一种重组慢病毒载体、重组慢病毒
阅读说明：本技术 一种重组慢病毒载体、重组慢病毒 (recombinant lentivirus vectors and recombinant lentiviruses ) 是由 王磊 张德庆 胡俊 杨国华 于 2019-06-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因工程技术领域,尤其是一种重组慢病毒载体、重组慢病毒,重组慢病毒载体主要以慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro为骨架,在慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro上插入信号肽序列S,并通过重组慢病毒载体将293T细胞转染成慢病毒后感染细胞,并转染成本远远低于脂质体,感染效率高；另外,可以筛选出过表达稳定细胞株,进行无血清悬浮培养,分泌表达目的蛋白,能大大提高蛋白产量,有效降低杂蛋白比例；另外,通过引入His标签,从而有利于表达蛋白的检测和纯化。(The invention relates to the technical field of genetic engineering, in particular to recombinant lentiviral vectors and recombinant lentiviruses, wherein the recombinant lentiviral vectors mainly take lentiviral vectors pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP + Puro as a framework, a signal peptide sequence S is inserted into the lentiviral vectors pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP + Puro, 293T cells are transfected into lentiviruses through the recombinant lentiviral vectors and then infected into the cells, the transfection cost is far lower than that of liposome, the infection efficiency is high, in addition, overexpression stable cell strains can be screened out for serum-free suspension culture, the target protein is secreted and expressed, the protein yield can be greatly improved, the impurity protein proportion is effectively reduced, and in addition, the detection and purification of the expressed protein are facilitated by introducing a His label.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组慢病毒载体、重组慢病毒。
背景技术
慢病毒属逆转录病毒科，是RNA病毒。慢病毒是指以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分；慢病毒载体系统主要是由三种不同质粒构成，分别是转移质粒，辅助质粒和包膜表达质粒，转移质粒主要是用来***外源目的基因，同时也保留了对病毒的整合复制起主要作用的元件，辅助质粒主要包括gag、pol和rev蛋白，gag主要是编码病毒的核心蛋白，pol则主要编码病毒复制过程中所需要的酶，而rev蛋白则参与编码HIV结构蛋白mRNA的核-浆转运过程；信号肽是指分泌蛋白前体N-末端的15～30个氨基酸，在多肽链合成中有其特定的作用，信号肽的功能主要是使正在翻译的核糖体附着到RER膜上，指引蛋白质在细胞内运输；目前，研究采用的信号肽来自表达系统自身的信号序列或外源信号序列，另外，现有质粒转染真核细胞的方法表达蛋白，需要大量提取质粒和培养细胞，工作量大，并且提取蛋白需要裂解细胞后纯化，产量低，杂蛋白多，纯度低。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在提取蛋白裂解细胞杂蛋白多的缺点，而提出的一种重组慢病毒载体、重组慢病毒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种重组慢病毒载体、重组慢病毒，所述重组慢病毒载体主要以慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro为骨架，在慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro上***信号肽序列S，具体的实施过程如下；
步骤1：将载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro进行XbaI和EcoRI双酶切，回收载体骨架部分，设计并合成带有XbaI和EcoRI粘性末端的信号肽序列S；
步骤2：将载体骨架部分用连接酶与信号肽序列S进行连接，获得重组载体，命名为pCDH-S；
步骤3：以重组载体pCDH-S的NotI酶切位点处设计上游引物，***纯化标签6×His序列和终止密码子，得到改装的慢病毒载体pCDH-CMV-HSA-MCS-6His-EF1-GFP+Puro；
步骤4：将6His-OPN片段***到改装的慢病毒载体的XbaI和EcoRI双酶切位点之间，以PstI酶切位点处设计下游引物，以重组载体pCDH-S为模板，通过PCR反应获得含His标签的PCR产物；
步骤5：将含His标签的PCR产物与重组载体pCDH-S分别经NotI和PstI双酶切后连接构建重组慢病毒载体pCDH-CMV-HSA-6′His-OPN-6His-EF1-GFP+Puro；
优选的，所述信号肽序列S为两条带有XbaI和EcoRI酶切位点的互补寡核苷酸链退火而成，S信号肽的氨基酸序列为UCGCAGAUCCUUCGCGG。
优选的，在步骤2中，连接酶与信号肽序列S进行连接过程中，所述连接酶的肽链的氨基酸序列上会复制信号肽序列S的氨基酸序列，而复制的氨基酸序列为AGCGTCTAGGAAGCGGC,且通过氢键***连接酶的肽链上。
优选的，在步骤3中，所述纯化标签6×His的序列为GTTGATCTCAGAAGACGCACTCTC,所述终止密码子为UAG。
优选的，在步骤5中，所述NotI和PstI双酶切开的氨基酸序列分别是CGCAAATGGGCGTAGGCGTG和GGACTGTGGGCGATGTGC,而在断开的氨基酸序列与含His标签的PCR产物的氨基酸的序列重新组合，最终重组成pCDH-CMV-HSA-6′His-OPN-6His-EF1-GFP+Puro。
本发明还提供一种根据权利要求1-5所述的重组慢病毒载体、重组慢病毒的应用，其特征在于，通过上述的重组慢病毒载体可以将293T细胞转染成慢病毒后感染细胞，具体的转染过程如下：
(1)、将重组质粒pCDH-S-PLGF-His，两个辅助质粒pSPAX2和pMD2.G进行大提获得高浓度高纯度无内毒素的质粒；
(2)、以常规方法培养293T细胞，稳定传代后接种细胞至60mm培养皿，细胞数量以培养24小时达85％汇合度为依据；
(3)、将质粒pCDH-S-PLGF-His、pSPAX2和pMD2.G按照4：3：1比例共8μg质粒加到500μL PBS中，轻轻混匀，同时将20μg PEI加到500μL PBS中，涡旋混匀，再将PEI混合液加到质粒中，轻轻混匀后室温放置20min；
(4)、先吸走293T细胞的培养基1mL，再将混合液加到细胞中，过夜培养或待12h后换液，继续培养48h后收获上清，同时再补加新鲜培养基继续培养24h后收获上清。期间在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光情况，确保转染过程正常，转染效率正常。
本发明提出的一种重组慢病毒载体、重组慢病毒，有益效果在于：
1、本发明中通过带信号肽的慢病毒载体和辅助质粒通过PEI转染293T细胞包装成慢病毒后感染细胞，转染成本远远低于脂质体，感染效率高；另外，可以筛选出过表达稳定细胞株，进行无血清悬浮培养，分泌表达目的蛋白，能大大提高蛋白产量，有效降低杂蛋白比例；
2、本发明通过引入His标签有利于表达蛋白的检测和纯化，有效解决了原有慢病毒载体没有标签，表达蛋白不利于纯化的问题。
附图说明
图1为本发明提出的一种重组慢病毒载体、重组慢病毒的碱基序列表格图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1，一种重组慢病毒载体、重组慢病毒，重组慢病毒载体主要以慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro为骨架，在慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro上***信号肽序列S，具体的实施过程如下；
步骤1：将载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro进行XbaI和EcoRI双酶切，回收载体骨架部分，设计并合成带有XbaI和EcoRI粘性末端的信号肽序列S，信号肽序列S为两条带有XbaI和EcoRI酶切位点的互补寡核苷酸链退火而成，S信号肽的氨基酸序列为UCGCAGAUCCUUCGCGG；
步骤2：将载体骨架部分用连接酶与信号肽序列S进行连接，获得重组载体，命名为pCDH-S，连接酶与信号肽序列S进行连接过程中，连接酶的肽链的氨基酸序列上会复制信号肽序列S的氨基酸序列，而复制的氨基酸序列为AGCGTCTAGGAAGCGGC,且通过氢键***连接酶的肽链上；
步骤3：以重组载体pCDH-S的NotI酶切位点处设计上游引物，***纯化标签6×His序列和终止密码子，得到改装的慢病毒载体pCDH-CMV-HSA-MCS-6His-EF1-GFP+Puro，纯化标签6×His的序列为GTTGATCTCAGAAGACGCACTCTC,终止密码子为UAG；
步骤4：将6His-OPN片段***到改装的慢病毒载体的XbaI和EcoRI双酶切位点之间，以PstI酶切位点处设计下游引物，以重组载体pCDH-S为模板，通过PCR反应获得含His标签的PCR产物；
步骤5：将含His标签的PCR产物与重组载体pCDH-S分别经NotI和PstI双酶切后连接构建重组慢病毒载体pCDH-CMV-HSA-6′His-OPN-6His-EF1-GFP+Puro；NotI和PstI双酶切开的氨基酸序列分别是CGCAAATGGGCGTAGGCGTG和GGACTGTGGGCGATGTGC,而在断开的氨基酸序列与含His标签的PCR产物的氨基酸的序列重新组合，最终重组成pCDH-CMV-HSA-6′His-OPN-6His-EF1-GFP+Puro。
本发明还提供一种根据权利要求1-5的重组慢病毒载体、重组慢病毒的应用，其特征在于，通过上述的重组慢病毒载体可以将293T细胞转染成慢病毒后感染细胞，具体的转染过程如下：
(1)、将重组质粒pCDH-S-PLGF-His，两个辅助质粒pSPAX2和pMD2.G进行大提获得高浓度高纯度无内毒素的质粒；
(2)、以常规方法培养293T细胞，稳定传代后接种细胞至60mm培养皿，细胞数量以培养24小时达85％汇合度为依据；
(3)、将质粒pCDH-S-PLGF-His、pSPAX2和pMD2.G按照4：3：1比例共8μg质粒加到500μL PBS中，轻轻混匀，同时将20μg PEI加到500μL PBS中，涡旋混匀，再将PEI混合液加到质粒中，轻轻混匀后室温放置20min；
(4)、先吸走293T细胞的培养基1mL，再将混合液加到细胞中，过夜培养或待12h后换液，继续培养48h后收获上清，同时再补加新鲜培养基继续培养24h后收获上清。期间在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光情况，确保转染过程正常，转染效率正常。
在293T细胞转染成慢病毒感染细胞过程中，需要对pCDH-S-PEDF-His重组质粒的构建，主要以以重组慢病毒载体pCDH-S-His为骨架，经EcoRI和NotI双酶切回收骨架部分，并设计引物扩增PEDF基因，上游引物的序列为5’-TTTGAATTCTATGCAGGCCCTGGTGCTA-3，下游引物的序列为5’-TTTGCGGCCGCGGGGCCCCTGGGGTCCAGAA-3’(SEQ ID NO.8)；具体的实施步骤如下：
首先，以人cDNA为模板，通过PCR反应获得PEDF基因；
然后，扩增程序为预变性95摄氏度，持续4分钟，再变性95摄氏度，持续30秒；
再退火55摄氏度，持续30秒，继续延伸72摄氏度，持续1分钟30秒，循环数35个，延伸72摄氏度，持续10分钟；
最后，将PCR产物纯化后用EcoRI和NotI双酶切，跑胶回收，再与酶切回收的pCDH-S-His载体骨架部分用连接酶进行连接，再转化大肠杆菌，挑取单克隆菌落培养后提取质粒并测序验证。最终获得重组质粒pCDH-S-PEDF-His。
本发明中通过带信号肽的慢病毒载体和辅助质粒通过PEI转染293T细胞包装成慢病毒后感染细胞，转染成本远远低于脂质体，感染效率高；另外，可以筛选出过表达稳定细胞株，进行无血清悬浮培养，分泌表达目的蛋白，能大大提高蛋白产量，有效降低杂蛋白比例；此外，引入His标签有利于表达蛋白的检测和纯化。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。