阅读说明：本技术 一种以秸秆水解液为原料发酵生产abe的方法 (Method for producing ABE by fermenting straw hydrolysate serving as raw material ) 是由 郜晓峰 苏亚蕊 贺洁 马芳园 王深垒 于 2019-10-23 设计创作，主要内容包括：本申请属于生物质能源制备技术领域,具体涉及一种以秸秆水解液为原料发酵生产ABE的方法。具体包括：秸秆预处理、生物酶解、制备ABE发酵培养液、发酵水解液等步骤。本申请中,在以秸秆酸水解液为原料发酵丁醇时,配合特定微生物菌株发酵处理时,通过添加谷胱甘肽后可显著影响溶剂代谢途径中相关关键酶表达量的变化,进而改变了菌株细胞膜的化学成分,提高了产丁醇能力。本申请将秸秆预处理制成水解液后直接发酵生产ABE,避开了复杂的脱毒工艺,从而有利于降低生产成本和促进ABE发酵生产的产业化；进一步通过发酵工艺的优化,尤其是通过发酵过程中谷胱甘肽的添加和利用,进一步提高了ABE的发酵产率,有助于促进ABE工业化生产。(The application belongs to the technical field of biomass energy preparation, and particularly relates to a method for producing ABE by fermenting straw hydrolysate serving as a raw material. The method specifically comprises the following steps: straw pretreatment, biological enzymolysis, ABE fermentation culture solution preparation, hydrolysate fermentation and the like. According to the application, when the straw acid hydrolysate is used as the raw material for fermenting the butanol and is matched with a specific microbial strain for fermentation treatment, the change of related key enzyme expression quantity in a solvent metabolic pathway can be obviously influenced by adding the glutathione, so that the chemical components of cell membranes of the strain are changed, and the butanol production capacity is improved. According to the method, the ABE is directly fermented and produced after the straws are pretreated to prepare the hydrolysate, so that a complex detoxification process is avoided, and the production cost is reduced and the industrialization of ABE fermentation production is promoted; further, the fermentation yield of the ABE is further improved by optimizing the fermentation process, particularly by adding and utilizing glutathione in the fermentation process, and the promotion of the industrial production of the ABE is facilitated.)

一种以秸秆水解液为原料发酵生产ABE的方法

技术领域

本申请属于生物质能源制备技术领域，具体涉及一种以秸秆水解液为原料发酵生产ABE的方法。

背景技术

生物质能源技术开发利用过程中，丙酮、乙醇、丁醇（acetone-ethanol-butanol，简称ABE）发酵是一项较为成熟的发酵技术，也是仅次于酒精发酵的世界第二大发酵过程。随着全球经济的快速发展，能源问题成为经济发展的重要制约因素，寻找能够取代化石燃料的潜在能源迫在眉睫。

生物发酵生产燃料是最有效的方法之一，而生物丁醇则为生物燃料最具前景的研究之一。生物丁醇不仅是一种重要的有机化工原料，也是一种极具潜力的新型生物燃料。然而，利用粮食作物生产ABE引起人们对粮食安全与环境影响的忧虑，因此科学家对利用秸秆为原料生产ABE产生了浓厚的兴趣，与使用玉米和大豆等粮食作为原料的第一代生物燃料相比，秸秆ABE的最大优势在于避免了“道德风险”，一旦产业化生产，秸秆ABE可以解决“与人争粮”的问题，还可以变废为宝。

实际发酵生产过程中，由于丁醇生产菌无法直接利用秸秆类生物质的主要成分纤维素和半纤维素，因此在发酵前需要对秸秆进行一定程度的预处理。目前主要的预处理包括气爆、酸水解、酶处理等。秸秆预处理后会生成葡萄糖、木糖等可发酵性糖，但同时会产生大量盐类物质、酸类物质、醛类物质和酚类物质等微生物发酵抑制物。因此以秸秆水解物为底物发酵时往往需要复杂的脱毒处理工艺。目前常用的脱毒方法有物理法、化学法和生物法等。物理法主要有旋转蒸发、活性炭吸附、离子交换树脂等，其中旋转蒸发适合乙酸、糠醛等易挥发性物质的去除。活性炭吸附是主要依靠吸附作用除去部分木质素降解物及其他毒害物质，离子交换树脂既可以除去无机离子也可除去水解液中大部分糠醛、醋酸等，化学法是通过化学沉淀、改变pH及一些抑制物的电离特性从而达到降低毒性的目的，生物法是用特定的酶或微生物作用于发酵抑制物，通过改变抑制物的结构而降低毒性。但实际应用中，单一方法往往难以满足发酵需求，通常是各种方法综合利用。而这些脱毒方法明显增加了生产成本，限制了利用秸秆生产ABE的产业化。因此，针对性地开发廉价、操作性高的生产工艺，避开脱毒工艺，对于真正实现以秸秆为原料生产ABE具有十分重要的技术意义。

发酵液中氧化还原环境的改变对细胞生长、产品发酵影响很大，谷胱甘肽往往应用于好氧细菌的发酵氧化还原电位调节，对厌氧菌的研究报道不多。丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌为厌氧菌，不具备合成谷胱甘肽的能力。Linjiang Zhu 等（MetabolicEngineering13(2011)426–434）在丙酮丁醇梭菌中过表达gshAB，使菌株获得了合成谷胱甘肽的能力，结果表明可能是减少了溶剂对细菌细胞膜的损害，提高了菌株生产丁醇的能力。

发明内容

本申请目的在于提供及一种以秸秆水解液为原料，通过在水解液中加入谷胱甘肽来快速发酵生产丙酮、乙醇、丁醇的方法，而这种方法通过规避脱毒工艺的处理，能够达到简化ABE的发酵生产工艺的生产目的，从而促进ABE发酵生产的产业化发展。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种以秸秆水解液为原料发酵生产ABE的方法，具体包括如下步骤：

（一）秸秆水解液的制备

制备秸秆水解液时，包括秸秆预处理、生物酶解等步骤，具体而言：

（1）秸秆预处理

将秸秆粉碎后，与硫酸混匀，高温灭菌（高温灭菌过程中同时进行酸解）处理，随后调节pH=4~6；

具体操作而言，将干燥的秸秆，粉碎过40目筛，然后将秸秆干粉与0.75%硫酸（体积比）按1：6~12（质量比）混匀，121℃处理60min后，Ca(OH)₂调节 pH为4.8；

所述秸秆具体例如为小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆中等任意一种或几种任意比例混合物；

（2）生物酶解

在步骤（1）的灭菌处理后秸秆混合物中，添加生物酶，混匀后，40~60℃酶解处理24~48h，然后离心去除固体沉淀物，上清液即为待发酵的秸秆水解液，酶无需单独灭活；

具体操作而言：55℃ 处理24~48h，然后3000r/min离心5min除去固体物质；

所述生物酶为纤维素酶、木聚糖酶、β-1,4-甘露聚糖酶的混合物，具体用量为：每100mL秸秆水解液中，纤维素酶40~60µL，木聚糖酶40~60µL，β-甘露聚糖酶40~60µg；具体酶活要求为：

纤维素的标准酶活（CMC酶活）＞1×10⁵ u/mL（酶活定义：1mL酶液于50℃，pH 4.5条件下，1min催化 CMC 水解生成 1µg葡萄糖为一个纤维素酶CMC活力单位）；

木聚糖酶的标准酶活＞1×10⁸ U/mL（酶活定义：1 mL酶液于50℃、pH 5.0条件下，1min水解1%木聚糖溶液产生1µg木糖的酶量为一个木聚糖酶活力单位)；

β-1,4-甘露聚糖酶标准酶活＞5×10⁴ U/g（酶活定义：在pH为5.5，温度为37℃条件下，每分钟从浓度为3mg/mL的β-1,4-甘露聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位）；

（二）制备ABE发酵培养液

以丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutyLicum）CICC 8012（保藏号为CCTCC M2010148），和拜氏梭菌（C.beijerinckii）CGMCC1.255（平台资源编号1511C0002100007244）为例，制备种子液时，种子培养基配方及具体制备方法如下：

将与水混合均匀的4—6%（质量比）玉米粉蒸煮30min，补足蒸发水分后，去除O₂（具体例如利用充入N₂方式来去除O₂），然后灭菌处理（115~121℃灭菌15~30min），即配制成种子培养基；

在冷却至常温的种子培养基中，加入5—10%（体积比）的菌种孢子液，35~40℃（优选37℃恒温培养）静止培养4—24h（培养开始前，优选利用沸水浴热击30—90s，从而加速孢子萌发）；

（三）发酵水解液以制备ABE

首先，对步骤（一）中酶解处理完成后水解液进行组分调配作为发酵液，以利于后续发酵，具体而言：每升秸秆水解液中，加入：1~3g CH₃COO(NH₄)、0.5~0.7g KH₂PO₄、0.3~0.5gK₂HPO₄、1~2g豆粉，然后调节pH至中性；优选配方为：每升秸秆水解液中，加入：2g CH₃COO(NH₄)、0.6g KH₂PO₄、0.4g K₂HPO₄、1.5g豆粉， Ca(OH)2调pH为7.0；调配完成后，去除O₂（具体例如利用充入N₂方式来去除O₂），灭菌处理后（115~121℃灭菌15~30min）冷却至室温备用；

其次，在无菌条件下，将步骤（二）中所制备种子液，按10%（体积比）比例接种至上述调配并灭菌处理后发酵液中，35~40℃（优选37℃恒温培养）静止培养4—24h；

最后，在上述发酵液中添加谷胱甘肽，继续35~40℃（优选37℃恒温培养）静止发酵48—72h；发酵液中谷胱甘肽的添加量为0.05—0.5g/L。

本申请中，发明人认为，在以秸秆酸水解液为原料发酵丁醇时，配合特定微生物菌株发酵处理时，通过添加谷胱甘肽后可显著影响溶剂代谢途径中相关关键酶表达量的变化，进而改变了菌株细胞膜的化学成分，这可能是谷胱甘肽提高梭菌发酵丁醇能力的原因。

总体而言，本申请的主要技术特点表现在：

（1）本申请中将秸秆预处理制成水解液后直接发酵生产ABE，避开了复杂的脱毒工艺，从而有利于降低生产成本，和促进ABE发酵生产的产业化；

（2）通过发酵工艺的优化，尤其是通过发酵过程中谷胱甘肽的添加和利用，进一步提高了ABE的发酵产率，从而进一步促进ABE工业化生产。

总之，本申请通过对于秸秆水解、ABE发酵等关键工艺步骤的优化和简化，尤其是对谷胱甘肽添加时间和添加用量的优化，进一步提高了ABE的产量，同时降低了生产成本，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

附图说明

图1为谷胱甘肽不同添加时间对拜氏梭菌产溶剂的影响；

图2为谷胱甘肽对丙酮丁醇梭菌代谢途径关键酶表达量的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中所采用部分物料情况简要说明如下。

生物酶：

纤维素酶，阿拉丁（aladdin）公司产品 ，产品性质：来源于黑曲霉，粉末，酶活为10000U/g；

木聚糖酶，阿拉丁（aladdin）公司产品，产品性质：酶活≥2500 U/g，米曲霉中表达；

β-1,4-甘露聚糖酶，索莱宝（Solarbio）公司产品，产品性质：粉状，酶活≥60000u/g，最适作用为 pH4.5-5.0，作用温度为 40-65℃。

实施例1

以新鲜玉米芯作为发酵原料，本实施例所提供的秸秆水解液为原料发酵生产ABE的方法，具体过程简介如下。

（一）秸秆水解液的制备

制备秸秆水解液时，包括秸秆预处理、生物酶解等步骤，具体而言：

（1）秸秆预处理

将新鲜玉米芯晒干后，粉碎过40目筛，然后取20g玉米芯放入500mL三角瓶中，加入200mL的0.75%稀硫酸，121℃处理60min后，Ca(OH)₂调节pH为4.8。

（2）生物酶解

在步骤（1）的灭菌处理后秸秆混合物中，添加生物酶，混匀后，55℃酶解处理48h，然后3000r/min离心5min去除固体沉淀物，上清液即为待发酵的秸秆水解液；

所述生物酶为纤维素酶、木聚糖酶、β-1,4-甘露聚糖酶的混合物，具体用量为：每100mL秸秆水解液中，纤维素酶50µL，木聚糖酶50µL，β-1,4-甘露聚糖酶50µg。

（二）制备ABE发酵培养液

针对拜氏梭菌（C.beijerinckii）CGMCC1.255（平台资源编号1511C0002100007244）为例，制备种子液时，种子培养基配方及具体制备方法如下：

将与水混合均匀的5%（质量比）玉米粉蒸煮30min，补足蒸发水分后，去除O₂（具体利用充入N₂方式来去除O₂），然后灭菌处理（115℃灭菌20min），即配制成种子培养基；

在冷却至常温的种子培养基中，加入10%（体积比）的菌种孢子液，37℃静止培养24h（培养开始前，利用沸水浴热击60s，从而加速孢子萌发）。

（三）发酵水解液以制备ABE

首先，对步骤（一）中酶解处理完成后水解液进行组分调配作为发酵液，以利于后续发酵，具体而言：每升秸秆水解液中，加入：2g CH₃COO(NH₄)、0.6g KH₂PO₄、0.4g K₂HPO₄、1.5g豆粉， Ca(OH)₂调pH为7.0；调配完成后，转入厌氧瓶中，去除O₂（具体利用充入N₂方式来去除O₂），灭菌处理后（121℃灭菌20min）冷却至室温备用；

其次，在无菌条件下，将步骤（二）中所制备种子液，按10%（体积比）比例接种至上述调配并灭菌处理后发酵液中，37℃恒温培养）静止发酵72h。

发酵结束后，采用气相色谱检测发酵上清液中的ABE。

发酵过程中，为确定合适的谷胱甘肽添加时机，因此分别在发酵0、8、16、24h时，分别添加谷胱甘肽0.1g/L。

具体结果如图1所示。可以看出：

发酵8h后添加谷胱甘肽的发酵液中：乙醇含量0.94g/L，丙酮含量2.13g/L，丁醇含量4.05g/L，总溶剂含量7.12g/L；

发酵24h后添加谷胱甘肽的发酵液中：乙醇含量0.59g/L，丙酮含量1.44g/L，丁醇含量1.22g/L，总溶剂含量3.25g/L。

作为对照，如果不添加谷胱甘肽（相关操作同前述操作），则发酵72h后，发酵液中：乙醇含量0.76g/L，丙酮含量1.64g/L，丁醇含量3.25g/L，总溶剂含量5.65g/L。

综上可以看出，后续发酵过程中，谷胱甘肽的添加时间节点选择对于提高ABE的产率具有十分重要的影响。

实施例2

本实施例以新鲜玉米芯为例，进行了发酵实验，具体操作同实施例1，仅调整菌种为丙酮丁醇梭菌（种子液制备方法同实施例1），设定谷胱甘肽加入时间节点为发酵8h后加入（加入量同实施例1）。

分别在产酸期18h和产溶剂期36h提取总RNA，采用荧光定量PCR法分析溶剂代谢途径关键酶基因表达量的差异，荧光定量结果如图2所示（具体关键酶基因及对应酶名称为：ack 乙酸激酶；buk 丁酸激酶；ptb 磷酸转丁酰酶；pta 磷酸转乙酰酶；adhE 乙醇脱氢酶；ctfAB CoA转移酶；bdhB 丁醇脱氢酶B。

分析可以看出：谷胱甘肽的加入显著影响了溶剂代谢途径关键酶基因表达量，产酸期（18h）时，与不添加谷胱甘肽相比，代谢途径关键酶基因表达都显著增加，表明菌株生长旺盛，代谢能力强；产溶剂期（36h）时，与产溶剂直接相关的基因ptb、pta、adhE、ctfABCoA、bdhB表达量显著增加，尤其是丁醇脱氢酶基因bdhB与不加谷胱甘肽相比表达量增加到7.48倍，而与副产物乙酸、丁酸的相关基因ack、buk表达量显著降低，这表明谷胱甘肽的添加促进了溶剂的合成。

发酵结束后测定结果表明：乙醇含量1.43g/L，丙酮含量4.92g/L，丁醇含量6.94g/L，总溶剂含量13.29g/L；

而作为对照，如果不添加谷胱甘肽，发酵72h后，乙醇含量1.02g/L，丙酮含量2.85g/L，丁醇含量4.94g/L，总溶剂含量8.81g/L。

由此可见，后续发酵过程中，谷胱甘肽的添加对于提高ABE的产率具有十分重要的影响。

实施例3

本实施例以新鲜小麦秸秆为例，进行了发酵实验，具体操作同实施例1，分别采用丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌进行发酵，设定谷胱甘肽加入时间节点为发酵8h后加入（加入量同实施例1）。结果表明：

单独接种丙酮丁醇梭菌发酵时，发酵液中：乙醇含量1.25g/L，丙酮含量3.17g/L，丁醇含量4.89g/L，总溶剂含量9.31g/L；

单独接种拜氏梭菌发酵时，发酵液中：乙醇含量1.03g/L，丙酮含量2.64g/L，丁醇含量4.32g/L，总溶剂含量7.99g/L。

作为对照，如果不添加谷胱甘肽（其他相关操作相同），发酵72h后，单独接种丙酮丁醇梭菌发酵时，发酵液中：乙醇含量0.73g/L，丙酮含量2.23g/L，丁醇含量3.95g/L，总溶剂含量6.91g/L；单独接种拜氏梭菌发酵时，发酵液中：乙醇含量0.67g/L，丙酮含量1.94g/L，丁醇含量4.05g/L，总溶剂含量6.66g/L。

实施例4

本实施例以新鲜水稻秸秆为例，进行了发酵实验，具体操作同实施例1，同样分别采用丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌进行发酵，设定谷胱甘肽加入时间节点为发酵8h后加入（加入量同实施例1）。结果表明：

单独接种丙酮丁醇梭菌发酵时，发酵液中：乙醇含量1.03g/L，丙酮含量2.92g/L，丁醇含量4.94g/L，总溶剂含量8.99g/L；

单独接种拜氏梭菌发酵时，发酵液中：乙醇含量0.88g/L，丙酮含量2.23g/L，丁醇含量3.96g/L，总溶剂含量7.07g/L。

作为对照，如果不添加谷胱甘肽（其他相关操作相同），发酵72h后，单独接种丙酮丁醇梭菌发酵时，发酵液中：乙醇含量0.55g/L，丙酮含量1.99g/L，丁醇含量3.12g/L，总溶剂含量5.66g/L；单独接种拜氏梭菌发酵时，发酵液中：乙醇含量0.45g/L，丙酮含量1.32g/L，丁醇含量2.98g/L，总溶剂含量4.75g/L。