阅读说明：本技术 极长链多不饱和脂肪酸、类延长素（elovanoid）羟基化衍生物和使用方法 (Very long chain polyunsaturated fatty acid, elongin-like (elowanoid) hydroxylated derivatives and methods of use ) 是由 N·G·巴赞 N·A·佩塔西斯 于 2018-03-19 设计创作，主要内容包括：提供了化合物、药物组合物、化妆品和皮肤病学组合物或营养补充组合物,其包括ω-3极长链多不饱和脂肪酸(n-3 VLC-PUFA)和/或其内源性羟基化衍生物(被称为类延长素)。本公开提供了用于神经保护、器官和组织保护或恢复、预防或减缓衰老相关疾病和病状以及在衰老过程期间维持功能的方法。(Compounds, pharmaceutical, cosmetic and dermatological or nutraceutical compositions are provided that include omega-3 very long chain polyunsaturated fatty acids (n-3 VLC-PUFAs) and/or their endogenous hydroxylated derivatives (known as elongatoids). The present disclosure provides methods for neuroprotection, organ and tissue protection or restoration, prevention or slowing of aging-related diseases and conditions, and maintaining function during the aging process.)

极长链多不饱和脂肪酸、类延长素（ELOVANOID）羟基化衍生物 和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年3月20日提交的美国临时申请第62/473,697号和2017 年12月22日提交的美国临时申请第62/609,531号的权益，其通过引用整体并入本文。

关于联邦政府赞助的研究或开发的声明

本发明是在政府支持下根据国立卫生研究院授予的合同EY005121和 GM103340完成的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本公开涉及与ω-3极长链多不饱和脂肪酸(n-3VLC-PUFA)及其羟基化衍生物(被称为类延长素)有关的器官保护、疾病预防、健康恢复和抗衰老化合物、组合物和使用方法。

背景技术

尽管人类衰老过程是不可避免的，但最近的发现已标识出破坏稳态和/或加速细胞和组织损伤并促进年龄相关性疾病和病状的发作的因子。例如，长时间暴露于无法补偿的氧化应激、受损细胞和细胞碎片的积累以及组织修复和清除的延迟都与衰老相关疾病和病状(例如，慢性炎症、癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和脑血管疾病)的发作有关。通过减少破坏稳态，加速细胞损伤和细胞死亡(细胞衰老)的关键因子，可以预防或延缓年龄相关性疾病和病状，改善生活质量并延长人类寿命。

年龄相关性和非年龄相关性炎性、退行性、神经退行性、创伤性、皮肤病学和心血管疾病包含影响全球许多人的大量疾病。在大多数情况下，这些疾病及相关病状和病症难以治疗，导致生活质量受损和/或寿命缩短，并且仍然是未满足的主要医疗需求。

在本公开范围内的炎性、退行性或神经退行性疾病和病状包含稳态被异常或失调炎性反应破坏的急性和慢性病症。这些病状由多种炎性因子引发和介导，包含未补偿的氧化应激、趋化因子、细胞因子、血液/组织屏障的破损、自身免疫性疾病、钙失调(包含细胞中钙超载)、线粒体功能障碍、遗传因子(基因易感性、多态性)或遗传性病状、表观基因组修饰、或涉及诱发过量的原细胞损伤、细胞和/或器官稳态的促炎/破坏的白细胞、单核细胞/巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞或实质细胞其它病状。这些疾病发生在多种组织和器官中，包含皮肤、肌肉、胃、肠、肝、肾、肺、眼睛、耳朵和大脑。这些疾病目前通过抗炎剂治疗，例如皮质类固醇、非类固醇抗炎药物、TNF调节剂、COX-2抑制剂等。

全身性炎性或退行性疾病和病状可能影响重要器官(例如，心脏、肌肉、胃、肠、肝、肾和肺)，并且可能导致年龄相关性慢性炎性疾病，例如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和狼疮。

眼部炎性或退行性疾病和病状通常会影响角膜、视神经、小梁网和视网膜。没有有效的预防或治疗，它们会导致致盲眼病，例如青光眼、白内障、糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性(AMD)。

大脑相关炎性、退行性或神经退行性疾病和病状，例如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、缺血性中风、创伤性脑损伤、癫痫、肌萎缩性脊髓侧索硬化症，通常导致早衰、认知功能障碍和死亡。

皮肤炎性或退行性疾病和病状通常由阳光暴露或其它因素引起的皮肤损伤或由造成过量脱落的异常皮肤细胞增生而导致，所述其它因素包含皮肤炎症(皮炎或湿疹)、特应性皮炎(特应性湿疹)、皮肤脱水。阳光暴露或其它因素引起的皮肤损伤与多种疾病和病状(例如，湿疹、牛皮癣、特应性皮炎或神经性皮炎)相关，并且可能由暴露于紫外光和其它类型的接触性皮炎而导致。另外，由某些全身性疾病和病状引起的瘙痒会导致各种炎性和其它类型的刺激引起的皮肤瘙痒，并导致需要抓挠，这可能导致进一步的皮肤损伤或皮肤外观改变。

尽管取得了很大进展，但我们对通常导致器官损伤、慢性疾病和加速衰老的炎性、神经炎性、退行性或神经退行性疾病和病状的病理生理学仍然知之甚少。因此，保护器官、预防衰老相关疾病和病状以及全面恢复健康仍然是未满足的主要医疗需求。有效保护皮肤组织免于炎性、神经炎性、过度增生性或脱水性皮肤病状还存在较大的空白。特别地，我们对皮肤损伤、皮肤外观改变和皮肤衰老的病理生理学的了解仍不清楚。作为人体最大的器官，皮肤可以提供保护和支撑并在人类的整体外观和幸福感方面发挥关键作用。

考虑到皮肤健康、皮肤功能和皮肤外观的总体重要性，已致力于开发保护皮肤和总体皮肤健康的方法。当前大多数治疗涉及皮质类固醇的皮肤递送，或使用含有维生素、矿物质或草药成分的油和洗剂，这些通常不能有效预防或治疗多种类型的皮肤损伤并且还具有副作用，例如皮肤变薄和肌肉损失。尽管此些制剂可以提供一些保护，但仍存在开发有效保护受损皮肤、预防皮肤损伤、恢复皮肤健康、改善皮肤外观并延缓皮肤衰老的化合物、组合物和方法的未满足的需求。

本公开还涉及先前未知的器官保护、疾病预防、健康恢复、营养增强和抗衰老化合物、组合物和方法。特别地，本公开涉及在面临疾病发作时对细胞和器官功能的保护，涉及健康组织和器官的恢复，并且涉及衰老的延缓和衰老相关疾病和病状的预防。本公开还涉及治疗或预防多种疾病和病状(包含炎性、退行性、神经退行性、创伤性、心血管、衰老相关疾病和病状)，并且用于预防和治疗由阳光暴露、衰老或其它原因导致的受损或变形皮肤。

随着ω-3长链多不饱和脂肪酸20或22碳ω-3多不饱和脂肪酸(n-3或n3 PUFA)(即二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)或二十二碳五烯酸 (DPA))的抗炎和促消退作用的发现，这些有益的脂质分子及其某些类型的酶促羟基化衍生物被越来越多地用于治疗目的，并且被用作预防或管控过度炎症的营养或膳食补充剂。

本公开涉及含有至少23个碳的碳链的ω-3极长链多不饱和脂肪酸化合物 (n3VLC-PUFA)的先前未知的有益作用。

本公开还涉及先前未知的发现，即n3 VLC-PUFA被内源性转化成治疗上有益的羟基化衍生物(被称为类延长素)，其表现出先前未知的生物活性，起到炎性反应的有益调节剂的作用并且促进破坏功能的恢复。

总之，本公开涉及用于预防、保护、恢复、治疗或营养应用中的涉及ω-3 极长链多不饱和脂肪酸(n3 VLC-PUFA或n-3VLC-PUFA)及其羟基化衍生物 (类延长素)的化合物、组合物和方法。

发明内容

提供了化合物、药物组合物、化妆品和皮肤病学组合物或营养补充组合物，其包括ω-3极长链多不饱和脂肪酸(n-3VLC-PUFA)和/或其内源性羟基化衍生物(被称为类延长素)。本公开提供了用于神经保护、器官和组织保护或恢复、预防或减缓衰老相关疾病和病状以及在衰老过程期间维持功能的方法。

n3 VLC-PUFA在体内转化成几种先前未知类型的VLC-PUFA羟基化衍生物，被称为类延长素(ELV)，其能够保护和防止对其功能完整性受到破坏的组织和器官的进行性损伤。

大脑和视网膜中的神经元细胞和组织中的n3 VLC-PUFA响应于神经元应激状态而局部释放，并酶促转化成类延长素，从而提供局部神经保护以确保神经元存活。

通过提供与n3 VLC-PUFA及其相应的类延长素(ELV)有关的某些化合物，可以有效地阻抑衰老相关细胞衰老。

因此，本公开涉及预防和治疗健康困扰病状和衰老相关疾病和病状。特别地，本公开提供了化合物、组合物和方法，其保护和防止威胁重要组织和器官的功能和完整性的损害，防止加速衰老并延缓细胞衰老。

本公开提供了化合物、组合物和方法，其可以促进保护、预防和治疗由持续炎症、损伤或创伤触发的多种器官中的紊乱。

因此，本公开的一个方面涵盖了包括在其碳链中具有至少23个碳原子的至少一种ω-3极长链多不饱和脂肪酸的组合物的实施例。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物包括在其碳链中具有至少 23个碳原子的至少一种n3 VLC-PUFA，其中所述n3 VLC-PUFA可以是甲酸、甲酸酯、甲酸盐或磷脂衍生物的形式。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述n3 VLC-PUFA化合物可以选自由式A或B组成的组：

其中：m可以是0到19，并且-CO-OR可以是羧酸基团或其盐或酯，并且其中：如果-CO-OR可以是羧酸基团并且所述化合物A或B可以是其盐，则所述盐的阳离子可以是药学上可接受的阳离子，并且如果-CO-OR可以是酯，则R 可以是烷基基团。

在本公开的一些其它实施例中，所述n3 VLC-PUFA化合物可以是选自由式 C、D、E或F组成的组的磷脂的形式，其中m可以是0到19：

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以进一步包括药学上可接受的载剂并且被调配成用于递送一定量的所述至少一种ω-3极长链多不饱和脂肪酸，所述量有效地减少了接受受试者的组织的病理状态或接受受试者的组织的病理状态的发作。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述病理状态可以是所述接受受试者的组织的衰老或炎症。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以被调配成用于将所述至少一种极长链多不饱和脂肪酸组织局部递送到接受受试者的皮肤。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述病理状态可以是所述接受受试者的神经组织的病理状态。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以进一步包括至少一种营养组分，并且所述组合物可以被调配成用于将所述至少一种极长链多不饱和脂肪酸口服或肠胃外递送到接受受试者。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种ω-3极长链多不饱和脂肪酸可以在其碳链中具有约26到约42个碳原子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种ω-3极长链多不饱和脂肪酸可以在其碳链中具有32或34个碳原子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述ω-3极长链多不饱和脂肪酸可以在其碳链中具有五个或六个交替的顺式几何形状的双键。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述ω-3极长链多不饱和脂肪酸是 14Z,17Z,20Z,23Z,26Z,29Z)-三十二碳-14,17,20,23,26,29-六烯酸或 (16Z,19Z,22Z,25Z,28Z,31Z)-三十四碳-16,19,22,25,28,31-六烯酸。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种ω-3极长链多不饱和脂肪酸可以是14Z,17Z,20Z,23Z,26Z,29Z)-三十二碳-14,17,20,23,26,29-六烯酸或 (16Z,19Z,22Z,25Z,28Z,31Z)-三十四碳-16,19,22,25,28,31-六烯酸。

本公开的另一个方面涵盖了包括在其碳链中具有至少23个碳原子的至少一种类延长素的组合物的实施例。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以进一步包括药学上可接受的载剂并且可以被调配成用于递送一定量的所述至少一种类延长素，所述量有效地减少了接受受试者的组织的病理状态或延缓了接受受试者的组织中的至少一种衰老作用。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述病理状态可以是所述接受受试者的组织的衰老或炎症。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以被调配成用于将所述至少一种类延长素局部递送到接受受试者的皮肤。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述病理状态可以是所述接受受试者的神经组织的病理状态。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以进一步包括至少一种营养组分，并且所述组合物可以被调配成用于将所述至少一种类延长素口服或肠胃外递送到接受受试者。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种类延长素可以选自由以下组成的组：单羟基化类延长素、二羟基化类延长素、炔基单羟基化类延长素和炔基二羟基化类延长素或其任何组合。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种类延长素可以是多种类延长素的组合，其中所述组合选自由以下组成的组：单羟基化类延长素和二羟基化类延长素；单羟基化类延长素和炔基单羟基化类延长素；单羟基化类延长素和炔基二羟基化类延长素；二羟基化类延长素和炔基单羟基化类延长素；二羟基化类延长素和炔基二羟基化类延长素；单羟基化类延长素、二羟基化类延长素和炔基单羟基化类延长素；单羟基化类延长素、二羟基化类延长素和炔基二羟基化类延长素；和单羟基化类延长素、二羟基化类延长素、炔基单羟基化类延长素和炔基二羟基化类延长素，其中每种类延长素独立地是外消旋混合物、分离的对映体或对映体的组合(其中一种对映体的量大于另一种对映体的量)；并且其中每种类延长素独立地是非对映混合物、分离的非对映体或非对映体的组合(其中一种非对映体的量大于另一种非对映体的量)。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述单羟基化类延长素可以选自由式 G、H、I或J组成的组：

其中：m可以是0到19，并且-CO-OR可以是羧酸基团或其盐或酯，并且其中：如果-CO-OR可以是羧酸基团并且所述化合物G、H、I或J可以是其盐，则所述盐的阳离子可以是药学上可接受的阳离子，并且如果-CO-OR可以是酯，则R可以是烷基基团。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的对映体G和H，其中所述对映体在带有所述羟基基团的n-6碳处具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的对映体I和J，其中所述对映体在带有所述羟基基团的n-6碳处具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括G或H中的一种对映体，其量超过G或H中的另一种对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括I或J中的一种对映体，其量超过I或J中的另一种对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述二羟基化类延长素可以选自由式 K、L、M和N组成的组：

其中：m可以是0到19，并且-CO-OR可以是羧酸基团或其盐或酯，并且其中：如果-CO-OR可以是羧酸基团并且所述化合物K、L、M或N可以是其盐，则所述盐的阳离子可以是药学上可接受的阳离子，并且如果-CO-OR可以是酯，则R可以是烷基基团，并且其中：化合物K和L各自在碳链中具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3、n-7、n-15和n-18开始的4个顺式碳-碳双键和位置n-9和n-11开始的2个反式碳-碳双键；并且化合物M和N各自在碳链种具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3、n-7和n-15开始的3个顺式碳-碳双键；和位置n-9和n-11开始的2个反式碳-碳双键。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的非对映体K和L，其中所述非对映体在位置n-6具有(S)或(R)手性，并且在位置n-13 具有(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的一种或多种非对映体K和L，其中所述非对映体在位置n-6具有(S)或(R)手性，并且在位置n-13具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括K或L中的一种非对映体，其量超过K或L中的另一种非对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的非对映体M和N，其中所述非对映体在位置n-6具有(S)或(R)手性，并且在位置n-13 具有(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的一种或多种非对映体M和N，其中所述非对映体在位置n-6具有(S)或(R)手性，并且在位置n-13具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括M或N中的一种非对映体，其量超过M或N中的另一种非对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述炔基单羟基化类延长素可以选自由式O、P、Q或R组成的组：

其中：m可以是0到19，并且-CO-OR可以是羧酸基团或其盐或酯，并且其中：如果-CO-OR可以是羧酸基团并且所述化合物O、P、Q或R可以是其盐，则所述盐的阳离子可以是药学上可接受的阳离子，并且如果-CO-OR可以是酯，则R可以是烷基基团，并且其中：化合物O和P各自在碳链中具有总共23到 42个碳原子，具有位于n-3、n-12、n-15和n-18开始的位置处的4个顺式碳- 碳双键；具有n-7开始的位置处的反式碳-碳双键和位置n-9开始的碳-碳三键；并且化合物Q和R各自在碳链种具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3、 n-12和n-15开始的3个顺式碳-碳双键，具有n-7开始的位置处的反式碳-碳双键和位置n-9开始的碳-碳三键。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的对映体O和P，其中所述对映体在带有所述羟基基团的n-6碳处具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的对映体Q和R，其中所述对映体在带有所述羟基基团的n-6碳处具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括O或P中的一种对映体，其量超过O或P中的另一种对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括Q或R中的一种对映体，其量超过Q或R中的另一种对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述类延长素可以是选自由式S、T、 U或V组成的组的炔基二羟基化类延长素：

其中：m可以是0到19，并且-CO-OR可以是羧酸基团或其盐或酯，并且其中：如果-CO-OR可以是羧酸基团并且所述化合物S、T、U或V可以是其盐，则所述盐的阳离子可以是药学上可接受的阳离子，并且如果-CO-OR可以是酯，则R可以是烷基基团，并且其中：化合物S和T各自在碳链中具有总共23到 42个碳原子，具有位于n-3、n-15和n-18开始的位置处的3个顺式碳-碳双键，具有位于n-9和n-11开始的位置处的2个反式碳-碳双键和位置n-7开始的碳- 碳三键；并且化合物U和V各自在碳链种具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3和n-15开始的2个顺式碳-碳双键，具有位于n-9、n-11开始的位置处的 2个反式碳-碳双键和位置n-7开始的碳-碳三键。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的非对映体S和T，其中所述非对映体在位置n-6具有(S)或(R)手性，并且在位置n-13 具有(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的一种或多种非对映体S和T，其中所述非对映体在位置n-6具有(S)或(R)手性，并且在位置n-13具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括S或T中的一种非对映体，其量超过S或T中的另一种非对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的非对映体U和V，其中所述非对映体在位置n-6具有(S)或(R)手性，并且在位置n-13 具有(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的一种或多种非对映体U和V，其中所述非对映体在位置n-6具有(S)或(R)手性，并且在位置n-13具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括U或V中的一种非对映体，其量超过U或V中的另一种非对映体的量。

在某些有利实施例中，本公开提供了有效量的至少一种所提供的化合物和/ 或所提供的组合物，以发挥适合于神经保护、器官保护和组织保护的有效神经保护、组织保护和神经恢复作用。

在其它实施例中，本公开提供了用于有效保护、预防或治疗已被阳光或其它原因损伤或已受皮肤衰老影响的皮肤的化合物和皮肤病学或化妆品组合物。所提供的化合物、组合物和方法诱导皮肤细胞的存活和正常功能，保护皮肤，改善皮肤健康和皮肤外观并延缓皮肤衰老。

附图说明

本公开集中关注了应用于皮肤疾病、视网膜疾病、心血管疾病、胃肠/肝疾病和脑疾病的化合物、组合物和方法。最初在大脑和视网膜中研究了所提供的化合物和组合物的独特结构、生物合成和功能，如以下附图所总结。当结合附图查阅以下描述的本公开的各个实施例的详细描述时，将容易地理解本公开的另外的方面。

图1是示出了假定的由ω-3(n-3或n3)极长链多不饱和脂肪酸(n3 VLC-PUFA)生物合成类延长素(ELV)的方案。

图2是示出了假定的n3 VLC-PUFA生物合成的方案。

图3A-3K示出了由培养的初代人视网膜色素上皮细胞(RPE)生成类延长素ELV-N32和ELV-N34及其结构表征。

图3A是示出了由中间体(1、2和3)(它们各自以立体化学纯的形式制备) 合成ELV-N32和ELV-N34的方案。中间体2和3的立体化学通过使用对映体纯的环氧化物起始材料预先定义。最终的ELV(4)经由中间体1、2和3的迭代偶联组装，并且被分离为甲基酯(Me)或钠盐(Na)。

图3B示出了与ELV-N32标准品一起示出的C32:6n3、内源性单羟基 -C32:6n3和ELV-N32的洗脱曲线。ELV-N32的MRM示出了比标准ELV-N32 洗脱时的峰更早洗脱的两个大峰，其表现出相同的裂解图式(在***图谱中示出)，表明它们是异构体。

图3C示出了ELV-N32和ELV-N34的全子扫描的色谱图。

图3D示出了ELV-N32的裂解图式。

图3E示出了C34:6n3和ELV-N34的洗脱曲线。

图3F示出了内源性ELV-N34的UV图谱，其表现出类似于NPD1的三烯特征，其中λmax在275nm处并且肩峰在268和285nm处。

图3G示出了ELV-N32的裂解图式。

图3H示出了内源性ELV-N32的全裂解图谱。

图3I示出了ELV-N32标准品，其示出了来自标准品的所有主峰均与内源峰相匹配。然而，内源性ELV-N32具有更多的未在标准品中示出的碎片，表明它包含不同的异构体。

图3J示出了与标准ELV-N34峰匹配的内源性ELV-N34的全裂解图谱。

图3K示出了ELV-N34异构体的存在。

图4A-4K示出了来自神经元细胞培养物的类延长素ELV-N32和ELV-N34 的结构表征。将大脑皮层混合神经元细胞在OGD条件下用32:6n3和34:6n3(各 10μM)培育。

图4A是示出了由中间体(a、b和c)(它们各自以立体化学纯的形式制备) 合成ELV-N32和ELV-N34的方案。中间体b和c的立体化学通过使用对映体纯的环氧化物起始材料预先定义。最终的ELV(d)经由中间体a、b和c的迭代偶联组装，并且被分离为甲基酯(Me)或钠盐(Na)。

图4B在***图中示出了32:6n3、内源性单羟基-32:6、ELV-N32和ELV-N32 标准品。ELV-N32的MRM示出了比标准ELV-N32洗脱时的峰更早洗脱两个大峰，但它们表现出相同的裂解图式，表明它们是异构体。

图4C示出了在34:6n3和ELV-N34中表现出与图4A中相同的特征。

图4D示出了内源性ELV-N32的UV图谱，其表现出三烯特征，但是这些在本浓度下不确定。

图4E示出了内源性ELV-N32的全裂解图谱。

图4F示出了内源性ELV-N34的UV图谱，其表现出类似于NPD1的三烯特征，其中λmax在275nm处并且肩峰在268和285nm处。

图4G示出了内源性ELV-N34的裂解图式。

图4H示出了内源性ELV-N32的全裂解图式。

图4I示出了ELV-N34标准品，其示出了来自标准品的所有主峰均与内源峰相匹配，但不完全匹配；内源性ELV-N34具有更多的未在标准品中示出的碎片，表明它可能含有异构体。

图4J示出了ELV-N34全裂解图谱；内源性ELV-N34与标准ELV-N34峰匹配

图4K示出了暗示的ELV-N34异构体的存在。

图5A和5B示出了在神经元细胞培养物中ELV-N32和ELV-N34的检测。将细胞在OGD条件下用C32:6n3和C34:6n3(各5μM)培育。

图5A示出了VLC-PUFA C32:6n3、内源性27-羟基-32:6n3、内源性27,33- 二羟基-32:6n3(ELV-N32)和经由立体控制全有机合成以立体化学纯的形式制备的合成ELV-N32。内源性ELV-N32的MRM与合成ELV-N32标准品的MRM 非常匹配。

图5B示出了在C34:6n3和ELV-N34中表现出与图5A中相同的特征，其中在ELV-N34MRM中具有更多的峰，这暗示可能的异构体。

图6A示出了使用特异性标志物ZO-1(闭合小环蛋白-1)、RPE65、MITF (小眼畸形相关转录因子)和β-连环蛋白对初代人RPE细胞进行的免疫染色的共焦图像。

图6B示出了光学显微镜图像，其描绘了在培养物中的不同传代的初代人 RPE细胞形态。放大条，50μm。

图7A-7L示出了在UOS下的人RPE细胞中的由32:6n3和34:6n3进行的细胞保护。

图7A示出了人RPE细胞(ARPE-19细胞)中C32:6n3和C34:6n3的浓度依赖性抗凋亡活性。将12孔板中的铺满的(80％)ARPE-19细胞血清饥饿8小时，诱导UOS，然后用50-500nMC32:6n3或34:6n3游离酸攻击16小时。收获治疗的细胞，并且检测Hoechst阳性固缩细胞。数据是三个独立实验的Hoechst 阳性固缩细胞的15孔计数的平均值。

图7B示出了DHA(100nM)与32:6n3和34:6n3(各250nM)持续16小时的细胞保护的比较。将UOS引入血清饥饿的ARPE-19细胞中，并如图7A 中所述检测凋亡性细胞死亡。结果是三个独立实验的平均值。

图7C示出了在UOS下的RPE中的由C32:6n3和C34:6n3进行的SIRT1 上调。PD146176(一种15-LOX-1抑制剂)对C32:6n3和C34:6n3的作用在UOS 的影响下RPE中诱导了SIRT1的上调。除非另有说明，否则结果是三个独立实验(每个实验9个孔)的平均值。

图7D示出了15-LOX-1抑制剂PD146176在UOS下的RPE细胞中减弱了 C32:6n3或C34:6n3诱导的Iduna上调。

图7E-7I示出了在UOS下的ARPE-19细胞中的C32:6n3或C34:6n3对抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的作用。在UOS下的ARPE-19细胞中的C32:6n3和 C34:6n3对上述蛋白质的上调和下调的作用的蛋白质印迹检测。

图7E示出了C32:6n3或C34:6n3对抗凋亡蛋白Bcl-2的作用。

图7F示出了C32:6n3或C34:6n3对抗凋亡蛋白Bc-xL的作用。

图7G示出了C32:6n3或C34:6n3对促凋亡蛋白Bax的作用。

图7H示出了C32:6n3或C34:6n3对促凋亡蛋白Bim的作用。

图7I示出了C32:6n3或C34:6n3对促凋亡蛋白Bid的作用。

图7J示出了在UOS下的RPE细胞中的C32:6n3和C34:6n3对抑制素(1 型)的浓度依赖性(100和250nM)上调。

图7K示出了NPD1(200nM)、C32:6n3或C34:6n3(3μM)对初代人RPE 细胞存活的作用。

图7L示出了在存在10μM PD146176的情况下C32:6n3或C34:6n3对初代人RPE细胞的细胞保护。误差条，SEM；*p<0.05。

图8A(图a-d)示出了VLC-PUFA 32:6n3和34:6n3改善了未补偿的氧化应激(UOS)诱导的初代人RPE细胞死亡。图a：未治疗的(对照)RPE细胞；图b：UOS 16小时的RPE细胞；图c：UOS 16小时+32:6n3的RPE细胞；图 d：UOS 16小时+34:6n3的RPE细胞。当加入32:6n3或34:6n3时，防止了细胞死亡(图c和d)。细胞培养物的典型区域呈现在每个图的右图中。核用Hoechst 染色标记，死细胞突出显示。使用强度阈值算法将这些分开，并使用Image J 宏(左列)进行计数。

图8B示出了活细胞(对照细胞)和死细胞(UOS细胞)的定量基于核大小。误差条，SEM；*p<0.05。

图8C示出了当加入32:6n3或34:6n3时，防止了细胞死亡。

图9A-9C示出了15-LOX-1抑制剂在初代人RPE细胞上未改变由32:6n3 和34:6n3介导的针对UOS的细胞保护。将去血清(图9A，图a和b)和低血清(图9A，图c和d)人RPE细胞用15-脂氧合酶-1(15-LOX-1)抑制剂(10 微摩尔，PD146176)培育1小时，然后经受氧化应激(H₂O₂/TNFα)16小时以诱导凋亡(图9A，图a-d，图9C)。

32:6n3和34:6n3的加入保护人RPE细胞(图9A，图b和d，图9C)免于细胞死亡。细胞培养物的典型区域呈现在图9A，图a-d右列中。核用Hoechst 染色标记，死细胞突出显示。使用强度阈值算法将这些分开，并使用Image J 宏(图9A，图a-d，左列)进行计数。

图9B示出了活细胞(对照细胞)和死细胞(UOS细胞)的定量基于核大小。误差条，SEM；*p<0.05。

图10A-10H示出了ELV-N32和ELV-N34在UOS下的RPE细胞中增强了促稳态蛋白的丰度并降低了细胞损伤蛋白的丰度。

图10A示出了在UOS下的ARPE-19细胞中的SIRT1的浓度依赖性(100 和250nM)上调。结果是三个独立实验的平均值。

图10B示出了在UOS下的RPE细胞中的PD146176对ELV-N32和ELV-N34 诱导的Iduna上调的作用。

图10C示出了在UOS下的RPE细胞中的ELV-N32和ELV-N34的细胞保护能力。脂氧合酶抑制剂对凋亡抑制的作用。

图10D示出了在UOS下的ARPE-19细胞中的ELV-N32 Na或ELV-N32 Me 对抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL和促凋亡蛋白Bax的作用。

图10E示出了在UOS下的RPE中的ELV-N32 Na或ELV-N32 Me和ELV-N34 Na或ELV-N34 Me对促凋亡蛋白Bim(e)的诱导的作用的比较。

图10F示出了在UOS下的RPE中的ELV-N32 Na或ELV-N32 Me和 ELV-N34 Na或ELV-N34 Me对促凋亡蛋白Bid(f)的诱导的作用的比较。

图10G示出了ARPE-19细胞中ELV-N32 Na或ELV-N34 Me对UOS诱导的凋亡的浓度依赖性(50、100、250和500nM)降低。

图10H示出了在UOS下的ARPE-19细胞中的由ELV-N32或ELV-N34进行的抑制素(1型)上调取决于浓度(100和250nM)。误差条，SEM；*p<0.05。

图11A-11D示出了脂联素受体1的遗传消融导致视网膜中VLC-PUFA及其衍生物的消耗。

图11A示出了膳食DHA或衍生自膳食18:3n3的膳食DHA由肝脏提供并由AdipoR1捕获，随后通过ELOVL4在PRC的内节段中延长为VLC-PUFA并掺入磷脂酰胆碱分子物种中(其也含有DHA)。在每天的PRC外节段更新期间，这些磷脂酰胆碱分子物种与视紫红质相互作用，并且在脱落和吞噬之后成为 RPE细胞的一部分。UOS或其它稳态破坏因子触发VLC-PUFA的释放。描绘了C32:6n3和C34:6n3生成氢过氧形式，然后分别生成ELV-N32或ELV-N34。

图11B示出了与WT中相比，AdipoR1基因敲除(KO)小鼠的视网膜中游离C32:6n3的池大小减小了。插图1示出了KO和野生型(WT)中的ELV-N32；插图2示出了WT中的单羟基32:6n3(ELV-N32的氢过氧前体的稳定衍生物) 以及KO中缺少可检测的信号。

图11C示出了与WT中相比，AdipoR1 KO小鼠的视网膜中游离34:6n3的相似池大小减小了。插图1示出了KO和WT中的ELV-N32；插图2示出了 WT中的单羟基C34:6n3(ELV-N34的氢过氧前体的稳定衍生物)以及KO中的缺少可检测的信号。

图11D示出了RPE细胞维持PRC功能完整性(左)；右，脂联素受体1 (AdipoR1)的消融会关断DHA可用性，并随之发生PRC变性。

图12A和12B示出了本公开的类延长素在视网膜变性中起神经保护和维持光感受器细胞完整性的作用。

图12A示出了类延长素通路在多能干细胞iPSC-RPE中减少，所述多能干细胞iPSC-RPE衍生自受晚发性视网膜变性(L-ORD)影响的家族。本疾病是由于CTRP5中的突变(S163R)引起的。使用了来自L-ORD患者和未受影响的兄弟姐妹的分化成视网膜色素上皮细胞(RPE)的多能干细胞(iPSC)。将细胞在无血清培养基中培育，并以大约5个光感受器细胞外节段(POS)/细胞喂养4小时以总结脱落和盘吞噬，或在含0.5％血清的培养基中用1μM 32:6和34:6 游离脂肪酸(VLC-PUFA)培育24小时。收集培养基和细胞裂解物以用于基于 LC-MS/MS的代谢脂质组学分析。代谢脂质组学分析表明，iPSC-RPE喂养的 POS或VLC-PUFA主要在细胞的顶侧以极化方式分泌稳定的类延长素生物合成中间体(27s-羟基32:6n-3和29s-羟基34:6n-3)。与患者相比，对照iPSC-RPE 分泌了显著更多的类延长素ELV-N32和ELV-N34。

图12B示出了在不存在POS或VLC-PUFA的情况下，在对照中仍检测到 27s-羟基32:6n-3，但在患者iPSC-RPE中未检测到。同样，发现DHA衍生的脂质介质神经保护素D1(NPD1)在对照中的分泌量显著更高(p<0.05)。由于 NPD1和类延长素衍生自相同的磷脂前体，因此在L-ORD中可能会发生两种脂质介质都缺少的情况。

图13A-13D示出了初代皮层神经元中的氧-糖剥夺(OGD)的体外模型。ω-3 VLC-PUFA和类延长素响应于神经元应激而局部释放，并提供对暴露于氧-糖剥夺的皮层神经元的保护。

图13A示出了OGD培养基具有比对照(无OGD)培养基更多的游离脂肪酸(FA32:6和FA34:6)释放。

图13B示出了在OGD培养基(红色)中检测到27-S-羟基32:6，但是对照培养基具有可忽略的量的27-S-羟基32:6(蓝色)。(插图中)示出了ELV-N32 的子扫描，其呈现了可能的ELV-N32峰。

图13C示出了在OGD培养基中检测到29-S-羟基34:6，但是对照培养基具有可忽略的量的29-S-羟基34:6。

图13D示出了与可能的子分子的理论值非常匹配的27-S-羟基32:6的全裂解图式。

图14A-14C示出了类延长素阻抑了加速细胞损伤和细胞死亡(细胞衰老) 的关键因子，导致年龄相关性细胞死亡以及相关疾病和病状的延缓，从而延长人类寿命。

图14A示出了类延长素阻抑了衰老信号转导通路的活化。

图14B示出了类延长素通过诱导自噬因子(ATG3、ATG5、ATG7、Beclin-1) 的表达来活化自噬，导致自噬清除和寡聚Aβ肽的去除，从而阻抑细胞衰老进展。自噬过程涉及多于100个基因。以下基因在AMD疾病中升高：

图14C示出了类延长素降低了由寡聚Aβ肽诱导的促炎因子(CHF、IL-1β) 的基因表达。

图15A-15L示出了ELV-N32和ELV-N34引发对暴露于氧糖剥夺(OGD) 或NMDA兴奋性毒性的大脑皮层混合神经元培养物的保护。

图15A示出了在表现出形态的培养物中的大脑皮层和海马神经元的明场图像(10X)。

图15B示出了在βIII微管蛋白、GFAP和Hoechst染色的体外12天培养物中的大脑皮层神经元(DIV12)的代表性免疫荧光图像。

图15C和15F示出了暴露于NMDA(50μM)兴奋性毒性(图15C)或OGD (图15F)以及由ELV-N32-Na或ELV-N34-Me(500nM浓度)引发的神经保护的大脑皮层神经元，如通过用Hoechst 33258对细胞进行固定和染色来评估。 (****p<0.0001，***p<0.001，并且**p<0.05，n＝9，单因素ANOVA，然后进行 Holm-Sidak多重比较测试)。

图15D和15G示出了用于分别在存在NMDA(图15D)或OGD(图15G) 的情况下计算Hoechst阳性核和固缩核与非固缩核的频率分布的无偏图像分析方法。

图15E和15H示出了代表性图像，其示出了分别受到NMDA(图15E)或 OGD应激(图15H)攻击的Hoechst阳性核的阈值化和尺寸排阻。

图15I-15L示出了在暴露于NMDA(图15I和15J)或OGD(图15K-15L) 之后由ELV-N32-Na或ELV-N34-Me引发的神经保护，如通过钙黄绿素阳性细胞计数所评估。

图16A-16I示出了ELV-N32和ELV-N34诱导对暴露于未补偿的氧化应激、氧糖剥夺(OGD)或NMDA兴奋性毒性的大脑皮层混合和海马神经元培养物的保护。

图16A示出了在存在非竞争性NMDA受体拮抗剂MK801马来酸酯(地佐环平)(10μM)或神经保护素D1(NPD1)(100nM)或ELV-N32-Na(200nM) 或ELV-N32-Me(200nM)的情况下将培养物中的大脑皮层混合神经元暴露于 NMDA(100μM)兴奋性毒性之后的细胞存活，如通过MTT测定所评估。 (#p<0.001，n＝6，单因素ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)。

图16B和16C示出了在将皮层神经元分别暴露于由TNFα(10ng/ml)加 H₂O₂(50μM、100μM或200μM)(图16B)引起的未补偿的氧化应激或NMDA 兴奋性毒性(25μM、50μM或100μM)(图16C)之后，ELV-N32-Na或 ELV-N32-Me(200nM浓度)的神经保护作用。通过无偏图像分析和Hoechst 阳性核计数来评估细胞存活。(#p<0.0001，并且*p<0.05，n＝9，单因素ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)。

图16D和16E示出了在存在ELV-N32-Na、ELV-N32-Me、ELV-N34-Na或 ELV-N34-Me(1μM浓度)的情况下的OGD暴露之后通过Hoechst染色(图 16D)和MTT测定(图16E)评估的细胞存活。(#p<0.0001，**p<0.001，并且*p<0.05，n＝9，单因素ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)。

图16F和16G示出了在存在或不存在ELV-N32-Na或ELV-N34-Me(500nM 浓度)的情况下的OGD应激之后通过Hoechst阳性细胞计数评估的在海马神经元(DIV 12)(图16F)或培养物中的皮层神经元(DIV12)(图16G)中的神经保护。当以500nM浓度加入时，32:6或34:6也表现出神经保护。

图16H和16I示出了在存在或不存在ELV-N32-Na或ELV-N34-Na或32:6 或34:6(500nM)的情况下暴露于NMDA(50μM)(图16H)或OGD(图16I) 的培养物中的大脑皮层混合神经元(DIV 28)(通过Hoechst染色和细胞计数评估)。

图17示出了在存在ELV-N32-Na或ELV-N32-Me(500nM)的情况下将培养物中的皮层神经元(DIV 12)分别暴露于NMDA(50μM)(图A-C)或OGD (图E-G)之后通过Hoechst阳性核计数和无偏图像分析评估的细胞存活。来自三个单独实验的结果。(#p<0.0001，**p<0.001，并且*p<0.05，n＝9，单因素 ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)。

32:6(250nM)可以减弱NMDA兴奋性毒性(图D)，而34:6(250nM) 引发了对暴露于OGD的培养物中的皮层神经元(DIV 28)的神经保护 (#p<0.0001，并且**p<0.001)(图H)。

图18A-18I示出了ELV-N32和ELV-N34引发了对暴露于氧糖剥夺(OGD) 或未补偿的氧化应激(UOS)的大脑皮层混合神经元或海马混合神经元培养物的保护。

图18A示出了用90分钟OGD攻击的大脑皮层混合神经元培养物(DIV 12) 的代表性图像。在用ELV-N32 Na或ELV-N34 Me(500nM浓度)治疗12小时之后用Hoechst 33258对细胞进行固定和染色，表明由OGD导致的固缩和由 ELV-N32 Na或ELV-N34 Me引发的神经保护。

图18B示出了来自图18A的数据的汇总(***p<0.0001，并且**p<0.001，n＝9，单因素ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)。

图18C和18D示出了用于分别在存在OGD+ELV-N32 Na(图18C)或OGD +ELV-N34 Me(图18D)的情况下计算Hoechst阳性核和固缩核与非固缩核的相对频率分布％的无偏图像分析方法。当经受OGD应激时，细胞经历固缩，如核峰的左移所示。在用ELV-N32 Na或ELV-N34 Me治疗之后，存在向着对照核群峰的正向右移，表明这些新的脂质介质引发了细胞存活。用于定义固缩核与非固缩核的核大小界限由黑色虚线表示并由矩形突出显示。

图18E示出了在用90分钟OGD攻击的大脑皮层混合神经元培养物(DIV 12)的暴露之后由ELV-N32 Na或ELV-N34 Me引发的神经保护，如通过钙黄绿素阳性细胞计数所评估(****p<0.0001，n＝3，单因素ANOVA，然后进行 Holm-Sidak多重比较测试)。

图18F示出了在用90分钟OGD攻击大脑皮层混合神经元培养物(DIV 12) 的暴露以及随后用ELV-N32 Me、ELV-N32 Na、ELV-N34 Me或ELV-N34 Na(1 μM浓度)治疗之后的细胞存活，如通过MTT测定所评估。(#p<0.0001， **p<0.001，并且*p<0.05，n＝9，单因素ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)。

图18G和18H示出了在海马混合神经元培养物(DIV 12)在存在或不存在 ELV-N32Na或ELV-N34 Me(500nM浓度)的情况下经受OGD应激之后由 ELV-N32 Na、ELV-N34 Na、32:6或34:6引发的神经保护，如通过无偏图像分析以及随后的Hoechst阳性核计数所评估。

当以500nM浓度加入时，32:6或34:6也表现出神经保护(#p<0.0001，n＝3，单因素ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)(图18G)或皮层混合神经元培养(DIV 28)(#p<0.0001，**p<0.001，并且*p<0.05，n＝3，单因素ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)(图18H)分别经受90分钟OGD。

图18I示出了在皮层混合神经元培养物(DIV 12)经受由TNFα(10ng/mL) 和H₂O₂(50μM、100μM或200μM)的加入诱导的12小时未补偿的氧化应激 (UOS)之后由ELV-N32 Na或ELV-N34 Na(200nM浓度)引发的神经保护，如通过先进行Hoechst阳性核计数再进行无偏图像分析所评估(#p<0.0001，并且*p<0.001，n＝9，单因素ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)。

图19A-19H示出了ELV-N32和ELV-N34诱导的对暴露于NMDA兴奋性毒性的大脑皮层混合神经元培养物的保护。

图19A示出了经受12小时NMDA兴奋性毒性的大脑皮层混合神经元培养物(DIV 12)的代表性图像。在用ELV-N32 Na或ELV-N34 Me(500nM浓度) 以及NMDA(100μM)治疗12小时之后用Hoechst 33258对细胞进行固定和染色，表明由NMDA兴奋性毒性导致的固缩和由ELV-N32 Na或ELV-N34 Me引发的神经保护。

图19B示出了来自(图19A)的数据的汇总(****p<0.0001，并且**p<0.05， n＝9，单因素ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)。

图19C和19D示出了用于分别在存在NMDA+ELV-N32 Na(图19C)或 NMDA+ELV-N34Me(图19D)的情况下计算Hoechst阳性核和固缩核与非固缩核的相对频率分布％的无偏图像分析方法。当细胞经受NMDA兴奋性毒性时，它们经历固缩，如核峰的左移所示。在用ELV-N32 Na或ELV-N34 Me治疗之后，存在向着对照核群峰的正向右移，表明由这些类延长素引发的细胞存活。用于定义固缩核与非固缩核的核大小界限由虚线表示并由矩形突出显示。

图19E示出了在用12小时NMDA(100μM浓度)攻击的大脑皮层混合神经元培养物(DIV 12)的暴露之后由ELV-N32 Na或ELV-N34 Me引发的神经保护，如通过钙黄绿素阳性细胞计数所评估(****p<0.0001，n＝3，单因素 ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)。

图19F示出了在存在非竞争性NMDA受体拮抗剂MK801马来酸酯(地佐环平)(10μM)或ELV-N32-Na(200nM)或ELV-N32-Me(200nM)的情况下将培养物中的大脑皮层混合神经元(DIV 12)暴露于NMDA(100μM)兴奋性毒性之后的细胞存活，如通过MTT测定所评估。(#p<0.001，n＝6，单因素 ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)。

图19G示出了在将大脑皮层混合神经元(DIV 12)暴露于NMDA兴奋性毒性(25μM、50μM或100μM)之后，ELV-N32 Na或ELV-N32 Me(200nM 浓度)的神经保护作用。通过无偏图像分析和Hoechst阳性核计数来评估细胞存活。(#p<0.0001，并且*p<0.05，n＝9，单因素ANOVA，然后进行Holm-Sidak 多重比较测试)。

图19H示出了在存在或不存在ELV-N32 Na或ELV-N34 Na或32:6或34:6 (500nM)的情况下暴露于NMDA(50μM)的培养物中的大脑皮层混合神经元(DIV 28)，通过Hoechst染色和细胞计数评估。(#p<0.0001，n＝3，单因素 ANOVA，然后进行Holm-Sidak多重比较测试)。

图20A-20D示出了ELV-N32和ELV-N34改善神经/行为评分，保护半影并减小缺血性中风后的MRI病灶体积。

图20A示出了在MCAo期间(60分钟)以及在治疗之后的各个时间的总神经评分(正常评分＝0，最大评分＝12)。在MCAo的60分钟时，所有动物的评分均为11(可能为12)。与媒剂(脑脊髓液；CSF)治疗组相比，类延长素治疗的大鼠在第1、3和7天的神经评分显著改善。

图20B示出了与媒剂组相比，类延长素治疗显著减小了从第7天的T2WI 计算出的缺血核心、半影和总病灶体积。

图20C和20D示出了代表性的T2WI、伪图像、核心/半影(图20C)和(图 20D)从第7天的T2WI计算出的3D梗死体积。核心和半影是从整个大脑提取的。使用计算MRI方法(用于半影标识的分层区域分割法)在媒剂治疗和类延长素治疗动物中自动地标识核心和半影组织。在媒剂治疗大鼠的缺血核心和半影中观察到T2高强度，与水肿形成相一致。相反，类延长素治疗动物的病灶大小较小。3D重建来自第7天的每组中的相同动物。示出的值是平均值±SD(每组n＝5-6)。与CSF组相比，*p<0.05(重复测量ANOVA，然后进行Bonferroni 测试)。

图21A-20C示出了ELV-N32和ELV-N34减轻实验性缺血性中风诱导的神经元和星形胶质细胞损伤。

图21A和21B示出了来自所有组的代表性的NeuN、SMI-71和GFAP染色脑切片。媒剂(脑脊髓液；CSF)治疗大鼠表现出广泛的神经元损失、GFAP 反应性星形胶质细胞和SMI-71阳性血管减少。相反，用类延长素治疗增加了 NeuN、SMI-71和GFAP阳性细胞。

图21C示出了冠状脑图(前囟点+1.2mm)，其示出了在皮层(列a、b和c) 和纹状体(列s)中NeuN、SMI-71和GFAP阳性细胞计数的区域的位置。在缺血核心区(S)和不同半影区(a、b和c)中，类延长素治疗增加了NeuN阳性神经元、SMI阳性血管和GFAP阳性星形胶质细胞的数量。示出的值是平均值±SD(每组n＝5-6)。*，与媒剂有显著差异(p<0.05；重复测量ANOVA，然后进行Bonferroni测试)。

图22A-22D示出了ELV-N32和ELV-N34减少NVU破坏并减少缺血性中风后的脑梗死。

图22A示出了通过薄壁组织内的免疫球蛋白G(IgG)的免疫检测评估的 NVU分解。IgG染色表明NVU分解。媒剂(脑脊髓液；CSF)治疗大鼠表现出皮层中和皮层下的IgG免疫反应性增加。用ELV-N34-Na或ELV-N34-Me治疗在皮层中表现出较少的IgG染色，并且大部分位于梗死核心(皮层下)。

图22B示出了条形图，其示出了ELV-N34-Na和ELV-N34-Me显著降低皮层中、皮层下和整个半球中(总)的IgG免疫反应性。示出的值是平均值±SD (每组n＝5-6)。与媒剂组相比，*p<0.05(重复测量ANOVA，然后进行Bonferroni 测试)。

图22C示出了来自用媒剂和类延长素治疗的大鼠的尼氏染色脑切片。媒剂治疗大鼠表现出较大的皮层和皮层下梗死。相反，用类延长素治疗的大鼠表现出较不广泛的损伤，主要在皮层下区域。

图22D示出了皮层、皮层下和总校正后的梗死体积。与媒剂治疗组相比，所有ELV治疗均大幅减小皮层、皮层下和总梗死体积。示出的值是平均值±SD (每组n＝5-6)。*，与媒剂有显著差异(p<0.05；重复测量ANOVA，然后进行 Bonferroni测试)。

图23A-23C示出了类延长素提供神经保护并改善创伤性脑损伤(TBI)后的神经缺损。用32碳或34碳类延长素甲基酯或钠盐治疗后，总神经评分显著降低。图23A和23C：经由静脉内注射递送；图23B：经由硬膜下注射递送。使SD大鼠经受中度液压冲击损伤(FPI)模型，并用32和34碳类延长素的甲基酯(ME)或钠盐(Na)形式(ELV-N32-ME、ELV-N34-ME、ELV-32-Na-d2、 ELV-N34-炔烃)或媒剂(脑脊髓液；CSF)治疗(1μg/每只大鼠)。TBI后1小时将治疗递送到硬膜下腔中。在第1、2、3、7或14天对动物进行神经行为检查(正常＝0，最大缺损＝12)。所有ELV治疗均从第1天开始改善神经评分，与CSF治疗组相比，这在整个2周的存活期内持续存在。示出的值是平均值±SEM(每组n＝6-8)，*与相应的盐水组由显著差异(P<0.05；重复测量ANOVA，然后进行Bonferroni测试)。ELV-N34-炔烃(IV，300μg/每只动物)。在第1、2、 3、7或14天对所有动物进行神经行为检查(正常＝0，最大缺损＝12)。

图24示出了用于单羟基化类延长素G、H、I、J、O、P、Q、R的全合成的方案1。

试剂和条件：(a)儿茶酚硼烷，加热；(b)N-碘-琥珀酰亚胺，MeCN；(c) 4-氯丁-2-炔-1-醇，Cs₂CO₃，NaI，CuI，DMF；(d)CBr₄，PPh₃，CH₂Cl₂，0℃； (e)乙炔基-三甲基硅烷，CuI，NaI，K₂CO₃，DMF；(f)林德拉催化剂，H₂， EtOAc；(g)Na₂CO₃，MeOH；(h)Pd(PPh₃)₄，CuI，Et₃N；(i)^tBu₄NF，THF；(j)林德拉催化剂，H₂，EtOAc或Zn(Cu/Ag)，MeOH；(k)NaOH，THF， H₂O，然后用HCl/H₂O酸化；(I)NaOH、KOH等，或胺、亚胺等。

图25示出了用于二羟基化类延长素K、L、S和T的全合成的方案2。

试剂和条件：(a)CuI，NaI，K₂CO₃，DMF；(b)樟脑磺酸(CSA)，CH₂CI₂， MeOH，室温；(c)林德拉催化剂，H₂，EtOAc；(d)DMSO，(COCl)₂，Et₃N， -78℃；(e)Ph₃P＝CHCHO，PhMe，回流；(f)CHI₃，CrCl₂，THF，0℃；(g) 催化剂Pd(Ph₃)₄，CuI，PhH，室温；(h)^tBu₄NF，THF，室温；(i)Zn(Cu/Ag)，MeOH，40℃；(j)NaOH，THF，H₂O，然后用HCl/H₂O酸化；(k)NaOH、 KOH等，或胺、亚胺等。

图26示出了用于二羟基化类延长素M、N、U和V的全合成的方案3。

试剂和条件：(a)氰尿酰氯，Et₃N，丙酮，室温；(b)(3-甲基氧杂环丁-3- 基)甲醇，吡啶，CH₂Cl₂，0℃；(c)BF₃.OEt₂，CH₂Cl₂；(d)ⁿBuLi，BF₃.OEt₂， THF，-78℃，然后1；(e)^tBuPh₂SiCI，咪唑，DMAP，CH₂Cl₂，室温；(f)樟脑磺酸，CH₂Cl₂，ROH，室温；(g)林德拉催化剂，H₂，EtOAc；(h)DMSO， (COCl)₂，Et₃N，-78℃；(i)Ph₃P＝CHCHO，PhMe，回流；(j)CHl₃，CrCl₂，THF，0℃；(k)催化剂Pd(Ph₃)₄，CuI，PhH，室温；(I)^tBu₄NF，THF，室温； (m)Zn(Cu/Ag)，MeOH，40℃；(n)NaOH，THF，H₂O，然后用HCl/H₂O 酸化；(o)NaOH、KOH等，或胺、亚胺等。

图27示出了用于32碳二羟基化类延长素的全合成的方案4。

图28示出了用于34碳二羟基化类延长素的全合成的方案5。

具体实施方式

在更详细地描述本公开之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施例，并且因此当然可以有所不同。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限制。

在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则介于所述范围的上限和下限之间的每个中间值(直至下限单位的十分之一)以及在所述范围中的任何其它所述或中间值均涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在较小范围中，并且也应涵盖在本公开内，但受限于所述范围中任何具体排除的限制。在所述范围包含一个或两个限制的情况下，排除了所述包含的限制中的一个或两个的范围也包含在本公开中。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述有利的方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利均被具体地和单独地指出通过引用并入一样，并且其通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用均是其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本公开由于是在先公开而无权早于此出版物。此外，提供的出版日期可以与可能需要独立确认的实际出版日期不同。

对于本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独的实施例具有分立组件和特征，这些组件和特征可以在不脱离本公开的范围或精神的情况下容易地与其它几个实施例中的任何一个的特征分开或组合。任何所述的方法可以按所述事件的顺序或逻辑上可能的任何其它顺序进行。

除非另有说明，否则本公开的实施例将采用医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学、毒理学等的技术，其在本领域技术范围内。文献中对此些技术进行了充分的解释。

必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则如说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指示对象。因此，例如，对“一个支撑物”的提及包含多个支撑物。在本说明书和随后的权利要求中，将引用许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义，除非存在明显的相反意图。

如本文使用，除非另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义。在本公开中，“包括(comprises/comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”等可以具有在美国专利法中赋予它们的含义，并且可以是指“包含 (includes/including)”等。当应用于本公开所涵盖的方法和组合物时，“基本由……组成(consisting essentially of/consistsessentially)”等是指类似于本文公开的那些的组合物，但是可以含有另外的结构基团、组合物组分或方法步骤(或如上讨论的其类似物或衍生物)。然而，与本文公开的相应组合物或方法的那些相比，此些另外的结构基团、组合物组分或方法步骤等不会实质性地影响组合物或方法的基本和新颖特性。

在描述各个实施例之前，提供了以下定义，并且除非另外指出，否则应使用所述以下定义。

定义

如本文使用，使用了命名法烷基、烷氧基、羰基等，如化学领域技术人员通常所理解。如在本说明书中使用，烷基基团(group)可以包含直链、支链和环状烷基基团(radical)(其含有至多约20个碳或1到16个碳)并且是直链或支链的。本文的烷基基团包含但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基、叔戊基和异己基。

如本文使用，低级烷基是指具有约1或约2个碳到约6个碳的碳链。合适的烷基基团可以是饱和或不饱和的。此外，烷基还可以在一个或多个碳上被取代基取代一次或多次，其中所述取代基选自由以下组成的组：C1-C15烷基、烯丙基、丙二烯基、烯基、C3-C7杂环、芳基、卤代、羟基、氨基、氰基、氧代、硫代、烷氧基、甲酰基、羧基、羧酰胺基、磷酰基、膦酸根、膦酰胺基、磺酰基、烷基磺酸根、芳基磺酸根和磺酰胺。另外，烷基基团可以含有至多10个杂原子，在某些实施例中含有1、2、3、4、5、6、7、8或9个杂原子取代基。合适的杂原子包含氮、氧、硫和磷。

如本文使用，“环烷基”是指单环或多环系统，在某些实施例中具有3到 10个碳原子，在其它实施例中具有3到6个碳原子。环烷基基团的环系统可以由一个环或两个或更多个环构成，它们可以以稠合、桥连或螺接方式连结在一起。

如本文使用，“芳基”是指含有3到16个碳原子的芳族单环或多环基团。如在本说明书中使用，芳基基团(group)是芳基基团(radical)，其可以含有至多10个杂原子，在某些实施例中含有1、2、3或4个杂原子。芳基基团还可以任选地被芳基基团或低级烷基基团取代一次或多次，在某些实施例中被取代1 到3或4次，并且它也可以稠合到其它芳基或环烷基环。合适的芳基基团包含例如苯基、萘基、甲苯基、咪唑基、吡啶基、吡咯基、噻吩基、嘧啶基、噻唑基和呋喃基基团。

如在本说明书中使用，环被定义为具有至多20个原子，所述原子可以包含一个或多个氮、氧、硫或磷原子，条件是所述环可以具有一个或多个取代基，所述取代基选自由以下组成的组：氢、烷基、烯丙基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、氯代、碘代、溴代、氟代、羟基、烷氧基、芳氧基、羧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰基氨基、羧酰胺基、氰基、氧代、硫代、烷基硫代、芳基硫代、酰基硫代、烷基磺酸根、芳基磺酸根、磷酰基、膦酸酯根、磷酰胺基和磺酰基，并且另外的条件是所述环还可以含有一个或多个稠合环，包含碳环、杂环、芳基或杂芳基环。

如本文使用，烯基和炔基碳链，如果没有具体说明，含有2到20个碳或2 到16个碳，并且是直链或支链的。在某些实施例中，具有2到20个碳的烯基碳链含有1到8个双键，并且在某些实施例中，具有2到16个碳的烯基碳链含有1到5个双键。在某些实施例中，具有2到20个碳的炔基碳链含有1到8 个三键，并且在某些实施例中，具有2到16个碳的炔基碳链含有1到5个三键。

如本文使用，“杂芳基”是指单环或多环芳族环系统，在某些实施例中具有约5到约15个成员，其中环系统中的原子中的一个或多个(在一个实施例中， 1到3个)原子是杂原子，即除碳以外的元素，包含但不限于氮、氧或硫。杂芳基基团可以任选地稠合到苯环。杂芳基基团包含但不限于呋喃基、咪唑基、吡咯烷基、嘧啶基、四唑基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-甲基吡咯基、喹啉基和异喹啉基。

如本文使用，“杂环基”是指单环或多环非芳族环系统，在一个实施例中具有3到10个成员，在另一个实施例中具有4到7个成员，在另一个实施例中具有5到6个成员，其中环系统中的原子中的一个或多个(在某些实施例中，1 到3个)原子是杂原子，即除碳以外的元素，包含但不限于氮、氧或硫。在杂原子是氮的实施例中，氮任选地被烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基、杂环基烷基、酰基、胍基取代，或者氮可以被季铵化以形成铵基，其中取代基如上选择。

如本文使用，“芳烷基”是指其中烷基的一个氢原子被芳基基团置换的烷基基团。

如本文使用，“卤代”、“卤素”或“卤化物”是指F、Cl、Br或I。

如本文使用，“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被卤素置换的烷基基团。此些基团包含但不限于氯甲基和三氟甲基。

如本文使用，“芳氧基”是指RO-，其中R是芳基，包含低级芳基，例如苯基。

如本文使用，“酰基”是指-COR基团，包含例如烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基或杂芳基羰基，所有这些都可以任选地被取代。

如本文使用，“n-3”或“n3”、“n-6”或“n6”等是指多不饱和脂肪酸或其衍生物的习惯命名法，其中双键(C＝C)的位置是从脂肪酸或脂肪酸衍生物的碳链末端(甲基末端)算起的碳原子。例如，“n-3”是指从脂肪酸或脂肪酸衍生物的碳链的末端起的第三个碳原子。类似地，“n-3”或“n3”、“n-6”或“n6”等同样是指取代基的位置，例如位于脂肪酸或脂肪酸衍生物的碳原子处的羟基基团(OH)，其中数字(例如，3、6等)是从脂肪酸或脂肪酸衍生物的碳链末端算起的。

如本文使用，除非另有说明，否则任何保护基团和其它化合物的缩写均应与它们的常用用法、公认的缩写或IUPAC-IUB生化命名法委员会(参见(1972) 《生物化学(Biochem)》，11:942-944)。

如本文使用，其中在示出具有末端羧基基团“-COOR”的本公开的化合物的化学结构中，“R”旨在表示共价键合到羧基的基团，例如烷基基团。在替代方案中，羧基基团进一步旨在具有负电荷，如“-COO^-”，并且R是阳离子，包含金属阳离子、铵阳离子等。

如本文使用，“受试者”是动物，通常是哺乳动物，包含人类，例如患者。

如本文使用，化合物的“药学上可接受的衍生物”包含其盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、缩醛、缩酮、原酸酯、半缩醛、半缩酮、酸、碱、溶剂化物、水合物或前药。此些衍生物可以由本领域技术人员使用用于此衍生的已知方法容易地制备。所产生的化合物可以在没有实质性毒性作用的情况下施用于动物或人类，并且其具有药物活性或者是前药。

药学上可接受的盐包含但不限于胺盐，例如但不限于N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、氨、二乙醇胺和其它羟烷基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、1-对氯苄基-2-吡咯烷基-T-基甲基苯并咪唑、二乙胺和其它烷基胺、哌嗪和三(羟甲基)氨基甲烷；碱金属盐，例如但不限于锂、钾和钠；碱土金属盐，例如但不限于钡、钙和镁；过渡金属盐，例如但不限于锌；和其它金属盐，例如但不限于磷酸氢钠和磷酸二钠；并且还包含但不限于矿物酸的盐，例如但不限于盐酸盐和硫酸盐；和有机酸的盐，例如但不限于乙酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和富马酸盐。

药学上可接受的酯包含但不限于酸性基团的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基和杂环基酯，所述酸性基团包含但不限于甲酸、磷酸、次膦酸、磺酸、亚磺酸和硼酸。

药学上可接受的烯醇醚包含但不限于式C＝C(OR)的衍生物，其中R是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基或杂环基。药学上可接受的烯醇酯包含但不限于式C＝C(OC(O)R)的衍生物，其中R是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基芳或杂环基。

药学上可接受的溶剂化物和水合物是化合物与一个或多个溶剂或水分子，或1到约100或1到约10或一到约2、3或4个溶剂或水分子的复合物。

如本文使用，“调配物”应是指并且包含化合物、混合物或溶液的组分的任何集合，所述化合物、混合物或溶液被选择为规定的最终用途(包含产品规格和/或使用条件)提供最佳性能。术语调配物应包含液体、半液体、胶体溶液、分散液、乳液、微乳液和纳米乳液，包含水包油乳液和油包水乳液、糊剂、粉末和混悬液。本发明的调配物还可以与其它无毒化合物包含或包装在一起，所述其它无毒化合物例如化妆品载剂、赋形剂、粘合剂和填充剂等。具体地，考虑用于实践本发明的可接受的化妆品载剂、赋形剂、粘合剂和填充剂是使化合物适于口服递送和/或提供稳定性以使得本发明的调配物表现出商业上可接受的保质期的那些。

如本文使用，术语“施用”是指使用玻璃体内、眼内、眼部、视网膜下、鞘内、静脉内、皮下、透皮、皮内、颅内、局部等的施用向受试者提供治疗有效量的调配物或药物组合物。本发明的调配物或药物化合物可以单独施用，但是也可以基于选择的施用途径和标准药物实践与其它化合物、赋形剂、填充剂、粘合剂、载剂或其它媒剂一起施用。施用可以通过载剂或媒剂，例如可注射溶液，包含无菌水溶液或非水溶液或盐溶液；膏剂；洗剂；胶囊；片剂；颗粒；小丸剂；粉末；混悬液、乳液或微乳液；贴剂；胶束；脂质体；泡囊；植入物，包含微植入物；滴眼剂；其它蛋白质和多肽；合成聚合物；微球；纳米颗粒等。

本发明的调配物或药物组合物也可以与其它无毒化合物包含或包装在一起，所述其它无毒化合物例如药学上可接受的载剂、赋形剂、粘合剂和填充剂，包含但不限于葡萄糖、乳糖、***胶、明胶、甘露糖醇、黄原胶、刺槐豆胶、半乳糖、寡糖和/或多糖、淀粉糊、三硅酸镁、滑石粉、玉米淀粉、淀粉片段、角质素、胶体二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素、右旋糖酐、糊精等。具体地，考虑用于实践本发明的药学上可接受的载剂、赋形剂、粘合剂和填充剂是使本发明的化合物适于玻璃体内递送、眼内递送、眼部递送、视网膜下递送、鞘内递送、静脉内递送、皮下递送、透皮递送、皮内递送、颅内递送、局部递送等的那些。此外，包装材料可以是生物惰性的或缺少生物活性(例如，塑料聚合物、硅酮等)，并且可以由受试者在内部进行处理而不影响与其一起包装和/或递送的组合物/调配物的有效性。

可以校准本发明调配物的不同形式，以便适于不同个体和单个个体的不同需求。实施本概念非常复杂，并且必要的研究具有挑战性。然后，本调配物不必对抗每个个体的每个原因。相反，通过对抗必要的原因，本调配物将使身体和大脑恢复其正常功能。然后，身体和大脑本身将校正其余的缺陷。没有药物可以校正AD的每个单一原因，但是本调配物将使可能性最大化。

如本文使用，术语“治疗有效量”是指所施用的组合物或药物组合物的一个实施例的量，所述量将在一定程度上减轻所治疗的疾病或病状的一种或多种症状，和/或所述量将在一定程度上可以预防所治疗受试者患有或有风险患上的病状或疾病的一种或多种症状。如本文可互换使用，“受试者”、“个体”或“患者”是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包含但不限于鼠、猿、人类、农场动物、运动动物和宠物。术语“宠物”包含狗、猫、豚鼠、小鼠、大鼠、兔子、雪貂等。术语农场动物包含马、绵羊、山羊、鸡、猪、牛、驴、美洲驼、羊驼、火鸡等。

“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的载剂”或“药学上可接受的佐剂”是指可用于制备通常安全、无毒且无生物学或其它不良影响的药物组合物的赋形剂、稀释剂、载剂和/或佐剂，并且包含兽医使用和/或人类药物使用可接受的赋形剂、稀释剂、载剂和佐剂。如在说明书和权利要求中使用，“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载剂和/或佐剂”包含一种和多种此些赋形剂、稀释剂、载剂和佐剂。

如本文使用，“药物组合物”或“药物调配物”是指涵盖适合于施用于受试者(例如，哺乳动物，尤其是人类)的组合物或药物组合物，并且是指活性剂或成分与药学上可接受的载剂或赋形剂的组合，使得所述组合物适合于体外、体内或离体的诊断、治疗或预防用途。在中，“药物组合物”是无菌的，并且优选地不含能够在受试者内引发不良反应的污染物(例如，药物组合物中的化合物是药物级的)。药物组合物可以被设计成用于通过支架洗脱装置、导管洗脱装置、血管内球囊、吸入剂等经由多种不同的施用途径(包含口服、静脉内、口腔、直肠、肠胃外、腹膜内、真皮内、气管内、肌肉内、皮下)施用于有需要的受试者或患者。

术语“施用”是指将本公开的组合物引入受试者。组合物的一种有利的施用途径是局部施用。然后，可以使用任何施用途径，例如口服施用、静脉内施用、皮下施用、腹膜施用、动脉内施用、吸入施用、***施用、直肠施用、鼻腔施用、引入脑脊液、血管内施用(静脉或动脉)或滴入身体腔室。

如本文使用，“治疗(treatment/treating)”是指目的为以改善或以其它方式有利地改变疾病或病症的一种或多种症状的任何方式来对抗病状、疾病或病症的管控和护理。所述术语旨在包含针对患者所患有的给定病状的全范围治疗，例如出于以下目的而施用活性化合物：改善或减轻症状或并发症；延缓病状、疾病或病症的进展；治愈或消除病状、疾病或病症；和/或预防病状、疾病或病症，其中“预防(preventing/prevention)”应被理解为是指以阻碍病状、疾病或病症的发展为目的的患者管控和护理，并且包含施用活性化合物以预防或减少症状或并发症发作的风险。

待治疗的患者优选是哺乳动物，特别是人类。治疗还涵盖本文组合物的任何药物用途，例如用于治疗本文提供的疾病的用途。

如本文使用，术语“营养组分”是指例如蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质和其它有益营养素，包含本发明的功能成分，即旨在对食用食物的人产生具体益处的成分。碳水化合物可以是但不限于葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、塔格糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、木糖、木糖醇、右旋糖、聚右旋糖、环糊精、海藻糖、棉子糖、水苏糖、低聚果糖、麦芽糊精、淀粉、果胶、树胶、角叉菜胶、菊粉、纤维素基化合物、糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇、异麦芽酮糖醇、赤藓糖醇、果胶、树胶、角叉菜胶、菊粉、氢化难消化性糊精、氢化淀粉水解物、高度支化麦芽糖糊精、淀粉和纤维素。

营养蛋白质、碳水化合物等的市售来源及其规格是加工食品调配物领域的普通技术人员已知的或可以容易地确定的。

包含营养组分的本公开的组合物可以是食物制剂，其可以是但不限于小于通常被认为是食物棒的“零食大小”或“小食大小”的组合物。例如，食物棒可以制有压痕或齿孔以允许食用者折成较小的部分以进食，或者食物“棒”可以是小块，而不是长条形产品。

较小块可以单独地包涂或包覆。它们可以单独包装或成组包装。所述食物可以包含例如但不限于未被研磨成均质块的固体材料。所述食物可以例如但不限于包涂或包覆有巧克力(包含黑、淡、牛奶或白巧克力、角豆、酸奶、其它糖食、坚果或谷物)。包衣可以是复合糖食包衣或非糖食(例如，无糖)包衣。包衣可以是光滑的，或可以含有固体颗粒或碎块。

讨论

年龄相关性和非年龄相关性炎性、退行性、神经退行性、创伤性、皮肤病学和心血管疾病包含影响全球许多人的大量疾病。在大多数情况下，这些疾病及相关病状和病症难以治疗，导致生活质量受损和/或寿命缩短，并且仍然是未满足的主要医疗需求。

可以通过本公开的组合物减少或消除的炎性、退行性或神经退行性疾病和病状包含但不限于稳态被异常或失调炎性反应破坏的急性和慢性病症。这些病状由多种炎性因子引发和介导，包含未补偿的氧化应激、趋化因子、细胞因子、血液/组织屏障的破损、自身免疫性疾病、钙失调(包含细胞中钙超载)、线粒体功能障碍、遗传因子(基因易感性、多态性)或遗传性病状、或涉及诱发过量的原细胞损伤、细胞和/或器官稳态的促炎/破坏的白细胞、单核细胞/巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞或实质细胞其它病状。这些疾病发生在多种组织和器官中，包含皮肤、肌肉、胃、肠、肝、肾、肺、眼睛、耳朵和大脑。这些疾病目前通过抗炎剂治疗，例如皮质类固醇、非类固醇抗炎药物、TNF调节剂、COX-2抑制剂等。

退行性疾病包含涉及活细胞和组织的进行性缺失的病状，其导致进行性功能损伤，例如膝盖、髋关节或其它关节的软骨缺失(例如，骨关节炎)。其它退行性疾病涉及细胞和细胞间稳态紊乱，并且包含心脏病、动脉粥样硬化、癌症、糖尿病、肠道疾病、骨质疏松症、***炎、类风湿性关节炎等。

神经退行性疾病包含大脑、视网膜、脊髓和周围神经的一些主要疾病，由此细胞组织的进行性消亡会导致功能受损。这些是由于免疫性或炎性病症和/ 或遗传病状或衰老引起的。它们包含多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、视网膜退行性疾病(例如，年龄相关性黄斑变性)、遗传性眼部疾病(例如，色素性视网膜炎、青光眼)等。

眼部炎性或退行性疾病和病状通常会影响角膜、视神经、小梁网和视网膜。没有有效的预防或治疗，它们会导致致盲眼病，例如青光眼、白内障、糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性(AMD)。

视网膜退行性疾病是致盲的主要原因，它影响了很多人。视网膜变性是由视网膜的光感受器细胞进行性和最终死亡引起的视网膜退化。常见的视网膜退行性疾病的实例包含色素性视网膜炎，年龄相关性黄斑变性和Stargardt病。色素性视网膜炎仅在美国就影响50,000至100,000人，而黄斑变性是美国55岁及以上人群视力丧失的主要原因，影响了超过1,000万人。还没有针对这些和其它视网膜退行性疾病的有效治疗。

对于视网膜退行性疾病，涉及光感受器细胞的进行性缺失的详细分子机制仍是未知的，并且当今可用的治疗不能有效治疗这些主要疾病并防止视力丧失。需要一种能确保视网膜光感受器细胞的存活的用于预防和治疗视网膜退行性疾病的方法。

全身性炎性或退行性疾病和病状可能影响重要器官(例如，心脏、肌肉、胃、肠、肝、肾和肺)，并且可能导致年龄相关性慢性炎性疾病，例如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和狼疮。

大脑相关炎性、退行性或神经退行性疾病和病状，例如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、缺血性中风、创伤性脑损伤、癫痫、肌萎缩性脊髓侧索硬化症，通常导致早衰、认知功能障碍和死亡。

皮肤炎性或退行性疾病和病状通常由阳光暴露或其它因素引起的皮肤损伤或由造成过量脱落的异常皮肤细胞增生而导致，所述其它因素包含皮肤炎症(皮炎或湿疹)、特应性皮炎(特应性湿疹)、皮肤脱水。阳光暴露或其它因素引起的皮肤损伤与多种疾病和病状(例如，湿疹、牛皮癣、特应性皮炎或神经性皮炎)相关，并且可能由暴露于紫外光和其它类型的接触性皮炎而导致。另外，由某些全身性疾病和病状引起的瘙痒会导致各种炎性和其它类型的刺激引起的皮肤瘙痒，并导致需要抓挠，这可能导致进一步的皮肤损伤或皮肤外观改变。

尽管取得了很大进展，但对通常导致器官损伤、慢性疾病和加速衰老的炎性、神经炎性、退行性或神经退行性疾病和病状的病理生理学仍然知之甚少。

因此，保护器官、预防衰老相关疾病和病状以及全面恢复健康仍然是未满足的主要医疗需求。有效保护皮肤组织免于炎性、神经炎性、过度增生性或脱水性皮肤病状还存在较大的空白。特别地，对皮肤损伤、皮肤外观改变和皮肤衰老的病理生理学的了解仍不清楚。

当今可用的治疗不能有效治疗这些主要疾病或减慢其对生命功能的进行性损伤。需要一种确保经历氧化应激或其它稳态破坏的关键细胞的存活的方法。因此，对炎性、神经炎性、退行性或神经退行性疾病的管控存在较大的治疗空白。

本公开涵盖用于预防和治疗炎性和退行性疾病(包含神经退行性疾病和视网膜退行性疾病)的化合物、组合物和方法的实施例。这基于有关某些ω-3或ω-6极长链多不饱和脂肪酸(n3或n6 VLC-PUFA)及其相关羟基化衍生物的关键保护作用的新发现。

研究已经表明某些长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)在炎症和相关病状中起重要作用。这些包含含有18-22个碳的ω-3(n3)和ω-6(n6)多不饱和脂肪酸，其包含：花生四烯酸(ARA，C20:4n6，即20个碳，4个双键，ω-6)、二十碳五烯酸(EPA，C20:5n3，20个碳，5个双键，ω-3)、二十二碳五烯酸(DPA， C22:5n3，22个碳，5个双键，ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA，C22:6n3，22 个碳原子，6个双键，ω-3)。

LC-PUFA经由脂氧合酶型酶转化成生物活性羟基化PUFA衍生物，所述羟基化PUFA衍生物用作在炎症和相关病状中起重要作用的生物活性脂质介质。这些中最重要的是在某些炎症相关细胞中经由脂氧合酶(LO或LOX)酶(例如，15-LO，12-LO)的作用而生成的羟基化衍生物，其导致具有有效作用(包含抗炎、促消退、神经保护或组织保护作用等)的单羟基化、二羟基化或三羟基化PUFA衍生物的形成。例如，神经保护素D1(NPD1)是一种经由15-脂氧合酶(15-LO)的酶促作用在细胞中形成的DHA的二羟基衍生物，其被示出具有确定的R/S和Z/E立体化学结构(10R,17S-二羟基-二十二碳 -4Z,7Z,11E,13E,15Z,19Z-六烯酸)和独特的生物特征(包含立体选择性有效抗炎、稳态恢复、促消退、生物活性)。已经示出，NPD1调节神经炎性信号转导和蛋白稳态，并且促进神经再生、神经保护和细胞存活。

脂肪酸的其它重要类型是n3和n6极长链多不饱和脂肪酸(n3 VLC-PUFA， n6 VLC-PUFA)，其在含有延长酶的细胞中产生，所述延长酶将n3和n6 LC-PUFA延伸为含有24到42个碳原子(C24-C42)的n3和n6 VLC-PUFA。这些中最重要的似乎是具有28-38个碳(C28-C38)的VLC-PUFA。VLC-PUFA 的代表性类型包含C32:6n3(32个碳，6个双键，ω-3)、C34:6n3、C32:5n3和 C34:5n3。这些VLC-PUFA通过延长酶(特别是ELOVL4(极长链脂肪酸延长因子4))的作用生物发生地(biogenically)衍生。VLC-PUFA还在复杂的脂质 (包含鞘脂和磷脂)中被酰化，特别是在磷脂酰胆碱的某些分子物种中。

ELOVL4的生物合成作用和VLC-PUFA的生物学功能已成为许多近期研究的主题，这些研究表明了其在视网膜、大脑、睾丸和皮肤中有潜在作用。这些 VLC-PUFA被认为在膜组织中发挥功能，并且它们对于健康的重要性也日益得到认可。

已经示出VLC-PUFA在视网膜(中枢神经系统的组成部分)以及大脑中的重要性。例如，常染色体显性Stargardt样黄斑营养不良(STGD3)是一种青少年发病型视网膜退行性疾病，其由ELOVL4基因的外显子6的突变引起，导致 ELOVL4蛋白(一种关键的延长酶)截短而没有内质网(ER)保留/回收信号，从而导致VLC-PUFA的生物合成严重降低。与年龄匹配的对照眼供体相比，年龄相关性黄斑变性(AMD)供体眼中还存在低视网膜VLC-PUFA水平和异常低的n3/n6比值。隐性ELOVL4突变表现出鱼鳞病、癫痫发作、智力低下和痉挛性四肢瘫痪的临床特征，类似于具有严重的神经表型的Sjogren-Larsson综合征(SLS)，暗示了VLC-PUFA合成对于中枢神经系统和皮肤发育的重要性。

发现VLC-PUFA并入光感受器外膜的磷脂中，并且示出其在光感受器的寿命中以及在它们的突触功能和神经元连接性中起重要作用。因此，能够放置光感受器细胞凋亡的基于VLC-PUFA的生物活性衍生物可以为各种类型的视网膜退行性疾病(包含Stargardt样黄斑营养不良(STGD3)和X连锁青少年视网膜劈裂症(XLRS))提供治疗益处，所述X连锁青少年视网膜劈裂症是一种由 RS1基因的突变引起的遗传性早发型视网膜退行性疾病，其是男性青少年黄斑变性的主要原因。本病状指示显著的光感受器突触损伤，尚无针对光感受器突触损伤的可用治疗。

本公开的实施例涵盖的化合物、组合物和方法涉及n3 VLC-PUFA在大脑和视网膜中(特别是在视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞中)诱导存活信号转导的用途。

n3 VLC-PUFA的生物合成通路：n3 VLC-PUFA的生物合成从其碳链中仅含有偶数个碳的低级碳PUFA开始，例如含有22个碳和6个交替的C＝C键的二十二碳六烯酸(DHA)(C22:6n3)和含有22个碳和5个交替的C＝C键的二十二碳五烯酸(DPA)(C22:5n3)。n3 VLC-PUFA的生物合成需要使用DHA或其它较短链PUFA作为底物，并且需要某些延长酶(例如，ELOVL4)的存在和作用。如图1和2中所总结，这些22碳ω-3长链脂肪酸(n3 LC-PUFA)是延长酶(例如，ELOVL4)的底物，所述延长酶一次向羧基末端加入一个2碳CH₂CH₂基团，形成n3 VLC-PUFA，其含有具有至少24个碳到至少42个碳的碳链。

二十二碳六烯酸(DHA，C22:6n3，1并入磷脂酰胆碱分子物种(3)的2 位，并被延长酶转化成较长链n3 VLC-PUFA。通过延长酶ELOVL4(极长链脂肪酸延长因子4)进行的延长导致形成极长链ω-3多不饱和脂肪酸(n3 VLC-PUFA，2，包含C32:6n3和C34:6n3，然后其并入磷脂酰胆碱分子物种，3 的1位。DHA存在于2位并且n3 VLC-PUFA存在于1位可能会提供冗余的、互补的和协同的细胞保护和神经保护作用，这放大了在用病理条件攻击时的神经元和其它关键细胞类型的潜在存活。

n3-VLC-PUFA，3的脂氧合导致形成n3-VLC-PUFA的酶促羟基化衍生物，其被称为类延长素，包含单羟基化合物(例如，ELV-27S和ELV-29S，4)和二羟基衍生物(例如，ELV-N32和ELV-N34，5)。类延长素ELV-N32是20R,27S- 二羟基32:6衍生物(32碳，6双键类延长素，具有类似神经保护素的20(R),27(S)- 二羟基型式)。类延长素ELV-N34是22R,29S-二羟基34:6衍生物(34碳，6双键类延长素，具有22(R),29(S)-二羟基型式)。

图2示出了二十二碳六烯酸(DHA，C22:6n3)向光感受器的递送，光感受器外节段膜的更新以及类延长素的合成。通过饮食获得DHA或前体C18:3n3， DHA本身也是如此(图1)。体循环(主要是门脉系统)将它们带入肝脏。一旦进入肝脏，干细胞将DHA并入DHA磷脂(DHA-PL)中，然后以脂蛋白的形式转运到脉络膜毛细血管(神经血管单元)并转运到其它组织的毛细血管。

DHA从脉络膜毛细血管穿过布鲁赫膜(Bruch's membrane)(图2)，并被衬在视网膜背面的视网膜色素上皮(RPE)细胞吸收，以被发送到光感受器内节段。本从肝脏到视网膜的靶向递送途径被称为DHA长环。

然后，DHA通过光感受器间基质(IPM)并且到达光感受器内节段，在其中并入光感受器外节段、细胞膜和细胞器的磷脂中。大部分用于盘膜生物发生 (外节段)。随着新的富含DHA的盘在光感受器外节段的底部合成，较旧的盘会被向顶地推向RPE细胞。每天，RPE细胞会吞噬光感受器尖端，从而去除最旧的盘。所产生的吞噬体在RPE细胞内降解，并且DHA循环回光感受器内节段，用于新的盘膜生物发生。本局部循环被称为22:6短环。

类延长素由光感受器内节段中的ELOVL4(极长链脂肪酸延长因子4)生物合成的ω-3极长链多不饱和脂肪酸(n3 VLC-PUFA)形成。因此，含有C1 处的VLCω-3FA(描绘为C34:6n3)和C2处的DHA(C22:6n3)的内节段中的磷脂酰胆碱分子物种用于光感受器膜生物发生。已经发现本磷脂与视紫红质紧密相关。一旦盘在RPE细胞中的吞噬作为日常的生理过程，当出现潜在的稳态紊乱时，磷脂酶A1(PLA1)就会切割sn-1处的酰基链，释放出C34:6n3并导致类延长素的形成(例如，类延长素-34，ELV-N34)。未用于类延长素合成的VLCω-3脂肪酸通过短环循环。

因此，出于生物合成的原因，天然存在的和生物遗传衍生的n3 VLC-PUFA 仅含有偶数个碳，其范围为至少24个碳到至少42个碳(即24、26、28、30、 32、34、36、38、40、42个碳)。因此，仅含有奇数个碳的n3 VLC-PUFA(其范围为至少23到至少41个碳原子(即23、25、27、29、31、33、35、37、39、 41个碳))不是天然存在的，但它们可以使用合成化学方法和策略来合成和制造。

类延长素ELV-N32和ELV-N34在视网膜和大脑中的立体控制全合成和结构表征：如图3和4中所总结，ELV-N32(27S-和ELV-N34由三种关键中间体(1、 2和3)(它们各自以立体化学纯的形式制备)合成。中间体2和3的立体化学通过使用对映体纯的环氧化物起始材料预先定义。中间体1、2和3的迭代偶联产生了ELV-N32和ELV-N34(4)，其被分离为甲基酯(Me)或钠盐(Na)。合成材料ELV-N32和ELV-N34与在其碳链上具有相同碳数量的内源性类延长素相匹配，所述内源性类延长素从培养的人视网膜色素上皮细胞(RPE)(图3) 和神经元细胞培养物(图4)获得。

类延长素的实验检测和表征：实验证据记录了类延长素的生物合成形成，所述类延长素为单羟基和二羟基n3 VLC-PUFA衍生物，其分子结构类似于DHA 衍生的17-羟基-DHA和二羟基化合物NPD1(10R,17S-二羟基-二十二碳-4Z,7Z,11E,13E,15Z,19Z-六烯酸)。类延长素是酶促生成的32碳(ELV-N32)和 34碳(ELV-N34)n3 VLC-PUFA的羟基化衍生物，其是首次在人初代视网膜色素上皮细胞(RPE)的培养物(图3A-3K)中和神经元细胞培养物中(图4A-4K) 标识。

本公开提供了具有与n3 VLC-PUFA相关的碳链的化合物，除了具有6或5 个C＝C键之外，所述化合物还含有一个、两个或多个羟基基团。基于本类型的化合物可能负责n3VLC-PUFA的保护和神经保护作用的假设，我们试图用加入的32:6n3和34:6n3 VLC-PUFA脂肪酸标识它们在培养物中的人视网膜色素上皮细胞中的存在。我们的结果表明了来自32:6n3和34:6n3 VLC-PUFA脂肪酸的单羟基和二羟基类延长素衍生物。经由立体控制全有机合成，将这些类延长素(ELV-N32，ELV-N34)的结构与以立体化学纯的形式制备的标准品进行了比较(图5A和5B)。

n3 VLC-PUFA和类延长素在眼科疾病和病状中的有益使用：眼部炎性或退行性疾病和病状通常会影响角膜、视神经、小梁网和视网膜。没有有效的预防或治疗，它们会导致致盲眼病，例如青光眼、白内障、糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性(AMD)。越来越多的证据表明，视网膜细胞和组织中 ELOVL4突变和/或n3 VLC-PUFA减少与退行性、神经退行性和视网膜退行性疾病有关，这些疾病与过度和持续的炎性环境相关。因此，在已知n3VLC-PUFA 起主要作用的情况下，对n3 VLC-PUFA在视网膜细胞和组织中的结构、性质和潜在作用进行评定。

实验使用人视网膜色素上皮(RPE)细胞完成，所述细胞是神经外胚层来源的视网膜的有丝***后细胞，是中枢神经系统的组成部分。这些细胞具有丰富的机制，可以保护自身免于损伤并保护其它细胞(特别是光感受器细胞的存活)。它们是人体内最活跃的吞噬细胞，对光感受器和视力的健康至关重要，并且具有分泌神经营养素和其它有益物质的能力。

n3 VLC-PUFA在视网膜退行性疾病(例如，常染色体显性Stargardt样黄斑营养不良(STGD3)和年龄相关性黄斑变性(AMD))中的有益作用得到以下方面的支持：(a)n3 VLC-PUFA在视网膜中生物合成，并且已知在视网膜中起主要作用；(b)在培养物的初代人视网膜色素上皮细胞(RPE)中发现并结构表征了类延长素ELV-N32和ELV-N34(图1、6A和6B)；(c)ELOVL4是涉及 DHA(C22:6)转化成n3 VLC-PUFA的关键酶；(d)延长酶ELVOL4的某些突变导致视网膜退行性疾病，例如STGD3和AMD；(e)将DHA捕获到含有 ELOVL4产物的视网膜细胞中所必需的蛋白质的遗传消融导致VLC-PUFA水平的大幅下降，从而导致视网膜变性；(f)RPE细胞中未补偿的氧化应激(UOS) 与视网膜退行性疾病的早期阶段有关；(g)n3 VLC-PUFAC32:6n3和C34:6n3 为暴露于UOS的人RPE细胞提供细胞保护(如图7A-8C中所示)，这无法用脂氧合酶抑制剂改变(图9A-9C)；(h)类延长素ELV-N32和ELV-N34通过上调抗凋亡蛋白(图10A-10G)并促进光感受器细胞存活(图11A-11D)来对UOS 下的人RPE细胞提供细胞保护；(i)类延长素ELV-N32和ELV-N34在晚发性视网膜变性(L-ORD)中促进光感受器细胞完整性(图12A和12B)。

如图14A-14C中所示，类延长素(ELV)对抗Aβ肽诱导的视网膜色素上皮细胞衰老进展。Aβ42是淀粉样蛋白发生通路的终产物，是年龄相关性黄斑变性(AMD)的玻璃疣和阿尔茨海默病(AD)的老年斑的组分。为了模拟体内 OAβ的作用，使用了6月龄小鼠，分别在视网膜下注射仅OAβ、OAβ+ELV和仅ELV。未注射小鼠用作阴性对照，而PBS注射小鼠用作假对照。注射量为2 μl PBS、10μM OAβ、10μM OAβ+200ng ELV-32、仅200ng ELV-32、10μM OAβ +200ngELV-34或仅200ng ELV-34。注射后第3天，从视杯分离mRNA，并使用q-PCR分析基因表达。然后，在第7天，使小鼠经受光学相干断层扫描 (OCT)分析，然后摘除眼睛并进行处理以进行组织学、整装RPE染色和蛋白质印迹(WB)。OCT和组织学(数据未示出)表明，与对照以及ELV治疗组相比，在OAβ诱导的视网膜变性中，OAβ注射组的视网膜厚度更薄。用ZO-1 整装染色表明，紧密联结也被OAβ破坏。有趣的是，ELV和OAβ的共注射表明，ELV能够恢复RPE层的形态和稳态。此外，在WB分析中，衰老标志物 p16INK4a的蛋白水平在OAβ组中被上调，但在ELV联合治疗组和对照组中被阻抑。最后，基因表达分析表明，ELV降低了衰老和AMD标志物的水平，这由OAβ注射触发，同时诱导了RPE功能基因的表达，这在OAβ注射组中被下调。本数据表明，ELV-32和ELV-34通过下调衰老、AMD和炎症相关基因表达并通过保留RPE功能基因的表达来保护RPE和视网膜免于OAβ诱导的衰老，从而恢复视网膜结构并维持稳态。

类延长素(ELV)化合物：1.ELV C32:6-乙炔甲基酯；2.ELV C32:6-NPD1 样钠盐；3.ELV C34:6-乙炔甲基酯；4.ELV C32:6-NPD1样甲基酯；5.ELV C34:6-NPD1样甲基酯。

自噬过程涉及多于100个基因。以下基因在AMD疾病中升高：

ATG3(自噬相关3)本基因编码一种泛素样缀合酶，是参与自噬(真核细胞中胞质成分的降解、更新和循环过程)的泛素化样系统的组分。已知本蛋白质在细胞死亡期间在自噬的调节中起作用。

ATG5(自噬相关5)由本基因编码的蛋白质与自噬蛋白12结合，在泛素样缀合系统中作用E1样活化酶。编码的蛋白质涉及多个细胞过程，包含自噬小泡形成、氧化损伤后的线粒体质量控制、先天抗病毒免疫反应的负调节、淋巴细胞发育和增殖、MHC II抗原呈递、脂肪细胞分化和凋亡。

ATG7(自噬相关7)本基因编码E1样活化酶，对于自噬和细胞质至液泡的转运至关重要。编码的蛋白质还被认为在长时间代谢应激期间会调节p53依赖性细胞周期通路。它与多种功能相关，包含轴突膜运输、轴突稳态、线粒体自噬、脂肪分化和造血干细胞维持。

BECN1(Beclin 1)本基因编码调节自噬(由饥饿诱导的降解的代谢过程) 的蛋白质。编码的蛋白质是介导小泡运输过程的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)复合物的组分。本蛋白被被认为在多种细胞过程中起作用，包含肿瘤发生、神经变性和凋亡。

衰老细胞具有几个明显的特性，例如细胞大小增加、诱导的溶酶体水解酶衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-GAL)的酶活性。(2)。除了这些特征外，还存在衰老信号转导通路(包含p16INK4a、p21CIP1、p27KIP和p53)的活化。(3)

p16INK4a(也被称为细胞周期素依赖性激酶抑制剂2A、细胞周期素依赖性激酶4抑制剂A或其它几种同义词)是一种肿瘤阻抑蛋白。本蛋白质由 CDKN2A基因编码。p16通过减缓从G1期到S期的细胞进程来在细胞周期调节中起重要作用。

p21Cip1(也被称为p21Waf1、细胞周期素依赖性激酶抑制剂1或CDK相互作用蛋白1)是一种细胞周期素依赖性激酶抑制剂(CKI)，其能够抑制所有细胞周期素/CDK复合物。本蛋白质由CDKN1A基因编码。p21代表p53活性的主要靶标，因此与将DNA损伤与细胞周期停滞联系在一起相关。

p27Kip1(也被称为细胞周期素依赖性激酶抑制剂1B)是一种酶抑制剂。本蛋白质由CDKN1B基因编码。它编码属于细胞周期素依赖性激酶(Cdk)抑制蛋白的Cip/Kip家族的蛋白。编码的蛋白质与细胞周期素E-CDK2或细胞周期素D-CDK4复合物结合并阻止其活化，因此控制G1的细胞周期进程。它通常被称为细胞周期抑制蛋白，因为它的主要功能是停止或减慢细胞***周期。

p53(也称为肿瘤蛋白p53，肿瘤阻抑因子p53)也是细胞周期抑制剂。本蛋白质由TP53(人类)和Trp53(小鼠)编码。多种应激源可以通过激酶直接或间接活化p53。结果是抑制所有细胞周期素并导致细胞停滞。

数据为在眼中n3 VLC-PUFA或其类延长素(例如，ELV-N32、ELV-N34) 的治疗或预防用途提供了支持，包含视网膜退行性疾病和其它眼科疾病和病状 (包含青光眼、白内障、糖尿病性视网膜病、Stargardt样黄斑营养不良(STGD3) 和年龄相关性黄斑变性(AMD))的治疗。

n3 VLC-PUFA和类延长素在脑疾病和病状中的有益使用：VLC-PUFA和类延长素通路在中枢神经系统(CNS)(包含大脑和神经元细胞)中具有活性。

当应用于培养物中的大脑皮层混合神经元细胞或海马细胞时，ELV-N32(Na 或Me形式)或ELV-N34(Na或Me形式)能够克服未补偿的氧化应激、NMDA 诱导的神经元兴奋性毒性或OGD的损伤作用。大多数中风本质上是缺血性的，氧糖剥夺会导致涉及线粒体损伤的一系列事件，最终导致神经元死亡。因此，体外OGD模型为梳理ELV参与的细胞事件和假定的潜在神经保护信号转导通路提供了一个机会。ELV-N32和ELV-N34均可引发神经保护并克服神经元细胞毒性。当在OGD损害90分钟之后的再氧合阶段2小时后以250nM的剂量应用时，ELV的32碳ω-3VLC-PUFA(C32:6n3)前体能够为大脑皮层神经元提供神经保护。总之，内源性生成的类延长素(ELV-N32或ELV-N34)在培养物中的大脑皮层和海马神经元中改善了由多种应激源(例如，NMDA、未补偿的氧化应激或OGD)诱发的神经元损伤。这些新颖的生物活性脂质属于一类新的脂质介质，被称为类延长素(ELV)，其衍生自在位置C1和C2处具有两个PUFA的磷脂分子物种。

实验性缺血性中风2小时后1小时进行的所有ELV治疗均改善了整个7天存活期的神经恢复。局灶性缺血后的脑水肿的快速诱导是中风后发病和死亡的主要原因。在皮层(半影区)以及皮层下区域检测到最大程度的保护。组织病理学表明，皮层和皮层下区域中的梗死较小，全细胞损伤较少，嗜酸性粒细胞区域密度较高，并且沿梗死边缘的神经元收缩，所有这些均在类延长素治疗大鼠中检测到。

脑缺血引发一系列复杂的细胞、分子和代谢事件，导致不可逆的脑损伤。死神经元和受损组织被从血流中侵入受损组织的活化驻留小胶质细胞和/或巨噬细胞清除。半影中的存活星形胶质细胞和活化小胶质细胞可以通过产生涉及修复机制的生长因子、细胞因子和细胞外基质分子来促进神经元完整性的恢复。结果表明，ELV治疗增加了皮层中的NeuN阳性神经元、GFAP阳性反应性星形胶质细胞的数量和SMI-71阳性血管密度。血管完整性促进神经发生和突触发生，进而有助于功能恢复改善。

在脑缺血后，BBB的完整性受损，使分子不受控制地进入脑实质，从而加剧了缺血引起的损伤。在患者中，BBB完整性的缺失与中风预后恶化有关。测量了内源性IgG渗入脑实质的BBB缺血性破坏。用ELV-N34-Na和ELV-N34-Me 治疗减轻了局灶性脑缺血诱导的BBB破坏。

新近标志的ELV保护了经历氧糖剥夺或NMDA受体介导的兴奋性毒性的神经元。此外，ELV减小了梗死体积、解救了缺血性核心和半影，减少了BBB 损伤，并且促进了伴有神经/行为恢复的细胞存活。合理地提出，新型ELV疗法具有治疗局灶性缺血性中风和其它引起炎性/稳态破坏的病状的潜力。

本文提供了ELOVL4和n3 VLC-PUFA在CNS中的有益作用：(a)ELOVL4 在CNS(包含神经元细胞)中表达，并涉及DHA(C22:6)到n3 VLC-PUFA 的转化；(b)在初代皮层神经元的氧糖剥夺(OGD)体外模型中，n3 VLC-PUFA 由初代皮层神经元响应于OGD而释放，并被酶促转化成单羟基类延长素27(S)- 羟基-32:6n3(图13B)和29(S)-羟基-34:6n3(图13C)。然而，在神经元未暴露于OGD的对照培养基中，n3 VLC-PUFA(例如，C32:6n3和C34:6n3)和单羟基类延长素的水平可忽略不计(图13B和13C)。

如图13A-13D中所示，n3 VLC-PUFA(例如，C32:6n3和C34:6n3)由来自SD大鼠胚胎的初代皮层神经元响应于氧糖剥夺(OGD)而内源性释放；并被酶促转化成类延长素，包含29(S)-羟基-34:6n3和27(S)-羟基-32:6n3。在神经元未暴露于OGD的对照培养基中，VLC-PUFA(例如，C32:6n3和C34:6n3) 和类延长素的水平可忽略不计。建立体外OGD模型，并从SD大鼠胚胎培养初代混合皮层神经元。在DIV 12上，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，并用无葡萄糖的神经基础培养基(Gibco)培育30分钟。之后，将细胞置于模块化培育箱(Billups-Rothenberg Inc.)中，并在37℃下在厌氧箱(95％N₂和5％CO₂) 进行OGD培育90分钟。在OGD暴露90分钟后，将细胞返回到原始培养基[神经基础培养基(Gibco)，含有2％B27(Gibco)和2％N-2(Gibco)补充剂以及 0.5mM谷氨酰胺和青霉素-链霉素(50U/ml)(Gibco)]，并在常氧箱(37℃， 5％CO₂)中保持12小时。对于常氧(对照)条件，神经元用PBS洗涤，但在 120分钟的过程期间(其它细胞在此期间经受OGD应激)保持在常规培养基[神经基础培养基(Gibco)，含有2％B27(Gibco)和2％N-2(Gibco)补充剂以及 0.5mM谷氨酰胺和青霉素-链霉素(50U/ml)(Gibco)]中。此后，使对照细胞经受随后的常规培养基更换，以匹配受OGD应激的细胞的时间。

在12小时后，对照板和OGD板均用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，将细胞刮下并收集在甲醇中进行LC-MS/MS分析。使用液-液脂质提取法从收集的细胞培养基中提取脂肪酸。将提取物加载到液相色谱串联质谱仪上进行分析。我们分析了脂肪酸、单羟基脂肪酸衍生物(27-S-羟基32:6和29-S-羟基34:6)、 ELV-N32(20,27-二羟基脂肪酸32:6n3)和ELV-N34(22,29-二羟基脂肪酸 34:6n3)。将样品标准化为内标(AA-d8)进行比较。

据推测，OGD触发单羟基类延长素以及较小程度的ELV-N32和ELV-N34 的释放，这将保护初代皮层神经元。这些数据表明了n3 VLC-PUFA和类延长素的神经保护作用。

类延长素ELV-N32和ELV-N34引发对以下的保护：(a)暴露于OGD(图 18A-18I)或NMDA毒性(图15A-15L和图19A-19H)的大脑皮层神经元；(b) 暴露于未补偿的氧化应激(UOS)、氧糖剥夺(OGD)或NMDA兴奋性毒性(图 16A-16I)的大脑皮层混合和海马神经元培养物，其中评估了细胞存活(图17)。

类延长素ELV-N32和ELV-N34改善神经/行为评分，保护半影并减小缺血性中风后的MRI病灶体积(图20A-2D)。

类延长素ELV-N32和ELV-N34减轻实验性缺血性中风诱导的神经元和星形胶质细胞损伤(图21A-21C)。

类延长素ELV-N32和ELV-N34减少神经血管单元(NVU)的破坏并减少缺血性中风后的脑梗死(图22A-22D)。

类延长素ELV-N32和ELV-N34提供神经保护并改善创伤性脑损伤(TBI) 后的神经缺损(图23A-23C)。

数据一致支持n3 VLC-PUFA和类延长素(例如，ELV-N32、ELV-N34)在大脑中的潜在治疗或预防用途，包含大脑相关炎性、退行性或神经退行性疾病和病状(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、缺血性中风、创伤性脑损伤、癫痫、肌萎缩性脊髓侧索硬化症)的治疗。

n3 VLC-PUFA和类延长素在全身性和/或年龄相关性疾病和病状中的使用：由炎性、自身免疫性、退行性、神经退行性疾病、应激相关性、年龄相关性或创伤性病状引起的全身性疾病可能影响重要器官(例如，心脏、肌肉、胃、肠、肝、肾和肺)，并且可能导致年龄相关性慢性炎性疾病，例如类风湿性关节炎、心血管疾病、脑血管疾病、动脉粥样硬化、狼疮和其它衰老相关性疾病和病状。鉴于其在保护预防慢性疾病和病状的关键细胞和器官的功能方面的独特有益作用，预计所提供的n3 VLC-PUFA和/或类延长素化合物可有效治疗多种这些慢性疾病和病状。

n3 VLC-PUFA和类延长素在皮肤疾病和病状中的有益作用：皮肤炎性或退行性疾病和病症通常由阳光暴露或其它因素引起的皮肤损伤或由造成过量脱落的异常皮肤细胞增生而导致，所述其它因素包含皮肤炎症(皮炎或湿疹)、特应性皮炎(特应性湿疹)、皮肤脱水。阳光暴露或其它因素引起的皮肤损伤与多种疾病和病状(例如，湿疹、牛皮癣、特应性皮炎或神经性皮炎)相关，并且可能由暴露于紫外光和其它类型的接触性皮炎而导致。另外，由某些全身性疾病和病状引起的瘙痒会导致各种炎性和其它类型的刺激引起的皮肤瘙痒，并导致需要抓挠，这可能导致进一步的皮肤损伤或皮肤外观改变。

考虑到皮肤健康、皮肤功能和皮肤外观的总体重要性，已致力于开发保护皮肤和总体皮肤健康的方法。当前大多数治疗涉及皮质类固醇的皮肤递送，或使用含有维生素、矿物质或草药成分的油和洗剂，这些通常不能有效预防或治疗多种类型的皮肤损伤并且还具有副作用，例如皮肤变薄和肌肉损失。尽管此些制剂可以提供一些保护，但仍存在开发有效保护受损皮肤、预防皮肤损伤、恢复皮肤健康、改善皮肤外观并延缓皮肤衰老的化合物、组合物和方法的未满足的需求。

尽管所提供的化合物对皮肤和其它组织具有巨大的保护、神经保护、修复和其它有益作用，但它们是有限量地局部生物合成的。随着时间的流逝并且由于皮肤损伤和皮肤衰老，所提供化合物的局部供应不足以为受损组织提供所需的保护。

因此，通过以可以直接和局部吸收到皮肤上的方式提供所提供的化合物的组合物，所提供的化合物和组合物将为受损伤或衰老影响的皮肤提供显著的益处，从而实现皮肤健康的恢复、皮肤外观的美容改善和皮肤衰老的延缓。

通过阻抑衰老相关性皮肤组织损伤，并且通过防止神经元损伤并恢复神经元功能，所提供的化合物、组合物和方法能够保护皮肤免于受损，改善皮肤健康和皮肤外观，并延缓皮肤衰老。鉴于它们在保护关键细胞和器官(包含皮肤) 功能方面的独特有益作用，预计所提供的n3 VLC-PUFA和/或类延长素化合物可有效治疗多种皮肤疾病和病状，包含皮肤相关性炎性、自身免疫性、退行性或神经退行性皮肤疾病和病状。

综上所述，以上数据和分析为本公开(即所提供的化合物、皮肤病学或化妆品组合物以及所提供的化合物用于皮肤组织的方法能够为因炎症、脱水、衰老或其它原因而受损的皮肤提供保护、预防和治疗)提供了基础。

n3 VLC-PUFA作为潜在治疗剂的有益作用：本文所述的概念和数据为所提供的n3VLC-PUFA和/或类延长素化合物作为用于视网膜退行性疾病以及与大脑、CNS相关的疾病的预防和治疗以及与炎性或退行性疾病和病状相关的其它未满足的治疗需求的潜在治疗剂的有益使用提供了支持。

本公开的化合物的来源：所提供的化合物不是从自然界中天然存在的组织中分离出来的，而是从结合人细胞和化学合成n3-VLC-PUFA的人工实验的结果中分离出来的。使用HPLC和质谱，我们的合成类延长素化合物的一般结构与在人视网膜色素上皮细胞中生物合成或在神经元细胞培养物中检测到的化合物相匹配。然而，目前尚不知晓所提供的具有特定定义立体化学的单羟基化和二羟基化类延长素的天然存在。此外，所提供的化合物不是从天然来源获得的，而是通过采用本领域已知的立体控制合成方法以市售材料作为起始而制备的。所提供的制备方法被设计成适合n3 VLC-PUFA的独特疏水性质，其与碳总数为 22个或更少的碳的化合物有显著差异。

本公开涵盖具有立体化学纯的结构并且被化学合成和修饰以具有使其能够发挥药理活性的另外的结构特征和性质的化合物。所提供的化合物是甲酸酯或盐形式的化学修饰的药学上可接受的衍生物，所述甲酸酯或盐形式增强了其化学和生物稳定性并使其能够用于涉及各种药物递送形式的治疗应用。

本公开还提供了所提供的化合物的药理学有效组合物，这增强了其以可以到达靶向细胞和组织的方式递送到受试者的能力。

n3 VLC-PUFA和类延长素的总体有益使用：本公开提供了用于预防和治疗多种全身性炎性、退行性和神经退行性疾病(包含皮肤疾病、眼科疾病、脑疾病(包含神经创伤))的化合物和组合物。

本公开提供的化合物和组合物能够在经历未补偿的氧化应激或其它稳态破坏的某些细胞中恢复稳态并诱导细胞存活信号转导。

本公开还提供了使用所提供的化合物和组合物的方法，所述化合物和组合物含有游离甲酸或其药学上可接受的盐的形式或者其相应的酯或其它前药衍生物的形式的ω-3极长链多不饱和脂肪酸的羟基化衍生物。所提供的化合物可以容易地通过采用本领域已知的方法以市售材料作为起始而制备。

含有所提供的化合物和药学上可接受的载剂的药物组合物的施用恢复了稳态平衡，并促进了维持正常功能所必需的某些细胞的存活。所提供的化合物、组合物和方法可以用于炎性、退行性和神经退行性疾病的预防和治疗。

本公开通过模拟固有细胞/器官反应的具体生物学来靶向这些病状的引发和早期进展的关键步骤，以实现效力、选择性、无副作用和持续的生物活性。

化合物

本文中描述了基于ω-3极长链多不饱和脂肪酸及其羟基化衍生物的化合物，其被称为“类延长素”。

ω-3极长链多不饱和脂肪酸具有A或B或其衍生物的结构：

其中：A在碳链中含有总共23到42个碳原子，并且具有位置n-3、n-6、 n-9、n-12、n-15和n-18开始的6个交替的顺式碳-碳双键，并且其中B在碳链中含有总共23到42个碳原子，并且具有位置n-3、n-6、n-9、n-12和n-15开始的5个交替的顺式碳-碳双键。R可以是氢、甲基、乙基、烷基或阳离子，所述阳离子例如铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子，包含但不限于钠、钾、镁、锌或钙阳离子，并且其中m是0到19的数字。

本公开的ω-3极长链多不饱和脂肪酸可以具有末端羧基基团“-COOR”，其中“R”旨在表示共价键合到羧基的基团，例如烷基基团。在替代方案中，羧基基团进一步旨在具有负电荷，如“-COO^-”，并且R是阳离子，包含金属阳离子、铵阳离子等。

在一些ω-3极长链多不饱和脂肪酸中，m是选自由0到15组成的组的数字。因此，m可以是选自1、3、5、7、9、11、13或15的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共24、26、28、30、32、34、36或38个碳原子。在其它ω-3 极长链多不饱和脂肪酸中，m是选自由0、2、4、6、8、10、12或14组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共23、25、27、19、31、33、35或37个碳原子。在一些ω-3极长链多不饱和脂肪酸中，m是选自由5到15组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37或38个碳原子。在一些ω-3极长链多不饱和脂肪酸中，m是选自由9到11组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共32或34 个碳原子。

在一些实施例中，ω-3极长链多不饱和脂肪酸是甲酸，即R是氢。在其它实施例中，ω-3极长链多不饱和脂肪酸是甲酸酯，其中R是甲基、乙基或烷基。当ω-3极长链多不饱和脂肪酸是甲酸酯时，R可以是但不限于甲基或乙基。在一些实施例中，ω-3极长链多不饱和脂肪酸是甲酸酯，其中R是甲基。

在一些实施例中，ω-3极长链多不饱和脂肪酸可以是甲酸盐，其中R是铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子，所述金属阳离子选自由钠、钾、镁、锌或钙阳离子组成的组。在一些有利实施例中，R是铵阳离子或亚胺阳离子。R可以是钠阳离子或钾阳离子。在一些实施例中，R是钠阳离子。

本公开的ω-3极长链多不饱和脂肪酸或衍生物可以在其碳链中具有32或 34个碳和从位置n-3开始的6个交替的顺式双键，并且具有式A1(14Z,17Z,20Z,23Z,26Z,29Z)-三十二碳-14,17,20,23,26,29-六烯酸)或式 A2(16Z,19Z,22Z,25Z,28Z,31Z)-三十四碳-16,19,22,25,28,31-六烯酸)：

在ω-3极长链多不饱和脂肪酸的一些实施例中，羧基衍生物是甘油衍生的磷脂的一部分，其可以通过利用本领域已知的方法容易地以结构A或B的n3 VLC-PUFA的甲酸形式作为起始而制备，并且由结构C、D、E或F表示：

其中C或E在碳链中含有总共23到42个碳原子，并且具有位置n-3、n-6、 n-9、n-12、n-15和n-18开始的6个交替的顺式碳-碳双键，并且其中D或E在碳链种含有总共23到42个碳原子，并且具有位置n-3、n-6、n-9、n-12和n-15 开始的5个交替的顺式碳-碳双键。在有利实施例中，m是选自由0到15组成的组的数字。在其它实施例中，m是选自1、3、5、7、9、11、13或15的数字，其中脂肪酸组分在碳链中含有总共有24、26、28、30、32、34、36或38个碳原子。在另外的有利实施例中，m是选自由0、2、4、6、8、10、12或14组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共23、25、27、19、31、33、 35或37个碳原子。

在一些实施例中，m是选自由5到15组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个碳原子。在一些实施例中，m是选自由5、7、9、11、13或15组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共28、30、32、34、36或38个碳原子。在其它实施例中，m是选自由4、6、8、10、12或14组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共27、29、31、33、35或37个碳原子。在有利实施例中， m是选自由9到11组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共32 或34个碳原子。

本公开的单羟基化类延长素可以具有G、H、I或J的结构：

其中化合物G和H在碳链中具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3、 n-9、n-12、n-15和n-18开始的5个顺式碳-碳双键和位置n-7开始的反式碳-碳双键；并且其中化合物I和J在碳链中具有总共23到42个碳原子，并且具有位置n-3、n-9、n-12和n-15开始的4个顺式碳-碳双键和位置n-7开始的反式碳 -碳双键；其中R是氢、甲基、乙基、烷基或阳离子，所述阳离子选自由以下组成的组：铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子，所述金属阳离子选自由以下组成的组：钠、钾、镁、锌或钙阳离子，并且其中m是选自由0到19组成的组的数字；其中化合物G和H可以作为等摩尔混合物存在；其中化合物I和J可以作为等摩尔混合物存在；其中所提供的化合物G和H主要是在带有羟基基团的碳处具有确定的(S)或(R)手性的一种对映体；并且其中化合物G和H主要是在带有羟基基团的碳处具有确定的(S)或(R)手性的一种对映体。

如本文和在本公开的其它结构中使用，示出的本公开的化合物具有末端羧基基团“-COOR”，“R”旨在表示共价键合到羧基的基团，例如烷基基团。在替代方案中，羧基基团进一步旨在具有负电荷，如“-COO^-”，并且R是阳离子，包含金属阳离子、铵阳离子等。

在本公开的单羟基化类延长素的一些实施例中，m是选自由0到15组成的组的数字。在其它有利实施例中，m是选自1、3、5、7、9、11、13或15的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共24、26、28、30、32、34、36或38 个碳原子。在其它实施例中，m是选自由0、2、4、6、8、10、12或14组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共23、25、27、19、31、33、35 或37个碳原子。

在一些实施例中，m是选自由5到15组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个碳原子。在一些实施例中，m是选自由5、7、9、11、13或15组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共28、30、32、34、36或38个碳原子。在其它实施例中，m是选自由4、6、8、10、12或14组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共27、29、31、33、35或37个碳原子。在有利实施例中， m是选自由9到11组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共32 或34个碳原子。

在一些实施例中，本公开的单羟基化类延长素是甲酸，即R是氢。在其它实施例中，所述化合物是甲酸酯，其中R是甲基、乙基或烷基。在有利实施例中，所述化合物是甲酸酯，其中R是甲基或乙基。在有利实施例中，所述化合物是甲酸酯，其中R是甲基。在其它有利实施例中，所述化合物是甲酸盐，其中R是铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子，所述金属阳离子选自由钠、钾、镁、锌或钙阳离子组成的组。在一些有利实施例中，R是铵阳离子或亚胺阳离子。在其它有利实施例中，R是钠阳离子或钾阳离子。在有利实施例中，R是钠阳离子。

本公开的二羟基化类延长素可以具有结构K、L、M或N

其中化合物K和L在碳链中具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3、 n-7、n-15和n-18开始的4个顺式碳-碳双键和位置n-9、n-11开始的2个反式碳-碳键；并且其中化合物M和N在碳链中具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3、n-7、n-12和n-15开始的3个顺式碳-碳双键和位置n-9、n-11开始的 2个反式碳-碳键，其中R是氢、甲基、乙基、烷基或阳离子，所述阳离子选自由以下组成的组：铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子，所述金属阳离子选自由以下组成的组：钠、钾、镁、锌或钙阳离子，并且其中m是选自由0到19 组成的组的数字；其中化合物K和L可以作为等摩尔混合物存在；其中化合物 M和N可以作为等摩尔混合物存在，其中化合物K和L主要是在带有羟基基团的碳处具有确定的(S)或(R)手性的一种对映体；其中所述提供的化合物M和 N主要是在带有羟基基团的碳处具有确定的(S)或(R)手性的一种对映体。

如本文和在本公开的其它结构中使用，示出的本公开的化合物具有末端羧基基团“-COOR”，“R”旨在表示共价键合到羧基的基团，例如烷基基团。在替代方案中，羧基基团进一步旨在具有负电荷，如“-COO^-”，并且R是阳离子，包含金属阳离子、铵阳离子等。

在本公开的二羟基化类延长素的一些实施例中，m是选自由5到15组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个碳原子。在有利实施例中，m是选自由5、7、9、11、13 或15组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共28、30、32、34、 36或38个碳原子。在其它实施例中，m是选自由4、6、8、10、12或14组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共27、29、31、33、35或37 个碳原子。在有利实施例中，m是选自由9到11组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共32或34个碳原子。

本公开的一些二羟基化类延长素是甲酸，即R是氢。在其它实施例中，本公开的二羟基化类延长素是甲酸酯，其中R是甲基、乙基或烷基。在有利实施例中，所述化合物是甲酸酯，其中R是甲基或乙基。在有利实施例中，所述化合物是甲酸酯，其中R是甲基。

在其它实施例中，本公开的二羟基化类延长素是甲酸盐，其中R是铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子，所述金属阳离子选自由钠、钾、镁、锌或钙阳离子组成的组。在一些有利实施例中，R是铵阳离子或亚胺阳离子。在其它有利实施例中，R是钠阳离子或钾阳离子。在有利实施例中，R是钠阳离子。

本公开的炔基单羟基化类延长素可以具有O、P、Q或R的结构：

其中化合物O和P在碳链中具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3、 n-12、n-15和n-18开始的4个顺式碳-碳双键、位置n-7开始的反式碳-碳键和位置n-9开始的碳-碳三键；其中化合物I和J在碳链中具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3、n-12和n-15开始的3个顺式碳-碳双键、位置n-7开始的反式碳-碳键和位置n-9开始的碳-碳三键；其中R是氢、甲基、乙基、烷基或阳离子，所述阳离子选自由以下组成的组：铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子，所述金属阳离子选自由以下组成的组：钠、钾、镁、锌或钙阳离子，并且其中m是选自由0到19组成的组的数字；其中化合物O和P可以作为等摩尔混合物存在；其中化合物Q和R可以作为等摩尔混合物存在；其中所提供的化合物O和P主要是在带有羟基基团的碳处具有确定的(S)或(R)手性的一种对映体；并且其中所提供的化合物O和P主要是在带有羟基基团的碳处具有确定的 (S)或(R)手性的一种对映体。

如本文和在本发明的其它结构中使用，示出的本公开的炔基单羟基化类延长素具有末端羧基基团“-COOR”，“R”旨在表示共价键合到羧基的基团，例如烷基基团。在替代方案中，羧基基团进一步旨在具有负电荷，如“-COO^-”，并且R是阳离子，包含金属阳离子、铵阳离子等。

在一些实施例中，m是选自由0到15组成的组的数字。在其它实施例中， m是选自1、3、5、7、9、11、13或15的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共24、26、28、30、32、34、36或38个碳原子。

在另外的实施例中，m是选自由0、2、4、6、8、10、12或14组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共23、25、27、19、31、33、35或 37个碳原子。在一些实施例中，m是选自由5到15组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或 38个碳原子。在实施例中，m是选自由5、7、9、11、13或15组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共28、30、32、34、36或38个碳原子。在其它实施例中，m是选自由4、6、8、10、12或14组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共27、29、31、33、35或37个碳原子。在一些实施例中，m是选自由9到11组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共32或34个碳原子。

在一些实施例中，本公开的炔基单羟基化类延长素是甲酸，即R是氢。在其它实施例中，本公开的炔基单羟基化类延长素是甲酸酯，其中R是甲基、乙基或烷基。在实施例中，本公开的炔基单羟基化类延长素是甲酸酯，其中R是甲基或乙基。

在一些实施例中，R是甲基。在其它实施例中，本公开的炔基单羟基化类延长素可以是甲酸盐，其中R是铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子，所述金属阳离子选自由钠、钾、镁、锌或钙阳离子组成的组。在一些实施例中，R是铵阳离子或亚胺阳离子。在其它实施例中，R是钠阳离子或钾阳离子。在实施例中，R是钠阳离子。

炔基二羟基化类延长素可以具有S、T、U或V的结构：

其中化合物S和T在碳链中具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3、 n-12、n-15和n-18开始的3个顺式碳-碳双键，具有位置n-9和n-11开始的2 个反式碳-碳双键和位置n-7开始的碳-碳三键；并且其中化合物U和V在碳链中具有总共23到42个碳原子，并且具有位置n-3和n-15开始的2个顺式碳- 碳双键，具有位置n-9和n-11开始的2个反式碳-碳双键和位置n-7开始的碳- 碳三键；其中R是氢、甲基、乙基、烷基或阳离子，所述阳离子选自由以下组成的组：铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子，所述金属阳离子选自由以下组成的组：钠、钾、镁、锌或钙阳离子，并且其中m是选自由0到19组成的组的数字；其中化合物S和T可以作为等摩尔混合物存在；其中化合物U和V 可以作为等摩尔混合物存在。

在一些实施例中，所提供的化合物S和T主要是在带有羟基基团的碳处具有确定的(S)或(R)手性的一种对映体；其中所提供的化合物U和V主要是在带有羟基基团的碳处具有确定的(S)或(R)手性的一种对映体。

如本文和在本发明的其它结构中使用，示出的本发明的化合物具有末端羧基基团“-COOR”，“R”旨在表示共价键合到羧基的基团，例如烷基基团。在替代方案中，羧基基团进一步旨在具有负电荷，如“-COO^-”，并且R是阳离子，包含金属阳离子、铵阳离子等。

在一些实施例中，m是选自由5到15组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38个碳原子。在实施例中，m是选自由5、7、9、11、13或15组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共28、30、32、34、36或38个碳原子。在其它实施例中，m是选自由4、6、8、10、12或14组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共27、29、31、33、35或37个碳原子。在实施例中，m是选自由9到11组成的组的数字，其中脂肪酸组分在其碳链中含有总共32或34个碳原子。

在一些实施例中，所述提供的化合物是甲酸，即R是氢。

在其它实施例中，所提供的化合物是甲酸酯，其中R是甲基、乙基或烷基。在实施例中，所提供的化合物是甲酸酯，其中R是甲基或乙基。在实施例中，所提供的化合物是甲酸酯，其中R是甲基。在其它实施例中，所提供的化合物是甲酸盐，其中R是铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子，所述金属阳离子选自由钠、钾、镁、锌或钙阳离子组成的组。在一些实施例中，R是铵阳离子或亚胺阳离子。在其它实施例中，R是钠阳离子或钾阳离子。在实施例中，R是钠阳离子。

在有利实施例中，本公开提供了式G1的单羟基化32碳甲基酯，其名称为： (S,14Z,17Z,20Z,23Z,25E,29Z)-27-羟基三十二碳-14,17,20,23,25,29-六烯酸甲酯；式G2的单羟基化32碳钠盐，其名称为：(S,14Z,17Z,20Z,23Z,25E,29Z)-27-羟基三十二碳-14,17,20,23,25,29-六烯酸钠；式G3的单羟基化34碳甲基酯，其名称为：(S,16Z,19Z,22Z,25Z,27E,31Z)-29-羟基三十四碳-16,19,22,25,27,31-六烯酸甲酯；或式G4的单羟基化34碳钠盐，其名称为：(S,16Z,19Z,22Z,25Z,27E,31Z)-29- 羟基三十四碳-16,19,22,25,27,31的-六烯酸钠：

在其它有利实施例中，本公开提供了式K1的二羟基化32-碳甲基酯，其名称为：(14Z,17Z,20R,21E,23E,25Z,27S,29Z)-20,27-二羟基三十二碳 -14,17,21,23,25,29-六烯酸甲酯；式K2的二羟基化32碳钠盐，其名称为：(14Z,17Z,20R,21E,23E,25Z,27S,29Z)-20,27-二羟基三十二碳-14,17,21,23,25,29-六烯酸钠；式K3的二羟基化34碳甲基酯，其名称为： (16Z,19Z,22R,23E,25E,27Z,29S,31Z)-22,29-二羟基三十四碳-16,19,23,25,27,31-六烯酸甲酯；或式K4的二羟基化34碳钠盐，其名称为： (16Z,19Z,22R,23E,25E,27Z,29S,31Z)-22,29-二羟基三十四碳-16,19,23,25,27,31-六烯酸钠：

在其它实施例中，本发明提供了式O1的炔基单羟基化32碳甲基酯，其名称为：(S,14Z,17Z,20Z,25E,29Z)-27-羟基三十二碳-14,17,20,25,29-五烯-23-炔酸甲酯；式O2的炔基单羟基化32-碳钠盐，其名称为：(S,17Z,20Z,25E,29Z)-27-羟基十二碳酸钠-17,20,25,29-四烯-23-炔酸钠；式O3的炔基单羟基化34碳甲基酯，其名称为：(S,16Z,19Z,22Z,27E,31Z)-29-羟基三十四碳-16,19,22,27,31-五烯-25-炔酸甲酯；式O4的炔基单羟基化34碳钠盐，其名称为： (S,16Z,19Z,22Z,27E,31Z)-29-羟基三十四碳-16,19,22,27,31-五烯-25-炔酸钠：

在其它有利实施例中，本发明提供了式S1的炔基二羟基化32碳甲基酯，其名称为：(14Z,17Z,20R,21E,23E,27S,29Z)-20,27-二羟基三十二碳 -14,17,21,23,29-五烯-25-炔酸甲酯；式S2的炔基二羟基化32碳钠盐，其名称为：(14Z,17Z,20R,21E,23E,27S,29Z)-20,27-二羟基三十二碳-14,17,21,23,29-五烯-25- 炔酸钠；或式S3的炔基二羟基化34碳甲基酯，其名称为： (16Z,19Z,22R,23E,25E,29S,31Z)-22,29-二羟基三十四碳-16,19,23,25,31-五烯-27- 炔酸甲酯；或式S4的炔基二羟基化34碳钠盐，其名称为： (16Z,19Z,22R,23E,25E,29S,31Z)-22,29-二羟基三十四碳-16,19,23,25,31-五烯-27- 炔酸钠。

所提供的化合物的制备和制造方法：本公开的所提供的化合物可以通过采用本领域已知的方法以市售材料作为起始容易地制备，如图24-28中所示的方案1-5中所总结。

方案1(图24)示出了用于O型化合物的立体控制全合成的详细方法，其中n是9，并且脂肪酸链含有总共32个碳原子，并且R基团是甲基或钠阳离子。特别地，方案1示出了以十五碳-14-炔酸甲酯(S1)作为起始的化合物 ELV-N32-Me和ELV-N32-Na的合成。通过以十七碳-16-炔酸酯(T1)作为起始，本过程得到化合物ELV-N34-Me和ELV-N34-Na。ELV-N32-Me和ELV-N32-Na 的炔基前体(即13a、13b、15a和15b)也在本公开中的所提供的化合物X和 Z中。方案1通过采用对于本类型的反应典型的反应条件提供了用于制备所提供的化合物的试剂和条件。

方案2(图25)描述了通过以方案1中也使用的中间体2、5和7作为起始的二羟基化类延长素K和L及其炔烃前体S和T的全合成。可以根据文献程序(《四面体快报(TetrahedronLett.)》，2012；53(14):1695-8)完成保护的(R)环氧化物4到中间体15的转换，以及7和15的偶联及随后的到中间体17的转换。

在中间体2或17之间或中间体5或17之间催化交叉偶联，然后进行脱保护，形成炔基化合物S和T，然后将其选择性还原以形成二羟基化类延长素K 和L。通过水解和酸化得到相应的甲酸，可以通过加入等量的相应碱将其转化成甲酸盐。可以类似地通过改变炔烃起始材料7中的碳数来制备其碳链中具有至少23个碳且至多42个碳的K、L、S和T型的二羟基化类延长素。

方案3(图26)描述了通过利用方案1中也使用的相同的炔基中间体2和 5的M和N型的具有五个不饱和双键的二羟基化类延长素及其炔烃前体U和V 的全合成。(《四面体快报(Tetrahedron Lett.)》，2012；53(14):1695-8)。

常见中间体22的合成以甲酸18开始，使用已知方法将其转化成原酸酯19 (《四面体快报(Tetrahedron Lett.)》，1983,24(50),5571-4)。通过锂化炔烃与环氧化物1的反应得到中间体21，其被转化成碘化物中间体22，类似于16到17 的转化。在中间体2或5与22之间催化交叉偶联，然后进行脱保护，形成炔基二羟基类延长素U和V，然后将其选择性还原以形成二羟基化类延长素M和N。

通过水解和酸化得到相应的甲酸，可以通过加入等量的相应碱将其转化成甲酸盐。可以类似地通过改变炔烃甲酸18中的碳数来制备其碳链中具有至少 23个碳且至多42个碳的M、N、U和V型的二羟基化类延长素。

方案4(图27)示出了以炔烃甲基酯23、中间体15和炔烃中间体2作为起始的32碳二羟基化类延长素的立体控制全合成。特别地，本方案示出了32 碳炔基类延长素化合物ELV-N32-Me-乙炔的全合成，及其到类延长素甲基酯 ELV-N32-Me、类延长素甲酸ELV-N32-H和类延长素钠盐ELV-N32-Na的转化。

方案5(图28)示出了以炔烃甲基酯30作为起始并采用与方案4中相同顺序的反应的34碳二羟基化类延长素的立体控制全合成。

特别地，本方案示出了34碳炔基类延长素化合物ELV-N34-Me-乙炔的全合成，及其到类延长素甲基酯ELV-N34-Me、类延长素甲酸ELV-N34-H和类延长素钠盐ELV-N34-Na的转化。

方案1-5(图24-28)中呈现的化学也可以容易地适于其碳链中具有至少23 个碳且至多42个碳的另外的单羟基化和二羟基化类延长素的全合成。

用于治疗疾病的药物组合物：在其它实施例中，本公开提供了药物组合物的调配物，其在药学上可接受的载剂中含有治疗有效量的一种或多种本文提供的化合物或其盐。

所提供的组合物含有一种或多种本文提供的化合物或其盐，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载剂和/或佐剂。所述化合物优选地被调配成合适的药物制剂，例如溶液、混悬液、片剂、分散片、丸剂、胶囊、粉末、缓释调配物或酏剂(用于口服、口腔、鼻内、***、直肠、眼部施用，从玻璃体内植入的储药器或嵌入在眼表面的胶原蛋白或其它材料中的纳米装置或树状聚合物缓释)、或无菌溶液或混悬液(用于肠胃外施用)、皮肤贴剂以及透皮贴剂制剂和干粉吸入剂。所提供的调配物可以呈滴剂的形式(例如，滴眼剂)，并且药物调配物可以进一步含有抗氧化剂和/或用于治疗眼病的已知试剂。通常，使用本领域熟知的技术和程序将上述化合物调配成药物组合物(参见例如《安塞尔药物剂型介绍(Ansel Introductionto Pharmaceutical Dosage Forms)》，第四版，1985, 126)。

本公开的有利实施例提供了药物组合物，其含有各种形式的所提供的化合物(游离甲酸或其药学上可接受的盐的形式，或其相应的酯或其磷脂衍生物的形式)。在其它有利实施例中，本公开提供了含有一种或多种类延长素(游离甲酸或其药学上可接受的盐的形式，或其相应的酯的形式)的药物组合物，所述类延长素含有在极长链多不饱和脂肪酸的n-3到n-18之间的位置处的一个或两个羟基基团。

在另一个有利实施例中，本公开提供了一种用于在所有年龄段均保持和保护皮肤并用于治疗皮肤疾病或病症的药物组合物。在一些实施例中，皮肤疾病或病症涉及皮肤炎症、皮肤过度增生或皮肤脱水。

在实施例中，本公开提供了一种用于治疗皮肤疾病或病症的组合物，所述皮肤疾病或病症选自由以下组成的组：皮炎、湿疹、特应性皮炎、神经性皮炎、光接触性皮炎、干燥性湿疹、脂溢性湿疹、汗疱症、盘状湿疹、静脉性湿疹、疱疹样皮炎、神经性皮炎和自身湿疹化、辐射诱导的皮肤炎症或牛皮癣。

在所提供的组合物中，将有效浓度的一种或多种化合物或药学上可接受的衍生物与合适的药物载剂或媒剂混合。如上所述，可以在调配之前将化合物衍生为相应的盐、酯、烯醇醚或酯、酸、碱、溶剂化物、水合物或前药。组合物中化合物的浓度在施用时可有效地递送治疗、预防或改善疾病、病症或病状的一种或多种症状的量。

如本文所述，可以通过采用本领域已知的方法容易地制备组合物。所述组合物可以是药物调配物的组分。

药物调配物可以进一步含有用于治疗炎性或退行性疾病(包含神经退行性疾病)的已知试剂。所提供的组合物可以用作脂肪酸的药物前体，并且可以在定位到患病部位时转化成游离脂肪酸。

本公开还提供了用于预防、恢复或治疗疾病或病状的包装组合物或药物组合物。本公开提供的其它包装组合物或药物组合物进一步包含指示，所述指示包含以下中的至少一个：使用所述组合物治疗疾病或病状的说明。试剂盒可以进一步包含本领域已知的用于将以上列出的组分的各种组合施用于宿主的合适的缓冲液和试剂。

药物调配物：本公开的实施例包含本文标识的组合物或药物组合物，并且可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载剂、天然存在或合成的抗氧化剂和/或佐剂一起调配。另外，本公开的实施例包含与一种或多种药学上可接受的辅助物质一起调配的组合物或药物组合物。特别地，所述组合物或药物组合物可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载剂和/或佐剂一起调配，以提供本公开的组合物的一个实施例。

多种药学上可接受的赋形剂是本领域已知的。药学上可接受的赋形剂已在各种出版物中充分描述，包含例如A.Gennaro(2000)，《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy)》，第20版，Lippincott, Williams,&Wilkins；《药物剂型与药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)》(1999)，H.C.Ansel等人编辑，第7版，Lippincott, Williams,&Wilkins；和《药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》(2000)，A.H.Kibbe等人编辑，第3版，Amer.Pharmaceutical Assoc。药学上可接受的赋形剂(例如，媒剂、佐剂、载剂或稀释剂)是公众容易获得的。此外，药学上可接受的辅助物质(例如，pH调节和缓冲剂、张度调节剂、稳定剂、湿润剂等)是公众容易获得的。

在本公开的一个实施例中，可以使用能够产生所需作用的任何方式将组合物或药物组合物施用于受试者。因此，可以将组合物或药物组合物掺入用于治疗施用的多种调配物中。例如，可以通过与适当的药学上可接受的载剂或稀释剂组合将组合物或药物组合物调配成药物组合物，并且可以将其调配成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏剂、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。

用于组合物或药物组合物的合适的赋形剂媒剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，如果需要，媒剂可以含有少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、抗氧化剂或pH缓冲剂。制备此些剂型的方法对于本领域技术人员而言是已知的，或者在考虑本公开后将是显而易见的。参见例如《雷明顿药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》，Mack Publishing Company，伊斯顿，宾夕法尼亚州，第17版，1985。无论如何，待施用的组合物或调配物将含有足以在所治疗的受试者中达到所需状态的一定量的组合物或药物组合物。

本公开的组合物可以包含包括缓释或控释基质的那些。另外，本公开的实施例可以与使用缓释调配物的其它治疗结合使用。如本文使用，缓释基质是由可通过酶促或基于酸的水解或通过溶解而降解的材料(通常是聚合物)制成的基质。一旦***体内，基质就会被酶和体液作用。缓释基质理想地选自生物相容性材料，例如脂质体、聚丙交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚乙丙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、甲酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。说明性的可生物降解基质包含聚丙交酯基质、聚乙交酯基质和聚乙丙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)基质。在另一个实施例中，本公开的药物组合物(以及组合组合物)可以在控释系统中递送。例如，可以使用静脉内输注、可植入的渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其它施用方式来施用组合物或药物组合物。在一个实施例中，可以使用泵(Sefton(1987)，《CRC生物医学工程关键参考(CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.)》，14:201；Buchwald等人(1980)，《外科学(Surgery)》，88:507；Saudek等人(1989)，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J. Med.)》，321:574)。在另一个实施例中，使用了聚合物材料。在又一个实施例中，将控释系统放置在治疗靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分。在又一个实施例中，将控释系统放置在治疗靶标附近，因此仅需要全身的一部分。其它控释系统在Langer(1990)，《科学(Science)》，249:1527-1533的评论中进行了讨论。

在另一个实施例中，本公开的组合物(以及分开或一起的组合组合物)包含通过将本文所述的组合物或药物组合物浸渍到吸收性材料(例如缝合线、绷带和纱布)中而形成或涂覆到固相材料(例如，外科缝合钉、拉链和导管，用于递送组合物)的表面上的那些。鉴于本公开，本类型的其它递送系统对于本领域技术人员将是显而易见的。

在另一个实施例中，本公开的组合物或药物组合物(以及分开或一起的组合组合物)可以是迟释调配物的一部分。可以如标准参考文献中所述制备迟释剂型调配物，所述标准参考文献例如《药物剂型——片剂(Pharmaceutical dosage form tablets)》，Liberman等人编辑(纽约，Marcel Dekker,Inc.，1989)，《雷明顿：药学的科学与实践(Remington-Thescience and practice of pharmacy)》，第 20版，Lippincott Williams&Wilkins，巴尔的摩，马里兰州，2000，和《药物剂型与药物递送系统(Pharmaceutical dosage forms anddrug delivery systems)》，第6版，Ansel等人，(梅迪亚，宾夕法尼亚州：Williams andWilkins，1995)。这些参考文献提供了有关用于制备片剂和胶囊以及片剂、胶囊和颗粒的迟释剂型的赋形剂、材料、设备和方法的信息。这些参考文献提供了有关用于制备片剂和胶囊以及片剂、胶囊和颗粒的迟释剂型的载剂、材料、设备和方法的信息。

组合物或药物组合物的实施例可以已一种或多种剂量施用于受试者。本领域技术人员将容易理解，剂量水平可以根据所施用的组合物或药物组合物的具体情况、症状的严重程度和受试者对副作用的敏感性而不同。给定化合物的有利剂量可由本领域技术人员通过多种方式容易地确定。

在一个实施例中，施用多次剂量的组合物或药物组合物。组合物或药物组合物的施用频率可以取决于多种因素(例如，症状的严重程度等)中的任何一种而不同。例如，在一个实施例中，组合物或药物组合物可以每月一次、每月两次、每月三次、隔周一次(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、隔日一次(qod)、每日一次(qd)、每日两次(qid)、每日三次(tid)或每日四次施用。如上所讨论，在一个实施例中，组合物或药物组合物在1到10天的时间段内每日施用1到4次。

组合物或药物组合物类似物的施用持续时间(例如，组合物或药物组合物所施用的时间段)可以取决于多种因素(例如，患者反应等)中的任何一种而不同。例如，组合物或药物组合物可以组合地或分开地在约一天到一周、约一天到两周的时间段内施用。

可以有效治疗病状或疾病的本公开的组合物和药物组合物的量可以通过标准临床技术确定。另外，可以任选地采用体外或体内测定来帮助标识最佳剂量范围。待采用的精确剂量还可以取决于施用途径，并且可以根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。

施用途径：本公开的实施例提供了用于使用适合于药物递送的任何可用方法和途径(包含体内和离体方法以及全身和局部施用途径)向受试者(例如，人)施用活性剂的方法和组合物。施用途径包含鼻内、肌肉内、气管内、皮下、真皮内、玻璃体内、局部应用、静脉内、直肠、鼻部、口服以及其它肠内和肠胃外施用途径。如果需要，施用途径可以组合，或者取决于试剂和/或期望的作用进行调整。活性剂可以单次剂量或多次剂量施用。

n-3VLC-PUFA及其生物发生衍生物在细胞中形成，不是人类饮食的组成部分。本文提供的新化合物的有利施用途径将包含口服和肠胃外施用(包含在眼表面上)、进入眼睛的玻璃体内和视网膜下注射，以绕过肠吸收、肠-肝和血- 眼屏障。所提供的调配物可以以滴剂(例如，滴眼剂)的形式或通过用于治疗眼病的任何其它常规方法来递送。

除吸入施用外的肠胃外施用途径包含但不限于局部、透皮、皮下、肌内内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内和静脉内途径，即除通过消化道外的任何施用途径。可以进行肠胃外施用以影响组合物的全身或局部递送。在需要全身递送的地方，施用通常涉及药物制剂的侵入性或全身吸收的局部或粘膜施用。在一个实施例中，组合物或药物组合物也可以通过肠内施用递送到受试者。肠内施用途径包含但不限于口服和直肠递送(例如，使用栓剂)。

通过皮肤或粘膜施用组合物或药物组合物的方法包含但不限于合适的药物制剂的局部应用、透皮传递、注射和表皮施用。对于透皮传递，吸收促进剂或离子电渗疗法是合适的方法，可以使用市售“贴剂”来完成离子电渗传递，所述“贴剂”经由电脉冲连续几天或更长的时间来连续不断地递送其产物。

本公开提供的化合物和组合物能够在经历氧化应激或其它稳态破坏的某些细胞中恢复稳态并诱导存活信号转导。本公开还提供了使用所提供的化合物和组合物的方法，所述化合物和组合物含有游离甲酸或其药学上可接受的盐的形式或者其相应的酯或其它前药衍生物的形式的极长链多不饱和脂肪酸的羟基化衍生物。所提供的化合物可以容易地通过采用本领域已知的方法以市售材料作为起始而制备。

所提供的化合物(以类延长素衍生物ELV-N32-Me、ELV-N32-Na、 ELV-N34-Me和ELV-N34-Na为例)的生物活性归因于它们到达靶向人细胞并通过进入细胞或/和通过在膜结合受体处起作用而发挥其生物作用的能力。可替代地，所提供的化合物可以经由细胞内受体(例如，核膜)起作用，并且因此它们将通过影响关键的信号转导事件而具体地起作用。含有所提供的化合物和药学上可接受的载剂的药物组合物的施用恢复了稳态平衡，并促进了维持正常功能所必需的某些细胞的存活。所提供的化合物、组合物和方法可以用于炎性、退行性和神经退行性疾病的预防和治疗。本公开通过模拟固有细胞/器官反应的具体生物学来靶向这些病状的引发和早期进展的关键步骤，以实现效力、选择性、无副作用和持续的生物活性。

因此，本公开的一个方面涵盖了包括在其碳链中具有至少23个碳原子的至少一种极长链多不饱和脂肪酸的组合物的实施例。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以进一步包括药学上可接受的载剂并且被调配成用于递送一定量的所述至少一种极长链多不饱和脂肪酸，所述量有效地减少了接受受试者的组织的病理状态或接受受试者的组织的病理状态的发作。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述病理状态可以是所述接受受试者的组织的衰老或炎症。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以被调配成用于将所述至少一种极长链多不饱和脂肪酸组织局部递送到接受受试者的皮肤。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述病理状态可以是所述接受受试者的神经组织的病理状态。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以进一步包括至少一种营养组分，并且所述组合物可以被调配成用于将所述至少一种极长链多不饱和脂肪酸口服或肠胃外递送到接受受试者。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种极长链多不饱和脂肪酸可以在其碳链中具有约26到约42个碳原子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种极长链多不饱和脂肪酸可以在其碳链中具有32或34个碳原子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述极长链多不饱和脂肪酸可以在其碳链中具有五个或六个具有顺式几何形状的双键。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述极长链多不饱和脂肪酸是 14Z,17Z,20Z,23Z,26Z,29Z)-三十二碳-14,17,20,23,26,29-六烯酸或 (16Z,19Z,22Z,25Z,28Z,31Z)-三十四碳-16,19,22,25,28,31-六烯酸。

本公开的另一个方面涵盖了包括在其碳链中具有至少23个碳原子的至少一种类延长素的组合物的实施例。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以进一步包括药学上可接受的载剂并且可以被调配成用于递送一定量的所述至少一种类延长素，所述量有效地减少了接受受试者的组织的病理状态或延缓了接受受试者的组织中的至少一种衰老作用。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述病理状态可以是所述接受受试者的组织的衰老或炎症。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以被调配成用于将所述至少一种类延长素局部递送到接受受试者的皮肤。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述病理状态可以是所述接受受试者的神经组织的病理状态。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以进一步包括至少一种营养组分，并且所述组合物可以被调配成用于将所述至少一种类延长素口服或肠胃外递送到接受受试者。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种类延长素可以选自由以下组成的组：单羟基化类延长素、二羟基化类延长素、炔基单羟基化类延长素和炔基二羟基化类延长素或其任何组合。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种类延长素可以是多种类延长素的组合，其中所述组合选自由以下组成的组：单羟基化类延长素和二羟基化类延长素；单羟基化类延长素和炔基单羟基化类延长素；单羟基化类延长素和炔基二羟基化类延长素；二羟基化类延长素和炔基单羟基化类延长素；二羟基化类延长素和炔基二羟基化类延长素；单羟基化类延长素、二羟基化类延长素和炔基单羟基化类延长素；单羟基化类延长素、二羟基化类延长素和炔基二羟基化类延长素；和单羟基化类延长素、二羟基化类延长素、炔基单羟基化类延长素和炔基二羟基化类延长素，其中每种类延长素独立地是外消旋混合物、分离的对映体或对映体的组合(其中一种对映体的量大于另一种对映体的量)；并且其中每种二羟基化类延长素独立地是非对映混合物、分离的非对映体或非对映体的组合(其中一种非对映体的量大于另一种非对映体的量)。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以进一步包括在其碳链中具有至少23个碳原子的至少一种极长链多不饱和脂肪酸。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种极长链多不饱和脂肪酸可以在其碳链中具有约26到约42个碳原子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种极长链多不饱和脂肪酸可以在其碳链中具有五个或六个顺式几何形状的双键。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述至少一种极长链多不饱和脂肪酸可以是14Z,17Z,20Z,23Z,26Z,29Z)-三十二碳-14,17,20,23,26,29-六烯酸或 (16Z,19Z,22Z,25Z,28Z,31Z)-三十四碳-16,19,22,25,28,31-六烯酸。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述单羟基化类延长素可以选自由式 G、H、I或J组成的组：

其中：n可以是0到19，并且-CO-OR可以是羧酸基团或其盐或酯，并且其中：如果-CO-OR可以是羧酸基团并且所述化合物G、H、I或J可以是其盐，则所述盐的阳离子可以是药学上可接受的阳离子，并且如果-CO-OR可以是酯，则R可以是烷基基团。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述药学上可接受的阳离子可以是铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述金属阳离子可以是钠、钾、镁、锌或钙阳离子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的对映体G和H，其中所述对映体在带有所述羟基基团的碳处具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的对映体I和J，其中所述对映体在带有所述羟基基团的碳处具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括G或H中的一种对映体，其量超过G或H中的另一种对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括I或J中的一种对映体，其量超过I或J中的另一种对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述单羟基化类延长素可以选自由以下组成的组：(S,14Z,17Z,20Z,23Z,25E,29Z)-27-羟基三十二碳-14,17,20,23,25,29- 六烯酸甲酯(G1)、(S,14Z,17Z,20Z,23Z,25E,29Z)-27-羟基三十二碳-14,17,20,23,25,29-六烯酸钠(G2)、(S,16Z,19Z,22Z,25Z,27E,31Z)-29-羟基三十四碳-16,19,22,25,27,31-六烯酸甲酯(G3)；和(S,16Z,19Z,22Z,25Z,27E,31Z)-29-羟基三十四碳-16,19,22,25,27,31-六烯酸钠(G4)，分别具有下式：

在本公开的本方面的一些实施例中，所述二羟基化类延长素可以选自由式 K、L、M和N组成的组：

其中：m可以是0到19，并且-CO-OR可以是羧酸基团或其盐或酯，

并且其中：如果-CO-OR可以是羧酸基团并且所述化合物K、L、M或N 可以是其盐，则所述盐的阳离子可以是药学上可接受的阳离子，并且如果 -CO-OR可以是酯，则R可以是烷基基团。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述药学上可接受的阳离子可以是铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述金属阳离子可以是钠、钾、镁、锌或钙阳离子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的非对映体K和L，其中所述非对映体在位置n-6具有(S)或(R)手性，并且在位置n-13 具有(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的非对映体M和N，其中所述非对映体在位置n-6具有(S)或(R)手性，并且在位置n-13 具有(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括K或L中的一种非对映体，其量超过K或L中的另一种非对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括M或N中的一种非对映体，其量超过M或N中的另一种非对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述二羟基化类延长素可以选自由以下组成的组：(14Z,17Z,20R,21E,23E,25Z,27S,29Z)-20,27-二羟基三十二碳 -14,17,21,23,25,29-六烯酸甲酯(K1)、(14Z,17Z,20R,21E,23E,25Z,27S,29Z)-20,27- 二羟基三十二碳-14,17,21,23,25,29-六烯酸钠(K2)、 (16Z,19Z,22R,23E,25E,27Z,29S,31Z)-22,29-二羟基三十四碳-16,19,23,25,27,31-六烯酸甲酯(K3)和(16Z,19Z,22R,23E,25E,27Z,29S,31Z)-22,29-二羟基三十四碳 -16,19,23,25,27,31-六烯酸钠(K4)，分别具有下式：

在本公开的本方面的一些实施例中，所述炔基单羟基化类延长素可以选自由式O、P、Q或R组成的组：

其中：m可以是0到19，并且-CO-OR可以是羧酸基团或其盐或酯，并且其中：如果-CO-OR可以是羧酸基团并且所述化合物O、P、Q或R可以是其盐，则所述盐的阳离子可以是药学上可接受的阳离子，并且如果-CO-OR可以是酯，则R可以是烷基基团，并且其中：化合物O和P各自在碳链中具有总共23到 42个碳原子，具有位于n-3、n-12、n-15和n-18开始的位置处的4个顺式碳- 碳双键；具有n-7开始的位置处的反式碳-碳双键和位置n-9开始的碳-碳三键；并且化合物Q和R各自在碳链种具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3、 n-12和n-15开始的3个顺式碳-碳双键，具有n-7开始的位置处的反式碳-碳双键和位置n-9开始的碳-碳三键。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述炔基单羟基化类延长素可以选自由以下组成的组：(S,14Z,17Z,20Z,25E,29Z)-27-羟基三十二碳-14,17,20,25,29-五烯-23-炔酸甲酯(O1)；(S,17Z,20Z,25E,29Z)-27-羟基三十二碳-17,20,25,29-四烯-23- 炔酸钠(O2)；(S,16Z,19Z,22Z,27E,31Z)-29-羟基三十四碳-16,19,22,27,31-五烯-25- 炔酸甲酯(O3)；和(S,16Z,19Z,22Z,27E,31Z)-29-羟基三十四碳-16,19,22,27,31- 五烯-25-炔酸钠(O4)，分别具有下式：

在本公开的本方面的一些实施例中，所述药学上可接受的阳离子可以是铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述金属阳离子可以是钠、钾、镁、锌或钙阳离子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的对映体O和P，其中所述对映体在带有所述羟基基团的碳处具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的对映体Q和R，其中所述对映体在带有所述羟基基团的碳处具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括O或P中的一种对映体，其量超过O或P中的另一种对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括Q或R中的一种对映体，其量超过Q或R中的另一种对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述类延长素可以是选自由式S、T、U或V组成的组的炔基二羟基化类延长素：

其中：m可以是0到19，并且-CO-OR可以是羧酸基团或其盐或酯，并且其中：如果-CO-OR可以是羧酸基团并且所述化合物S、T、U或V可以是其盐，则所述盐的阳离子可以是药学上可接受的阳离子，并且如果-CO-OR可以是酯，则R可以是烷基基团，并且其中：化合物S和T各自在碳链中具有总共23到 42个碳原子，具有位置n-3、n-15和n-18开始的3个顺式碳-碳双键；位置n-9、 n-11开始的2个反式碳-碳双键；和位置n-7开始的碳-碳三键；并且化合物U 和V各自在碳链种具有总共23到42个碳原子，具有位置n-3和n-15开始的2 个顺式碳-碳双键；位置n-9和n-11开始的2个反式碳-碳双键；和位置n-7开始的碳-碳三键。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述药学上可接受的阳离子是铵阳离子、亚胺阳离子或金属阳离子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述金属阳离子是钠、钾、镁、锌或钙阳离子。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述炔基单羟基化类延长素可以选自由以下组成的组：(14Z,17Z,20R,21E,23E,27S,29Z)-20,27-二羟基三十二碳 -14,17,21,23,29-五烯-25-炔酸甲酯(S1)；(14Z,17Z,20R,21E,23E,27S,29Z)-20,27- 二羟基三十二碳-14,17,21,23,29-五烯-25-炔酸钠(S2)； (16Z,19Z,22R,23E,25E,29S,31Z)-22,29-二羟基三十四碳-16,19,23,25,31-五烯-27- 炔酸甲酯(S3)；和(16Z,19Z,22R,23E,25E,29S,31Z)-22,29-二羟基三十四碳 -16,19,23,25,31-五烯-27--炔酸钠(S4)，分别具有下式：

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的非对映体S和T，其中所述非对映体在带有所述羟基基团的碳处具有(S)或(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括等摩尔量的非对映体U和V，其中所述非对映体在位置n-6具有(S)或(R)手性，并且在位置n-13 具有(R)手性。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括S或T中的一种非对映体，其量超过S或T中的另一种非对映体的量。

在本公开的本方面的一些实施例中，所述组合物可以包括U或V中的一种非对映体，其量超过U或V中的另一种非对映体的量。

通过检查以下附图、详细描述和实例，本公开的其它组合物、化合物、方法、特征和优点对于本领域普通技术人员将是或变得显而易见的。所有此些另外的组合物、化合物、方法、特征和优点旨在包含在本说明书内并且包含在本公开的范围内。

实例

实例1

皮层神经元的初代培养物：皮层和海马神经元的初代培养物是从取自孕期确定的二月龄Sprague-Dawley(SD)大鼠(Charles River Lab.，威尔明顿，马萨诸塞州)的18日龄胚胎(E18)收获的。简而言之，对孕期确定的SD大鼠实施安乐死，并在无菌条件下收集胚胎。用镊子在冰上解剖出胚胎脑，并将其放入含有冰冷汉克平衡盐溶液(HBSS)(GIBCO)的皮氏培养皿中。在解剖显微镜下去除脑膜，并用微型弹簧剪将皮层组织切成小块。将这些组织转移到含有胰蛋白酶-EDTA(0.025％HBSS溶液)和DNase I的15ml试管。将试管在 37℃箱中培育15分钟，每5分钟搅拌一次。在用5ml 10％FBS停止胰蛋白酶消化后，将这些组织用火抛光的巴斯德吸管研磨15次。静置细胞团2分钟，并将上清液转移到15ml微量离心管。通过70μm孔径过滤器(Corning细胞滤网) 过滤上清液，并以1000rpm离心5分钟。然后将细胞重悬于含有2％B27 (GIBCO)和2％N₂(GIBCO)补充剂以及0.5mM谷氨酰胺、50U/ml青霉素/ 链霉素的神经基础培养基(GIBCO)中。

使用Neubauer血细胞计数器对细胞进行计数。将1x10⁶个细胞接种到涂有聚D-赖氨酸的12孔细胞培养皿(CORNING)上，并在培育箱中培养(37℃， 5％CO₂)。24小时后第一次更换培养基，然后每三天用新鲜培养基更换一半培养基。结果，获得90％纯度的神经元，如通过III类β微管蛋白、GFAP和Hoechst 33258染色确定。将细胞在培养物中保持约2周，直到它们暴露于未补偿的氧化应激、OGD或NMDA兴奋性毒性。

实例2

抗体：使用了以下抗体：β-连环蛋白(目录号sc-7963，批号K0812)Santa CruzBiotechnology：(使用浓度1:50)；ZO-1(目录号187430，批号1633993A) LifeTechnologies：(使用浓度1:100)；MITF(目录号ab59232，批号GR52475-3) ABCAM：(使用浓度1:250)；RPE65(目录号ab78036，批号3GR254004-1)， ABCAM：(使用浓度1:250)。

实例3

人RPE细胞培养物：将由无眼病理的供体眼睛制备的初代人视网膜色素上皮细胞(RPE)在八代后铺板并转化。将细胞在T75瓶中于含有10％FBS、5％ NCS、MEM-NEAA(ThermoFisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、1x青霉素/链霉素和10ng/ml FGF的MEM培养基中在37℃，5％CO₂，99％相对湿度下培养24-48小时，随后用10μM游离32:6和34:6脂肪酸混合物培育24小时。

图6A和6B描绘了使用特异性标志物ZO-1(闭合小环蛋白-1)、RPE65、 MITF(小眼畸形相关转录因子)和β-连环蛋白对初代人RPE细胞进行的免疫染色以及描绘了在培养物中的不同传代的初代人RPE细胞形态的光学显微镜检查。使ARPE-19细胞在T-75mM瓶中于含有10％FBS的DMEM F-12培养基中生长并保持，并且以5％CO₂的恒定供应在37℃下培育。在暴露前，将6孔板中75-80％铺满的细胞(在DMEM/F12+10％FBS中生长72小时)血清饥饿8 小时。

实例4

RPE细胞暴露于UOS和VLC-PUFA：为了进行细胞活力测定实验，同时用 NPD1(200nM)、32-6、34-6(各3μM)脂肪酸或32-6和34-6二者对hRPE 细胞进行伴随治疗。在整个实验持续时间中，向hRPE培养基补充3μM 32-6 和34-6。在OS诱导前1小时，将15lox-1抑制剂(10μM)加入细胞，并在整个实验中保持不变。细胞用4％PFA固定并用Hoescht染色。

在暴露前，将6孔板中的75-80％铺满的ARPE19细胞(在DMEM/F12+10％ FBS中生长72小时)血清饥饿8小时。血清饥饿的细胞用TNF-α(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)(10ng/ml)和H₂O₂(600μM)治疗以诱导氧化应激，并同时用递增浓度(50-500nM)的VLC-PUFA(C32:6n3和C34:6n3)攻击，其中氧化应激持续16小时(凋亡)以及在检测到凋亡并收获以进行蛋白质分析之前的6小时(蛋白质印迹)。在一些实验中，加入浓度为100nM的DHA和浓度为1μM的15-LOX-1抑制剂PD146176，以治疗应激下的RPE细胞。制作细胞提取物，并通过Bio-Rad(赫拉克勒斯，加利福尼亚州)蛋白试剂调节蛋白质浓度，并将其用于蛋白质印迹分析。

实例5

蛋白质分析：通过蛋白质印迹分析来分析Bcl-2家族蛋白质、SIRT1和抑制素(1型)和Iduna蛋白。简而言之，将20-25μg当量的每种细胞提取物在4-12％凝胶(Promega)上于125V下电泳2小时。用I-blot转印设备将蛋白质转移到硝酸纤维素膜。将膜用Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bid、Bim、SIRT1和抑制素(1 型)(Santa Cruz Biotechnology)特异的一抗和Iduna抗体(Neuro-Mab Lab， UCLA，洛杉矶，加利福尼亚州)在4℃下治疗过夜，并用二抗、山羊抗小鼠lg：辣根过氧化物酶和结合辣根过氧化物酶缀合抗生物素抗体探测45分钟，然后使用ECL试剂盒(Amersham)对蛋白质进行评定。

实例6

免疫细胞化学和细胞凋亡评估：免疫细胞化学测定在8孔玻片室中进行。简而言之，将细胞在4％多聚甲醛(FA)中固定20分钟，并用0.1％Triton X-100 的PBS溶液渗透。在室温下，将非特异性表位在1x PBS中的10％牛血清白蛋白(BSA)中封闭1小时。免疫染色通过将一抗在4℃下培育过夜进行。样品在室温下用以1/250稀释的Alexa Fluor 555缀合二抗(MeridianLife Science Inc.，孟菲斯，田纳西州，美国)染色2小时，并且核用Hoechst(2μM Hoechst 33258) 染色。用Zeiss LSM 510共焦显微镜和Zeiss Axioplan-2反卷积显微镜拍照。

为了评估细胞死亡，将hRPE和ARPE-19细胞用甲醇固定15分钟，用1x PBS洗涤，然后加载2μM Hoechst(溶解于罗克氏溶液(Promega)中)，在成像前再培育15分钟。然后通过使用Zeiss LSM 510共焦显微镜在UV荧光下观察细胞。记录图像并通过使用自动化无偏方法评估细胞凋亡。

实例7

RPE细胞中的类延长素ELV-N32和ELV-N34的LC-MS/MS：将人RPE细胞(ABC细胞p#19)在T75瓶中培养24-48小时，随后用10μM游离32:6和34:6 脂肪酸混合物培育24小时。在血清剥夺24小时后，立即将细胞用1mM H₂O₂培育24小时。使用液-液脂质提取法从收集的细胞培养基提取脂肪酸，随后进行质谱分析。将提取物加载到液相色谱串联质谱仪(LC-MS/MS)上进行分析。分析了脂肪酸、单羟基脂肪酸衍生物(27-羟基脂肪酸C32:6n3和29-羟基脂肪酸34:6n3)以及ELV-N32(20,27-二羟基脂肪酸C32:6n3)和ELV-N34(22,29- 二羟基脂肪酸C34:6n3)。ELV-N32和ELV-N34及其氘标记的衍生物ELV-N32-d2 和ELV-N34-d2通过立体控制化学合成制备，并用于与细胞生成的衍生物匹配。

实例8

光氧化应激：将C57/BI6野生型和AdipoR1基因敲除小鼠在21-23℃下于温度受控房间内12小时:12小时光暗周期圈养。对于光诱导的氧化应激，将小鼠暴露于1小时强光下(10英寸圆形22W荧光灯的8灯阵列；冷白色，FTC8T9/CW；Electric，费尔菲尔德，康涅狄格州；18klux；270μE m-2s)。在光暴露后，通过颈脱位处死动物并摘除眼睛。丢弃角膜、虹膜和晶状体，并将视网膜与视杯的其余部分分开。然后将这些组织快速冷冻。将来自相同基因型的动物的视网膜汇集在一起。对样品进行处理以进行脂质提取和基于 LC-MS/MS的脂质组分析。

实例9

氧糖剥夺(OGD)、NMDA兴奋性毒性或未补偿的氧化应激(UOS)暴露：建立体外氧糖剥夺(OGD)模型。从SD大鼠胚胎培养初代皮层神经元。在体外第12天(DIV)，将细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并在无葡萄糖的神经基础培养基(GIBCO)中培育30分钟。然后将细胞置于模块化培育箱中，并在37℃下于厌氧箱(95％N₂，5％CO₂)中培育90分钟以进行OGD。

在OGD暴露90分钟后，将细胞返回到原始培养基(含有2％B27(GIBCO) 和2％N₂(GIBCO)补充剂以及0.5mM谷氨酰胺、50U/ml青霉素/链霉素的神经基础培养基(GIBCO))并置于常氧箱(37℃，5％CO₂)中2小时。然后，用含ELV-N32或ELV-N34[500nM]的培养基更换培养基，并在常氧箱(37℃， 5％CO₂)中保持12小时，然后对细胞进行采样并使用如先前所述(25-28)的不同方法测定细胞活力。通过加入NMDA(25μM、50μM或100μM浓度)或通过加入TNFα(10ng/ml)和H₂O₂(50μM、100μM或200μM)将培养物中的大脑皮层混合神经元细胞或海马细胞暴露于NMDA或未补偿的氧化应激 (UOS)12小时。12小时后测定在存在ELV-N32、ELV-N34、32:6或34:6的情况下的细胞活力和神经保护。

实例10

Hoechst染色和无偏图像分析：用不含钙或镁的1x杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(GIBCO)洗涤细胞，并使用冰冷的4％多聚甲醛(PFA)固定10 分钟，随后在100％甲醇中培育15分钟。将细胞用1x pH 7.4磷酸盐缓冲盐水 (PBS)(GIBCO)洗涤，并在含有20μMHoechst 33258(Molecular Probes)的 PBS中培育20分钟。然后将细胞用1x PBS洗涤3次，并在4℃下于1x PBS中保存，直到将其成像以进行显微镜检查。

使用Zeiss 510Meta激光共焦显微镜和LSM 510Meta软件从每个孔的中心获取一张4x4小块马赛克图案。将图像导入图像分析软件ImageJ(国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州)，并使用自定义宏进行批处理。将大津自动阈值应用于Hoechst染色核的每个图像，并记录每个检测到的对象的面积。面积<10μm²的对象从分析中排除。为了估计非固缩核的百分比，选择了大小界限值，在此值以上的对象都被假定为非固缩核。基于来自各种细胞群的核大小分布的形状选择固缩大小界限。将结果导出到Microsoft Excel并进行分析。

实例11

钙黄绿素AM-碘化丙啶活/死测定和MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物测定：使用20μL A组份(钙黄绿素-AM)和20μL B组份(碘化丙锭)组合活/死细胞毒性试剂盒(Invitrogen)的两种组分来制备10mL溶液。在12孔细胞培养板的每个孔上，加入50μL本溶液，并将细胞在常氧箱(37℃， 5％CO₂)中培育1-2小时。然后使用OlympusFluoview激光共焦显微镜对细胞成像。将图像导入NIH图像分析软件ImageJ，并分离绿色和红色通道。使用细胞计数器，对图像进行计数，以确定活细胞(绿色)和死核(红色)的数量。将结果导出到Microsoft Excel并进行分析。

MTT测定基于代谢活性细胞将黄色的四唑盐MTT切割成紫色的甲臜晶体。进行所述测定以测量每个治疗组中初代皮层神经元的活力。简而言之，将溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)(Sigma-Aldrich)(5mg/ml，每孔100μL)加入12孔板中的细胞，并在常氧箱(37℃，5％CO₂)中培育2小时。然后，由于活细胞中琥珀酸脱氢酶对染料的作用，将所生成的蓝色甲臜还原产物溶解于1mL异丙醇中，转移到96孔板中的三个复孔中，并使用Molecular ProbesSpectramax微板读取器在490nm处读取其吸光度。结果表示为细胞存活百分比。

实例12

大脑中动脉闭塞和套管植入右侧脑室：将重280-340g的雄性 Sprague-Dawley大鼠(Charles River Lab.，威尔明顿，马萨诸塞州)禁食过夜，但可以自由饮水。在麻醉前10分钟注射硫酸阿托品(0.5mg/kg，i.p.)。在70％一氧化二氮和30％氧气的混合物中用3％异氟烷诱导麻醉。所有大鼠经口插管并机械通气。在通气期间，用泮库溴铵(0.6mg/kg，i.p.)使动物瘫痪。将导管植入右股动脉和静脉以进行血液采样并输注药物。在手术之前和期间对动脉血气、血糖、动脉血压和心脏跳动率进行系列分析。在MCAo之前、期间和之后密切监测直肠(CMA/150温度控制器，CMA/Microdialysis AB，斯德哥尔摩，瑞典)和颅内(颞肌；Omega Engineering，斯坦福德，康涅狄格州)温度。每天监测直肠温度和体重直至处死。

大鼠通过腔内线栓进行右侧大脑中动脉闭塞2小时(MCAo)。简而言之，通过中线颈部切口暴露右侧颈总动脉(CCA)分叉，并且隔离、结扎并解剖颈外动脉的枕动脉分支。仔细隔离颈内动脉(ICA)后，将涂有聚L-赖氨酸的3-0 单股通过ICA推进至MCA，直到感觉到轻度抵抗。用缝合丝线闭合颈部切口，然后使动物恢复。MCAo 2小时后，用相同的麻醉组合麻醉大鼠。重新***温度探针，并小心地去除腔内缝合线。使动物自由饮食饮水7天。

去除缝合线后三十分钟，将脑输注套管植入右侧脑室，以对每只大鼠进行治疗。用3％异氟烷麻醉大鼠，然后将其固定到立体定位设备，其颅骨置于前囟点和人字点之间。使用立体定位坐标将无菌不锈钢套管(5mm长)植入侧脑室 (前囟点尾侧0.2mm，中线侧2mm，硬膜下5mm)。治疗完成后，去除套管。

实例13

治疗：将钠盐(Na)或甲基酯(Me)形式的类延长素(ELV)溶解于人工脑脊髓液(CSF)中，并在2小时的MCAo后1小时施用到右侧脑室中。使用了以下ELV：ELV-N32-Na、ELV-N32-Me、ELV-N34-Na和ELV-N34-Me(5 μg/50μl)或CSF(50μl)。所有治疗均由对治疗组不知情的研究人员进行。

实例14

神经/行为测试：行为测试由对治疗组不知情的观察人员在60分钟时(在 MCAo期间)并且然后在MCAo之后的第1、2、3和7天进行。测试组合由先前用于评定神经功能的各个方面的两个测试组成：(1)姿势反射测试，用于检查动物用尾巴悬挂时的上身姿势；和(2)前肢放置测试，用于检查对视觉、触觉和本体感受刺激的前肢放置反应中的感觉运动整合。神经功能以0-12的标度进行分级(正常评分＝0，最大评分＝12)。在MCAo期间60分钟未表现出高度对侧缺损(评分10-11)的大鼠被排除在进一步研究之外。

实例15

总病灶、核心和半影体积的磁共振成像(MRI)获取和分析：在第7天，使用配备了89mm(ID)接收器线圈的11.7T Bruker Advance 8.9cm水平钻孔仪(Bruker Biospin，Billerica，MA)，对4％多聚甲醛固定的大脑进行高分辨率离体MRI。收集T2加权图像(T2WI)、扩散加权图像(DWI)、3D体积和表观扩散系数(ADC)图。T2和ADC图分别由T2WI和DWI计算得出。使用分层区域分隔法(HRS)来根据T2弛豫和水分迁移(ADC)自动标识核心和半影体积(总病灶＝核心+半影)。通过HRS进行的半影组织确定通过在每个大脑层面使用PWI/DWI减影来确认。半影被定义为PWI与异常ADC之间的差异(扩散-灌注不匹配)(与正常组织相比2STD升高或降低)。

实例16

组织病理学和免疫组织化学：MCAo后7天，用3％的异氟烷、70％的一氧化二氮和余量的氧气使大鼠重新麻醉，并经心灌注0.9％盐水以及随后的4％多聚甲醛。使用MultiBrain RTM技术(NeuroScience Associates，诺克斯维尔，田纳西州)将大脑去除并包埋在明胶基质中。为了量化梗死体积，使用CCD相机 (QICAM Fast 1394，QIMAGING，不列颠哥伦比亚，加拿大)将组织学切片以九个标准冠状层面(前囟点层面：+5.2，+2.7，+1.2，-0.3，-1.3，-1.8，-3.8，- 5.0和-7.3mm)数字化(MCID核心成像软件；InterFocus ImagingLtd.，剑桥，英国)(30)。将脑切片在电动显微镜BX61VS(奥林巴斯，日本)上以10倍物镜成像。由对实验组不知情的研究人员标出皮层和皮层下梗死的区域以及每个切片的左半球和右半球。梗死体积计算为横截面积和相交距离的积分乘积，并针对脑肿胀进行校正。

通过同侧和对侧半球的差异来测量脑水肿。对相邻切片进行免疫组织化学程序，以标识缺血核心和半影中的具体血管和神经元元素。使用了以下抗体：大鼠血脑屏障(SMI-71，BioLegend，圣地亚哥，加利福尼亚州)，用作血管标志物；胶质纤维酸性蛋白(GFAP，Agilent Tech.，圣克拉拉，加利福尼亚州)，用于标记反应性星形胶质细胞；和神经元特异性核蛋白(NeuN， Chemicon/Millipore，比勒利卡，马萨诸塞州)和生物素化抗大鼠免疫球蛋白(IgG)抗体(BioLegend，圣地亚哥，加利福尼亚州)，用于检测BBB分解。在中部病灶层面(前囟点层面-0.3mm)处的皮层和纹状体中对阳性细胞和免疫阳性血管的数量进行计数。数据表示为每个高倍镜视野(放大倍数x40)阳性细胞和血管的数量。

遵循具体实验方案，使用共焦激光显微镜(LSM510，Carl Zeiss Microimaging，尔湾，加利福尼亚州)获得切片的图像。使用Zen软件(Carl Zeiss Microimaging)以212.3μmx 212.3μm的尺寸获取图像。使用ImageJ软件进行图像分析。由对实验条件不知情的研究人员进行分析。计算IgG染色强度，并在相同的层面求平均，如按与先前描述(23，31)针对缺血性损伤所评估。为了计算IgG染色的强度，将图像转换成灰度，并且记录平均灰度值并进行比较。 ImageJ软件将黑色像素指定为数值“0”并将白色像素指定为数值“1”。灰度等级被指定为介于其间的数值，随像素变暗而增大，随像素变暗而减小。因此，为了图的清晰性，IgG强度值表示为平均灰度的倒数。使用相同的设置同时对所有切片进行成像，而无需调整亮度或对比度。在整个对侧和同侧半球以及皮层和纹状体中测量IgG染色强度。

实例16

统计学分析：对于细胞培养物：所有结果均表示为平均值±SEM。来自所有实验的数据均使用单因素ANOVA(方差分析)进行平对，然后进行Sidak 多重比较事后测试。使用Graphpad Prism软件7.02版本进行统计学分析。p<0.05 的值被认为具有统计学显著性。

对于缺血性中风：数值表示为平均值±SD。使用重复测量ANOVA，然后通过Bonferroni程序校正以进行多重比较，从而来进行随时间变化的神经行为评分和跨冠状层面的梗死面积的组间比较。使用双尾学生t测试来进行两组的比较。p<0.05的差异被认为具有统计学显著性。

实例17

混合神经元培养物中的ELV-N32和ELV-N34的结构和立体化学：通过与通过采用我们先前报道的用于NPD1全合成的方法经由立体控制全有机合成制备的化合物的直接比较，确定了新型类延长素ELV-N32和ELV-N34的完整结构和立体化学。通过合成氘标记的衍生物进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS) 分析，进一步确定了这些结构指定。

ELV-N32和ELV-N34通过立体控制全化学合成制备(图4A)。这些具有完全限定的结构和立体化学的合成ELV的可用性使我们能够确定这些混合神经元细胞培养物衍生的ELV中的双键的完整R/S构型及Z/E几何形状。还生成了合成的立体化学纯的氘标记的ELV，并且通过通过LC-MS/MS将其与内源性产生的分子相匹配，从而确认了它们的结构和立体化学。

在OGD应激下的细胞中检测到ELV及其前体(图4B-4K)。使用m/z 499-> 93和499->401MRM跃迁进行ELV-N32检测(图4B)，并且使用m/z 527->93 和527->429跃迁进行ELV-N34检测(图4C)。对于其相应的单羟基前体，使用针对27-羟基-C32:6n3的m/z 483->385(图4B)和针对29-羟基-C34:6n3的 m/z 511->413(图4C)。为了进一步标识，对ELV进行了全裂解，发现与合成产生的标准品有很好的匹配。两种ELV在275nm处的UV最大值与缀合三烯结构一致(图4D和4F)。

在合成ELV与衍生自培养物中的混合神经元细胞的生物发生ELV匹配后，就建立了ELV-N32和ELV-N34的完整结构和立体化学。确定的ELV-N32(类延长素神经保护素样，衍生自32碳ω-3多不饱和脂肪酸(elovanoid neuroprotectin-like,derived from a 32-carbon omega-3polyunsaturated fatty acid)) 和ELV-N34(类延长素神经保护素样，衍生自34碳ω-3多不饱和脂肪酸 (elovanoid neuroprotectin-like,derived from a 34-carbon omega-3polyunsaturated fatty acid))的结构是：ELV-N32：(14Z,17Z,20R,21E,23E,25Z,27S,29Z)-20,27-二羟基三十二碳-14,17,21,23,25,29-六烯酸(图1E)；ELV-N34：(16Z,19Z,22R,23E,25E,27Z,29S,31Z)-22,29-二羟基三十四碳-16,19,23,25,27,31-六烯酸(图4G)。

实例18

ELV在未补偿的氧化应激、氧/糖剥夺或NMDA诱导的兴奋性毒性中的神经保护：在200nM浓度下，钠盐ELV-N32-Na或甲基酯ELV-N32-Me引起对暴露于未补偿的氧化应激下12小时的培养物中的大脑皮层混合神经元细胞的神经保护，所述氧化应激是通过加入10ng/mL的肿瘤坏死因子α(TNFα)和H₂O₂ (50μM、100μM或200μM)诱导的。ELV-N32-Na或ELV-N32-Me对抗凋亡核的剂量依赖性增加(图16B)。

为了确定ELV-N32或ELV-N34对OGD诱导的神经元细胞死亡的神经保护生物活性，将培养物中的大脑皮层混合神经元细胞或培养物中的海马神经元暴露于OGD 90分钟。在再氧合2小时后，以200nM、500nM或1μM浓度加入 ELV-N32或ELV-N34，然后通过Hoechst阳性核计数、或钙黄绿素阳性细胞计数或MTT测定评估细胞活力。在所有不同条件和浓度下，发现与仅暴露于OGD 的细胞相比，ELV-N32-Na、ELV-N32-Me、ELV-N34-Na或ELV-N34-Me引发了神经保护(图15F-15H、15K和15L；图16D-16G和16I)。此外，结果还表明，当在OGD暴露后加入时，前体34:6可以以低至250nM的浓度引发神经保护(补充图1H)。

此外，25μM、50μM或100μM浓度下的NMDA暴露12小时在大脑皮层混合神经元细胞和海马神经元培养物中诱导神经元死亡(图15C-15E和15-15J；图16A、16C和16H)，其可以通过加入200nM或500nM浓度的ELV-N32(Na 或Me)或ELV-N34(Na或Me)来补偿(当与NMDA同时加入时)。当细胞暴露于25μM、50μM或100μM浓度的NMDA时，存在凋亡核的剂量依赖性增加，这在存在ELV-N32-Na或ELV-N32-Me的情况下得到补偿。对于一个实验，测试了通过加入200nM的ELV-N32(Na或Me)以及100nM浓度的NPD1 是否具有协同作用。ELV-N32-Na和ELV-N32-Me均在100μM下12小时的针对神经NMDA兴奋性毒性的神经保护中表现出协同作用(图16A)。但是，除了NPD1之外，ELV-N32-Me还比一起使用的ELV-N32-Na和NPD1更有效。我们还发现，通过加入非竞争性NMDA受体拮抗剂MK801马来酸酯(地佐环平， 10μM)可以克服NMDA兴奋性毒性。将MK801和NPD1一起加入ELV-N32-Na 或ELV-N32-Me改善了仅由ELV-N32-Na或ELV-N32-Me引发的神经保护。此外，500nM浓度的前体34:6减弱了NMDA受体介导的兴奋性毒性(图16H)。

实例19

ELV诱导的缺血性中风后持续的神经改善和保护：局灶性缺血性中风导致感觉运动和认知功能受损，其中70-80％的患者在中风后立即表现出偏瘫。在2 小时的大脑中动脉闭塞(MCAo)后1小时，通过立体定位植入的输注插管将 ELV施用入右侧脑室。MCAo后啮齿动物的功能缺损类似于感觉运动缺损，并且由于任何中风疗法的最终目标都是神经/行为功能的恢复，因此使用感觉运动测试组合的两项测试来检测实验性缺血性中风后的神经缺损。

与脑脊髓液(CSF)组相比，所有ELV治疗动物都以持续方式大大改善了神经评分，直到7天存活期(图20A)。通过本时间段，CSF治疗大鼠继续表现出严重的损伤。T2加权成像(T2WI)显示较大的病灶，在CSF治疗大鼠的缺血核心和半影中观察到T2高强度，与水肿形成一致(图20B和20C)。相反，所有ELV治疗均显著减小了缺血核心和半影体积(从T2WI计算)(图4B)。与CSF治疗组相比，ELV-N32-Na、ELV-N32-Me、ELV-N34-Na和ELV-N34-Me 显著减小了总病灶体积(分别减小60％、56％、99％和91％)(图20B)。在MCAo 后第7天从T2WI计算三维(3D)病灶体积(图20D)。通过类延长素治疗，病灶体积大幅减小，并且大部分仅位于大脑的皮层下区域中(图20D)。

实例20

ELV减弱的细胞损伤、血管完整性和BBB破坏：在第7天，使用免疫组织化学检查牵涉脑梗死的神经元、星形胶质细胞和血管。CSF治疗大鼠表现出涉及皮层和皮层下区域的较大病灶，表征为神经元、胶质和血管元素的损失(图 21A和21B)。

相反，与CSF治疗组相比，ELV治疗大鼠表现出较少梗死，皮层中的NeuN 阳性、GFAP阳性细胞和SMI-71阳性血管的数量增加。NeuN、SMI-71和GFAP 的细胞计数(在图21C的图中描绘的区域)表明，所有ELV治疗均增加了NeuN 阳性神经元和GFAP阳性反应性星形胶质细胞，并保护了血管完整性(图21C)。几乎所有ELV治疗的结果(ELV-N32-Na除外)都是，半影组织内的血管密度 (SMI-71)均增加，并且并行地形成了更密集的富含GFAP的瘢痕组织。因此，血管密度的增强可能促进神经发生和突触发生，进而有助于改善修复并最终改善功能恢复。

最初通过将内源性IgG渗透到脑实质中来测量血脑屏障(BBB)的缺血性破坏(图22A和22B)。MCAo后在同侧半球中观察到IgG染色强度(图22A)。在CSF、ELV-N32-Na和ELV-N32-Me治疗组中，第7天的染色强度相似。相反，用ELV-N34-Na和ELV-N34-Me治疗表现出皮层中的显著更少的IgG染色；染色大部分位于梗死的核心(皮层下)。另外，降低了整个半球的IgG免疫反应性 (总)(图22B)(所有动物都顺利地存活下来)。来自CSF治疗大鼠的大脑表现出涉及右半球的皮层和皮层下区域的全坏死(pannecrotic)病灶(图22C)。相比之下，用ELV化合物治疗的大鼠的梗死大小表现出较不广泛损伤，主要在皮层下区域。与CSF治疗组相比，ELV介导的保护在额顶叶皮层(组织挽救 57-96％)和皮层下(73-75％)是广泛的(图22D)。在所有ELV治疗组中，经脑肿胀校正的总梗死体积大幅减小了55-91％(图22D)。

实例21

RPE细胞、ELV结构和立体化学：通过与通过采用先前报道的用于DHA 衍生的脂质介质神经保护素D1(NPD1；10R,17S)-二羟基二十二碳-(4Z,7Z,11E,13E,15Z,19Z)-六烯酸)全合成的方法经由立体控制全有机合成制备的化合物的直接比较，确定了新型32碳和34碳类延长素ELV-N32和ELV-N34 的完整结构和立体化学。通过合成氘标记的衍生物(ELV-N32-d2和ELV-N34-d2) 进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析，进一步确定了这些结构指定。ELV-N32和ELV-N34通过立体控制全化学合成制备(图3A)。具有完全限定的结构和立体化学的合成材料的可用性使我们能够确定这些人初代RPE细胞衍生的ELV中的双键的完整R/S构型及Z/E几何形状。在图6A和6B中描绘了使用特异性标志物ZO-1(闭合小环蛋白-1)、RPE65、MITF(小眼畸形相关转录因子)和β-连环蛋白对初代人RPE细胞进行的免疫染色的共焦图像以及培养物中的不同传代的光学显微镜形态。

简而言之，将这些细胞培养24-48小时，随后用10μM游离32:6,n6加34:6,n6 培育24小时。然后在血清剥夺24小时后，将细胞用1mM H₂O₂培育24小时。收集培育培养基，提取脂质并将其加载到液相色谱串联质谱仪(LC-MS/MS) 上进行分析。还生成了合成的立体化学纯的氘标记的ELV，并且通过通过 LC-MS/MS将其与内源性产生的分子相匹配，从而确认了它们的结构和立体化学。再与人初代RPE细胞培养基衍生的类延长素匹配后，证实的ELV-N32(来自32Cω-3多不饱和脂肪酸)和ELV-N34(来自34Cω-3多不饱和脂肪酸)的完整结构如下：ELV-N32：(14Z,17Z,20R,21E,23E,25Z,27S,29Z)-20,27-二羟基三十二碳-14,17,21,23,25,29-六烯酸；ELV-N34： (16Z,19Z,22R,23E,25E,27Z,29S,31Z)-22,29-二羟基三十四碳-16,19,23,25,27,31-六烯酸。

在UOS下的RPE细胞中检测到ELV及其前体VLC-PUFA(图3B-3K)。针对ELV-N32使用m/z 499→93和499→401MRM跃迁，并且针对ELV-N34 使用m/z 527→93和527→429跃迁以进行检测。对于相应的前体，针对27- 羟基-32:6n3使用m/z 483→385，并且针对29-羟基-34:6n3使用m/z 511→413。为了进一步标识，对ELV进行了全裂解，发现与标准品有很好的匹配。

实例22

ELV N32和N34引发有效的细胞保护：其表明，游离32:6n3或34:6n3在 ARPE-19细胞中引发针对UOS的保护(图7A和7B)，并且脂氧合酶抑制剂阻断了本作用(图10C)。为了测试32:6n3和34:6n3 VLC-PUFA调节人RPE细胞稳态和存活率的功效，将经历UOS的人RPE细胞用两种VLC-PUFA(各3μM) 和NPD1(200nM)培育16小时。加入H₂O₂(800μM)诱导凋亡(50％细胞死亡)。32:6n3和34:6n3均成功地防止了细胞死亡(分别4％和18％)；NPD1 将凋亡降低至11％(图7K和7L)。

氧化应激刺激通过活化15-脂氧合酶-1(15-LOX-1)引发DHA的酶促氧化，从而导致NPD1¹¹的生物合成。NPD1是一种衍生自DHA的应激反应脂质介质，并且它通过促进直接涉及细胞命运决定的蛋白质的活性和含量的调节，增强了面临氧化应激的RPE细胞中的存活信号转导。

将先前被剥夺血清12小时的hRPE细胞用15脂氧合酶1(15-LOX-1)抑制剂(PD146176)(10μM，1小时)培育，然后用600μM H₂O₂/TNF-α与32:6n3 和34:6n3(各3μM)的混合物的组合沐浴16小时。15-LOX-1抑制剂能使细胞致敏。因此，使用比细胞保护实验中更低的H₂O₂浓度。加入H₂O₂/TNF-α诱导了RPE细胞凋亡，并且用32:6n3和34:6n3的混合物治疗成功地防止了细胞死亡(图71)，表明15-LOX-1不涉及使用人初代RPE细胞的本游离脂肪酸细胞保护机制，。

实例23

32:6n3和34:6n3 VLC-PUFA增强抗凋亡和促存活蛋白表达：在图7A-7K中， 32:6n3和34:6n3上调促存活BcL2和BcL-x_L的表达(图7E和7F)，并下调促凋亡蛋白Bax、Bim和Bid(图7G-7I)。此外，32:6n3和34:6n3的促稳态作用是浓度依赖性的(图7J)。在存在15-LOX-1抑制剂的情况下，去乙酰化酶-1 (SIRT1)的表达增加(图7C)，而抑制剂对Iduna表达的作用不受影响(图7D)。

实例24

ELV N32和N34减弱RPE中的凋亡：测试了ELV是否能够在RPE细胞中抑制UOS诱导的凋亡。如图10C中所示，ELV-N32-Na和ELV-N34-Na在200nM 浓度下模拟了UOS介导的RPE细胞中的凋亡的衰减。有趣的是，两种不同的1 μM浓度的15-LOX-1抑制剂(15-LOX-1抑制剂或PD146176)能够补偿ELV 介导的经历UOS的RPE细胞中的凋亡的抑制(图10C)。UOS诱导的凋亡细胞死亡在RPE细胞中被ELV-N32-Na或ELV-N34-Me以浓度依赖性方式(50-500 nM)减弱。最高的抑制是500nM(钠盐和甲基酯形式)，最低的是50nM(图 10G)。

实例25

ELV上调促稳态和抗凋亡蛋白：探讨了ELV是否增强了促存活和促稳态蛋白在经历UOS的RPE细胞中的表达。图10Aa示出了ELV-N32-Na和ELV-N34-Na以剂量依赖性方式(100-200nM)上调UOS RPE细胞中的去乙酰化酶1(SIRT1)，并且ELV-N32-Na在上调SIRT1方面比ELV-N34-Na更有效。 ELV-N32-Na和ELV-N34-Na以200nM浓度增强了UOS下的RPE细胞中的Iduna表达(图10B)。PD-146176是一种15-LOX-1抑制剂，在经历UOS的 ARPE-19细胞中以1μM浓度阻断了这些作用。抑制素(1型)是一种细胞存活蛋白，在经历UOS的RPE细胞中被ELV-N32和ELV-N34(钠盐和甲基酯形式) 以浓度依赖性方式(100-200nM)上调(图10H)。在图10D中示出，ELV-N32-Na 或ELV-N34-Na增强了抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的丰度。另一方面，ELV-N32 或ELV-N34(钠盐或甲基酯)减少了促凋亡的Bax、Bim和Bid(图10D-10F)。有趣的是，尽管Bcl-2和Bcl-xL被上调(图10D)，但Bax、Bim和Bid被钠盐或甲基酯下调(图10D-10F)。

实例26

AdipoR1调节DHA摄取和ELV形成：RPE细胞维持PRC功能完整性，其消亡涉及多种形式的视网膜变性的发生(图11D)。RPE细胞的一种功能是在 PRC更新期间回收DHA并将其通过光感受器间基质返回到PRC内节段，以进行新的外节段盘膜生物发生³⁷。最近，发现脂联素受体1(AdipoR1)对于光感受器细胞DHA的可获得性是必需的²⁸，并且单个氨基酸突变是常染色体显性色素性视网膜炎的原因³⁸。本受体的遗传消融导致PRC变性并关闭视网膜中的VLC-PUFA合成。与WT(蓝色)相比，AdipoR1敲除(KO)小鼠(红色)的视网膜中的游离C32:6n3和34:6n3的池大小显著减小。另外，未检测到KO(红色)中的ELV-N32和ELV-N34。与野生型(蓝色)不同，单羟基32:6n3和C34:6n3 (分别是ELV-N32和ELV-N34的氢过氧前体的稳定衍生物)缺少在KO(红色) 中可检测的信号(图11B和11C)。

实例27

ELV保护了维持PRC完整性的RPE细胞：通过ELOVL4在光感受器内节段中进行的DHA延长导致VLC-PUFA的生物合成及其在PRC盘状膜内的磷脂酰胆碱的C1位置处的***。然而，在应激条件下，这些VLC-PUFA被PLA1 切割，以合成单羟基和二羟基VLC-PUFA(ELV)(图11A)。小鼠视网膜中的光诱导的氧化应激会触发游离VLC-PUFA(32:6n3和34:6n3)及其单羟基和二羟基衍生物的产生(图11A)。在AdipoR1 KO小鼠中，未发现可检测量的这些分子(图5b、c，红色曲线)。因此，缺少VLC-PUFA前体DHA会导致视网膜变性(图11D)，然后是游离VLC-PUFA ω-3分子物种和ELV生物合成的显著下调。

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