阅读说明：本技术 一种用于卵巢癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒及检测方法 (Serum protein marker, kit and detection method for early screening and diagnosis of ovarian cancer ) 是由 张建营 王晓 史健翔 叶华 王鹏 代丽萍 马言 段亚茹 江秉华 于 2019-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种用于卵巢癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物,属于生物医学技术领域,血清蛋白标志物为NPM1基因编码的蛋白、GNAS基因编码的蛋白、P53基因编码的蛋白、FUBP1基因编码的蛋白或KRAS基因编码的蛋白中的任意一种或两种以上的联合。同时提供包含血清蛋白标志物的试剂盒及使用血清蛋白标志物的检测方法。本发明定制138个癌症驱动基因编码的人类蛋白质芯片,共包含180个人源重组蛋白质,先通过蛋白质芯片初步筛选出卵巢癌的早期检测血清标志物,再经过ELISA实验进行验证,最终筛选出可用于卵巢癌早期筛查和诊断的一组卵巢癌联合检测血清标志物,其包括NPM1、P53、GNAS和KRAS共4种基因编码的蛋白,可辅助卵巢癌的临床诊断,具有较好的参考价值。(The invention discloses a serum protein marker for early screening and diagnosis of ovarian cancer, which belongs to the technical field of biomedicine and is the combination of any one or more than two of protein coded by NPM1 gene, protein coded by GNAS gene, protein coded by P53 gene, protein coded by FUBP1 gene or protein coded by KRAS gene. Also provided are kits comprising serum protein markers and detection methods using serum protein markers. The invention customizes 138 cancer driver gene coded human protein chips, which contain 180 human source recombinant proteins, firstly preliminarily screens out early detection serum markers of ovarian cancer through the protein chips, then verifies through ELISA experiments, and finally screens out a group of ovarian cancer combined detection serum markers for early screening and diagnosis of ovarian cancer, which comprise 4 gene coded proteins of NPM1, P53, GNAS and KRAS, can assist clinical diagnosis of ovarian cancer, and has better reference value.)

一种用于卵巢癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒 及检测方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域。

背景技术

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织在2018年公布的全球肿瘤流行病统计数据(GLOBOCAN 2018)可知，在全球范围内，每年新发的卵巢癌病例数约有295414人，死亡数约为184799人。2018年美国约有22530位女性患卵巢癌，13980例女性死于卵巢癌。2015年中国癌症统计数据表明我国卵巢癌的新发病例数约为52100人，死亡数约为22500人。由于中国人口基数大，因此，从发病比例上，卵巢癌在我国的发病率并不高，但从数量上，卵巢癌发病人数和死亡人数均居于世界首位。卵巢癌的发病率在妇科肿瘤中低于***和子宫体癌，居于第三位，但其病死率在妇科肿瘤中居于首位。由于卵巢深居人体盆腔内部，因此，卵巢癌患者早期临床症状体征不明显，且临床上缺乏有效的普查和早期诊断方法，致使70％-80％的患者就诊时已属晚期，治疗效果及预后均极差，且5年生存率低于20％。

目前，临床上用于评估早期卵巢癌的方法主要有经***超声检查和血清CA125水平测试，但***超声发现的盆腔肿块大部分并非肿瘤，血清CA125水平增高也可见于女性经期等常规时期或其他良性妇科疾病，因此，这些检查或试验尚无法达到对卵巢癌患者进行早期诊断的目标，对于卵巢癌早期诊断价值不大。为了实现卵巢癌的早发现、早诊断、早治疗，降低其死亡率，提高生存率，迫切需要寻求一种新的有效的不具侵袭性的早期诊断方法。基于目前临床上卵巢癌的筛查方法存在的不足，如果能寻找出具有理想敏感度和特异度的卵巢癌标志物，并且检测手段价格低廉、便于进行高危人群的筛查，这将能创造巨大的社会价值，在医疗资源和经济价值方面均可节省，还能提高患者的生存率和生存时间。

在卵巢癌生物标志物领域，国内外众多学者已进行了大量的研究和探索，除了目前临床上常用的一些传统的肿瘤标志物如癌抗原125、人附睾蛋白4等用于卵巢癌的诊断。近年来，在人类肿瘤学的研究领域内，越来越多的研究表明，肿瘤组织在发生发展过程中，往往伴有细胞蛋白的异常表达，而这些异常表达的蛋白，有一部分可以进入循环系统，被机体的免疫系统识别并产生相应自身抗体，这一类在肿瘤发生发展过程中被机体免疫系统识别并产生免疫反应的蛋白，被称为肿瘤相关抗原(tumor associated antigens，TAAs)，其诱导产生的抗体称为抗TAA-抗体(autoantibody)。这一概念的提出对卵巢癌早期诊断研究指引了一个新的方向，这些自身抗体在肿瘤患者血清中有较高的滴度且存在时间较长，并且在临床确诊前数月甚至数年即可检测到，但在非肿瘤患者和正常人血清中不存在或者因含量太低而检测不到，因此这些抗肿瘤相关抗原自身抗体具有作为肿瘤免疫学标志物的潜力，所以发现具有理想诊断价值的TAA自身抗体指标对卵巢癌诊断有重要意义。众多研究为抗TAAs自身抗体用于卵巢癌早期诊断提供了依据和可行性，但基于肿瘤发生过程的复杂性，单一的诊断指标用于肿瘤诊断的能力相对较差，一般不能满足临床上肿瘤诊断的需求，如研究显示，单一的一种抗TAAs自身抗体在卵巢癌患者血清中出现的频率非常低，一般不超过20％，限制了单项抗TAAs自身抗体在肿瘤诊断中的应用。研究发现，通过联合使用一组“精心筛选”出来的抗TAAs自身抗体组合进行肿瘤的诊断，可在保证肿瘤诊断特异度的同时，大大提高肿瘤诊断的灵敏度，多项抗TAAs自身抗体组合联合应用于卵巢癌早期诊断的研究亦支持此学说，有研究数据表明，通过联合p62、c-Myc、p53、HCCR 4种抗TAAs自身抗体用于卵巢癌的诊断，在保证较高诊断特异度的同时，其灵敏度可达到72.04％，其诊断价值远高于单项抗TAA自身抗体，由此说明，联合多个抗TAAs自身抗体用于检测卵巢癌是一种有应用潜力的方案。

多年来，后续研究一直试图寻找诊断卵巢癌更加敏感特异的抗TAA自身抗体，优化诊断卵巢癌的组合。寻找有价值的TAA自身抗体，常用的方法有两种：一是重组cDNA表达文库血清学筛选(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries，SEREX)；另一种是蛋白质组学技术。与SEREX相比，蛋白组学技术能够对多个肿瘤血清进行筛选，并且能够筛选出具有翻译后修饰的TAA。在肿瘤的发生发展过程中，涉及到几十万个基因的突变，但仅有某些关键基因突变才可引起肿瘤的发生发展，这些关键基因被称为癌症驱动基因。研究认为不同类型的肿瘤发生时，一般都包含2-8个驱动基因，正是因为这些基因的突变才可导致肿瘤的优势生长，这些基因可以通过调节细胞周期、细胞生存和基因组维持3个细胞核心过程，被分为12个信号通路。目前在多种肿瘤的全基因组测序研究中共发现138个癌症驱动基因(参见Vogelstein B.Science.(2013)339(6127):1546-1558)，包括74个抑癌基因和64个癌症基因。这些基于癌症驱动基因编码的蛋白亦可诱发机体在其循环血液中产生相应的自身抗体，通过对癌症驱动基因编码蛋白及其诱发的血清中的自身抗体的研究可在一定程度上揭示肿瘤的发生发展或预后等。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于卵巢癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，同时提供包含血清蛋白标志物的试剂盒及使用血清蛋白标志物的检测方法是本发明的另一发明目的。

基于上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种用于卵巢癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，血清蛋白标志物为NPM1基因编码的蛋白、GNAS基因编码的蛋白、P53基因编码的蛋白、FUBP1基因编码的蛋白或KRAS基因编码的蛋白中的任意一种或两种以上的联合，

所述NPM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

所述GNAS基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

所述P53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

所述FUBP1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

所述KRAS基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

NPM1基因具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，GNAS基因具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，P53基因具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，FUBP1基因具有如SEQ IDNO.9所示的核苷酸序列，KRAS基因具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。

所述血清蛋白标志物为NPM1基因编码的蛋白、GNAS基因编码的蛋白、P53基因编码的蛋白和KRAS基因编码的蛋白的联合。

一种试剂盒，其包括用于卵巢癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，所述血清蛋白标志物被包被于固相载体上。

所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺或纤维素。

试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或两种以上的组合。

使用用于卵巢癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将每种血清蛋白标志物分别进行包被、封闭后清洗；

2)再与稀释后的待测血清进行一抗孵育，清洗，再进行二抗孵育，清洗；

3)显色系统显色后终止反应，测定吸光度值；

4)以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，得到每种血清蛋白标志物的吸光度值，以正常对照组血清OD值的第95百分位数作为截断值，当病例组血清中自身抗体的OD值大于等于正常对照组血清OD值的第95百分位数时定义为卵巢癌患者，否则判定为正常，计算出每种血清蛋白标志物的阳性率、灵敏度特异度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比。

还包括步骤5)并联联合检测：利用logistics回归模型构建上述血清蛋白标志物的并联联合检测模型，计算联合诊断结果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明定制138个癌症驱动基因编码的人类蛋白质芯片，共包含180个人源重组蛋白质，用以筛选潜在的可用于诊断或其他表征癌症的标志物，先通过蛋白质芯片初步筛选出卵巢癌的早期检测血清标志物，再经过ELISA实验进行验证，最终筛选出可用于卵巢癌早期筛查和诊断的一组卵巢癌血清蛋白标志物，尤其是NPM1、P53、GNAS和KRAS基因编码的蛋白的联合，其联合诊断卵巢癌ROC曲线下面积达0.686，95％CI为0.628～0.744，灵敏度为51.83％，特异度为83.54％，可辅助卵巢癌的临床诊断，具有较好的参考价值。

2)本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低等特点，且操作简单、快捷，可为卵巢癌的早期诊断提供依据。

附图说明

图1为实验例中基于focused array人蛋白质芯片检测原理图；

图2为实验例中间接ELISA检测原理图；

图3为实验例中蛋白质芯片筛选出的5个TAA单独诊断卵巢癌ROC曲线分析图以及SNR值散点图；

图4为实验例中ELISA验证5个TAA单独诊断卵巢癌ROC曲线分析图以及OD值散点分布图(训练集)；

图5为实验例中ELISA验证4个TAAs联合诊断卵巢癌在验证集数据中的ROC曲线图(验证集)；

图6为实验例中ELISA验证4个TAAs(NPM1、GNAS、P53、KRAS)联合诊断卵巢癌在验证集数据中的ROC曲线图。

具体实施方式

实验例

1血清样本的准备

1.1用于进行蛋白芯片实验的血清样本

收集在北京佑安医院和郑州大学第一附属医院原发性卵巢癌病人(卵巢癌经病理诊断)，病人同意以及机构审查委员会和医院伦理委员会批准。所有标本均用红头采血管采集研究对象全血5～10mL，在室温放置2小时后，1000g离心15分钟，取上清液，每个样本分装若干份贴好标签，放置于冰箱中，于-80℃下低温保存，避免反复冻融。

根据流行病学分析，本研究最终收集了17例原发性卵巢癌血清，以及同时期体检的27例佑安医院正常女性对照血清进行初步芯片筛选。17例原发性卵巢癌患者中，平均年龄为48±18岁，年龄范围为12-73岁；27例正常血清中，平均年龄为40±10岁，年龄范围为21-58岁。所有卵巢癌患者血清都是在患者最初诊断为卵巢癌，尚未接受任何放化疗及手术治疗时采集的，被诊断的时间为2015年4月至2016年5月。正常人血清来自参加年度健康体检，无任何恶性肿瘤症状的体检人群。

1.2用于进行ELISA实验验证的血清样本

(1)收集自北京佑安医院和郑州大学第一附属医院的血清样本(详见上述1.1部分)。

(2)来自郑州大学第一附属医院和河南省肿瘤医院(234例新发卵巢癌，病例组)和郑州市金水区心血管调查项目(234例正常人，正常对照组)，234例新发性卵巢癌患者中，平均年龄为53±12岁，年龄范围为15-77岁；而234例正常血清中，平均年龄为52±14岁，年龄范围为13-82岁。所有卵巢癌患者血清都是在患者最初诊断为卵巢癌，尚未接受任何放化疗时采集的，被诊断的时间为2015年4月至2016年5月。正常人血清来自参加年度健康体检，无任何恶性肿瘤症状的体检人群。

2用于筛选卵巢癌诊断标志物的蛋白芯片定制

将138个癌症驱动基因(参见Vogelstein B.Science.(2013)339(6127):1546-1558)编码的蛋白(共180个人源重组蛋白质)固定于蛋白芯片上，用于肿瘤标志物的筛选。用于筛选肿瘤标志物的蛋白芯片为在广州博翀生物科技有限公司定制的HuProt^TM人类蛋白质芯片。

3.蛋白芯片实验

实验原理参见图1。

3.1实验所需试剂

1)封闭液：3mL 10％BSA，加入7mL 1×PBS溶液，混匀，置于冰上。

2)血清孵育液：1mL 10％BSA，加入9mL 1×PBST溶液溶液，混匀，置于冰上。

3)清洗液：1×PBST溶液，存放于4℃冰箱。

4)二抗孵育液：包括荧光标记抗人IgM二抗(cy5标记，呈现红色)和荧光标记抗人IgG二抗(cy3标记，呈现绿色)。

3.2蛋白芯片具体实验步骤

(a)复温：将芯片从-80℃冰箱内取出，于4℃冰箱复温半小时，然后于室温复温15min。

(b)封闭：复温后的芯片，14blocks围栏固定，向每个block中加入封闭液，并放置在侧摆摇床上，室温封闭3小时。

(c)血清样本孵育：封闭完成后，倒尽封闭液体，然后迅速加入预先准备好的血清孵育液，每张芯片孵育14个样本(血清样本先放在4℃层析柜冻融，与含1％BSA的1×PBST溶液以1∶50体积比例稀释)，每个血清样本的上样体积为200μL，侧摆摇床20rpm，4℃过夜孵育。

(d)清洗：将芯片及芯片夹一同取出，吸去样本，然后迅速加入等体积的1×PBST溶液，如此循环数次，保证在拆除芯片夹时血清样本间无交叉污染。拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min。

(e)二抗孵育：将芯片转移到加入了3mL二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床40rpm，避光，室温60min。

(f)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，置于水平摇床上，80rpm清洗3次，每次10min。完成后用ddH₂O清洗2次，每次10min。

(g)干燥：将芯片置于芯片干燥机中离心干燥。

(h)扫描：按照扫描仪的操作规范和使用说明操作。

(i)数据提取：将芯片图像和结果每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存。

(j)进行数据预处理。

(k)进行数据分析，获得最终的卵巢癌血清标志物，该蛋白质芯片实验筛选出以下血清蛋白标志物：癌症驱动基因NPM1、GNAS、P53、FUBP1和KRAS编码的蛋白(图3为上述蛋白芯片筛选出的5个TAA，即NPM1、GNAS、P53、FUBP1和KRAS编码的蛋白单独诊断卵巢癌的ROC曲线分析图以及SNR值散点图)。其中，NPM1、GNAS、P53、FUBP1和KRAS基因编码的蛋白依次具有如SEQ ID NO.1～5所示的氨基酸序列，NPM1、GNAS、P53、FUBP1和KRAS基因依次具有如SEQID NO.6～10所示的核苷酸序列。

4 ELISA间接法实验验证

实验原理参见图2。

具体实验步骤如下：

a)包被：按照表1中浓度进行包被，100μL/孔，4℃过夜；

b)封闭：2％BSA(索莱宝，北京，分析纯)的1×PBST溶液(PBS，Tween20索莱宝，北京)溶液，200μL/孔，4℃过夜；

c)清洗：350μL/孔1×PBST溶液清洗3次；

d)一抗孵育：血清与含1％BSA的1×PBST溶液1:100体积比例稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h；

e)清洗：350μL/孔1×PBST溶液清洗5次；

f)二抗孵育：HRP标记的鼠抗人IgG(奥科，武汉)与含1％BSA的1×PBST溶液1∶10000体积比例稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h；

g)清洗：350μL/孔1×PBST溶液清洗5次；

h)显色：TMB显色系统，A液(200mgTMB·2HCl溶于1L去离子水，索莱宝，北京，分析纯)与B液(9.2g柠檬酸，37gNa₂HPO₄·12H2O和8ml0.75％H₂O₂溶于1L去离子水)1∶1体积比例混合后，100μL/孔，室温避光，达到预期颜色(约需5-15min)；

i)终止：10％的浓硫酸50μL/孔后10min内测吸光度。

j)测吸光度：以OD450-OD620为相对OD值，然后扣去空白对照，调整IgG做归一化处理，然后进行后续数据处理(数据处理方法详见下述“5数据处理”部分b-d所示)。

其中，上述经蛋白芯片实验筛选出的5个TAA进行ELISA实验验证时各自的包被浓度如下表1所示，ELISA实验的96孔板排布表如下表2所示。表2中阳性质控为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性质控为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经Western Blot验证为阴性的血清，空白为血清稀释液，IgG1～IgG8为梯度稀释的人IgG抗体，浓度依次为10、20、50、100、150、200、250、300ng/ml。

表1 5个TAA各自的包被浓度

表2 ELISA实验的96孔板排布

实验结果：采用ELISA方法对5个TAA进行检测，结果见图4和5。图4和5为ELISA验证实验中5个TAA即NPM1、GNAS、P53、FUBP1和KRAS单独诊断卵巢癌的ROC曲线分析图以及相应的OD值散点分布图。从图4中可以看出，单个指标诊断卵巢癌ROC曲线下面积为0.53～0.71，其中P53的曲线下面积最大，为0.708；KRAS的ROC曲线下面积次之，为0.694；FUBP1的ROC曲线下面积最小，为0.533。从图4中还可以看出，5个指标OD值分布于0～1之间，中位OD值基本上均分布于0.2～0.4之间。

5数据处理

通过使用focused array人蛋白质芯片在卵巢癌组和NC正常对照组，通过统计学数据分析筛选出差异表达蛋白，具体方法如下：

(1)通过Focused Array蛋白质芯片实验获得芯片初筛结果。

(2)稳定性分析：在实验过程中，根据不同时间、不同芯片、不同位置，将测试样本test进行重复，用以评价不同芯片在不同时间的稳定性。

(3)数据分析及结果：剔除高背景、极端样本干扰后的样本，将IgG响应类型的各180个蛋白进行一致的统计学分析，分析逻辑如下：

a)为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理，实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值，进行后续统计学分析。

b)对于所有蛋白在卵巢癌组与对照组的ROC曲线下面积(Area under the ROC，AUC)及对应的P值，定义AUC＞0.5，P<0.05为最低筛选标准。

c)基于以上逻辑，进行卵巢癌组(收集自北京佑安医院和郑州大学第一附属医院的17例原发性卵巢癌患者血清)和佑安对照组(27例佑安医院正常血清)比对，筛选出卵巢癌组明显高于对照组的差异蛋白作为卵巢癌候选标志物，最终经芯片选定了5种血清蛋白标志物(NPM1、GNAS、P53、FUBP1和KRAS)来评价卵巢癌的诊断价值。其中，NPM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，GNAS基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，P53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，FUBP1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，KRAS基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

所述NPM1基因具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，GNAS基因具有如SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列，P53基因具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，FUBP1基因具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，KRAS基因具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。上述5种基因的信息来源见下表3。

表3 5种基因的信息来源

基因名称	Uniprot数据库登录号	NCBI参考序列登录号
			KRAS	Q15046	NM_004985
NPM1	P06748-2	NM_199185
			GNAS	Q5JWF2	NM_080425
TP53	P04637	NM_000546
			FUBP1	Q96AE4	NM_003902

(4)对经蛋白质芯片筛选出的5种血清蛋白标志物进行ELISA实验验证：包括对送检芯片样本验证以及送检芯片之外重新收集的样本进行验证，既实现了蛋白芯片的验证又保证了推广性。

(5)实验结果：经蛋白质芯片筛选出的5种血清蛋白标志物进行ELISA实验验证，对所有验证人群利用随机抽样的方法，进一步将468例研究对象随机分为训练组和验证组。训练组为小样本，用来验证公司芯片筛选结果，验证组为大样本，针对训练组分析的结果进行进一步地筛选验证。

分组方法：将234例卵巢癌患者的按1-234编辑ID号，利用EXCEL中的随机函数RAND()命令每个ID对应生成一个0-1之间的随机数，将随机数按从小到大的顺序排列，取前70位顺次对应的ID作为训练组，其余为验证组。同理，对234例正常对照执行上述过程。最后得到训练组卵巢癌70例和正常对照70例，共计140例，验证组卵巢癌164例和正常对照164例，共计328例。以正常对照组血清OD值的第95百分位数作为截断值，当病例组血清中自身抗体的OD值大于等于正常对照组血清OD值的第95百分位数时定义为卵巢癌患者，否则判定为正常，由此来计算各个TAAs自身抗体的阳性率、灵敏度、特异度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比等指标。

并联联合检测：利用logistics回归模型构建并联联合检测模型，以灵敏度最高的指标作为起点，此后每增加一个指标能最大限度地提高灵敏度又能保持较高的特异度，并联的抗体数目以能检测的灵敏度最高为终点。

对以上所构建的模型的诊断价值以及经济效益分析，含有4个指标(NPM1、GNAS、P53、KRAS)的模型效果最佳，如图6和表3所示，其联合诊断卵巢癌ROC曲线下面积达0.686，95％CI为0.628～0.744，灵敏度为51.83％，特异度为83.54％。

实施例

一种用于卵巢癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，所述血清蛋白标志物为NPM1基因编码的蛋白、GNAS基因编码的蛋白、P53基因编码的蛋白和KRAS基因编码的蛋白四种的联合，

所述NPM1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

所述GNAS基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

所述P53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

所述KRAS基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

NPM1基因具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，GNAS基因具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，P53基因具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，KRAS基因具有如SEQ IDNO.10所示的核苷酸序列。

一种试剂盒，其包括用于卵巢癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，所述血清蛋白标志物被包被于固相载体上，固相载体为由聚氯乙烯制成的的凹孔平板，还包括阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液。

阳性对照血清为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性对照血清为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经WesternBlot验证为阴性的血清，封闭液为2％BSA的1×PBST溶液，血清稀释液和第二抗体稀释液均为含1％BSA的1×PBST溶液，第二抗体为HRP标记的鼠抗人IgG，洗涤液为1×PBST溶液，显色液为A液(200mgTMB·2HCl溶于1L去离子水，索莱宝，北京，分析纯)与B液(9.2g柠檬酸，37gNa₂HPO₄·12H₂O和8ml0.75％H₂O₂溶于1L去离子水)1:1体积比例混合的溶液，终止液为10％的浓硫酸。

使用用于卵巢癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物的检测方法，包括以下步骤：

1)将每种血清蛋白标志物分别进行包被(包被浓度见表1)，100μL/孔，4℃下过夜；然后进行封闭：采用封闭液200μL/孔，4℃过夜；350μL/孔洗涤液清洗3次；

2)再与稀释后的待测血清(待测血清与血清稀释液以1:100体积比例稀释)进行一抗孵育：100μL/孔，37℃半水浴1h；350μL/孔洗涤液清洗5次；再进行二抗孵育(第二抗体与第二抗体稀释液以1:10000体积比例稀释)，100μL/孔，37℃半水浴1h；350μL/孔洗涤液清洗5次；

3)显色：TMB显色系统，显色液100μL/孔，室温避光，显色，达到预期颜色；终止反应：终止液50μL/孔终止，10min内测吸光度值；

4)以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，得到每种血清蛋白标志物的吸光度值，以正常对照组血清OD值的第95百分位数作为截断值，当病例组血清中自身抗体的OD值大于等于正常对照组血清OD值的第95百分位数时定义为卵巢癌患者，否则判定为正常，计算出每种血清蛋白标志物(各个TAAs自身抗体)的阳性率、灵敏度特异度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比等指标；

5)并联联合检测：利用logistics回归模型构建上述血清蛋白标志物的并联联合检测模型，也即以灵敏度最高的指标作为起点，此后每增加一个TAAs指标能最大限度地提高灵敏度又能保持较高的特异度，并联的抗体数目以能检测的灵敏度最高为终点，计算联合诊断结果。

本实施例的方法测定的结果只能作为中间结果的信息，因此不能直接判定患者是否患有卵巢癌，后续还需要结合临床症状、影像学及组织病理学等信息，最终判定患者的患病情况。

<110> 郑州大学

<120> 一种用于卵巢癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒及检测方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1 .0

<211> 294

<212> PRT

<213> 人

<221> NPM1基因编码的蛋白

<400> 1

MEDSMDMDMS PLRPQNYLFG CELKADKDYH FKVDNDENEH QLSLRTVSLG AGAKDELHIV 60

EAEAMNYEGS PIKVTLATLK MSVQPTVSLG GFEITPPVVL RLKCGSGPVH ISGQHLVAVE 120

EDAESEDEEE EDVKLLSISG KRSAPGGGSK VPQKKVKLAA DEDDDDDDEE DDDEDDDDDD 180

FDDEEAEEKA PVKKSIRDTP AKNAQKSNQN GKDSKPSSTP RSKGQESFKK QEKTPKTPKG 240

PSSVEDIKAK MQASIEKGGS LPKVEAKFIN YVKNCFRMTD QEAIQDLWQW RKSL 294

<211> 1037

<212> PRT

<213> 人

<221> GNAS基因编码的蛋白

<400> 2

MGVRNCLYGN NMSGQRDIPP EIGEQPEQPP LEAPGAAAPG AGPSPAEEME TEPPHNEPIP 60

VENDGEACGP PEVSRPNFQV LNPAFREAGA HGSYSPPPEE AMPFEAEQPS LGGFWPTLEQ 120

PGFPSGVHAG LEAFGPALME PGAFSGARPG LGGYSPPPEE AMPFEFDQPA QRGCSQLLLQ 180

VPDLAPGGPG AAGVPGAPPE EPQALRPAKA GSRGGYSPPP EETMPFELDG EGFGDDSPPP 240

GLSRVIAQVD GSSQFAAVAA SSAVRLTPAA NAPPLWVPGA IGSPSQEAVR PPSNFTGSSP 300

WMEISGPPFE IGSAPAGVDD TPVNMDSPPI ALDGPPIKVS GAPDKRERAE RPPVEEEAAE 360

MEGAADAAEG GKVPSPGYGS PAAGAASADT AARAAPAAPA DPDSGATPED PDSGTAPADP 420

DSGAFAADPD SGAAPAAPAD PDSGAAPDAP ADPDSGAAPD APADPDAGAA PEAPAAPAAA 480

ETRAAHVAPA APDAGAPTAP AASATRAAQV RRAASAAPAS GARRKIHLRP PSPEIQAADP 540

PTPRPTRASA WRGKSESSRG RRVYYDEGVA SSDDDSSGDE SDDGTSGCLR WFQHRRNRRR 600

RKPQRNLLRN FLVQAFGGCF GRSESPQPKA SRSLKVKKVP LAEKRRQMRK EALEKRAQKR 660

AEKKRSKLID KQLQDEKMGY MCTHRLLLLG AGESGKSTIV KQMRILHVNG FNGEGGEEDP 720

QAARSNSDGE KATKVQDIKN NLKEAIETIV AAMSNLVPPV ELANPENQFR VDYILSVMNV 780

PDFDFPPEFY EHAKALWEDE GVRACYERSN EYQLIDCAQY FLDKIDVIKQ ADYVPSDQDL 840

LRCRVLTSGI FETKFQVDKV NFHMFDVGGQ RDERRKWIQC FNDVTAIIFV VASSSYNMVI 900

REDNQTNRLQ EALNLFKSIW NNRWLRTISV ILFLNKQDLL AEKVLAGKSK IEDYFPEFAR 960

YTTPEDATPE PGEDPRVTRA KYFIRDEFLR ISTASGDGRH YCYPHFTCAV DTENIRRVFN 1020

DCRDIIQRMH LRQYELL 1037

<211> 393

<212> PRT

<213> 人

<221> P53基因编码的蛋白

<400> 3

MEEPQSDPSV EPPLSQETFS DLWKLLPENN VLSPLPSQAM DDLMLSPDDI EQWFTEDPGP 60

DEAPRMPEAA PPVAPAPAAP TPAAPAPAPS WPLSSSVPSQ KTYQGSYGFR LGFLHSGTAK 120

SVTCTYSPAL NKMFCQLAKT CPVQLWVDST PPPGTRVRAM AIYKQSQHMT EVVRRCPHHE 180

RCSDSDGLAP PQHLIRVEGN LRVEYLDDRN TFRHSVVVPY EPPEVGSDCT TIHYNYMCNS 240

SCMGGMNRRP ILTIITLEDS SGNLLGRNSF EVRVCACPGR DRRTEEENLR KKGEPHHELP 300

PGSTKRALPN NTSSSPQPKK KPLDGEYFTL QIRGRERFEM FRELNEALEL KDAQAGKEPG 360

GSRAHSSHLK SKKGQSTSRH KKLMFKTEGP DSD 393

<211> 228

<212> PRT

<213> 人

<221> FUBP1基因编码的蛋白

<400> 4

MADYSTVPPP SSGSAGGGGG GGGGGGVNDA FKDALQRARQ IAAKIGGDAG TSLNSNDYGY 60

GGQKRPLEDG DQPDAKKVAP QNDSFGTQLP PMHQQQSRSV MTEEYKVPDG MVGFIIGRGG 120

EQISRIQQES GCKIQIAPDS GGLPERSCML TGTPESVQSA KRLLDQIVEK GRPAPGFHHG 180

DGPGNAVQEI MIPASKAGLV IGKGGETIKQ LQERAGVKMV MIQDGPQN 228

<211> 189

<212> PRT

<213> 人

<221> KRAS基因编码的蛋白

<400> 5

MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGET CLLDILDTAG 60

QEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNTKSF EDIHHYREQI KRVKDSEDVP MVLVGNKCDL 120

PSRTVDTKQA QDLARSYGIP FIETSAKTRQ RVEDAFYTLV REIRQYRLKK ISKEEKTPGC 180

VKIKKCIIM 189

<211> 885

<212> DNA

<213> 人

<221> NPM1基因

<400> 6

ATGGAAGATT CGATGGACAT GGACATGAGC CCCCTGAGGC CCCAGAACTA TCTTTTCGGT 60

TGTGAACTAA AGGCCGACAA AGATTATCAC TTTAAGGTGG ATAATGATGA AAATGAGCAC 120

CAGTTATCTT TAAGAACGGT CAGTTTAGGG GCTGGTGCAA AGGATGAGTT GCACATTGTT 180

GAAGCAGAGG CAATGAATTA CGAAGGCAGT CCAATTAAAG TAACACTGGC AACTTTGAAA 240

ATGTCTGTAC AGCCAACGGT TTCCCTTGGG GGCTTTGAAA TAACACCACC AGTGGTCTTA 300

AGGTTGAAGT GTGGTTCAGG GCCAGTGCAT ATTAGTGGAC AGCACTTAGT AGCTGTGGAG 360

GAAGATGCAG AGTCAGAAGA TGAAGAGGAG GAGGATGTGA AACTCTTAAG TATATCTGGA 420

AAGCGGTCTG CCCCTGGAGG TGGTAGCAAG GTTCCACAGA AAAAAGTAAA ACTTGCTGCT 480

GATGAAGATG ATGACGATGA TGATGAAGAG GATGATGATG AAGATGATGA TGATGATGAT 540

TTTGATGATG AGGAAGCTGA AGAAAAAGCG CCAGTGAAGA AATCTATACG AGATACTCCA 600

GCCAAAAATG CACAAAAGTC AAATCAGAAT GGAAAAGACT CAAAACCATC ATCAACACCA 660

AGATCAAAAG GACAAGAATC CTTCAAGAAA CAGGAAAAAA CTCCTAAAAC ACCAAAAGGA 720

CCTAGTTCTG TAGAAGACAT TAAAGCAAAA ATGCAAGCAA GTATAGAAAA AGGTGGTTCT 780

CTTCCCAAAG TGGAAGCCAA ATTCATCAAT TATGTGAAGA ATTGCTTCCG GATGACTGAC 840

CAAGAGGCTA TTCAAGATCT CTGGCAGTGG AGGAAGTCTC TTTAA 885

<211> 3111

<212> DNA

<213> 人

<221> GNAS基因

<400> 7

ATGGGCGTGC GCAACTGCCT CTACGGCAAT AATATGTCAG GACAACGCGA TATCCCCCCT 60

GAAATCGGGG AACAGCCCGA GCAACCACCT TTGGAGGCCC CAGGGGCAGC TGCCCCCGGT 120

GCTGGGCCTA GCCCAGCCGA AGAGATGGAG ACCGAACCGC CTCACAACGA GCCCATCCCC 180

GTCGAGAATG ATGGCGAGGC CTGTGGACCC CCAGAGGTCT CCAGACCCAA CTTTCAGGTC 240

CTCAACCCGG CATTCAGGGA AGCTGGAGCC CATGGAAGCT ACAGCCCACC TCCTGAGGAA 300

GCAATGCCCT TCGAGGCTGA ACAGCCCAGC TTGGGAGGCT TCTGGCCTAC ACTGGAGCAG 360

CCTGGATTCC CCAGTGGGGT CCATGCAGGC CTTGAGGCCT TCGGCCCAGC ACTCATGGAG 420

CCCGGAGCCT TCAGTGGTGC CAGACCAGGC CTGGGAGGAT ACAGCCCTCC ACCAGAAGAA 480

GCTATGCCCT TTGAGTTTGA CCAGCCTGCC CAGAGAGGCT GCAGTCAACT TCTCTTACAG 540

GTCCCAGACC TTGCTCCAGG AGGCCCAGGT GCTGCAGGGG TCCCCGGAGC TCCTCCCGAG 600

GAGCCCCAAG CCCTCAGGCC TGCAAAGGCT GGCTCCAGAG GAGGCTACAG CCCTCCCCCT 660

GAGGAGACTA TGCCATTTGA GCTTGATGGA GAAGGATTTG GGGACGACAG CCCACCCCCG 720

GGGCTTTCCC GAGTTATCGC ACAAGTCGAC GGCAGCAGCC AGTTCGCGGC AGTCGCGGCC 780

TCGAGTGCGG TCCGCCTCAC TCCCGCCGCG AACGCGCCTC CCCTCTGGGT CCCAGGCGCC 840

ATCGGCAGCC CATCCCAAGA GGCTGTCAGA CCTCCTTCTA ACTTCACGGG CAGCAGCCCC 900

TGGATGGAGA TCTCCGGACC CCCGTTCGAG ATTGGCAGCG CCCCCGCTGG GGTCGACGAC 960

ACTCCCGTCA ACATGGACAG CCCCCCAATC GCGCTTGACG GCCCGCCCAT CAAGGTCTCC 1020

GGAGCCCCAG ATAAGAGAGA GCGAGCAGAG AGACCCCCAG TTGAGGAGGA AGCAGCAGAG 1080

ATGGAAGGAG CCGCTGATGC CGCGGAGGGA GGAAAAGTAC CCTCTCCGGG GTACGGATCC 1140

CCTGCCGCCG GGGCAGCCTC AGCGGATACC GCTGCCAGGG CAGCCCCTGC AGCCCCAGCC 1200

GATCCTGACT CCGGGGCAAC CCCAGAAGAT CCCGACTCCG GGACAGCACC AGCCGATCCT 1260

GACTCCGGGG CATTCGCAGC CGATCCCGAC TCCGGGGCAG CCCCTGCCGC CCCAGCCGAT 1320

CCCGACTCCG GGGCGGCCCC TGACGCCCCA GCCGATCCCG ACTCCGGGGC GGCCCCTGAC 1380

GCCCCAGCCG ATCCAGATGC CGGGGCGGCC CCTGAGGCTC CCGCCGCCCC TGCGGCTGCT 1440

GAGACCCGGG CAGCCCATGT CGCCCCAGCT GCGCCAGACG CAGGGGCTCC CACTGCCCCA 1500

GCCGCTTCTG CCACCCGGGC AGCCCAAGTC CGCCGGGCGG CCTCTGCAGC CCCTGCCTCC 1560

GGGGCCAGAC GCAAGATCCA TCTCAGACCC CCCAGCCCCG AGATCCAGGC TGCCGATCCG 1620

CCTACTCCGC GGCCTACTCG CGCGTCTGCC TGGCGGGGCA AGTCCGAGAG CAGCCGCGGC 1680

CGCCGCGTGT ACTACGATGA AGGGGTGGCC AGCAGCGACG ATGACTCCAG CGGAGACGAG 1740

TCCGACGATG GGACCTCCGG ATGCCTCCGC TGGTTTCAGC ATCGGCGAAA TCGCCGCCGC 1800

CGAAAGCCCC AGCGCAACTT ACTCCGCAAC TTTCTCGTGC AAGCCTTCGG GGGCTGCTTC 1860

GGTCGATCTG AGAGTCCCCA GCCCAAAGCC TCGCGCTCTC TCAAGGTCAA GAAGGTACCC 1920

CTGGCGGAGA AGCGCAGACA GATGCGCAAA GAAGCCCTGG AGAAGCGGGC CCAGAAGCGC 1980

GCAGAGAAGA AACGCAGTAA GCTCATCGAC AAACAACTCC AGGACGAAAA GATGGGCTAC 2040

ATGTGTACGC ACCGCCTGCT GCTTCTAGGT GCTGGAGAAT CTGGTAAAAG CACCATTGTG 2100

AAGCAGATGA GGATCCTGCA TGTTAATGGG TTTAATGGAG AGGGCGGCGA AGAGGACCCG 2160

CAGGCTGCAA GGAGCAACAG CGATGGTGAG AAGGCAACCA AAGTGCAGGA CATCAAAAAC 2220

AACCTGAAAG AGGCGATTGA AACCATTGTG GCCGCCATGA GCAACCTGGT GCCCCCCGTG 2280

GAGCTGGCCA ACCCCGAGAA CCAGTTCAGA GTGGACTACA TCCTGAGTGT GATGAACGTG 2340

CCTGACTTTG ACTTCCCTCC CGAATTCTAT GAGCATGCCA AGGCTCTGTG GGAGGATGAA 2400

GGAGTGCGTG CCTGCTACGA ACGCTCCAAC GAGTACCAGC TGATTGACTG TGCCCAGTAC 2460

TTCCTGGACA AGATCGACGT GATCAAGCAG GCTGACTATG TGCCGAGCGA TCAGGACCTG 2520

CTTCGCTGCC GTGTCCTGAC TTCTGGAATC TTTGAGACCA AGTTCCAGGT GGACAAAGTC 2580

AACTTCCACA TGTTTGACGT GGGTGGCCAG CGCGATGAAC GCCGCAAGTG GATCCAGTGC 2640

TTCAACGATG TGACTGCCAT CATCTTCGTG GTGGCCAGCA GCAGCTACAA CATGGTCATC 2700

CGGGAGGACA ACCAGACCAA CCGCCTGCAG GAGGCTCTGA ACCTCTTCAA GAGCATCTGG 2760

AACAACAGAT GGCTGCGCAC CATCTCTGTG ATCCTGTTCC TCAACAAGCA AGATCTGCTC 2820

GCTGAGAAAG TCCTTGCTGG GAAATCGAAG ATTGAGGACT ACTTTCCAGA ATTTGCTCGC 2880

TACACTACTC CTGAGGATGC TACTCCCGAG CCCGGAGAGG ACCCACGCGT GACCCGGGCC 2940

AAGTACTTCA TTCGAGATGA GTTTCTGAGG ATCAGCACTG CCAGTGGAGA TGGGCGTCAC 3000

TACTGCTACC CTCATTTCAC CTGCGCTGTG GACACTGAGA ACATCCGCCG TGTGTTCAAC 3060

GACTGCCGTG ACATCATTCA GCGCATGCAC CTTCGTCAGT ACGAGCTGCT C 3111

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人

<221> P53基因

<400> 8

ATGGAGGAGC CGCAGTCAGA TCCTAGCGTC GAGCCCCCTC TGAGTCAGGA AACATTTTCA 60

GACCTATGGA AACTACTTCC TGAAAACAAC GTTCTGTCCC CCTTGCCGTC CCAAGCAATG 120

GATGATTTGA TGCTGTCCCC GGACGATATT GAACAATGGT TCACTGAAGA CCCAGGTCCA 180

GATGAAGCTC CCAGAATGCC AGAGGCTGCT CCCCGCGTGG CCCCTGCACC AGCAGCTCCT 240

ACACCGGCGG CCCCTGCACC AGCCCCCTCC TGGCCCCTGT CATCTTCTGT CCCTTCCCAG 300

AAAACCTACC AGGGCAGCTA CGGTTTCCGT CTGGGCTTCT TGCATTCTGG GACAGCCAAG 360

TCTGTGACTT GCACGTACTC CCCTGCCCTC AACAAGATGT TTTGCCAACT GGCCAAGACC 420

TGCCCTGTGC AGCTGTGGGT TGATTCCACA CCCCCGCCCG GCACCCGCGT CCGCGCCATG 480

GCCATCTACA AGCAGTCACA GCACATGACG GAGGTTGTGA GGCGCTGCCC CCACCATGAG 540

CGCTGCTCAG ATAGCGATGG TCTGGCCCCT CCTCAGCATC TTATCCGAGT GGAAGGAAAT 600

TTGCGTGTGG AGTATTTGGA TGACAGAAAC ACTTTTCGAC ATAGTGTGGT GGTGCCCTAT 660

GAGCCGCCTG AGGTTGGCTC TGACTGTACC ACCATCCACT ACAACTACAT GTGTAACAGT 720

TCCTGCATGG GCGGCATGAA CCGGAGGCCC ATCCTCACCA TCATCACACT GGAAGACTCC 780

AGTGGTAATC TACTGGGACG GAACAGCTTT GAGGTGCGTG TTTGTGCCTG TGCTGGGAGA 840

GACCGGCGCA CAGAGGAAGA GAATCTCCGC AAGAAAGGGG AGCCTCACCA CGAGCTGCCC 900

CCAGGGAGCA CTAAGCGAGC ACTGCCCAAC AACACCAGCT CCTCTCCCCA GCCAAAGAAG 960

AAACCACTGG ATGGAGAATA TTTCACCCTT CAGATCCGTG GGCGTGAGCG CTTCGAGATG 1020

TTCCGAGAGC TGAATGAGGC CTTGGAACTC AAGGATGCCC AGGCTGGGAA GGAGCCAGGG 1080

GGGAGCAGGG CTCACTCCAG CCACCTGAAG TCCAAAAAGG GTCAGTCTAC CTCCCGCCAT 1140

AAAAAACTCA TGTTCAAGAC AGAAGGGCCT GACTCAGACT GA 1182

<211> 684

<212> DNA

<213> 人

<221> FUBP1基因

<400> 9

ATGGCAGACT ATTCAACAGT GCCTFCCCCC CTCTTCTGGC TCAGCTGGTG GCGGTGGTGG 60

CGGCGGTGGT GGTGGAGGAG TTAACGACGC TTTCAAAGAT GCACTGCAGA GAGCCCGGCA 120

GATTGCAGCA AAAATTGGAG GTGATGCAGG GACATCACTG AATTCAAATG ACTATGGTTA 180

TGGGGGACAA AAAAGACCTT TAGAAGATGG AGATCAACCA GATGCTAAGA AAGTTGCTCC 240

TCAAAATGAC TCTTTTGGAA CACAGTTACC ACCGATGCAT CAGCAGCAAA GCAGATCTGT 300

AATGACAGAA GAATACAAAG TTCCAGATGG AATGGTTGGA TTCATAATTG GCAGAGGAGG 360

TGAACAGATC TCACGCATAC AACAGGAATC TGGATGCAAA ATACAGATAG CTCCTGACAG 420

TGGTGGCCTT CCAGAAAGGT CCTGTATGTT AACTGGAACA CCTGAATCTG TCCAGTCAGC 480

AAAACGGTTA CTGGACCAGA TTGTTGAAAA AGGAAGACCA GCTCCTGGCT TCCATCATGG 540

CGATGGACCG GGAAATGCAG TTCAAGAAAT CATGATTCCA GCTAGCAAGG CAGGATTAGT 600

CATTGGAAAA GGGGGAGAAA CTATTAAACA GCTTCAGGAA CGGGCTGGAG TTAAAATGGT 660

TATGATTCAA GACGGGCCGC AGAA 684

<211> 570

<212> DNA

<213> 人

<221> KRAS基因

<400> 10

ATGACTGAAT ATAAACTTGT GGTAGTTGGA GCTGGTGGCG TAGGCAAGAG TGCCTTGACG 60

ATACAGCTAA TTCAGAATCA TTTTGTGGAC GAATATGATC CAACAATAGA GGATTCCTAC 120

AGGAAGCAAG TAGTAATTGA TGGAGAAACC TGTCTCTTGG ATATTCTCGA CACAGCAGGT 180

CAAGAGGAGT ACAGTGCAAT GAGGGACCAG TACATGAGGA CTGGGGAGGG CTTTCTTTGT 240

GTATTTGCCA TAAATAATAC TAAATCATTT GAAGATATTC ACCATTATAG AGAACAAATT 300

AAAAGAGTTA AGGACTCTGA AGATGTACCT ATGGTCCTAG TAGGAAATAA ATGTGATTTG 360

CCTTCTAGAA CAGTAGACAC AAAACAGGCT CAGGACTTAG CAAGAAGTTA TGGAATTCCT 420

TTTATTGAAA CATCAGCAAA GACAAGACAG AGAGTGGAGG ATGCTTTTTA TACATTGGTG 480

AGGGAGATCC GACAATACAG ATTGAAAAAA ATCAGCAAAG AAGAAAAGAC TCCTGGCTGT 540

GTGAAAATTA AAAAATGCAT TATAATGTAA 570