttt ccgttcccgc cccaagccca tatcagaagt tgtataaaga 840
gcccgacctg ccctcctcca agatgggctt ttcttgttct tctcctcatc acattcaagc 900
atctctcttc tcttctaata gcttctctac cactactcta ctgcatcttc cacctagtta 960
ctctagactt ctcttttcat acttccacca acctttcaaa acagaagatg atattgaagg 1020
agcatttttt gggcttggct ggagctagtg gaggtcaaca atgaatgcct attttggttt 1080
agtcgtccag gcggtgagca caaaatttgt gtcgtttgac aagatggttc atttaggcaa 1140
ctggtcagat cagccccact tgtagcagta gcggcggcgc tcgaagtgtg actcttatta 1200
gcagacagga acgaggacat tattatcatc tgctgcttgg tgcacgataa cttggtgcgt 1260
ttgtcaagca aggtaagtgg acgacccggt cataccttct taagttcgcc cttcctccct 1320
ttatttcaga ttcaatctga cttacctatt ctacccaagc atccaaatga aaaagcctga 1380
actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct gatcgaaaag ttcgacagcg tctccgacct 1440
gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag gagggcgtgg 1500
atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt atgtttatcg 1560
gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg agttcagcga 1620
gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag acctgcctga 1680
aaccgaactg cccgctgttc tccagccggt cgcggaggcc atggatgcga tcgctgcggc 1740
cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac 1800
tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt 1860
gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc 1920
cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcatgcggat ttcggctcca acaatgtcct 1980
gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc 2040
ccaatacgag gtcgccaaca tcctcttctg gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca 2100
gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcgcc tccgggcgta 2160
tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca atttcgatga 2220
tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg ggactgtcgg 2280
gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact 2340
cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat agagtagatg 2400
ccgaccggga accagtttcg agtttctcca taataatgtg tgagtagttc ccagataagg 2460
gaattagggt tcctataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg 2520
tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca 2580
gtactaaaat ccagatcccc cgaattaatt cggcgttaat tcagtacatt aaaaacgtcc 2640
gcaatgtgtt attaagtcga cgccgctcca ccggctgcac atgtcaaggc ccacctgcgc 2700
attgccatat gaaaatggcc tgacatcatg ttgaccggcc cagcaaacct ctgcagagcg 2760
gtcaagctgg cggcgcgcgt cttgtagctc gaccacgatg ggaatgggaa tgcagcagcc 2820
cagcagccac tgtgtgccct ggtcccccgg ctccaacgtc acagccgtgg ttggtggggc 2880
atgaaccatc ccaccgccag ccagcttttc ttcccccatt gccctcgtcg gccttctgtg 2940
agcttctcaa cacatctgcc gcctctgttg actccctctc ctcctcccag accctctggt 3000
ttgccctcct gtgacctgca caatctgccc cgcgccagtg tcatagtcct tggtacgtcc 3060
ccaccaccgc gcgcctccct ctctctgtcc gctatctcga ccatatcacc accacagaga 3120
tagccaccag agtgacgtct cgtgccctgc agcgtgcctc gtgtcgactg tcttgtcaac 3180
cgtcttctcc tgcctgccaa taccccatac cacctcaaat cacccagtcg caacccttct 3240
gcccttacca gccctcggag cttatcgata tctaaccctt tgatatagtg caacaggtgc 3300
tcagcctaca atcgtctaga atggcttcgt accccggcca tcagcacgcg tctgcgttcg 3360
accaggctgc gcgttctcgc ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc 3420
agcaagaagc cacggaagtc cgcccggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata 3480
tagacggtcc ccacgggatg gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt 3540
cgcgcgacga tatcgtctac gtacccgagc cgatgactta ctggcgggtg ctgggggctt 3600
ccgagacaat cgcgaacatc tacaccacac aacaccgcct tgaccagggt gagatatcgg 3660
ccggggacgc ggcggtggta atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg 3720
tgaccgacgc cgttctggct cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc 3780
ccccggccct caccctcatc ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg 3840
ccgcgcgata ccttatgggc agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca 3900
tcccgccgac cttgcccggc acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca 3960
tcgaccgcct ggccaaacgc cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg 4020
cgattcgccg cgtttacggg ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt 4080
cgtggcggga ggattgggga cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc 4140
cccagagcaa cgcgggccca cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg 4200
cccccgagtt gctggccccc aacggcgacc tgtacaacgt gtttgcctgg gccttggacg 4260
tcttggccaa acgcctccgt cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg 4320
ccggctgccg ggacgccctg ctgcaactta cctccgggat gatccagacc cacgtcacca 4380
ccccaggctc cataccgacg atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg 4440
aggctaactg aaacacggaa ggagacaata ccggaaggaa cagtgacttc tccggaagct 4500
cctgcttgct atccccgcta gagtagtctg gcattgaagg agcccttgta ctgaacgaaa 4560
ttaatatcta cggcggggat cagcgacttc atgatacata cacatggggc acggttagag 4620
ccatgaaggc agtacgctgt tgtcgacact gtcctcccag ctgcccccct ttaaagctgc 4680
ctttacgctc agtttttctt cactgtttct ttttttttct ttttcccata actacattca 4740
ttttttattg tccatagtta ctacgcactc ctttttaatg gcatattatt tattcaccac 4800
caatatttct atcaacttga tccgtgtaac tacgtgtaac tgcgaaaaag gtgggactaa 4860
gagagatacg caagtgttaa accaagtagt aatggagata ataataaact aagtatgcag 4920
aacacgcacg tgaggttgtg actagaggtt gggacaacta aatattgtat caagtagtaa 4980
gtagaaacaa gcaaattcta gacaaaagaa aatagaaaaa atcccaagaa aagaaaaaga 5040
gggagagagc gaccatcggg cttgtcggca ggcaagcttt gactaaaggg ggagagagca 5100
gagaagaata gaagaagaag aagaagaaaa aaagaaaaaa agaaaaaaag gaaaaaagaa 5160
aatatcaaat aacctccagg ttaaatcttg tgactaccct cctacattca tacaggacaa 5220
aaggaaagaa aatgtgtgag aaaagggtcg aagaaaaaac aaaagttgaa aaaaaaaaga 5280
agaacaggaa agaaaaagga aaaaaaccat gctttgcatc cttcgatcgg gttataatag 5340
ctacccctct aatctacggc atgacatctg attggtcgtc accgctcaga tcaagctctc 5400
ctcgagctgc acgtcgtgca tgttcgcgtt cagcatagat ttcagcacgt cgagtctcag 5460
cctgttgcag gcagtcaaca ta 5482
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaacacccat gattgccagc gcca 24