阅读说明：本技术 低成本的微生物絮凝剂制备方法及其在含铜重金属废水处理中的应用 (Preparation method of low-cost microbial flocculant and application of microbial flocculant in treatment of copper-containing heavy metal wastewater ) 是由 虞磊 华景秋 徐庆涛 何涛 张锐 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种低成本的微生物絮凝剂制备方法,其步骤包括：将Bacillus菌种在盐水发酵培养基中培养；取盐水发酵培养基离心,得到上清液,上清液加NaCl进行沉淀,并收集沉淀；沉淀溶于纯水后透析,冷冻干燥,制得粉末状微生物絮凝剂。还公开了上述微生物絮凝剂在含铜重金属废水处理中的应用。本发明的有益效果：本发明的微生物絮凝剂无需在接种和扩大培养中进行高温灭菌处理,方法操作简单,可显著节省微生物絮凝剂的生产成本,生产的微生物絮凝剂对含铜的重金属废水能起到好的吸附去除作用。(The invention discloses a preparation method of a low-cost microbial flocculant, which comprises the following steps: culturing Bacillus strain in a saline fermentation culture medium; centrifuging a saline fermentation culture medium to obtain a supernatant, adding NaCl into the supernatant for precipitation, and collecting the precipitate; dissolving the precipitate in pure water, dialyzing, and freeze-drying to obtain powdered microbial flocculant. Also discloses application of the microbial flocculant in treatment of copper-containing heavy metal wastewater. The invention has the beneficial effects that: the microbial flocculant provided by the invention does not need high-temperature sterilization treatment in inoculation and amplification culture, the method is simple to operate, the production cost of the microbial flocculant can be obviously saved, and the produced microbial flocculant can well adsorb and remove copper-containing heavy metal wastewater.)

低成本的微生物絮凝剂制备方法及其在含铜重金属废水处理 中的应用

技术领域

本发明涉及一种低成本的微生物絮凝剂制备方法及其在含铜重金属废水处理中的应用，属于工业废水处理技术领域。

背景技术

作为较早被使用的废水预处理药剂，化学絮凝剂主要包括无机絮凝剂和有机高分子絮凝剂，一般认为无机和有机絮凝剂的联合投加对废水进行絮凝处理，效果明显，但它们在环境中不易被降解，残留较大，对环境易造成二次污染，且存在神经毒性，严重地威胁人体健康。与此同时，化学絮凝剂在污泥脱水中的大量使用会造成板框压滤机的滤布堵塞，不易清洗和处理，造成后续的处理成本增加。与市面上的化学絮凝剂相比，微生物絮凝剂是由微生物生长过程中向体外分泌的生物高分子有机物，主要成分为多糖和蛋白质。其在自然环境下可自行降解，无残留、无二次污染，是新型的环境友好型絮凝剂。

近年来，关于微生物絮凝剂的研究主要集中在培养条件的优化和应用方面；例如，付丽丽等人在专利CN110129375A中通过优化发酵时间和絮凝剂的提取方法提高了微生物絮凝剂的絮凝性；例如，许静等人在专利CN108793426A中将微生物絮凝剂混合物与天然高分子改性絮凝剂复合后应用在工业废水和城市废水的处理中；而对于成本控制方面却鲜有报道，本专利将根据菌株性能，在接种环节对其他菌株的进行有效阻拦，避免了种子培养基和扩大培养基的灭菌过程，节省了蒸汽、高压等使用产生的能源损耗，因此在成本控制方面具有明显效果；同时，通过此方法培养的微生物絮凝剂，具有丰富的表面官能团，其对水体中的重金属、染料等无机、有机污染物具有良好的净化效果。

发明内容

为克服现有生产技术的不足之处，本发明提供了一种微生物絮凝剂的制备方法。

本发明采取的技术方案为：低成本的微生物絮凝剂制备方法，其步骤包括：

(1)将Bacillus sp.菌种接入到种子培养基中，培养得到种子液；

(2)将种子液接种到盐水发酵培养基中培养58-120h；

(3)取盐水发酵培养基调节pH至碱性，超声，离心，收集上清液，上清液加饱和NaCl溶液，并收集沉淀；

(4)沉淀溶于纯水后透析，冷冻干燥，制得粉末状微生物絮凝剂；

其中，所述盐水发酵培养基中氯化钠浓度为50-150g/L，Bacillus sp.菌种的菌落呈圆点状，表面光滑，保藏在中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 23870，保藏日期：2015年2月11日。保藏单位的地址：北京市朝阳区酒仙桥西路24号院6号楼。

步骤(1)所述的种子培养基：葡萄糖10g/L,酵母膏1g/L,尿素1g/L,磷酸二氢钾2g/L,氯化钠50-150g/L，七水和硫酸镁0.2g/L，SL-6 1％(V/V)。

步骤(2)所述的盐水发酵培养基:蔗糖20g/L,酵母膏2g/L,尿素1g/L,磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钠50-150g/L，七水和硫酸镁0.2g/L，SL-6 1％(V/V)。

所述步骤(2)中在上清液中加入饱和NaCl溶液，搅拌，静置8小时以上，然后离心收集沉淀。

所述步骤(3)中透析使用分子量为14kD的半透膜，透析时间在24小时以上。

本发明还公开了上述的低成本的微生物絮凝剂制备方法制得的微生物絮凝剂。

以及上述的微生物絮凝剂在含铜重金属废水处理中的应用，其中废水的重金属浓度范围为20-60mg/L。

应用的步骤包括：将微生物絮凝剂加入含铜的重金属废水中搅拌处理，处理温度在4-45℃之间。

本发明的有益效果：利用Bacillus sp.菌种能够在5％以上高盐浓度下生长这一特性，在生产絮凝剂的过程中通过调节种子培养基和发酵培养基中氯化钠浓度在5％以上，减少这两个过程中的灭菌工艺，节约了生产的成本。本发明方法生产絮凝剂产量较高，1L培养基约产出1g絮凝剂。本发明生产的微生物絮凝剂絮凝效果好，适用范围广，在pH为2-10的条件下对高岭土悬浊液的絮凝率在90％以上。本微生物絮凝剂中多糖成分为54.95％，蛋白质含量为21.53％，在絮凝过程中起主要作用的是为多糖组分，经过100℃高温处理10分钟后其絮凝效果仍维持在90％左右。通过本方法培养的微生物絮凝剂，具有丰富的表面官能团，其对水中的重金属具有良好的吸附作用，100mg/L的絮凝剂对20-60mg/L的高浓度Cu²⁺去除率在35％以上。

附图说明

图1为不同盐浓度下Bacillus菌的生长曲线。

图2右起分别为只加0.3ml 0.1mol/L的氯化铁溶液，加0.3ml 0.1mol/L的氯化铁溶液和0.6mg絮凝剂，只加0.6mg絮凝剂对50ml的3g/L高岭土悬浊液絮凝效果对比图。

图3为絮凝剂SEM图及絮凝剂吸附铜离子后电子能量损失能谱mapping图。

图4为50g/L盐浓度的盐水发酵培养基中培养的菌液测序结果图。

图5为50g/L盐浓度的盐水发酵培养基中培养的菌液测序序列Blast比对结果图。

图6为絮凝剂组成及各组分对絮凝效果的影响图。

具体实施方式

实施例1-3

本微生物絮凝剂的低成本制备方法，其步骤包括：

(1)用移液枪从菌种保存管里移取100μL Bacillus sp.菌液至装有菌种活化培养基的三角瓶中，在设置温度为35℃、转速为150rpm的摇床里震荡12小时，用接种环蘸取少量菌液在活化平板培养基上划线，再将其置于培养箱中，在35℃下培养24小时，用接种环挑取活化平板培养基上的菌株接入到种子培养基中，在35℃，150rpm的条件下培养15h后即可得到种子液。

菌种活化培养基的组分为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，加水至1L；

活化平板培养基的组分为：LB培养基平板组成成分为：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂15g，加水至1L；

种子培养基组分为:葡萄糖10g/L,酵母膏1g/L,尿素1g/L,磷酸二氢钾2g/L,氯化钠100g/L，七水和硫酸镁0.2g/L，SL-6 1％(V/V)。其中SL-6微量元素溶液组成为：硼酸0.3g/L，六水合氯化钴0.2g/L，七水合硫酸锌0.1g/L，四水合氯化锰0.03g/L，钼酸钠0.03g/L，六水合氯化镍0.02g/L，氯化铜0.01g/L。

(2)具有絮凝活性的发酵液的制备：将培养好的种子液以20％的接种率接到未灭菌的盐水发酵培养基中培养，在35℃，150rpm的条件下培养90小时。如图1所示，在高盐条件下细菌可以大量生长，可得到具有絮凝活性的发酵液。

所述的盐水发酵培养基组分为:蔗糖10～20g/L,酵母膏2g/L,尿素1g/L,磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，氯化钠50～150g/L，七水和硫酸镁0.2g/L，SL-6 1％。

(3)纯化提取：将具有絮凝活性的发酵液在10000g，4℃的条件下离心30min去除菌体。在上清液中加入饱和氯化钠溶液，适当搅拌后4℃的条件下盐析过夜。将上清液离心得到白色沉淀，取其溶于适量去离子水，加入两倍体积饱和氯化钠溶液静置，重复上述步骤两次。将白色沉淀溶于适量去离子水，转入透析袋，透析24小时，期间每隔8小时更新一次。将透析后的溶液冷冻干燥，制成絮凝剂。1L培养基的产量为0.6-1g粉末状微生物絮凝剂。本微生物絮凝剂絮凝率测试步骤如下：

在3g/L浓度的高岭土悬浊液50ml中加入0.6mg的微生物絮凝剂，在200rpm下搅拌1min后在70rpm下搅拌1min，静置10min，测量上层清液550nm吸光度值。其中高岭土悬浊液的pH值约为6.8，反应温度为25℃，加入不同浓度的铁离子。由图2可以看出，本微生物絮凝剂的絮凝效果良好，最大絮凝率为97.88％，具体实验结果见表2。

其中絮凝率的计算方法：以未添加絮凝剂的高岭土悬浊液作空白对照，搅拌1min后静置10min，测试高岭土悬浊液在550nm的光浊度变化.絮凝率计算公式：

絮凝率/％＝(A-B)/A*100％(1)

式中：A—高岭土悬浊液的对照组OD₅₅₀；

B—加入絮凝剂后高岭土悬浊液OD₅₅₀。

表1.实施例1-3的盐水发酵培养基配方

	实施例1	实施例2	实施例3
				蔗糖	10g/L	15g/L	20g/L
氯化钠	50g/L	100g/L	150g/L

表2.不同Fe³⁺浓度下絮凝剂对3g/L高岭土悬浊液的絮凝效率

Fe<sup>3+</sup>浓度(mol/L)	絮凝率(％)
		1×10<sup>-4</sup>	----
2×10<sup>-4</sup>	23.18％
		3×10<sup>-4</sup>	92.79％
4×10<sup>-4</sup>	94.05％
		6×10<sup>-4</sup>	97.88％
8×10<sup>-4</sup>	90.51％
		1×10<sup>-3</sup>	94.12％

实施例4

检测本微生物絮凝剂生产过程中有无染菌，其步骤包括：

在未灭菌的盐浓度为50g/L和100g/L的发酵培养基中取2ml菌液进行16s测序，由图4可以看出测序结果为单峰，表明培养基未染菌。利用BLAST软件将测定得到的基因序列与Genbank数据库进行序列比对分析,进行同源性比较，由图5可以看出基因序列与芽孢杆菌的同源性为100％。结果表明在高盐浓度下，培养基内未染菌。

实施例5

本微生物絮凝剂的成分分析及高温处理后的絮凝效果，其步骤包括：

(1)高温处理：将配制好的1g/L微生物絮凝剂于沸水浴中放置30min后按照实施例1中絮凝率测定方法测试，絮凝率分别为92.91％，略小于最优化条件测定的97.88％的结果。由此可知絮凝剂在高温条件下较稳定。

(2)Bradford法测蛋白质含量具体操作如下：以牛血清白蛋白作为标准蛋白配置标准曲线。移取1mL样品，1mL 0.2M的氢氧化钠溶液于离心管摇匀，95℃加热20min，冰浴冷却至室温后离心，取上清液倒入比色管，加入配置好的考马斯亮蓝溶液5mL，摇匀静置5min后测A595；测得微生物絮凝剂中蛋白质含量为21.53％。

(3)蒽酮比色测糖含量具体操作如下：称取100mg蒽酮溶于100ml98％硫酸中配制蒽酮试剂，移取1mL样品于试管，加10ml蒽酮试剂摇匀同时置于沸水浴7min，取出冰浴至室温，测620nm吸光度值。用葡萄糖溶液配置标准溶液测得絮凝剂中多糖含量为54.95％。

实施例6

本微生物絮凝剂在对重金属Cu²⁺废水处理中的应用，其步骤包括：

配制Cu²⁺初始浓度为20、30、40、50、60mg/L，用0.1mM的HCl和NaOH调节溶液pH＝7.0，微生物絮凝剂投加量为100mg/L。放入气浴恒温振荡器中(25℃、160rpm)振荡，每隔一段时间取样，过滤(0.22μm，混合纤维素膜)并按照一定倍数稀释用原子吸收分光光度计测定Cu²⁺的残余浓度C_t，得出Cu²⁺的平衡浓度C_e。结果如表3所示，微生物絮凝剂对铜离子的吸附性能良好，微生物絮凝剂对Cu²⁺的最大去除率为45.74％，最大吸附量为210.8mg/g。

表3.实施例6微生物絮凝剂对重金属Cu²⁺的吸附

其中微生物絮凝剂对Cu²⁺的吸附率R(％)和平衡吸附量q_e按照公式1-1、1-2计算

式中：R—去除率(％)；

q_e—微生物絮凝剂对金属离子的吸附容量(mg/g)；

C₀—吸附前溶液中金属离子浓度(mg/L)；

C_e—吸附平衡时溶液中金属离子浓度(mg/L)；

V—溶液总体积(mL)；

m—微生物絮凝剂用量(mg)。