阅读说明：本技术 一种被动吸烟大鼠早期肝损伤模型建立方法及相关基因筛选方法 ([db:专利名称-en]) 是由 蔡继宝 苏加坤 徐达 郭磊 罗娟敏 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种被动吸烟大鼠早期肝损伤相关基因筛选方法,该方法建立大鼠被动吸烟模型,通过肝脏基因芯片技术,筛选出被动吸烟大鼠早期肝损伤差异基因,并对其功能进行注释分析,为吸烟致肝损伤提供基因水平的发现与解释,其建立的被动吸烟大鼠模型科学性更高,可靠性更强,染毒烟雾浓度控制精确,建模周期短,临床意义重大,可实现早发现早预防。([db:摘要-en])

一种被动吸烟大鼠早期肝损伤模型建立方法及相关基因筛选 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于被动吸烟大鼠肝损伤相关基因 筛选与功能分析的方法。

背景技术

吸烟危害健康已是众所周知的事实。全世界每年因吸烟死亡达250万人之 多，烟是人类第一杀手。自觉养成不吸烟的个人卫生习惯，不仅有益于健康，而 且也是一种高尚公共卫生道德的体现。吸烟者吐出来的冷烟雾中，烟焦油和烟碱 的含量比吸烟者吸入的热烟含量多1倍，苯并芘多2倍，一氧化碳多4倍，氨多 50倍。

烟草已被国家确定为一级致癌物。吸烟者比不吸烟者患肺癌的概率高10到 30倍，90％的总死亡率是由吸烟所导致。有资料表明，长期吸烟者的肺癌发病率 比不吸烟者高10-20倍，喉癌发病率高6-10倍，冠心病发病率高2-3倍。循环系 统发病率高3倍，气管炎发病率高2-8倍。

WHO资料表明，目前全球每年死于与吸烟有关的各种疾病达300万人，估 计到2025年将升高到1000万，而我国将占200万。2002年我国15岁以上人群 吸烟率为35.8％，其中男性和女性吸烟率分别为66.0％和3.1％。由此估计，吸烟 者约为3.5亿，占世界烟民的三分之一。此外，我国吸烟人群有年轻化的趋势， 与20世纪80年代相比，开始吸烟的平均年龄由22.4岁降为19.7岁。我国既是 烟草生产大国，也是烟草消费大国。我国的烟草产量相当于其他7个最大烟草生 产国的总和。我国每年销售的香烟高达1.6万亿支，国人消费的香烟约占世界三 分之一。如果将与吸烟有关的各种疾病所致的死亡均统计在内，目前每年约有100万人因此死亡。

中华医学会呼吸病学分会主任委员、***北京医院副院长王辰指出，吸烟 危害健康是不争的医学结论。撰写与发布《中国吸烟危害健康报告》的目的。调 查表明，我国吸烟人群逾3亿，另有约7.4亿不吸烟人群遭受二手烟的危害；每 年因吸烟相关疾病所致死亡人数超过100万，如对吸烟流行状况不加以控制，至 2050年每年死亡人数将突破300万，成为人民群众生命健康与社会经济发展不 堪承受之重。《报告》指出，烟草烟雾中含有69种已知的致癌物，这些致癌物 会引发机体内关键基因突变，正常生长控制机制失调，最终导致细胞癌变和恶性 肿瘤的发生。

香烟烟雾中含有4000种以上的有毒化学物质，主要通过以下几种机制损害 肝脏：①直接或间接毒性作用，促进IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子的产生，引 起继发性红细胞增多症，加重血清和肝脏的铁负荷及氧化应激，损伤肝细胞，激 活肝星状细胞，从而加重肝脏的炎症坏死和纤维化。②免疫损伤：吸烟可以抑制 淋巴细胞增殖，加速淋巴细胞凋亡，影响机体的体液免疫和细胞免疫；③致癌作 用：可以抑制T细胞活性，降低对肿瘤细胞的免疫监督作用，产生的苯并芘， 亚硝胺、放射性氡和钋等致癌物质可抑制p53基因的表达，增加肝细胞(HCC) 等肿瘤的发生。有研究表明吸烟能够原发性胆汁性肝硬化的发生率，而且呈剂量 依赖性的增加肝纤维化的风险。

发明内容

本发明的目的在于建立一种大鼠被动吸烟染毒模型，并利用基因芯片技术寻 找被动吸烟大鼠相较于正常大鼠的肝损伤差异基因，并对差异基因进行功能分 析，为吸烟致肝损伤提供基因水平的发现与解释。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种被动吸烟大鼠早期肝损伤相关基因筛选方法：建立大鼠被 动吸烟模型，通过肝脏基因芯片技术，筛选出被动吸烟大鼠早期肝损伤差异基因， 并对其功能进行注释分析。

优选的，所述大鼠被动吸烟模型建立方法为：每天进行60min时间主流烟气 暴露染毒，烟气浓度控制在(1100±10％)mg/m³，连续染毒30天。

优选的，所述大鼠被动吸烟模型建立时，所用香烟参数为：烟碱1.0mg/支， 焦油1.0mg/支，一氧化碳10.0mg/支。

优选的，所述大鼠肝脏基因芯片检测所用芯片为Agilent Rat lncRNA 2018 版。

优选的，所述肝脏基因芯片技术中，大鼠肝脏基因芯片数据采用FeatureExtraction软件(version10.7.1.1,Agilent Technologies)处理原始图像提取原始数据，接着利用Genespring软件(version 13.1,Agilent Technologies)进行quantile标 准化和后续处理，标准化后的数据进行过滤，用于比较的每组样本中至少有一组100％标记为“P”的探针留下进行后续分析，利用倍数变化值进行差异基因和差 异lncRNA筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>＝2.0且P值<＝0.05。 接着，对差异基因进行GO和KEGG富集分析，判定差异基因主要影响的生物 学功能或者通路。

优选的，所述被动吸烟大鼠早期肝损伤差异基因主要有：Ccdc77、Eef2k、Slc10a2、Fyn、Cacna1d、Samsn1、Rab30、Gstm6、Skap1、Cyp3a9、Nkain4、 Odf2、Stap1、Timd4、Ppara、Abcg2、Arhgef15、Asrgl1、Arl4d、Skap1、Fggy、 Gimap7。

优选的，所述被动吸烟大鼠早期肝损伤差异基因主要影响的生物学功能有： Tcell receptor signaling pathway；organ induction；transmembrane receptorprotein tyrosine kinase signaling pathway；proteolysis；negative regulation ofextrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand；regulation ofcilium assembly； cell surface receptor signaling pathway；positive regulationof signal transduction； dendrite morphogenesis；Cellular Component；TermDescription；T cell receptor complex；alpha-beta T cell receptor complex；cell periphery；apical plasma membrane；cell projection；cis-Golgi network；Molecular Function；TermDescription； phosphotyrosine binding；SH3/SH2adaptoractivity；metallocarboxypeptidase activity；protease binding；lipid binding；steroid hydroxylase activity。

优选的，所述被动吸烟大鼠早期肝损伤差异基因主要影响的通路有：Primaryimmunodeficiency；Hematopoietic cell lineage；Chemical carcinogenesis；T cellreceptor signaling pathway；Prion diseases；Linoleic acid metabolism；Measles

综上，与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：

本发明公开的被动吸烟大鼠模型通过每天60***流烟气暴露染毒，连续 30天进行造模。通过肝脏记基因芯片，筛选被动吸烟大鼠早期肝损伤基因，通 过GO和KEGG对差异基因进行功能分析，明确被动吸烟大鼠早期肝损伤差异 基因对机体生物功能和通路。

本发明在试验中每周对动物称重1次，其中，模型雄鼠体重在烟气暴露第 15、22、29天与对照组比较有统计学差异(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)；30 天后将动物解剖，摘取肝脏称重并计算脏器系数，结果表明烟气暴露30天，模 型组雄鼠肝脏重量低于对照组，有统计学差异(P＜0.01)。试验表明，雄鼠被 动吸烟30天后，肝脏重量和体重降低，说明该模型对动物肝脏有一定影响；基 因芯片结果表明被动吸烟大鼠早期肝损伤差异基因主要有：Ccdc77、Eef2k、 Slc10a2、Fyn、Cacna1d、Samsn1、Rab30、Gstm6、Skap1、Cyp3a9、Nkain4、Odf2、Stap1、Timd4、Ppara、Abcg2、Arhgef15、Asrgl1、Arl4d、Skap1、Fggy、 Gimap7，差异基因相关生物功能和通路有：Primary immunodeficiency； Hematopoietic cell lineage；Chemical carcinogenesis；T cell receptor signaling pathway；Prion diseases；Linoleic acid metabolism；Measles。

本发明建立的被动吸烟大鼠模型科学性更高，可靠性更强，染毒烟雾浓度控 制精确，建模周期短，通过对香烟型号、染毒时间、染毒方法、香烟焦油含量等 关键参数进行限定，可在短期时间内及早筛选出早期肝损伤差异基因，临床意义 重大，可实现早发现早预防，并能及早采取措施。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发 明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于 本发明的范围。

实施例

被动吸烟大鼠模型的建立

1实验动物：动物种系：SD大鼠，SPF级，雄鼠，共24只，购入时动物 年龄：9～10周龄，动物购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号： SCXK-(京)2016-0006。动物饲养于屏障环境内(许可证号：SYXK(晋)2013-0002， 有效期：2013年12月4日至2018年12月4日，发证机关：山西省科学技术厅)， 由获得资格认可的人员饲养。使用仁科环境监控平台对动物饲养室温湿度进行监 控，室温控制在20～26℃,湿度40～70％，12小时照明，12小时黑暗。标准饲 养笼内饲养,每笼5只,每周换笼2次。每日作业结束后清扫，擦拭笼架、台面，每周五用消毒液(稀戊二醛溶液、新洁尔灭)擦拭消毒，每周轮流更换消毒剂种 类。饲料为北京科澳协力饲料有限公司生产的大、小鼠饲料，饲料生产许可证号： SCXK-(京)2014-0010。动物自由饮食饮水，经适应性饲养7天后开始试验。

2试验方法：依据体重将24只动物随机分为对照组和模型组。将模型组动 物放置于染毒腔体内，按照60min时间进行主流烟气暴露染毒，烟气浓度控制在 (1100±10％)mg/m3。对照组动物不染毒，模型组动物采用普通卷烟染毒；染 毒频次为每天染毒1次，共30天。每周测定1次体重。染毒30天后，对所有动 物进行大体解剖检查，腹主动脉取血用于血液生化指标检测，摘取肝脏进行称重， 然后将肝脏迅速投入液氮冷冻5min以上，再转移至-80℃冰箱保存备用。然后 委托专业检测机构进行基因组学检测。

3差异筛选

在筛选差异基因之前，先进行探针过滤，在分组的每组样本中至少有一组 100％标记为“P”的探针留下进行后续分析。对于有生物学重复的分析，利用T 检验得到的差异显著性P值和标准化信号值的差异倍数Fold change值进行筛选， 标准为Fold change值>＝2.0且P值<＝0.01。对于没有生物学重复的分析，仅利 用差异倍数Fold change值进行筛选，标准为Fold change值>＝2.0。

4 GO分析

对差异基因进行GO分析，从而对这个基因的功能进行描述。GO包括三大 板块，Biological Process，Cellular Component和Molecular Function，所以有三类 结果。统计每个GO条目中所包括的差异基因个数，并用统计检验的方法计算 每个GO条目中差异基因富集的显著性。计算的结果会返回一个富集显著性的P 值，小的p值表示差异基因在该GO条目中出现了富集。可以根据GO分析的 结果结合生物学意义从而挑选用于后续研究的基因。

5 KEGG分析

利用KEGG数据库对差异基因进行Pathway分析，并且用统计检验的方法 计算每个Pathway条目中差异基因富集的显著性。计算的结果会返回一个富集显 著性的P值，小的P值表示差异基因在该Pathway中出现了富集。Pathway分 析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的Pathway分析，可以找到富集差 异基因的Pathway条目，寻找不同样品的差异基因可能和哪些细胞通路的改变 有关。

6实验结果

6.1体重和脏器重量变化

实验结果表明模型组动物体重在烟气暴露第15、22、29天与对照组比较有统 计学差异(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)；30天后将动物解剖，摘取肝脏、脾脏 称重，结果表明烟气暴露30天，模型组雄鼠肝脏重量低于对照组，有统计学差异 (P＜0.01)。上述结果表明，雄鼠被动吸烟30天后，肝脏重量和体重降低，说 明该模型对动物肝脏有一定影响。实验动物体重和脏器重量结果实验结果见表1 和表2。

表1被动吸烟大鼠动物体重变化

注：与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01。

表2被动吸烟大鼠动物脏器重量变化

注：与对照组比较，**P<0.01。

6.2差异基因筛选

利用T检验得到的差异显著性P值和标准化信号值的差异倍数Fold change值 进行筛选，标准为Fold change值>＝2.0且P值<＝0.01。对于没有生物学重复的分 析，仅利用差异倍数Fold change值进行筛选，标准为Fold change值>＝2.0。试验 中共筛选得到差异基因22条，其中上调15条，下调7条，详细结果见表3。

表3被动吸烟大鼠肝脏差异基因筛选结果

6.3差异基因GO分析

利对差异基因进行GO分析，从而对这个基因的功能进行描述。GO包括三大板块，Biological Process，Cellular Component和Molecular Function。用统计检验的方法计算每个GO 条目中差异基因富集的显著性。选取P值<0.01的结果，结果表明，被动吸烟大鼠肝脏差异基 因涉及的生物过程有9项，涉及的细胞组分有6项，涉及的分子功能有6项，具体结果详见表4。

表4被动吸烟大鼠肝脏差异基因GO分析结果

6.4差异基因KEGG分析

利用KEGG数据库对差异基因进行Pathway分析，并且用统计检验的方法计算每个Pathway条目中差异基因富集的显著性。选取P值<0.01的结果，结果表明，被动吸烟大鼠肝脏 差异基因涉及的通路有7条，7条通路主要有免疫、造血细胞谱系、T细胞受体信号通路、亚油 酸的新陈代谢等信号通路，具体结果详见表5。

表5被动吸烟大鼠肝脏差异基因KEGG分析结果

TermID	TermDescription	P-value
			path:rno053	Primary immunodeficiency	0.00025
path:r4n0o046	Hematopoietic cell lineage	0.0022
			path:r4n0o052	Chemical carcinogenesis	0.0028
path:r0n4o046	T cell receptor signaling pathway	0.0046
			path:r6n0o050	Prion diseases	0.0056
path:r2n0o005	Linoleic acid metabolism	0.0075
			path:r9n1o051	Measles	0.0084