阅读说明：本技术 一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法 (transposon mediated high-efficiency non-virus eukaryotic cell stable transfection method ) 是由 周晓荣 丁晓凌 汪晓莺 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法,其特征在于通过构建了同时表达目的基因和转座酶SB100X的载体系统,在简化实验操作的同时,在真核细胞中提高了转座子介导的稳定转染效率。更具体的,本发明通过构建了单载体SB-2in1-DEST,用GFP为目的基因来测试,使稳定转染GPF的细胞比例比转座子双载体系统提高了约2.5倍,证明本发明的转染方法能显著提高非病毒稳定转染的效率。而且,本发明构建的SB-2in1-DEST载体,可以采用Gateway系统方便地将目的基因克隆进去,简化了克隆所需的技术和时间。(The invention provides a transposon-mediated high-efficiency non-viral eukaryotic cell stable transfection method, which is characterized in that a vector system for simultaneously expressing a target gene and transposase SB100X is constructed, and the transposon-mediated stable transfection efficiency is improved in eukaryotic cells while the experimental operation is simplified.)

一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法

技术领域

本发明属于基因技术领域，具体涉及一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法。

背景技术

真核细胞的稳定转染有病毒和非病毒两种，病毒为载体的方法虽然效率高，但携带的基因大小受到限制，而且因为病毒有潜在的致癌性，是显著的安全隐患。非病毒载体的优点是安全性好，但缺点是效率低。理想的真核细胞转染技术要同时具有求安全性和高效性，但目前的方法都有不足，这是目前真核细胞，特别是原代真核细胞基因修饰的技术瓶颈。

转座子（Transposon）是一类DNA片段，能够在转座酶的作用下，***基因组DNA的其他部位，故也称“跳跃基因”。通过对鲑鱼科一种特殊转座子SB的分析，Ivics等发现该转座子本身携带一个失活的SB转座酶基因，导致该转座子中的DNA片段不能转移到其他部位。通过随机突变，Ivics等重建出具有活性的SB转座酶，该转座酶能使SB转座子被激活，转座子活性被唤醒，故称为睡美人系统（sleeping beauty, SB）。SB转座酶通过识别转座子两端的反向末端重复序列（Inverted terminal repeats, ITR），介导SB转座子被切除下来，***基因组新位置，故类似于“剪切—粘帖”。

目前SB系统已成为基因组学研究的强大工具，利用了SB系统介导的DNA整合来获得稳定表达目的基因的细胞，目前效果最强的SB转座酶是SB100X。而且，除了安全性好，SB系统的另一个特点是可以加载大的基因片段，这也优于病毒载体。如图1所示，以往的SB系统包括两个质粒，一个是编码SB转座酶的质粒，另一个是携带目的基因的质粒，该目的基因两侧有ITR，联合转染两个质粒后，目的基因能高效***到基因组中，形成整合性的稳定转染，该方法安全可靠。但是双载体SB系统的稳定转染效率低，基因克隆所需技术和时间要求高。

如图1所示，SB系统工作原理：目前的SB系统包括两个载体，一个编码SB转座酶（载体1），一个含目的基因和两端的ITR（载体2），共转染细胞后，SB转座酶表达，介导目的基因从载体2上剪切下来，并在SB转座酶的作用下，以整合的方式***基因组新位置，结果目的基因能稳定表达。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法。本发明将最强的SB100X转座酶编码基因和目的基因整合到一个载体上，形成了SB单载体系统，显著提高非病毒稳定转染的效率，另外，采用Gateway系统能方便地将目的基因克隆进去，简化了制备表达载体所需的技术和时间。

本发明的实施例提供一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法，包括如下步骤：

（1）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的DNA序列，以pbluesript载体为模版，合成EF1启动子驱动的SB100X表达载体，即EF1-SB100X载体，测序鉴定序列的准确性；

（2）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的DNA序列，以pbluesript载体为模版，构建CMV启动子驱动的，两端具有ITR序列的目的基因，即ITR-CMV-GFP载体，测序鉴定序列的准确性；

（3）利用PCR技术，借助pbluesript载体的多克隆位点，构建SB-2in1-DEST克隆载体，该载体包含了ITR、EF1-SB100X序列和用于Gateway克隆的序列；

（4）利用Gateway技术，将表达目的基因GFP的Entry克隆和SB-2in1-DEST重组，构建出SB-2in1-GFP载体，测序鉴定序列的准确性。该载体包含了GFP和SB100X的表达序列，转染后可以使SB100X瞬时表达，介导GFP基因整合到基因组DNA，最终达到稳定表达的效果；

（5）取0.1ng的EF1-SB100X、ITR-CMV-GFP或SB-2in1-GFP载体，按照产品说明书转化DH5α感受态菌种；

（6）挑取单个的菌克隆，在3-5ml的含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时，提取质粒，再次测序验证序列的准确性；

（7）验证后的克隆在100ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时，采用PureLinkHiPure Plasmid Midiprep Kit试剂盒（Invitorgen 公司）提取转染级的质粒，测量DNA浓度和纯度；

（8）采用Lonza的Electroporation and Nucleofector在所选择的真核细胞中同时转染两个质粒或SB-2in1-GFP质粒；

（9）转染细胞扩增10天，然后利用流式细胞仪鉴定各组稳定转染的细胞比例。

其中，步骤（2）和 步骤（4）中所用目的基因为GFP基因。

其中，步骤（4）中用Gateway克隆酶Clonase II将目的基因从Entry克隆里直接转移到SB-2in1-DEST中，完成SB-2in1-GFP载体的构建。

其中，步骤（5）中，转化产物分别接种到含100ug/ml氨苄青霉素的琼脂糖平板上，培养16小时。

进一步，接种环取5ul的菌液。

其中，步骤（6）中，1ml菌液用含20%甘油的LB培养基冻存在-80℃。

其中，步骤（7）于无菌环境下操作。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

本发明通过构建了单载体SB-2in1-GFP，使稳定转染GPF的细胞比例比双载体系统提高了约2.5倍，证明本发明的转染方法能显著提高非病毒稳定转染的效率。而且，本发明构建了SB-2in1-DEST载体，可以采用Gateway系统方便地将目的基因克隆进去，简化了克隆所需的技术和时间。

附图说明

图1为本发明背景技术中现有的SB系统的示意图；

图2为本发明中构建的EF1-SB100X载体结构图；

图3为本发明中构建的ITR-CMV-GFP载体结构图；

图4为本发明中构建的SB-2in1-DEST载体结构图；

图5为本发明中构建的SB-2in1-GFP载体结构图；

图6为本发明的中HBEC细胞转染2天和10天后流式细胞仪检测GFP阳性的细胞比例示意图；

图7位本发明中的PC-9细胞转染2天和10天后流式细胞仪检测GFP阳性的细胞比例示意图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明提供了一种转座子介导的高效非病毒真核细胞稳定转染方法，包括如下步骤：

（1）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的SB100X 基因的DNA序列（参考https://www.addgene.org/34879/），以pbluesript载体为模版，合成EF1启动子驱动的SB100X表达载体，即EF1-SB100X载体（图2），测序鉴定序列的准确性。EF1-SB100X载体是用来测试双载体系统的转染效率。

如图2所示，EF1-SB100X载体结构图：该载体是在pbluecript载体的框架上构建。主要包括真核启动子EF1α和SB100X基因的表达序列。下游的BGH polyA序列是转录终止所必须的。该载体还携带氨苄青霉素抗性基因（AmpR）和其启动子（AmpR promoter）。其他序列为载体在原核细胞中扩增所必须的。

（2）利用基因合成技术和服务，根据已经公开发表的ITR序列（参考https://www.addgene.org/26553/），仍以pbluesript载体为模版，构建两端具有ITR序列的绿色荧光蛋白GFP基因，上游是真核细胞强启动子CMV，获得ITR-CMV-GFP载体（图3），测序鉴定序列的准确性。ITR-CMV-GFP是用来测试双载体系统的转染效率，实际使用中可以将GFP基因替换成其他目的基因。

如图3所示，ITR-GFP载体结构图：该载体是在pbluecript载体的框架上构建。主要包括真核启动子CMV、GFP基因的表达序列和两端的ITR序列。下游的BGH polyA序列是转录终止所必须的。该载体还携带氨苄青霉素抗性基因（AmpR）和其启动子（AmpR promoter）。其他序列为载体在原核细胞中扩增所必须的。

（3）利用PCR技术与基因合成技术和服务，借助pbluesript载体的多克隆位点，构建SB-2in1-DEST载体（图4），该载体包含了ITR和EF1-SB100X序列。ITR之间是Gateway克隆需要的序列Gateway cassette（参考https://blog.addgene.org/plasmids-101-gateway-cloning）。利用Gateway克隆酶Clonase II将目的基因快速从入门载体（Entry vector）里直接转移到目标载体SB-2in1-DEST中（Destination vector），用于稳定表达。此外，利用商业化目的基因的入门载体可以大大缩短克隆所需要的时间。

如图4所示，SB-2in1-DEST载体结构图: 该载体是在pbluecript载体的框架上构建。主要包括两部分。第一部分包括上下游的两个ITR序列、真核启动子CMV、Gatewaycassette（attR1-CamR-ccdB-attR2）和下游的PolyA序列，Gateway cassette用于Gateway克隆目的基因，最终获得目的基因的整合与稳定表达。第二部分是EF1α和SB100X基因的表达序列，以及下游的BGH polyA序列，用于瞬时表达SB100X。该载体还携带氨苄青霉素抗性基因（AmpR）和其启动子（AmpR promoter）。其他序列为载体在原核细胞中扩增所必须的。

（4）如前所述，利用Gateway技术，将从Addgene购买的GFP入门载体（pDONR221_EGFP， 参考https://www.addgene.org/25899/）和SB-2in1-DEST重组，构建出SB-2in1-GFP表达载体（图5）。如图所示，SB-2in1-GFP载体包含了ITR-CMV-GFP和EF1-SB100X序列，测序鉴定序列的准确性。此处仍采用GFP作为目的基因是用来测试该方法的转染效率和双质粒系统的差异。实际使用中可以将GFP基因替换成其他目的基因。

如图5所示，SB-2in1-GFP载体结构图：该载体是用上述SB-2in1-DEST载体(Destination vector) 以及一个含GFP基因的入门载体（Entry vector），用Gateway克隆的方法获得的。SB-2in1-GFP载体主要包括两部分。第一部分是真核启动子CMV、GFP表达序列和下游的PolyA序列，以及上下游的ITR序列，用于GFP***基因组DNA并稳定表达。第二部分是EF1α和SB100X基因的表达序列，以及下游的BGH polyA序列，用于瞬时表达SB100X。该载体还携带氨苄青霉素抗性基因（AmpR）和其启动子（AmpR promoter）。其他序列为载体在原核细胞中扩增所必须的。

（5）转化EF1-SB100X、ITR-CMV-GFP或SB-2in1-GFP载体到DH5α感受态菌种。转化产物分别接种到含100ug/ml氨苄青霉素的琼脂糖平板上，培养16小时。接种环取5ul的菌液接种即可，目的是为了挑起单克隆。

（6）挑取单个的菌克隆，在3-5ml的含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时。提取质粒，再次测序验证序列的准确性。将1ml菌液用含20%甘油的LB培养基冻存在-80度长期保存。

（7）验证后的克隆在100ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中扩增16小时，采用PureLinkHiPure Plasmid Midiprep Kit（invitrogen）试剂盒，按照说明书提取转染级的质粒，测量DNA浓度和纯度，注意无菌操作。

（8）采用Lonza的Electroporation and Nucleofector在所选择的真核细胞中同时转染两个质粒或SB-2in1-GFP质粒（详见实施例1和实施例2）。

（9）转染细胞扩增10天，收集10⁶细胞，重悬于200ul PBS缓冲液中，然后利用流式细胞仪鉴定各组稳定转染（表达GFP）的细胞比例。选择该时间点检测是因为只有稳定转染的细胞是GFP阳性，而瞬时转染的细胞在扩增过程中就会丢失GPF的表达。

下面结合具体实施例进一步阐述本发明的转染方法。

实施例1：永生化的人原代支气管上皮细胞（HBEC）的转染和检测

（1-1）收集数期生长的永生化HBEC细胞，重悬于100ul的Lonza SF转染试剂（Lonza），加入转染杯中，细胞浓度为10⁷/ml。加入ITR-CMV-GFP载体和EF1-SB100X（2ug+1ug，比例2:1,质粒浓度大于0.5ug/ml），或SB-2in1-GFP（3ug，质粒浓度大于0.5ug/ml）轻弹转染杯混匀，静置5分钟，对照组只加入2ug ITR-GFP载体。

（1-2）采用Lonza 4D-Nucleofector（Lonza）的CM-130程序进行质粒的电转染。

（1-3）转染后在电转杯中加入500ul培养基，用试剂盒提供的一次性移液管将所有细胞悬液（约600ul）加入含15ml完全培养基（RPMI1640+10%胎牛血清）的T75细胞培养瓶中培养24小时，期间细胞会贴壁。

（1-4）更换新鲜的培养基，以后每三天更换一次，培养10天。期间因为细胞增殖很快，大概需要1：5传代2次。

（1-5）2天和10天后收集10⁶细胞，重悬于200ul PBS缓冲液中，流式细胞仪（BDCalibur）检测GFP阳性细胞比例，比较转染组和对照ITR-CMV-GFP单独转染组的差异。

如图6所示为SB单载体系统诱导高效的HBEC细胞稳定转染：HBEC细胞转染2天和10天后流式细胞仪检测GFP阳性的细胞比例。结果表明瞬时转染的效率在3组虽然都达到90%左右（Day 2），但10天后（Day 10），单独转染ITR-CMV-GFP组的GFP阳性细胞只剩下不到1%；而转染了SB双质粒后仍有约20%的细胞为GFP阳性。与之相比，转染了SB-2in1-GFP单质粒的细胞扩增10天后，GPF阳性率为50%以上，证明显著提高了稳定转染的效率。实施例2：人肺癌细胞株PC-9的转染和检测

（1-1）收集数期生长的PC9细胞，重悬于100ul的Lonza SE转染试剂，加入转染杯中，细胞浓度为10⁷/ml。加入SB-2in1-GFP（3ug）轻弹转染杯混匀，静置5分钟。

（1-2）采用Lonza 4D-Nucleofector的DS-137程序进行质粒的电转染。

（1-3）转染后在电转杯中加入500ul培养基，用试剂盒提供的一次性移液管将所有细胞悬液（约600ul）加入含15ml完全培养基（RPMI1640+10%胎牛血清）的T75细胞培养瓶中培养24小时，期间细胞会贴壁。

（1-4）更换新鲜的培养基，以后每三天更换一次，培养10天。期间因为细胞增殖很快，大概需要1：5传代2次。

（1-5）2天和10天后收集细胞，流式细胞仪检测GFP阳性细胞比例，方法同实施例1。

如图7所示为SB单载体系统诱导高效的PC-9细胞稳定转染：PC-9细胞转染2天和10天后流式细胞仪检测GFP阳性的细胞比例。结果表明，和未转染的细胞（Day 0）相比，瞬时转染效率80%以上（Day 2）。培养扩增10天后（Day 10），GPF阳性率为30%以上，证明了很好的稳定转染效果。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。