阅读说明：本技术 一种用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒及检测方法 (Serum protein marker, kit and detection method for early screening and diagnosis of esophageal squamous carcinoma ) 是由 张建营 王鹏 叶华 代丽萍 史健翔 王晓 孙桂英 姜国忠 赵志华 于 2019-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物,属于生物医学技术领域,血清蛋白标志物为P53、GNA11、GNAS、PTEN、ACVR1B、FBXW7、EGFR、PDGFRA、SRSF2、MEN1、DAXX或CASP8基因编码的蛋白中的任意一种或两种以上的联合。本发明基于癌症驱动基因在肿瘤发生和发展中所起的作用,定制138个癌症驱动基因编码的人类蛋白质芯片,共包含180个人源重组蛋白质,用以筛选潜在的可用于诊断或其他表征癌症的标志物,先通过蛋白质芯片初步筛选出食管鳞癌的早期检测血清标志物,再经过ELISA间接法实验进行验证,最终筛选出可用于食管鳞癌早期筛查和诊断的一组食管鳞癌联合血清蛋白标志物,用于辅助食管鳞癌的临床诊断,具有较好的参考价值。(The invention discloses a serum protein marker for early screening and diagnosis of esophageal squamous carcinoma, which belongs to the technical field of biomedicine, and the serum protein marker is any one or combination of more than two of proteins encoded by P53, GNA11, GNAS, PTEN, ACVR1B, FBXW7, EGFR, PDGFRA, SRSF2, MEN1, DAXX or CASP8 genes. Based on the role of the cancer driver genes in the occurrence and development of tumors, the invention customizes 138 human protein chips coded by the cancer driver genes, which contain 180 human source recombinant proteins in total and are used for screening potential markers capable of being used for diagnosis or other characterization of cancers, firstly, early detection serum markers of esophageal squamous cell carcinoma are preliminarily screened out through the protein chips, then, the early detection serum markers are verified through ELISA indirect method experiments, and finally, a group of esophageal squamous cell carcinoma combined serum protein markers capable of being used for early screening and diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma are screened out for assisting clinical diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma, so that the invention has better reference value.)

一种用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂 盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域。

背景技术

食管癌(esophageal carcinoma，EC)是人类常见的消化道恶性肿瘤之一，从组织类型上，食管癌主要分为食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)和食管腺癌，根据世界卫生组织下属国际癌症研究所发布的全球肿瘤流行的最新数据(Globocan 2018)显示，2018年全球食管癌发病57.2万例，位居恶性肿瘤发病的第7位；同期全球食管癌死亡50.9万例，位居恶性肿瘤死亡的第6位，在全球不同地区食管癌的发病率可相差2-3倍。中国是全球食管癌发病率最高的五大地区之一，世界上食管癌新发病例中大约53％为中国人，根据最新的肿瘤统计数据显示，中国的食管癌的发病率居恶性肿瘤发病的第6位，死亡率居恶性肿瘤死因的第4位，2015年中国有24.6万食管癌新发病例，有18.8万因食管癌死亡病例，其中，80％以上的食管癌患者都为食管鳞癌患者。食管癌早期大多起病隐匿，症状多不典型或无症状，易被忽视，而当患者出现进行性吞咽困难等典型症状时，往往已到癌症的中晚期，丧失了最佳的治疗时机。

目前，手术、放疗、化疗是包括食管癌在内的肿瘤的常用治疗手段，对早期食管癌患者而言，主要采取以手术为主、以术前或术后放化疗为辅的根治性治疗方式，对丧失手术治疗时机的中晚期食管癌患者，主要采取放疗或化疗的治疗方式。当前临床上广泛应用的食管癌检测方法为上消化道内窥镜检查，但内镜检查因其操作具有侵袭性的特点，具有一定痛苦，缺乏依从性和普及运用的可能；而食管X线钡餐检查和CT影像扫描也因各自的局限性，而不适合在大规模人群中筛查。基于目前临床上食管癌的筛查方法存在的不足，如果能寻找出具有理想敏感度和特异度的食管癌标志物，并且检测手段价格低廉、便于进行高危人群的筛查，这将能创造巨大的社会价值，在医疗资源和经济价值方面均可节省，而且可提高患者的生存率和生存时间。

在食管癌生物标志物领域，国内外众多学者已进行了大量的研究和探索，目前临床上亦常用一些传统的肿瘤标志物用于食管癌的诊断，如癌胚抗原、癌抗原125、癌抗原199等，但这些肿瘤标志物在食管癌诊断中的灵敏度和特异度均不高，尤其对早期食管癌患者的诊断价值更有限。近年来，在人类肿瘤学的研究领域内，已经发现癌症患者血清中含有一组独特的诱发自身抗体反应的细胞蛋白，被称为肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)，其诱导产生的抗体称为抗TAA-抗体(autoantibody)。这一概念的提出对食管癌早期诊断研究指引了一个新的方向。已有研究显示食管癌患者血清中存在不同类别的抗TAAs自身抗体，可能就是食管癌患者针对食管上皮细胞癌变过程中的某些细胞内抗原免疫反应的结果。众多研究亦为抗TAAs自身抗体用于食管癌早期诊断提供了依据和可行性，但基于肿瘤发生过程的复杂性，单一的诊断指标用于肿瘤诊断的能力相对较差，一般不能满足临床上肿瘤诊断的需求，如研究显示，单一的一种抗TAAs自身抗体在食管癌患者血清中出现的频率非常低，一般不超过20％，限制了单一一项抗TAA自身抗体在肿瘤诊断中的应用。研究发现，通过联合使用一组“精心筛选”出来的抗TAAs自身抗体组合进行肿瘤的诊断，可在保证肿瘤诊断特异度的同时，大大提高肿瘤诊断的灵敏度，多项抗TAAs自身抗体组合联合应用于食管癌早期诊断的研究亦支持此学说。

十余年来的后续研究一直试图寻找诊断食管癌更加敏感特异的抗TAA自身抗体，优化诊断食管癌的组合。寻找有价值的TAA自身抗体，常用的方法有两种：一是重组cDNA表达文库血清学筛选(serological analysis of recombinant cDNA expressionlibraries，SEREX)；另一种是蛋白质组学技术。与SEREX相比，蛋白组学技术能够对多个肿瘤血清进行筛选，并且能够筛选出具有翻译后修饰的TAA。在肿瘤的发生发展过程中，涉及到几十万个基因的突变，但仅有某些关键基因突变才可引起肿瘤的发生发展，这些关键基因被称为癌症驱动基因。研究认为不同类型的肿瘤发生时，一般都包含2-8个驱动基因，正是因为这些基因的突变才可导致肿瘤的优势生长，这些基因可以通过调节细胞周期、细胞生存和基因组维持3个细胞核心过程，被分为12个信号通路。目前在多种肿瘤的全基因组测序研究中共发现138个癌症驱动基因(参见Vogelstein B.Science.(2013)339(6127):1546-1558)，包括74个抑癌基因和64个癌症基因。这些基于癌症驱动基因编码的蛋白亦可诱发机体在其循环血液中产生相应的自身抗体，通过对癌症驱动基因编码蛋白及其诱发的血清中的自身抗体的研究可在一定程度上揭示肿瘤的发生发展或预后等。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，同时提供包含用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物的试剂盒和相应的检测方法是本发明的另一发明目的。

基于上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，血清蛋白标志物为P53、GNA11、GNAS、PTEN、ACVR1B、FBXW7、EGFR、PDGFRA、SRSF2、MEN1、DAXX或CASP8基因编码的蛋白中的任意一种或两种以上的联合；

所述P53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

所述GNA11基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

所述GNAS基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

所述PTEN基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

所述ACVR1B基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；

所述FBXW7基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；

所述EGFR基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；

所述PDGFRA基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；

所述SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；

所述MEN1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；

所述DAXX基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；

所述CASP8基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。

所述血清蛋白标志物为P53、GNA11、GNAS、EGFR、SRSF2、MEN1或DAXX基因编码的蛋白中的任意一种或两种以上的联合。

所述血清蛋白标志物为P53、GNA11、GNAS、EGFR、SRSF2、MEN1和DAXX基因编码的蛋白的联合。

一种试剂盒，包括用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物。

所述血清蛋白标志物被包被于固相载体上。

所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺或纤维素。

所述试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液或终止液中的任意一种或两种以上的组合。

使用用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)对每种血清蛋白标志物分别进行包被、封闭后，清洗；

2)再与稀释后的待测血清进行一抗孵育，清洗，再进行二抗孵育，清洗；

3)显色系统显色后终止反应，测定吸光度值；

4)以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，将吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值，

P＝1/(1+Exp(7.412-6.101×OD_P53-12.763×OD_GNA11-10.307×OD_GNAS-11.469×OD_EGFR-10.270×OD_SRSF2+5.737×OD_MEN1+14.533×OD_DAXX))；

式中OD_P53、OD_GNA11、OD_GNAS、OD_EGFR、OD_PTEN、OD_SRSF2、OD_MEN1、OD_DAXX分别为每种血清蛋白标志物的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；

当P值≥0.5时，初步判定为食管鳞癌样品；

当P值＜0.5时，初步判定为正常样品。

还包括步骤5)计算出每种血清蛋白标志物的阳性率、灵敏度特异度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比；

步骤6)并联联合检测：利用logistics回归模型构建上述血清蛋白标志物的并联联合检测模型，计算联合诊断结果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明基于癌症驱动基因在肿瘤发生和发展中所起的作用，定制138个癌症驱动基因编码的人类蛋白质芯片，共包含180个人源重组蛋白质，用以筛选潜在的可用于诊断或其他表征癌症的标志物，先通过蛋白质芯片初步筛选出食管鳞癌的早期检测血清标志物，再经过ELISA间接法实验进行验证，最终筛选出可用于食管鳞癌早期筛查和诊断的一组食管鳞癌血清蛋白标志物，尤其是P53、GNA11、GNAS、EGFR、SRSF2、MEN1和DAXX基因编码的蛋白的联合，其联合诊断食管鳞癌ROC曲线下面积达0.85，95％CI为0.77～0.92，保证特异度90.0％时，灵敏度为56.3％，一致率达到79.1％，用于辅助食管鳞癌的临床诊断，具有较好的参考价值；

2)本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低等特点，且操作简单、快捷，为食管鳞癌的早期诊断提供依据。

附图说明

图1为实验例中基于focused array人蛋白质芯片检测原理图；

图2-1、2-2为实验例中蛋白质芯片筛选出的12个TAA单独诊断食管鳞癌ROC曲线分析图；

图3为实验例中蛋白质芯片筛选出的12个TAA的SNR值散点图；

图4为实验例中间接ELISA检测原理图；

图5-1、5-2为实验例中ELISA验证12个TAA单独诊断食管鳞癌ROC曲线分析图；

图6为实验例中ELISA验证12个TAA的OD值散点分布图；

图7为实验例中ELISA验证7个TAAs联合诊断食管鳞癌在训练集数据中的ROC曲线图；

图8为实验例中ELISA验证7个TAAs联合诊断食管鳞癌在验证集数据中的ROC曲线图。

具体实施方式

实验例

1血清样本的准备

1.1用于进行蛋白芯片实验的血清样本

收集在北京佑安医院和郑州大学第一附属医院原发性食管鳞癌病人(食管鳞癌经病理诊断)，病人同意以及机构审查委员会和医院伦理委员会批准。所有标本均用红头采血管采集研究对象全血5～10mL，在室温放置2小时后，1000xg离心15分钟，取上清液，每个样本分装若干份贴好标签于-80℃低温冰箱保存，避免反复冻融。

根据流行病学分析，本研究最终收集了86例原发性食管鳞癌血清，以及同时期体检的50例佑安医院正常对照血清进行初步芯片筛选。86例原发性食管鳞癌患者中，共有男性50(58.1％)例，女性36(41.9％)例，平均年龄为64±8岁，年龄范围为44-88岁；而50例正常血清中，有男性23(46.0％)例，女性27(54.0％)例，平均年龄为40±13岁，年龄范围为20-71岁。所有食管鳞癌患者血清都是在患者最初诊断为食管鳞癌尚未接受任何放化疗及手术治疗时采集的，被诊断的时间为2015年4月至2016年5月。正常人血清来自参加年度健康体检，无任何恶性肿瘤症状的体检人群。

1.2用于进行ELISA间接法实验验证的血清样本

(1)收集自北京佑安医院和郑州大学第一附属医院的血清样本(详见上述1.1部分)。

(2)来自郑州大学第一附属医院和河南省肿瘤医院(190例新发食管鳞癌)和郑州市金水区心血管调查项目(190例正常人)，190例新发性食管鳞癌患者中，共有男性133(70％)例，女性57(30％)例，平均年龄为64±8岁，年龄范围为41-87岁；而190例正常血清中，有男性133(70％)例，女性57(30％)例，平均年龄为64±9岁，年龄范围为40-88岁。所有食管鳞癌患者血清都是在患者最初诊断为食管鳞癌尚未接受任何放化疗时，被诊断的时间为2015年4月至2016年5月。正常人血清来自参加年度健康体检，无任何恶性肿瘤症状的体检人群。

2用于筛选食管鳞癌诊断标志物的蛋白芯片定制

将138个癌症驱动基因(参见Vogelstein B.Science.(2013)339(6127):1546-1558)编码的蛋白(共180个人源重组蛋白质)固定于蛋白芯片上，用于肿瘤标志物的筛选。用于筛选肿瘤标志物的蛋白芯片为在广州博翀生物科技有限公司定制的HuProtTM人类蛋白质芯片。

3蛋白芯片实验

实验原理参见图1。

3.1实验所需试剂：

1)封闭液：3mL 10％BSA，加入7mL 1×PBS溶液，混匀，置于冰上。

2)血清孵育液：1mL 10％BSA，加入9mL 1×PBST溶液溶液，混匀，置于冰上。

3)清洗液：1×PBST溶液，存放于4℃冰箱。

4)二抗孵育液：包括荧光标记抗人IgM二抗(cy5标记，呈现红色)和荧光标记抗人IgG二抗(cy3标记，呈现绿色)。

3.2蛋白芯片具体实验步骤

(a)复温：将芯片从-80℃冰箱取出，于4℃冰箱复温半小时，然后于室温复温15min。

(b)封闭：复温后的芯片，14blocks围栏固定，向每个block中加入封闭液，并放置在侧摆摇床上，室温封闭3小时。

(c)血清样本孵育：封闭完成后，倒尽封闭液体，然后迅速加入预先准备好的血清孵育液，每张芯片孵育14个样本(样本先放在4℃层析柜冻融，与含1％BSA的1×PBST溶液以1:50比例稀释)，每个血清样本的上样体积为200μL，侧摆摇床20rpm，4℃过夜孵育。

(d)清洗：将芯片及芯片夹一同取出，吸去样本，然后迅速加入等体积的1×PBST溶液，如此循环数次，保证在拆除芯片夹时血清样本间无交叉污染。拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min。

(e)二抗孵育：将芯片转移到加入了3mL二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床40rpm，避光，室温60min。

(f)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，80rpm清洗3次，每次10min。完成后用ddH₂O清洗2次，每次10min。

(g)干燥：将芯片置于芯片干燥机离心干燥。

(h)扫描：按照扫描仪的操作规范和使用说明操作。

(i)数据提取：将芯片图像和结果每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存。

(j)进行数据预处理。

(k)进行数据分析，获得最终的食管鳞癌血清标志物，该蛋白质芯片实验筛选出以下血清蛋白标志物：癌症驱动基因P53、GNA11、GNAS、PTEN、ACVR1B、FBXW7、EGFR、PDGFRA、SRSF2、MEN1、DAXX和CASP8编码的蛋白(图2-1、2-2为上述蛋白芯片筛选出的12个TAA单独诊断食管鳞癌的ROC曲线分析图，图2-1、2-2中1-11依次为P53、GNA11、GNAS、PTEN、ACVR1B、FBXW7、EGFR、PDGFRA、SRSF2、MEN1、DAXX和CASP8编码的蛋白单独诊断食管鳞癌的ROC曲线；图3为上述12个TAA的SNR值散点图，图3中N表示Normal，即健康正常血清，E表示Esophagealsquamous cell carcinoma，即食管磷癌病例)。其中，P53、GNA11、GNAS、PTEN、ACVR1B、FBXW7、EGFR、PDGFRA、SRSF2、MEN1、DAXX和CASP8基因编码的蛋白依次具有如SEQ ID NO.1～12所示的氨基酸序列。4ELISA间接法实验验证

实验原理参见图4。

具体实验步骤如下：

a)包被：按照表1中浓度进行包被100μL/孔，4℃过夜。

b)封闭：2％BSA(索莱宝，北京，分析纯)的1×PBST溶液(PBS，Tween20索莱宝，北京)溶液，200μL/孔，4℃过夜。

c)清洗：350μL/孔1×PBST溶液清洗3次。

d)一抗孵育：血清与含1％BSA的1×PBST溶液1:100体积比例稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。

e)清洗：350μL/孔1×PBST溶液清洗5次。

f)二抗孵育：HRP标记的鼠抗人IgG(奥科，武汉)与含1％BSA的1×PBST溶液1:10000稀释后，100μL/孔，37℃半水浴1h。

g)清洗：350μL/孔1×PBST溶液清洗5次。

h)显色：TMB显色系统，A液(200mgTMB·2HCl溶于1L去离子水，索莱宝，北京，分析纯)与B液(9.2g柠檬酸，37gNa₂HPO₄·12H₂O和8ml0.75％H₂O₂溶于1L去离子水)1:1体积比例混合后，100μL/孔，室温避光，达到预期颜色(约需5-15min)。

i)终止：10％的浓硫酸50μL/孔后10min内测吸光度。

j)测吸光度：以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，调整IgG做归一化处理，然后进行后续数据处理(数据处理方法详见下述“5数据处理”部分b)-d)所示)。

其中，上述经蛋白芯片实验筛选出的12个TAA进行ELISA实验验证时各自的包被浓度如下表1所示，ELISA实验的96孔板排布表如下表2所示。表2中阳性质控为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性质控为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经Western Blot验证为阴性的血清，空白为血清稀释液，IgG1～IgG8为梯度稀释的人IgG抗体，浓度依次为10、20、50、100、150、200、250、300ng/ml。

表1 12个TAA各自的包被浓度

表2 ELISA实验的96孔板排布

实验结果：采用ELISA间接法对12个TAA进行检测，结果见图5-1、5-2和图6。图5-1、5-2为ELISA验证实验中12个TAA单独诊断食管鳞癌的ROC曲线分析图，图中1-12依次为P53、GNA11、GNAS、PTEN、ACVR1B、FBXW7、EGFR、PDGFRA、SRSF2、MEN1、DAXX和CASP8编码的蛋白单独诊断食管鳞癌的ROC曲线；图6为ELISA验证实验中12个TAA的OD值散点分布图，图中N表示Normal，即健康正常血清，E表示Esophagealsquamous cell carcinoma，即食管磷癌病例。

从图5-1、5-2可看出，单个指标诊断食管鳞癌ROC曲线下面积为0.51～0.70，保证特异度最低90％时，灵敏度范围为13.1％～35.3％。其中，GNA11的曲线下面积最大，为0.70，灵敏度达到33.7％，特异度为90.5％；PTEN的ROC曲线下面积次之，为0.67，灵敏度达26.8％，特异度为91.6％；MEN1的ROC曲线下面积最小，为0.51，灵敏度达16.8％，特异度为90.5％。从图6可看出，12个指标OD值分布于0～1之间，中位OD值基本上均分布于0.2～0.4之间。5数据处理

通过使用focused array人蛋白质芯片在食管鳞癌组和NC正常对照组，通过统计学数据分析筛选出差异表达蛋白，具体方法如下：

(1)通过Focused Array蛋白质芯片实验获得芯片初筛结果。

(2)稳定性分析：在实验过程中，根据不同时间、不同芯片、不同位置，将测试样本test进行重复，用以评价不同芯片在不同时间的稳定性。

(3)数据分析及结果：剔除高背景、极端样本干扰后的样本，将IgG和IgM响应类型的各180个蛋白进行一致的统计学分析，分析逻辑如下：

a)为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理，实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值，进行后续统计学分析。

b)假设需要比对的样本分别来自完全相同的两个总体，并通过F检验确定所需比对两组方差是否齐性，然后把F检验结果选择对应t检验，并且t检验结果以P-value进行表征。定义，当p-value<0.05时，拒绝原假设，即两者存在显著性差异。

c)对于任一蛋白，计算癌症组与正常组的组间的差异倍数，即fold change，用以表示两组间差异。

d)对于任一蛋白，根据所比对两组的诊断意义，首先，定义cutoff＝1.5为阳性判断阈值，即样本在蛋白上的SNR≥1.5时，该蛋白为阳性蛋白；然后，以对照组为基础，设置合适的cutoff阈值，在此cutoff阈值下计算癌症组与对照组阳性率之差，并且以最大的差值作为该蛋白在所比较的癌症组中的阳性率，用以寻找癌症组针对对照组特异的高响应蛋白，最后，定义阳性率不得低于15％。

e)基于以上逻辑，进行食管鳞癌组(收集自北京佑安医院和郑州大学第一附属医院的86例原发性食管鳞癌患者血清)和佑安对照组(50例佑安医院正常血清)比对，筛选出食管鳞癌组明显高于对照组的差异蛋白作为食管鳞癌候选标志物，最终经芯片选定了12种血清蛋白标志物(P53、GNA11、GNAS、PTEN、ACVR1B、FBXW7、EGFR、PDGFRA、SRSF2、MEN1、DAXX和CASP8)来评价食管鳞癌的诊断价值。其中，P53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，GNA11基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，GNAS基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，PTEN基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，ACVR1B基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，FBXW7基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，EGFR基因编码的蛋白具有如SEQ IDNO.7所示的氨基酸序列，PDGFRA基因编码的蛋白具有如SEQID NO.8所示的氨基酸序列，SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，MEN1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，DAXX基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.11，所示的氨基酸序列CASP8基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。上述12种基因的信息来源见下表3。

表3 12种基因的信息来源

(4)对经蛋白质芯片筛选出的12种血清蛋白标志物进行ELISA实验验证：包括对送检芯片样本验证以及送检芯片之外重新收集的样本进行验证，既实现了蛋白芯片的验证又保证了推广性。

(5)实验结果：经蛋白质芯片筛选出的12种血清蛋白标志物进行ELISA实验验证，对所有验证人群利用随机抽样的方法，抽取总人群的70％作为训练集，利用二元logistics回归构建疾病预测模型，分别用逐步向前(Forward：conditional)、逐步向后(Backward：conditional)以及直接输入法(Enter)三种方法筛选指标，分别有7种、7种、12种蛋白进入模型，其所对应的ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度(Se)、特异度(Sp)如下表4所示。

表4不同筛选方法筛选出的模型指标

对以上所构建的模型的诊断价值以及经济效益分析，含有7个指标(P53、GNA11、GNAS、EGFR、SRSF2、MEN1、DAXX)的模型效果最佳，在剩余的30％人群(验证集)中进行验证，如图7、8所示，其联合诊断食管鳞癌ROC曲线下面积达0.85，95％CI为0.77～0.92，保证特异度90.0％时，灵敏度为56.3％，一致率达到79.1％。

实施例

一种用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，血清蛋白标志物为P53、GNA11、GNAS、EGFR、SRSF2、MEN1和DAXX基因编码的蛋白的联合；

所述P53基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

所述GNA11基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

所述GNAS基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

所述EGFR基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；

所述SRSF2基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；

所述MEN1基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；

所述DAXX基因编码的蛋白具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

一种试剂盒，包括用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物，所述血清蛋白标志物被包被于固相载体上，所述固相载体为由聚氯乙烯制成的凹孔平板，所述试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。

阳性对照血清为ELISA实验OD值较高的并经Western Blot实验验证为相应抗体阳性的血清，阴性对照血清为正常对照人群中ELISA实验OD值处于均值附近的且经WesternBlot验证为阴性的血清，封闭液为2％BSA的1×PBST溶液，血清稀释液和第二抗体稀释液均为含1％BSA的1×PBST溶液，第二抗体为HRP标记的鼠抗人IgG，洗涤液为1×PBST溶液，显色液为A液(200mgTMB·2HCl溶于1L去离子水，索莱宝，北京，分析纯)与B液(9.2g柠檬酸，37gNa₂HPO₄·12H₂O和8ml0.75％H₂O₂溶于1L去离子水)1:1体积比例混合的溶液，终止液为10％的浓硫酸。

使用用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物的检测方法，包括以下步骤：

1)对每种血清蛋白标志物分别进行包被(包被浓度见上表1，100μL/孔，4℃过夜)、封闭(采用封闭液200μL/孔，4℃过夜)后，350μL/孔洗涤液清洗3次；

2)再与稀释后的待测血清(待测血清与血清稀释液以1:100体积比例稀释)进行一抗孵育(100μL/孔，37℃半水浴1h)，350μL/孔洗涤液清洗5次，再进行二抗孵育(第二抗体与第二抗体稀释液以1:10000体积比例稀释，100μL/孔，37℃半水浴1h)，350μL/孔洗涤液清洗5次；

3)显色系统显色：TMB显色系统，显色液100μL/孔，室温避光，达到预期颜色；终止反应：10％的浓硫酸，50μL/孔终止，10min内测吸光度值；

4)以OD₄₅₀-OD₆₂₀为相对OD值，然后扣去空白对照，将吸光度值代入以下公式，计算预测概率P值，

P＝1/(1+Exp(7.412-6.101×OD_P53-12.763×OD_GNA11-10.307×OD_GNAS-11.469×OD_EGFR-10.270×OD_SRSF2+5.737×OD_MEN1+14.533×OD_DAXX))；

式中OD_P53、OD_GNA11、OD_GNAS、OD_EGFR、OD_PTEN、OD_SRSF2、OD_MEN1、OD_DAXX分别为每种血清蛋白标志物的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；

当P值≥0.5时，初步判定为食管鳞癌样品；

当P值＜0.5时，初步判定为正常样品；

5)计算出每种血清蛋白标志物的阳性率、灵敏度特异度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比；

6)并联联合检测：利用logistics回归模型构建上述血清蛋白标志物的并联联合检测模型，计算联合诊断结果。

结果显示，待测血清的P值大于0.5，初步判定为疑似食管鳞癌样品。

由于本实施例的方法测定的结果只能作为中间结果的信息，不能直接判定患者是否患有食管鳞癌，因此后续还需要结合临床症状、影像学及组织病理学等信息，最终判定患者的患病情况。

<110> 郑州大学

<120> 一种用于食管鳞癌早期筛查和诊断的血清蛋白标志物、试剂盒及检测方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1 .0

<211> 393

<212> PRT

<213> 人

<221> P53基因编码的蛋白

<400> 1

MEEPQSDPSV EPPLSQETFS DLWKLLPENN VLSPLPSQAM DDLMLSPDDI EQWFTEDPGP 60

DEAPRMPEAA PPVAPAPAAP TPAAPAPAPS WPLSSSVPSQ KTYQGSYGFR LGFLHSGTAK 120

SVTCTYSPAL NKMFCQLAKT CPVQLWVDST PPPGTRVRAM AIYKQSQHMT EVVRRCPHHE 180

RCSDSDGLAP PQHLIRVEGN LRVEYLDDRN TFRHSVVVPY EPPEVGSDCT TIHYNYMCNS 240

SCMGGMNRRP ILTIITLEDS SGNLLGRNSF EVRVCACPGR DRRTEEENLR KKGEPHHELP 300

PGSTKRALPN NTSSSPQPKK KPLDGEYFTL QIRGRERFEM FRELNEALEL KDAQAGKEPG 360

GSRAHSSHLK SKKGQSTSRH KKLMFKTEGP DSD 393

<211> 359

<212> PRT

<213> 人

<221> GNA11基因编码的蛋白

<400> 2

MTLESMMACC LSDEVKESKR INAEIEKQLR RDKRDARREL KLLLLGTGES GKSTFIKQMR 60

IIHGAGYSEE DKRGFTKLVY QNIFTAMQAM IRAMETLKIL YKYEQNKANA LLIREVDVEK 120

VTTFEHQYVS AIKTLWEDPG IQECYDRRRE YQLSDSAKYY LTDVDRIATL GYLPTQQDVL 180

RVRVPTTGII EYPFDLENII FRMVDVGGQR SERRKWIHCF ENVTSIMFLV ALSEYDQVLV 240

ESDNENRMEE SKALFRTIIT YPWFQNSSVI LFLNKKDLLE DKILYSHLVD YFPEFDGPQR 300

DAQAAREFIL KMFVDLNPDS DKIIYSHFTC ATDTENIRFV FAAVKDTILQ LNLKEYNLV 359

<211> 1037

<212> PRT

<213> 人

<221> GNAS基因编码的蛋白

<400> 3

MGVRNCLYGN NMSGQRDIPP EIGEQPEQPP LEAPGAAAPG AGPSPAEEME TEPPHNEPIP 60

VENDGEACGP PEVSRPNFQV LNPAFREAGA HGSYSPPPEE AMPFEAEQPS LGGFWPTLEQ 120

PGFPSGVHAG LEAFGPALME PGAFSGARPG LGGYSPPPEE AMPFEFDQPA QRGCSQLLLQ 180

VPDLAPGGPG AAGVPGAPPE EPQALRPAKA GSRGGYSPPP EETMPFELDG EGFGDDSPPP 240

GLSRVIAQVD GSSQFAAVAA SSAVRLTPAA NAPPLWVPGA IGSPSQEAVR PPSNFTGSSP 300

WMEISGPPFE IGSAPAGVDD TPVNMDSPPI ALDGPPIKVS GAPDKRERAE RPPVEEEAAE 360

MEGAADAAEG GKVPSPGYGS PAAGAASADT AARAAPAAPA DPDSGATPED PDSGTAPADP 420

DSGAFAADPD SGAAPAAPAD PDSGAAPDAP ADPDSGAAPD APADPDAGAA PEAPAAPAAA 480

ETRAAHVAPA APDAGAPTAP AASATRAAQV RRAASAAPAS GARRKIHLRP PSPEIQAADP 540

PTPRPTRASA WRGKSESSRG RRVYYDEGVA SSDDDSSGDE SDDGTSGCLR WFQHRRNRRR 600

RKPQRNLLRN FLVQAFGGCF GRSESPQPKA SRSLKVKKVP LAEKRRQMRK EALEKRAQKR 660

AEKKRSKLID KQLQDEKMGY MCTHRLLLLG AGESGKSTIV KQMRILHVNG FNGEGGEEDP 720

QAARSNSDGE KATKVQDIKN NLKEAIETIV AAMSNLVPPV ELANPENQFR VDYILSVMNV 780

PDFDFPPEFY EHAKALWEDE GVRACYERSN EYQLIDCAQY FLDKIDVIKQ ADYVPSDQDL 840

LRCRVLTSGI FETKFQVDKV NFHMFDVGGQ RDERRKWIQC FNDVTAIIFV VASSSYNMVI 900

REDNQTNRLQ EALNLFKSIW NNRWLRTISV ILFLNKQDLL AEKVLAGKSK IEDYFPEFAR 960

YTTPEDATPE PGEDPRVTRA KYFIRDEFLR ISTASGDGRH YCYPHFTCAV DTENIRRVFN 1020

DCRDIIQRMH LRQYELL 1037

<211> 403

<212> PRT

<213> 人

<221> PTEN基因编码的蛋白

<400> 4

MTAIIKEIVS RNKRRYQEDG FDLDLTYIYP NIIAMGFPAE RLEGVYRNNI DDVVRFLDSK 60

HKNHYKIYNL CAERHYDTAK FNCRVAQYPF EDHNPPQLEL IKPFCEDLDQ WLSEDDNHVA 120

AIHCKAGKGR TGVMICAYLL HRGKFLKAQE ALDFYGEVRT RDKKGVTIPS QRRYVYYYSY 180

LLKNHLDYRP VALLFHKMMF ETIPMFSGGT CNPQFVVCQL KVKIYSSNSG PTRREDKFMY 240

FEFPQPLPVC GDIKVEFFHK QNKMLKKDKM FHFWVNTFFI PGPEETSEKV ENGSLCDQEI 300

DSICSIERAD NDKEYLVLTL TKNDLDKANK DKANRYFSPN FKVKLYFTKT VEEPSNPEAS 360

SSTSVTPDVS DNEPDHYRYS DTTDSDPENE PFDEDQHTQI TKV 403

<211> 505

<212> PRT

<213> 人

<221> ACVR1B基因编码的蛋白

<400> 5

MAESAGASSF FPLVVLLLAG SGGSGPRGVQ ALLCACTSCL QANYTCETDG ACMVSIFNLD 60

GMEHHVRTCI PKVELVPAGK PFYCLSSEDL RNTHCCYTDY CNRIDLRVPS GHLKEPEHPS 120

MWGPVELVGI IAGPVFLLFL IIIIVFLVIN YHQRVYHNRQ RLDMEDPSCE MCLSKDKTLQ 180

DLVYDLSTSG SGSGLPLFVQ RTVARTIVLQ EIIGKGRFGE VWRGRWRGGD VAVKIFSSRE 240

ERSWFREAEI YQTVMLRHEN ILGFIAADNK DNGTWTQLWL VSDYHEHGSL FDYLNRYTVT 300

IEGMIKLALS AASGLAHLHM EIVGTQGKPG IAHRDLKSKN ILVKKNGMCA IADLGLAVRH 360

DAVTDTIDIA PNQRVGTKRY MAPEVLDETI NMKHFDSFKC ADIYALGLVY WEIARRCNSG 420

GVHEEYQLPY YDLVPSDPSI EEMRKVVCDQ KLRPNIPNWW QSYEALRVMG KMMRECWYAN 480

GAARLTALRI KKTLSQLSVQ EDVKI 505

<211> 627

<212> PRT

<213> 人

<221> FBXW7基因编码的蛋白

<400> 6

MCVPRSGLIL SCICLYCGVL LPVLLPNLPF LTCLSMSTLE SVTYLPEKGL YCQRLPSSRT 60

HGGTESLKGK NTENMGFYGT LKMIFYKMKR KLDHGSEVRS FSLGKKPCKV SEYTSTTGLV 120

PCSATPTTFG DLRAANGQGQ QRRRITSVQP PTGLQEWLKM FQSWSGPEKL LALDELIDSC 180

EPTQVKHMMQ VIEPQFQRDF ISLLPKELAL YVLSFLEPKD LLQAAQTCRY WRILAEDNLL 240

WREKCKEEGI DEPLHIKRRK VIKPGFIHSP WKSAYIRQHR IDTNWRRGEL KSPKVLKGHD 300

DHVITCLQFC GNRIVSGSDD NTLKVWSAVT GKCLRTLVGH TGGVWSSQMR DNIIISGSTD 360

RTLKVWNAET GECIHTLYGH TSTVRCMHLH EKRVVSGSRD ATLRVWDIET GQCLHVLMGH 420

VAAVRCVQYD GRRVVSGAYD FMVKVWDPET ETCLHTLQGH TNRVYSLQFD GIHVVSGSLD 480

TSIRVWDVET GNCIHTLTGH QSLTSGMELK DNILVSGNAD STVKIWDIKT GQCLQTLQGP 540

NKHQSAVTCL QFNKNFVITS SDDGTVKLWD LKTGEFIRNL VTLESGGSGG VVWRIRASNT 600

KLVCAVGSRN GTEETKLLVL DFDVDMK 627

<211> 405

<212> PRT

<213> 人

<221> EGFR基因编码的蛋白

<400> 7

MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV 60

VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIP LENLQIIRGN MYYENSYALA 120

VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF 180

QNHLGSCQKC DPSCPNGSCW GAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC 240

TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV 300

VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK 360

NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGLS 405

<211> 218

<212> PRT

<213> 人

<221> PDGFRA基因编码的蛋白

<400> 8

MGTSHPAFLV LGCLLTGLSL ILCQLSLPSI LPNENEKVVQ LNSSFSLRCF GESEVSWQYP 60

MSEEESSDVE IRNEENNSGL FVTVLEVSSA SAAHTGLYTC YYNHTQTEEN ELEGRHIYIY 120

VPDPDVAFVP LGMTDYLVIV EDDDSAIIPC RTTDPETPVT LHNSEGVVPA SYDSRQGFNG 180

TFTVGPYICE ATVKGKKFQT IPFNVYALKG TCIISFLL 218

<211> 221

<212> PRT

<213> 人

<221> SRSF2基因编码的蛋白

<400> 9

MSYGRPPPDV EGMTSLKVDN LTYRTSPDTL RRVFEKYGRV GDVYIPRDRY TKESRGFAFV 60

RFHDKRDAED AMDAMDGAVL DGRELRVQMA RYGRPPDSHH SRRGPPPRRY GGGGYGRRSR 120

SPRRRRRSRS RSRSRSRSRS RSRYSRSKSR SRTRSRSRST SKSRSARRSK SKSSSVSRSR 180

SRSRSRSRSR SPPPVSKRES KSRSRSKSPP KSPEEEGAVS S 221

<211> 575

<212> PRT

<213> 人

<221> MEN1基因编码的蛋白

<400> 10

MGLKAAQKTL FPLRSIDDVV RLFAAELGRE EPDLVLLSLV LGFVEHFLAV NRVIPTNVPE 60

LTFQPSPAPD PPGGLTYFPV ADLSIIAALY ARFTAQIRGA VDLSLYPREG GVSSRELVKK 120

VSDVIWNSLS RSYFKDRAHI QSLFSFITGT KLDSSGVAFA VVGACQALGL RDVHLALSED 180

HAWSWLYLKG SYMRCDRKME VAFMVCAINP SIDLHTDSLE LLQLQQKLLW LLYDLGHLER 240

YPMALGNLAD LEELEPTPGR PDPLTLYHKG IASAKTYYRD EHIYPYMYLA GYHCRNRNVR 300

EALQAWADTA TVIQDYNYCR EDEEIYKEFF EVANDVIPNL LKEAASLLEA GEERPGEQSQ 360

GTQSQGSALQ DPECFAHLLR FYDGICKWEE GSPTPVLHVG WATFLVQSLG RFEGQVRQKV 420

RIVSREAEAA EAEEPWGEEA REGRRRGPRR ESKPEEPPPP KKPALDKGLG TGQGAVSGPP 480

RKPPGTVAGT ARGPEGGSTA QVPAPAASPP PEGPVLTFQS EKMKGMKELL VATKINSSAI 540

KLQLTAQSQV QMKKQKVSTP SDYTLSFLKR QRKGL 575

<211> 740

<212> PRT

<213> 人

<221> DAXX基因编码的蛋白

<400> 11

MATANSIIVL DDDDEDEAAA QPGPSHPLPN AASPGAEAPS SSEPHGARGS SSSGGKKCYK 60

LENEKLFEEF LELCKMQTAD HPEVVPFLYN RQQRAHSLFL ASAEFCNILS RVLSRARSRP 120

AKLYVYINEL CTVLKAHSAK KKLNLAPAAT TSNEPSGNNP PTHLSLDPTN AENTASQSPR 180

TRGSRRQIQR LEQLLALYVA EIRRLQEKEL DLSELDDPDS AYLQEARLKR KLIRLFGRLC 240

ELKDCSSLTG RVIEQRIPYR GTRYPEVNRR IERLINKPGP DTFPDYGDVL RAVEKAAARH 300

SLGLPRQQLQ LMAQDAFRDV GIRLQERRHL DLIYNFGCHL TDDYRPGVDP ALSDPVLARR 360

LRENRSLAMS RLDEVISKYA MLQDKSEEGE RKKRRARLQG TSSHSADTPE ASLDSGEGPS 420

GMASQGCPSA SRAETDDEDD EESDEEEEEE EEEEEEEATD SEEEEDLEQM QEGQEDDEEE 480

DEEEEAAAGK DGDKSPMSSL QISNEKNLEP GKQISRSSGE QQNKGRIVSP SLLSEEPLAP 540

SSIDAESNGE QPEELTLEEE SPVSQLFELE IEALPLDTPS SVETDISSSR KQSEEPFTTV 600

LENGAGMVSS TSFNGGVSPH NWGDSGPPCK KSRKEKKQTG SGPLGNSYVE RQRSVHEKNG 660

KKICTLPSPP SPLASLAPVA DSSTRVDSPS HGLVTSSLCI PSPARLSQTP HSQPPRPGTC 720

KTSVATQCDP EEIIVLSDSD 740

<211> 278

<212> PRT

<213> 人

<221> CASP8基因编码的蛋白

<400> 12

MDFSRNLYDI GEQLDSEDLA SLKFLSLDYI PQRKQEPIKD ALMLFQRLQE KRMLEESNLS 60

FLKELLFRIN RLDLLITYLN TRKEEMEREL QTPGRAQISA YRVMLYQISE EVSRSELRSF 120

KFLLQEEISK CKLDDDMNLL DIFIEMEKRV ILGEGKLDIL KRVCAQINKS LLKIINDYEE 180

FSKGEELCGV MTISDSPREQ DSESQTLDKV YQMKSKPRGY CLIINNHNFA KAREKVPKLH 240

SIRDRNGTHL DAGSHSVAQA GVQWCDLGSL QPPPPWFG 278