阅读说明：本技术 一种生物3d打印墨水及其制备方法 (Biological 3D printing ink and preparation method thereof ) 是由 宋薇 姚斌 黄沙 付小兵 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种生物3D打印墨水及其制备方法,该制备方法包括以下步骤：S1：制备氢氧化钙饱和溶液,在氢氧化钙饱中加入二氧化硅纳米粒子悬液、离心、取沉淀；即得改性纳米生物玻璃粒子；S2：将明胶和海藻酸钠溶解于去离子水中溶解,再加入步骤S1制得的改性纳米生物玻璃粒子,搅拌均匀制得液态水凝胶,消毒、平衡,即得明胶-海藻酸钠复合水凝胶；S3：将氯化钙固体粉末溶解于去离子水中,制得氯化钙溶液,消毒灭菌,即得交联剂；S4：在所述明胶-海藻酸钠复合水凝胶中加入交联剂进行交联,即得生物3D打印墨水；本发明制备的生物3D打印墨水不仅力学性能显著提高且成胶性能良好、孔隙丰富,具有很好的载细胞潜能。(The invention provides biological 3D printing ink and a preparation method thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: s1: preparing a calcium hydroxide saturated solution, adding the silica nanoparticle suspension into the calcium hydroxide saturated solution, centrifuging, and taking a precipitate; obtaining modified nanometer biological glass particles; s2: dissolving gelatin and sodium alginate in deionized water, adding the modified nano bioglass particles prepared in the step S1, uniformly stirring to prepare liquid hydrogel, and sterilizing and balancing to obtain gelatin-sodium alginate composite hydrogel; s3: dissolving calcium chloride solid powder in deionized water to obtain calcium chloride solution, and sterilizing to obtain crosslinking agent; s4: adding a cross-linking agent into the gelatin-sodium alginate composite hydrogel for cross-linking to obtain biological 3D printing ink; the biological 3D printing ink prepared by the invention not only has obviously improved mechanical property, but also has good gelling property, rich pores and good cell-carrying potential.)

一种生物3D打印墨水及其制备方法

技术领域

本发明涉及医疗模型制造及应用领域，特别涉及一种生物3D打印墨水及其制备方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，对维持人体内环境的稳态和机体的正常生理功能具有十分重要的作用，由于暴露于外界环境中，皮肤的破损、缺失时常发生，对于较小的皮肤缺损，机体可以通过自身代偿达到一定程度的完全再生，但是对于较大的创面来说，皮肤一般进行瘢痕修复，而对于更大的创面，皮肤的缺损常常延迟愈合或无法愈合，此种创面使患者的机体直接暴露于外界环境中，不仅无法维持机体的体液平衡，还使得患者暴露于高危的感染风险之下，因此及时的封闭创面就显得十分必要，以往，临床工作中常常采用无菌纱布进行创面覆盖，以起到隔绝细菌、保护创面的作用，最终的创面愈合还依赖于患者创面自身的愈合能力，而对于糖尿病患者和局部血运不良的患者，依靠自身的修复能力很难做到创面的封闭，因此，如何解决此类修复功能不足的创面成为临床工作中的一大难点。

随着组织工程技术的日新月异，3D打印技术和载细胞水凝胶正逐渐成为人们关注的重点，理想的创面敷料应具备黏附创面、柔软、透气/透水、维持内环境稳态等基本特征，同时还能够形成保水层，此外，还应具备便于携带、使用的特性，而水凝胶因其能同时满足以上的要求，被广泛应用于生物敷料的研发中。

与以往组织工程的种子细胞向支架材料迁移，并辅助以促进再生的微环境不同，载细胞生物墨水可以将生物材料、种子细胞以及再生微环境融为一体，极大的提高了组织工程皮肤在临床应用的可能，而在载细胞水凝胶的研制过程中，生物材料的选择应用以及适当地加入再生微环境是目前研究的重点，明胶因其出色的生物降解性、生物相容性、高细胞附着和增殖以及低免疫原性等被广泛应用于伤口敷料的研究中，在以往的研究中，明胶-海藻酸钠载细胞生物墨水不仅具有良好的生物相容性，还能提高细胞的迁移、增殖和分化的能力，然而在实际应用的过程中，明胶-海藻酸钠载细胞生物墨水的打印胶块硬度较低，导致质地较软，难以应用于动物的创面模型。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种生物3D打印墨水及其制备方法，

本发明提供了一种应用于生物3D打印墨水的改性纳米生物玻璃粒子，该改性纳米生物玻璃粒子的制备方法如下：制备氢氧化钙饱和溶液，在氢氧化钙饱中加入二氧化硅纳米粒子悬液、离心、取沉淀；即得改性纳米生物玻璃粒子。

本发明还提供了一种由改性纳米生物玻璃粒子和明胶-海藻酸钠复合水凝胶、交联剂制备的生物3D打印墨水，其中，改性纳米生物玻璃粒子、明胶-海藻酸钠复合水凝胶和交联剂的质量比为100-120:1-1:10-12

本发明还提供了一种生物3D打印墨水的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

S1：改性纳米生物玻璃粒子的制备：制备氢氧化钙饱和溶液，在氢氧化钙饱中加入二氧化硅纳米粒子悬液、离心、取沉淀；即得改性纳米生物玻璃粒子；

S2：明胶-海藻酸钠复合水凝胶的制备：将明胶和海藻酸钠溶解于去离子水中溶解，再加入步骤S1制得的改性纳米生物玻璃粒子，搅拌均匀制得液态水凝胶，消毒、平衡，即得明胶-海藻酸钠复合水凝胶；

S3：交联剂的制备：将氯化钙固体粉末溶解于去离子水中，制得氯化钙溶液，消毒灭菌，即得交联剂；

S4：在明胶-海藻酸钠复合水凝胶中加入交联剂进行交联，即得生物3D打印墨水。

进一步地改进，步骤S1的制备氢氧化钙饱和溶液具体包括以下步骤：称量氢氧化钙固体粉末置于烧杯中，加入去离子水使氢氧化钙固体粉末在去离子水中的浓度为1.6-1.7g/L，用恒温磁力搅拌器搅拌12h以上，搅拌过程中将烧杯密封，搅拌结束后离心，弃沉淀，取上清，即得氢氧化钙饱和溶液。

进一步地改进，步骤S1中的在氢氧化钙饱中加入二氧化硅纳米粒子悬液、离心、取沉淀具体包括以下步骤：取氢氧化钙饱和溶液置于烧杯中，加入40wt％二氧化硅纳米粒子悬液，氢氧化钙饱和溶液与40wt％二氧化硅纳米粒子悬液的体积比为40:6-7，将烧杯置于恒温磁力搅拌器上搅拌，搅拌时间不少于72h，搅拌过程中保持烧杯为密封状态，搅拌后离心，取沉淀，加入去离子水洗涤，再离心，取沉淀，加水洗涤，如此往复洗涤三次，取沉淀。

其中，离心速度为1500rpm，离心时间为5min。

进一步地改进，步骤S2的明胶为A型明胶，来源于猪皮。

进一步地改进，步骤S2的将明胶和海藻酸钠溶解于去离子水中溶解，再加入步骤S1制得的改性纳米生物玻璃粒子，搅拌均匀制得液态水凝胶具体为：称取明胶和海藻酸钠置于小烧杯中，加入去离子水，明胶在去离子水中的浓度为0.01g/ml，海藻酸钠在去离子水中的浓度为0.03g/ml，密封烧杯，在40℃±5条件下的水浴锅内溶解25-35min，加入步骤S1制得的改性纳米生物玻璃粒子，再次密封烧杯，使用恒温磁力搅拌器在40±5℃条件下搅拌1.5-2.5h，即得液态水凝胶。

进一步地改进，步骤S2的消毒、平衡具体包括以下步骤：将液态水凝胶在70℃水浴条件下处理30min，再放置于4℃冷浴5min，重复3次，消毒完成后放室温条件下平衡1h，用封口膜密封后放置于4℃条件下保存。

进一步地改进，步骤S3的交联剂的制备具体包括以下步骤：称氯化钙固体粉末置于烧杯中，加入去离子水，每1000ml去离子水中添加25g氯化钙固体粉末，置于恒温磁力搅拌器搅拌25-35min，得到2.5％的氯化钙溶液，转移至耐高温玻璃瓶，高压锅高压消毒灭菌后密封，放4℃保存，即得交联剂。

进一步地改进，步骤S4的在明胶-海藻酸钠复合水凝胶中加入交联剂进行交联具体为：取交联剂滴加到3D打印块表面至交联剂完全覆盖打印块，交联10min后去除交联剂，用DMEM完全培养基冲洗一遍。

本发明还提供了改性纳米生物玻璃粒子在制备力学性能、成胶性能良好、孔隙丰富和具有很好的载细胞潜能的生物3D打印墨水中的应用。

本发明所提供的生物3D打印墨水的制备方法制备的生物3D打印墨水不仅力学性能显著提高且成胶性能良好、孔隙丰富，具有很好的载细胞潜能。此外，在载细胞实验中，该水凝胶还能保持完好的形态，具备优越的临床应用潜力。

附图说明

附图1.为改性前后的纳米生物玻璃粒子的外观图片，其中，A为改性前的纳米生物玻璃粒子的外观图片，B为改性纳米生物玻璃粒子的外观图片；

附图2.为改性纳米生物玻璃粒子加入到明胶、海藻酸钠水凝胶中，充分搅拌混匀后制得的液态水凝胶分别在室温和37℃条件下放置72h后的状态图；其中A是改性纳米生物玻璃粒子制得的液态水凝胶在37℃条件下放置72h后的状态图；B是未改性纳米生物玻璃粒子制得的液态水凝胶在37℃条件下放置72h后的状态图；C是改性纳米生物玻璃粒子制得的液态水凝胶在室温下放置72h后的状态图；D是未改性纳米生物玻璃粒子制得的液态水凝胶在室温下放置72h后的状态图；

附图3.是将第三代小鼠成纤维细胞与凝胶混合后交联培养和培养三天后的形状图片，其中，A是实施例的水凝胶载细胞交联后的状态图；B是对照例的水凝胶载细胞交联后的状态图；C是实施例的水凝胶载细胞培养3天后的水凝胶的状态图；D是对照例的水凝胶载细胞培养3天后的水凝胶的状态图；

附图4.为试验例4的细胞存活率和细胞抑制率的柱状图；其中，BG为实施例，con为对照例。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围；本发明中所使用的设备，如无特殊规定，均为本领域内常用的设备；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。

实施例1

本实施例提供了一种改性纳米生物玻璃粒子，该改性纳米生物玻璃粒子由以下方法制备而成：称量1.65g氢氧化钙固体粉末置于烧杯中，加入1000ml去离子水后用恒温磁力搅拌器搅拌，搅拌速度为1500r/min，搅拌时间为12h，搅拌过程中将烧杯密封，搅拌结束后离心，弃沉淀，取上清，即得氢氧化钙饱和溶液，取400ml氢氧化钙饱和溶液置于烧杯中，加入67ml的40wt％二氧化硅纳米粒子悬液，将烧杯置于恒温磁力搅拌器上搅拌，搅拌时间为72h，搅拌速度为200r/min，搅拌过程中保持烧杯为密封状态，搅拌后离心5500rpm，10min，取沉淀，加入去离子水洗涤，再离心，取沉淀，加水洗涤，如此往复洗涤三次，取沉淀，即得改性纳米生物玻璃粒子。

实施例2

本实施例提供了一种生物3D打印墨水的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

S1：称量1.65g氢氧化钙固体粉末置于烧杯中，加入1000ml去离子水后用恒温磁力搅拌器搅拌，搅拌速度为1500r/min，搅拌时间为12h，搅拌过程中将烧杯密封，搅拌结束后离心，弃沉淀，取上清，即得氢氧化钙饱和溶液，取400ml氢氧化钙饱和溶液置于烧杯中，加入67ml的40wt％二氧化硅纳米粒子悬液，将烧杯置于恒温磁力搅拌器上搅拌，搅拌时间为72h，搅拌速度为200r/min，搅拌过程中保持烧杯为密封状态，搅拌后离心5500rpm，10min，取沉淀，加入去离子水洗涤，再离心，取沉淀，加水洗涤，如此往复洗涤三次，取沉淀，即得改性纳米生物玻璃粒子；

S2：称取0.1g的A型明胶来源于猪皮和0.3g海藻酸钠置于小烧杯中，加入10ml去离子水，密封烧杯，在40℃条件下的水浴锅内溶解30min，加入步骤S1制得的改性纳米生物玻璃粒子，再次密封烧杯，使用恒温磁力搅拌器在40℃条件下搅拌2h，搅拌速度为200r/min，即得液态水凝胶，将液态水凝胶在70℃水浴条件下处理30min，再放置于4℃冷浴5min，重复3次，消毒完成后放室温条件下平衡1h，用封口膜密封后放置于4℃条件下保存，即得明胶-海藻酸钠复合水凝胶；

S3：称2.5g氯化钙固体粉末置于烧杯中，加入100ml去离子水，置于恒温磁力搅拌器搅拌30min，得到2.5％的氯化钙溶液，转移至耐高温玻璃瓶，高压锅高压消毒灭菌后密封，放4℃保存，即得交联剂；

S4：在明胶-海藻酸钠复合水凝胶中加入交联剂进行交联，即得生物3D打印墨水。

对照例1

本对照例提供了一种生物3D打印墨水的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

S1：称取0.1g的A型明胶来源于猪皮和0.3g海藻酸钠置于小烧杯中，加入10ml去离子水，密封烧杯，在40℃条件下的水浴锅内溶解30min，再次密封烧杯，使用恒温磁力搅拌器在40,℃条件下搅拌2h，搅拌速度为200r/min，即得液态水凝胶，将液态水凝胶在70℃水浴条件下处理30min，再放置于4℃冷浴5min，重复3次，消毒完成后放室温条件下平衡1h，用封口膜密封后放置于4℃条件下保存，即得明胶-海藻酸钠复合水凝胶；

S2：称2.5g氯化钙固体粉末置于烧杯中，加入100ml去离子水，置于恒温磁力搅拌器搅拌30min，得到2.5％的氯化钙溶液，转移至耐高温玻璃瓶，高压锅高压消毒灭菌后密封，放4℃保存，即得交联剂；

S3：取交联剂滴加到3D打印块表面至交联剂完全覆盖打印块，交联10min后去除交联剂，用DMEM完全培养基冲洗一遍，即得生物3D打印墨水。

试验例1外观观察

取未改性的纳米玻璃粒子分散液(购买自sigma的试剂货号420816-1L)和实施例1制得的改性纳米生物玻璃粒子，观察其外观，结果见图1，可知，未经改性的纳米玻璃粒子分散液呈透明色，而本发明提供的改性纳米生物玻璃粒子呈乳白色。

试验例2凝胶状态稳定性

分别将未改性的纳米生物玻璃粒子和改性纳米生物玻璃粒子加入到实施例2步骤S2制得的明胶-海藻酸钠复合水凝胶中，充分搅拌混匀后在40℃条件下放置72h，观察其是否出现沉淀，结果如图2所示，由图2可知，改性纳米生物玻璃粒子可与明胶和海藻酸钠维持稳定的凝胶状态。

试验例3各组生物3D打印墨水与细胞培养后的状态测试

将实施例2和对照例1的生物3D打印墨水分别与第三代小鼠成纤维细胞混合后交联，放置于37℃，5％CO2细胞培养箱培养3天后，取出凝胶块，观察凝胶块状态，结果见图3，由图3可知，各组生物3D打印墨水与第三代小鼠成纤维细胞交联以及培养3天后均未出现溶解、分散现象，形状保持完好。

试验例4细胞增殖/毒性实验

细胞增殖/毒性实验：取第三代小鼠成纤维细胞按每孔1×10⁴细胞浓度接种到96孔板中，每孔加入DMEM完全培养基100ul，放细胞培养箱培养，培养条件为5％CO₂、37℃，待细胞完全贴壁后，弃掉旧的培养基，重新加入新的DMEM完全培养基100ul，分别加入10ul将实施例2和对照例1的生物3D打印墨水(提前在37℃溶解)，左右轻微摇匀后继续放回细胞培养箱培养12h、24h、48h，接着向每孔加入10ul CCK-8溶液(购买自碧云天的试剂，货号C0038)，再将96孔板放回培养箱内孵育2h，培养条件为5％CO₂、37℃，最后用酶标仪测定在450nm处的吸光度，测定并计算细胞存活率和对细胞的抑制率，结果见图4，由图4可知，共培12h时，对照例1的细胞存活率稍稍高于实施例2，24h、48h时，两组细胞存活率无明显差异，无论共培12h、24h还是48h，两组的细胞存活率均高于90％，表明本发明提供的生物3D打印墨水具有良好的生物相容性。

试验例5热稳定性测量

将实施例2和对照例1制得的液态水凝胶分别放置于室温(25℃)、37℃及4℃条件下，观察两组液态水凝胶流动状态并记录两组液态水凝胶在室温(25℃)和37℃条件下的成胶时间，以及在37℃条件下的熔胶时间，每组做三个平行样，每隔5min观察一下，结果取平均值，试验结果见表1。

表1.两组液态水凝胶的成胶时间和溶胶时间

由表1可以看出，本发明提供的方法制备的液态水凝胶的成胶时间和溶胶时间都较对照例的短，证明本发明提供的制备方法制备的生物3D打印墨水更加易于成型且易于溶解。

试验例6杨氏模量测量

本试验例的杨氏模量测量均在实验室环境、室温下、空气湿度在30％环境内完成，将实施例2和对照例1制备的液态水凝胶放置于10ml的注射器内，实施例2和对照例1均做3个平行样，将各装有液态水凝胶的注射器放置于4℃冷浴2h，待液态水凝胶完全凝固后得到固态凝胶支架，用35ml 2.5％的CaCl₂溶液交联凝胶支架，过夜14h，弃掉交联剂，测量交联后的凝胶支架的长、宽、高以便计算体积和表面积。测量完成后，将凝胶支架置于杨氏模量测定仪(Instron model 5567)上，运行速度设为5mm/min，测量各组生物3D打印墨水的杨氏模量，试验结果见表2。

表2.实施例和对照例的生物3D打印墨水杨氏模量测试结果

由表2可知，本发明提供的生物3D打印墨水的杨氏模量胶未添加改性纳米生物玻璃粒子的对照组更大，硬度比对照组增加了一倍还要多，表明本发明提供的生物3D打印墨水的机械性能更好。

试验例73孔隙率测量

将实施例2和对照例1制备的液态水凝胶放置于10ml的注射器内，实施例和对照例均做3个平行样，将各装有液态水凝胶的注射器放置于4℃冷浴2h，待液态水凝胶完全凝固后得到固态凝胶支架，向每个固态凝胶支架中加入35ml的2.5％CaCl2交联剂交联过夜14h，第二天弃掉交联剂，将各凝胶支架放置于-20℃冷冻14h，再转移至冻干机上，设置冻干机参数，按程序冻干后得到冻干凝胶样品，每组准备相同的3个有刻度的试管，每管放入10ml无水乙醇，得到体积V1，将冻干凝胶样品放入无水乙醇中，在4℃条件下放置48h,待冻干凝胶全部吸液沉底后记录试管内总体积得到V 2，将吸液后冻干凝胶样品取出，并记录试管内的液体体积得到V 3，则凝胶孔隙率P(％)＝(V1-V3)/(V2-V1)*100％.计算各组生物3D打印墨水的凝胶孔隙率，结果见表3。

表3.实施例2和对照例1的生物3D打印墨水的孔隙率结果

由表3可知，实施例2提供的生物3D打印墨水的孔隙率略低于对照例1，但二者均大于0.8，可允许细胞粘附和伸展。

最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。