阅读说明：本技术 一种甘蔗渣预处理改善酶解糖化效果的方法 (Method for improving enzymolysis saccharification effect by pretreating bagasse ) 是由 王朝宇 迟雪文 毕艳红 张睿 杨荣玲 刁怡涵 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种甘蔗渣预处理改善酶解糖化效果的方法,包括如下步骤：称取甘蔗渣,加入低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvent,DES)进行预处理,反应结束后对其进行固液分离；将分离的固体中加入KOH溶液进行预处理,反应结束后对其进行固液分离,分别收集固体和液体部分；将固体部分洗涤至中性即得到预处理后的甘蔗渣,进行酶解糖化,测定酶解液中的葡萄糖浓度。本发明甘蔗渣清洁高效预处理的方法可以改善纤维素酶水解效率低的问题,从而减少纤维素酶的用量,提高还原糖的转化效率,为甘蔗渣的综合利用提供一定的理论依据。(The invention discloses a method for improving enzymatic saccharification effect by bagasse pretreatment, which comprises the following steps of weighing bagasse, adding a Deep Eutectic Solvent (DES) for pretreatment, carrying out solid-liquid separation after the reaction is finished, adding a KOH solution into the separated solid for pretreatment, carrying out solid-liquid separation after the reaction is finished, respectively collecting solid and liquid parts, washing the solid part to be neutral to obtain the pretreated bagasse, carrying out enzymatic saccharification, and determining the glucose concentration in an enzymatic hydrolysate.)

一种甘蔗渣预处理改善酶解糖化效果的方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种甘蔗渣预处理改善酶解糖化效果的方法。

背景技术

能源是人类经济和社会可持续发展的物质基础，随着经济的快速发展，人们生活水平的不断提高，日益增长的能源需求与日益枯竭的不可再生资源的矛盾逐渐突出。与此同时，化石能源的开发与利用过程中造成的生态破坏与环境污染等问题也逐渐突现出来，温室气体的大量排放对全球气候产生了巨大影响，各种自然灾害的频发使得生态安全和人类社会的可持续发展受到严重的挑战。生物质能源作为可再生能源的一类典型代表，在生物液体燃料、生物质发电等方面在欧美等发达国家已具有相对成熟的发展体系。因此，若能将木质纤维生物质原料进行加工预处理，生产高附加值的生物质燃料或大宗化学品，会在一定程度上缓解全球的能源危机，减轻化石能源的压力。

甘蔗是常见于热带及亚热带地区的一年生或多年生的草本植物，富含糖分、维生素和矿物质等，中国是继巴西、印度后世界第三大甘蔗种植基地，目前我国甘蔗主产区分布在广西、云南、广东、海南、福建、四川、江西等地。甘蔗产量高达80公吨/公顷，比一般作物高出许多，因此可以把甘蔗看作是富含太阳能的高效储存器。它是一种重要的糖料作物，所生产的蔗糖占全球食糖总量的80％。我国是蔗糖的消费大国，目前我国食糖总产仅次于巴西和印度，其中蔗糖是我国食糖的主要来源，占食糖总量的92％以上，甘蔗之于我国糖业具有举足轻重的地位。而甘蔗渣是一种重要的制糖副产物，是甘蔗在糖厂经过压榨机或者渗透法把甘蔗汁提取后剩下的甘蔗茎的纤维性残渣，据统计糖厂每生产1吨蔗糖就会产生2-3吨的蔗渣。甘蔗渣具有复杂的组织结构，主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，淀粉和可溶性糖含量较少，其中纤维素含量最高，大约占40-45％，半纤维素仅次于纤维素，大约在30-35％，木质素的含量约为20-30％。蔗髓的组分与甘蔗渣含量相似，而蔗髓的灰分含量更高。目前甘蔗渣主要应用在生物发电、制浆造纸、饲料、沼气、燃料乙醇以及高性能材料等方面。但从碳水化合物并将其转化为单糖，再次发酵为乙醇等是一个复杂的过程，以往文献中采用碱处理甘蔗渣的条件都较为剧烈，这会对仪器设备造成一定的负担。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种甘蔗渣预处理改善酶解糖化效果的方法，本发明甘蔗渣清洁高效预处理的方法可以改善纤维素酶水解效率低的问题，从而减少纤维素酶的用量，提高还原糖的转化效率。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种甘蔗渣预处理改善酶解糖化效果的方法，包括如下步骤：

(1)称取甘蔗渣，加入的DES进行预处理，反应结束后对其进行固液分离分别收集固体和液体部分；

(2)向步骤(1)分离的固体中加入KOH溶液进行预处理，反应结束后对其进行固液分离；

(3)将步骤(2)分离的固体部分洗涤至中性即得到预处理后的甘蔗渣，进行酶解糖化，测定酶解液中的葡萄糖浓度。

其中，所述甘蔗渣为甘蔗提取蔗糖后的固体残渣部分。本发明使用的甘蔗渣购买于Futaste Co.Ltd.(China)或者其他市售公司均可，或者提取方法按照文献：王允圃,李积华,刘玉环,等.甘蔗渣综合利用技术的最新进展[J].中国农学通报,2010,26(16):370-375.；效果均一致。

其中，所述DES由氯化胆碱：乳酸按摩尔比1：1-5制备而成。作为优选，所述DES由氯化胆碱：乳酸按摩尔比1：2制备而成。

进一步地，所述DES由氯化胆碱和乳酸加入反应瓶中在60-80℃下磁力搅拌直至混合物变为无色澄清液体，然后转移至真空干燥箱中，用P₂O₅充分干燥后备用。

其中，所述DES预处理甘蔗渣的条件为：预处理时间为0.5-6h，预处理固液比1:8-1:30g/mL，预处理温度为60-130℃。

其中，所述KOH溶液的质量分数为5-40wt.％。

其中，所述KOH溶液进行预处理条件为：处理时间0.5-5h，处理固液比为1:6-1:15g/mL，处理温度为50-100℃。

对KOH预处理后的甘蔗渣进行固液分离，分别收集固体和液体部分，用自来水将固体残渣洗至中性，然后进行酶解糖化。

进一步地，所述酶解糖化为将预处理后的甘蔗渣，加入柠檬酸缓冲溶液调节pH，加入叠氮化钠溶液，然后加入纤维素酶，反应后采用HPLC测定酶解液中的葡萄糖浓度。

作为优选，所述纤维素酶加入量为3-30FPU/g-底物(即预处理后的甘蔗渣)，固体负载量为2-20wt.％，在pH 4.8，温度50℃下酶解2-96h。如酶水解反应体积为20mL，以5wt.％的固体负载量加入1g预处理后的甘蔗渣(以绝干计)，反应总体积是20mL×5％的固体负载量(固含量)为1g绝干的重量。

其中，本发明中纤维素酶活是以DNS为显色剂，以滤纸为底物表征纤维素酶的酶活。根据IUPAC标准，滤纸酶活(Filter paper activity，FPA)的定义为：1g固体酶(或1mL液体酶)，在50℃和pH 4.8的条件下，每小时由滤纸底物生成1μmol葡萄糖所需的酶用量定义为一个酶活力单位，以U/g(或U/mL)来表示。

所述酶解糖化过程结束后，取一定量酶解液进行高效液相(HPLC)检测，测定其中的还原糖含量。其中，HPLC的检测条件如表1所示。

表1液相色谱检测条件

本发明所述的甘蔗渣预处理改善酶解糖化效果的方法中产生的液体(步骤(1)和(2)收集的黑色液体)在制作钾肥、木质素基肥料和复合肥料中的应用。

本发明中采用DES和KOH预处理可以脱除包裹在纤维素表面的木质素和半纤维素，破坏了纤维素高度有序紧密排列的区域，使纤维素表面产生气孔，暴露更多的纤维素，增加孔隙率和孔隙度，提高纤维素酶对纤维素的可及性，从而促进酶解糖化的效率。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明采用DES及KOH预处理甘蔗渣，破坏了木质素、半纤维素对纤维素的包裹，去除木质素，降解半纤维素，改变纤维素的晶体结构，提高纤维素的可及度与疏松性，促进纤维素酶与底物的接触，进而提高纤维素酶水解得率和还原糖得率。甘蔗渣在本发明的预处理及酶水解条件下，确定DES预处理的最优条件为：DES种类为氯化胆碱：乳酸(1:2)，反应温度90℃，反应时间1h，固液比为1:10；KOH预处理的最优条件为：KOH用量15wt.％，反应温度90℃，反应时间2h，固液比为1:10。研究发现，10％固含量，20FPU/g-底物条件下，葡萄糖浓度最高为47.6±1.1g/L，木糖浓度为21.6±0.5g/L；5％固含量，20FPU/g-底物条件下，葡萄糖得率最高为87.4±0.7％，总糖得率最高为81.6±1.1％。且KOH预处理后的黑液中富含K+可以用来制作钾肥、木质素基肥料及复合肥，减少了废液的排放；开发利用甘蔗渣的能源属性，不仅可以减少农业废弃物的排放，而且符合国际寻求可再生能源的需求，并为甘蔗渣的综合利用提供一定的理论依据。

本发明采用低共熔溶剂DES和KOH溶液进行预处理，反应条件温和，减少对仪器设备的损伤，有利于工业化生产应用。

附图说明

图1为甘蔗渣预处理前后的扫描电镜图谱(SEM)；

图2为甘蔗渣预处理前后的傅里叶红外光谱(FTIR)；

图3为甘蔗渣预处理前后的及X射线衍射图谱(XRD)；

其中，a为甘蔗渣原料；b为实施例2中15wt.％KOH预处理后的甘蔗渣；

观察SEM、FTIR、XRD图谱可以发现，与未经预处理的甘蔗渣原料相比，预处理后的甘蔗渣结晶度增大，孔隙率与孔隙度增大，增加了纤维素酶对纤维素的可及性，从而提高酶解糖化的效率。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。

以下实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中甘蔗提取蔗糖后的固体残渣部分，所用甘蔗渣均以绝干物料计；DES是由氯化胆碱和乳酸加入反应瓶中在80℃下磁力搅拌直至混合物变为无色澄清液体而成，然后转移至真空干燥箱中，用P₂O₅充分干燥后备用。

实施例1

称取30.0±0.1g甘蔗渣，加入300.0±0.1g的DES(氯化胆碱：乳酸(1：2))在90℃下预处理1h，反应结束后对其进行固液分离，然后取固体再加入300.0±0.1mL的质量分数为10％的KOH溶液，在90℃下预处理2h，反应结束后对其进行固液分离；采用自来水对固体部分洗涤至中性，进行酶解糖化实验。酶水解反应体积为20mL，以5wt.％的固体负载量加入1g预处理后的甘蔗渣(以绝干计)，加入0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液调节酶水解的pH为4.8，加入0.2mL的叠氮化钠溶液(0.02g/mL)，然后加入纤维素酶，酶用量为20FPU/g-底物，以120rpm的转速在50℃下反应72h。然后采用HPLC测定酶解液中的葡萄糖浓度。结果表明酶解液中葡萄糖浓度为21.2g/L，木糖浓度为10.2g/L，最终所得总糖得率为76.3％。

实施例2

称取30.0±0.1g甘蔗渣，加入300.0±0.1g的DES(氯化胆碱：乳酸(1：2))在90℃下预处理1h，反应结束后对其进行固液分离，然后再加入300.0±0.1mL的质量分数为15％的KOH溶液，在90℃下预处理2h，反应结束后对其进行固液分离。采用自来水对固体部分洗涤至中性，进行酶解糖化实验。酶水解反应体积为20mL，以5wt.％的固体负载量加入1g预处理后的甘蔗渣(以绝干计)，加入0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液调节酶水解的pH为4.8，加入0.2mL的叠氮化钠溶液(0.02g/mL)，然后加入纤维素酶，酶用量为20FPU/g-底物，以120rpm的转速在50℃下反应72h。然后采用HPLC测定酶解液中的葡萄糖浓度。结果表明酶解液中葡萄糖浓度为24.4g/L，木糖浓度为11.0g/L，最终所得总糖得率为80.6％。

实施例3

称取30.0±0.1g甘蔗渣，加入300.0±0.1g的DES(氯化胆碱：乳酸(1：2))在90℃下预处理1h，反应结束后对其进行固液分离，然后再加入300.0±0.1mL的质量分数为15％的KOH溶液，在70℃下预处理2h，反应结束后对其进行固液分离。采用自来水对固体部分洗涤至中性，进行酶解糖化实验。酶水解反应体积为20mL，以5wt.％的固体负载量加入1g预处理后的甘蔗渣(以绝干计)，加入0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液调节酶水解的pH为4.8，加入0.2mL的叠氮化钠溶液(0.02g/mL)，然后加入纤维素酶，酶用量为20FPU/g-底物，以120rpm的转速在50℃下反应72h。然后采用HPLC测定酶解液中的葡萄糖浓度。结果表明酶解液中葡萄糖浓度为21.0g/L，木糖浓度为9.5g/L，最终所得总糖得率为74.7％。

实施例4

称取30.0±0.1g甘蔗渣，加入300.0±0.1g的DES(氯化胆碱：乳酸(1：2))在90℃下预处理1h，反应结束后对其进行固液分离，然后再加入300.0±0.1mL的质量分数为15％的KOH溶液，在100℃下预处理2h，反应结束后对其进行固液分离。采用自来水对固体部分洗涤至中性，进行酶解糖化实验。酶水解反应体积为20mL，以5wt.％的固体负载量加入1g预处理后的甘蔗渣(以绝干计)，加入0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液调节酶水解的pH为4.8，加入0.2mL的叠氮化钠溶液(0.02g/mL)，然后加入纤维素酶，酶用量为20FPU/g-底物，以120rpm的转速在50℃下反应72h。然后采用HPLC测定酶解液中的葡萄糖浓度。结果表明酶解液中葡萄糖浓度为24.3g/L，木糖浓度为10.4g/L，最终所得总糖得率为76.0％。

实施例5

称取30.0±0.1g甘蔗渣，加入300.0±0.1g的DES(氯化胆碱：乳酸(1：2))在90℃下预处理1h，反应结束后对其进行固液分离，然后再加入300.0±0.1mL的质量分数为15％的KOH溶液，在90℃下预处理1h，反应结束后对其进行固液分离。采用自来水对固体部分洗涤至中性，进行酶解糖化实验。酶水解反应体积为20mL，以5wt.％的固体负载量加入1g预处理后的甘蔗渣(以绝干计)，加入0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液调节酶水解的pH为4.8，加入0.2mL的叠氮化钠溶液(0.02g/mL)，然后加入纤维素酶，酶用量为20FPU/g-底物，以120rpm的转速在50℃下反应72h。然后采用HPLC测定酶解液中的葡萄糖浓度。结果表明酶解液中葡萄糖浓度为21.6g/L，木糖浓度为9.7g/L，最终所得总糖得率为75.1％。

实施例6

称取30.0±0.1g甘蔗渣，加入300.0±0.1g的DES(氯化胆碱：乳酸(1：2))在90℃下预处理1h，反应结束后对其进行固液分离，然后再加入300.0±0.1mL的质量分数为15％的KOH溶液，在90℃下预处理2h，反应结束后对其进行固液分离。采用自来水对固体部分洗涤至中性，进行酶解糖化实验。酶水解反应体积为20mL，以5wt.％的固体负载量加入1g预处理后的甘蔗渣(以绝干计)，加入0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液调节酶水解的pH为4.8，加入0.2mL的叠氮化钠溶液(0.02g/mL)，然后加入纤维素酶，酶用量为5FPU/g-底物，以120rpm的转速在50℃下反应72h。然后采用HPLC测定酶解液中的葡萄糖浓度。结果表明酶解液中葡萄糖浓度为18.4g/L，木糖浓度为7.5g/L，最终所得总糖得率为55.1％。

实施例7

称取30.0±0.1g甘蔗渣，加入300.0±0.1g的DES(氯化胆碱：乳酸(1：2))在90℃下预处理1h，反应结束后对其进行固液分离，然后再加入300.0±0.1mL的质量分数为15％的KOH溶液，在90℃下预处理2h，反应结束后对其进行固液分离。采用自来水对固体部分洗涤至中性，进行酶解糖化实验。酶水解反应体积为20mL，以2wt.％的固体负载量加入0.4g预处理后的甘蔗渣(以绝干计)，加入0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液调节酶水解的pH为4.8，加入0.2mL的叠氮化钠溶液(0.02g/mL)，然后加入纤维素酶，酶用量为20FPU/g-底物，以120rpm的转速在50℃下反应72h。然后采用HPLC测定酶解液中的葡萄糖浓度。结果表明酶解液中葡萄糖浓度为9.7g/L，木糖浓度为4.3g/L，最终所得总糖得率为74.2％。

实施例8

称取30.0±0.1g甘蔗渣，加入300.0±0.1g的DES(氯化胆碱：乳酸(1：2))在90℃下预处理1h，反应结束后对其进行固液分离，然后再加入300.0±0.1mL的质量分数为15％的KOH溶液，在90℃下预处理2h，反应结束后对其进行固液分离。采用自来水对固体部分洗涤至中性，进行酶解糖化实验。酶水解反应体积为20mL，以10wt.％的固体负载量加入2g预处理后的甘蔗渣(以绝干计)，加入0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液调节酶水解的pH为4.8，加入0.2mL的叠氮化钠溶液(0.02g/mL)，然后加入纤维素酶，酶用量为20FPU/g-底物，以120rpm的转速在50℃下反应72h。然后采用HPLC测定酶解液中的葡萄糖浓度。结果表明酶解液中葡萄糖浓度为47.6g/L，木糖浓度为21.6g/L，最终所得总糖得率为75.6％。

实施例9

实施例9与实施例2方法相同，不同之处在于：采用质量分数为20％的KOH溶液，所得葡萄糖得率为76.2％。

实施例10

实施例10与实施例2方法相同，不同之处在于：采用质量分数为40％的KOH溶液，所得葡萄糖得率为72.8％。

实施例11

实施例11与实施例2方法相同，不同之处在于：DES由氯化胆碱：乳酸按摩尔比1：1制备而成；DES预处理甘蔗渣的条件为时间为6h，预处理固液比1:8g/mL，预处理温度为60℃；KOH溶液进行预处理条件为：处理时间30min，处理固液比为1:6g/mL，处理温度为100℃；酶水解反应体积为20mL，以20wt.％的固体负载量加入4g预处理后的甘蔗渣(以绝干计)；纤维素酶加入量为3FPU/g-底物，固体负载量为2wt.％，在pH 4.8，温度50℃下酶解2h。

实施例12

实施例12与实施例2方法相同，不同之处在于：DES由氯化胆碱：乳酸按摩尔比1：5制备而成；DES预处理甘蔗渣的条件为时间为0.5h，预处理固液比1:30g/mL，预处理温度为130℃；KOH溶液进行预处理条件为：处理时间180min，处理固液比为1:18g/mL，处理温度为50℃；纤维素酶加入量为30FPU/g-底物，固体负载量为20wt.％，在pH 4.8，温度50℃下酶解96h。

实施例13

实施例13为对比例，实施例13与实施例2制备相同，不同之处在于：酶水解反应体积为20mL，以5wt.％的固体负载量加入1g未处理的甘蔗渣原料(以绝干计)，加入0.05mol/L柠檬酸缓冲溶液调节pH为4.8，加入0.2mL的叠氮化钠溶液(0.02g/mL)，然后加入纤维素酶，酶用量为20FPU/g-底物，以120rpm的转速在50℃下反应72h。然后采用HPLC测定酶解液中的葡萄糖浓度。结果表明酶解液中葡萄糖浓度为3.4g/L，木糖浓度为1.0g/L，最终所得总糖得率为14.4％。

对比最优条件的实施例2可发现，实施例13与实施例2对相同的甘蔗渣原料进行酶水解条件相同，但实施例13直接对未经预处理的甘蔗渣原料进行酶解糖化，而实施例2在酶水解前对甘蔗渣采用DES和15wt.％的KOH用量在90℃下以1:10的固液比预处理了2h，最终酶解液中葡萄糖浓度比实施例13高了21g/L，木糖浓度高出10g/L，实施例2最后所得总糖得率比实施例13高66.2％。

观察图1，图2及图3可以发现，与未经预处理的甘蔗渣原料相比，预处理后的甘蔗渣结晶度增大，孔隙率与孔隙度增大，从而增加了纤维素酶对纤维素的可及性，提高酶解糖化的效率。实施例2为本发明最优处理条件，实施例1-2是KOH用量逐渐增加，采用相同的酶水解条件证明了KOH用量对糖得率和糖浓度的影响，KOH溶液的质量分数为5-30wt.％均有好的效果，但是KOH用量过大会消耗成本，且用量太大会导致过水解，15wt.％KOH预处理效果最好；实施例2-4对比了温度对糖得率和糖浓度的影响，KOH溶液在90℃下预处理2h糖得率最高；实施例2，5是对比了不同时间对糖得率和糖浓度的影响，实施例2，6对比了酶水解不同酶用量对糖得率和糖浓度的影响；实施例2，7，8对比了酶水解不同固含量条件下对糖得率和糖浓度的影响。

本发明中采用DES及KOH的结合处理。单独两种方法都可以脱除木质素提高酶解糖化后的糖得率，但是单独进行DES处理木质素脱除率不高，效果不明显，而单独KOH预处理效果一般，同时需用的KOH用量较大，反应条件剧烈；二者结合协同增效明显，DES是绿色溶剂，先用DES处理脱除一部分木素，然后再加上KOH的处理，还可以减少KOH的用量达到同样的效果。

实施例14

将实施例4中的步骤(1)和(2)中进行固液分离收集液体部分作为原料进行钾肥、木质素基肥料或复合肥料制备。