一步法合成莱鲍迪苷m的方法

文档序号：1574564 发布日期：2020-01-31 浏览：36次 >En<

阅读说明：本技术 一步法合成莱鲍迪苷m的方法 (method for synthesizing rebaudioside M ) 是由马媛媛汪振洋宋浩洪解放来庆英刘文斌张敏华刘伟于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一步法合成莱胞迪苷M的方法,包括如下步骤：(1)将能够分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1和能够分泌表达糖基转移酶UGT2的重组菌2混合接种在含有甲醇的培养基中培养；(2)向步骤(1)获得的培养液中加入底物莱鲍迪苷A,加入尿苷二磷酸葡萄糖,硫酸镁或氯化镁,甲醇,反应,得到莱胞迪苷M；本发明克服了现有技术催化需要破胞、分离纯化或者加入细胞膜通透剂等繁琐步骤；本发明的原料莱鲍迪苷A相对于现有技术的价格昂贵莱鲍迪苷D做原料,价格低廉。提高重组菌糖苷转移酶的产量及热稳定性,实现直接用价值低的RebA为底物混菌催化一步法获得RebM。提高催化效率,降低酶纯化所需费用及底物的费用。(The invention discloses a step method for synthesizing rebaudioside M, which comprises the following steps of (1) mixing and inoculating a recombinant bacterium 1 capable of secreting and expressing glycosyltransferase UGT1 and a recombinant bacterium 2 capable of secreting and expressing glycosyltransferase UGT2 in a culture medium containing methanol for culture, (2) adding a substrate rebaudioside A into a culture solution obtained in the step (1), and adding uridine diphosphate glucose, magnesium sulfate or magnesium chloride and methanol for reaction to obtain the rebaudioside M.)

一步法合成莱鲍迪苷M的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地涉及一步法合成莱鲍迪苷M的方法。

背景技术

甜菊糖苷是一种从菊科草本植物甜菊叶中精提的新型天然低热量甜味剂甜菊糖苷类化合物，因其甜度高、热量低、无毒性、耐高温、耐酸碱和水溶性好等优点，被美国食品药品监督管理局认证为安全，可应用于食品行业^[1-5]。莱鲍迪苷M(Rebaudioside M，RebM)具有更好的口感特性，但其占叶子干重的含量小于0.1％，导致分离成本高、价格昂贵。生物催化法获得高浓度的RebM已引起了学者的关注。目前报道，来源甜叶菊的重组酶能催化RebD生成 RebM，但产量较低^[3-4]。

以RebD为底物、通过生物催化法可获得RebM，但其生物催化过程中，目前主要有以下几种问题：(1)生物催化需要高效的糖基转移酶，在植物中糖基转移酶含量很低，远达不到实际应用的水平，而且难于纯化；(2)胞内表达的重组糖基转移酶能催化RebD产物RebM的生成、但RebD在甜菊中含量也低于0.1％且也价格较高；(3)胞内表达生产的重组酶需要离心收集菌体破胞等过程才能进行催化，步骤繁琐；(4)在反应过程中，由于热抑制作用，糖基转移酶大部分活性会丧失。(5)重组菌获得重组酶、酶的制备及催化耗时耗力耗财^[3-9]。基于上述研究现状、亟需一种：价格低廉、产量大的底物及步骤少、快速有效、低成本的方法去获得莱鲍迪苷M。

这种技术也将是实现工业上生物催化制备RebM的可行途径。

参考文献：

[1]郝涤非.合成甜味剂在食品工业中的应用概述[J].生物学教学，2017，42(10)：10-12.

[2]袁光梅，左美文，谭颖等.菊糖的提取及其在面包中的应用研究进展[J].食品安全导刊，2018，09：142.

[3]Prakash I,Markosyan A,Bunders C.Development ofnext generationstevia sweetener: rebaudioside M[J].Foods,2014,3(1):162-175.

[4]万会达，李丹，夏咏梅.甜菊糖苷类物质的功能性研究进展[D].食品科学，2015，36(17)： 264-269.

[5]唐志发.甜菊糖的崛起与发展战略[J].中国食品工业,1999,(2):52-52.

[6]胡国华.复合食品添加剂[M].北京:化学工业出版社,2006.

[7]余波颖，王宁琳，李国婧等.基因工程和代谢工程在甜菊糖生产上应用进展[J].生物技术通报，2015，31(9)：8-14

[8]Kumari N and Kumar S,Chemistry and analytical techniques for ent-kaurene-glycosides of Stevia rebaudianaBertoni-Areview.2017.JournalofAppliedandNatural Science9(4):2114-2126

[9]李艳，严明，陈量量.一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法[P].中国：107666834，2018-08-10.

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种一步法合成莱鲍迪苷M的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一步法合成莱胞迪苷M的方法，包括如下步骤：

(1)将能够分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1和能够分泌表达糖基转移酶UGT2的重组菌2混合接种在含有甲醇的培养基中培养；

(2)向步骤(1)获得的培养液中加入底物莱鲍迪苷A，加入尿苷二磷酸葡萄糖，硫酸镁或氯化镁，甲醇，反应,得到莱胞迪苷M；

所述糖基转移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述糖基转移酶UGT2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

步骤(1)优选为：将能够分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1和能够分泌表达糖基转移酶UGT2的重组菌2混合接种在含有甲醇的培养基中培养2h-3天，所述重组菌1和重组菌2接种时的细胞浓度的比为1:0.7-2，重组菌1和重组菌2的总浓度控制在菌液的吸光值OD600为1，含有甲醇的培养基的pH＝5.5-8，含有甲醇的培养基中甲醇的体积浓度为0.5％-1.5％。

步骤(2)优选为：向步骤(1)获得的培养液中加入终度为0.5-20g/L底物莱鲍迪苷A，加入终浓度为0.2-1.5mM尿苷二磷酸葡萄糖，加入终浓度为0.5-5mM的硫酸镁或氯化镁，每24 小时加入终浓度为0.5％-1.5％的甲醇，反应,得到莱胞迪苷M。

重组菌1用下述步骤构建：将糖基转移酶UGT1基因连接至表达载体后转入宿主细胞1，获得第一种重组菌1；或将糖基转移酶UGT1基因通过分子生物学技术整合至宿主细胞1的基因组，获得第二种重组菌1；所述糖基转移酶UGT1基因的核苷序列如SEQ ID NO.2所示。

表达载体为pPICZalphaA/B/C、pPIC9K、pPIC9、pPinkα-HC、pYES2、YCplac33，YEplac195、 pHT01、pHT08或pHT43载体。

宿主细胞1为酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或枯草芽孢杆菌。

重组菌2用下述步骤构建：将糖基转移酶UGT2基因连接至表达载体后转入宿主细胞1，获得第一种重组菌2；或将糖基转移酶UGT2基因通过分子生物学技术整合至宿主细胞1的基因组，获得第二种重组菌2；所述糖基转移酶UGT2基因的核苷序列如SEQ ID NO.4所示。

表达载体为pPICZalphaA/B/C、pPIC9K、pPIC9、pPinkα-HC、pYES2、YCplac33，YEplac195、 pHT01、pHT08或pHT43载体。

宿主细胞1为酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或枯草芽孢杆菌。

重组菌株1分泌UGT1蛋白所用的信号肽为alpha因子、xyn2s，phoA、phoD、amyE、MFalpha、及SED1的信号肽，所述信号肽对应的核苷酸序列依次为SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；

重组菌株2分泌UGT1蛋白所用的信号肽为alpha因子、xyn2s，phoA、phoD、amyE、MFalpha、及SED1的信号肽，所述信号肽对应的核苷酸序列依次为SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。

本发明的优点：

1.克服了现有技术从甜叶菊中无法大量纯化出糖基转移酶的不足。

2.一步法合成克服了现有技术的催化需要破胞、分离纯化或者加入细胞膜通透剂等繁琐步骤。

3.现有的生物催化技术是使用底物莱鲍迪苷D(RebD)才能生产莱鲍迪苷M(RebM),RebD 相对本技术使用的底物莱鲍迪苷A(RebA)而言其价格昂贵，本发明使用相对价格低廉的RebA 作为底物，降低生产成本。

4.本发明混菌发酵、发酵液中加入RebA，一步即可生产RebM。RebM是一种甜度高、口感好的甜味剂，本发明的方法能获得分泌表达的糖苷转移酶，可提高重组菌糖苷转移酶的产量及热稳定性，实现直接用价值低的RebA为底物混菌催化一步法获得RebM。提高催化效率，降低酶纯化所需费用及底物的费用、获得甜度高、口感好、高价值的RebM。

附图说明

图1为含有糖基转移酶UGT1和UGT2基因的重组载体构建图。其中a为质粒pP-UGT1图谱，包含UGT1基因；b为pP-UGT2质粒图谱，包含UGT2基因。

图2为糖基转移酶UGT1和UGT2基因的重组巴斯德毕赤酵母转化子PCR鉴定电泳图谱。泳道M为DNA标准分子量Marker；其中a的各泳道分别为UGT1各转化子和对照菌株X33 的PCR产物电泳图谱。b各泳道分别为UGT2各转化子和对照菌株X33的PCR产物电泳图谱。CK是以水为模板的PCR产物电泳结果。

图3各转化子培养物上清总蛋白电泳图。其中a为转化子分泌表达UGT1的电泳图；b为转化子分泌表达UGT2的电泳图。

图4重组菌株1和重组菌株2在各种甲醇浓度下重组毕赤酵母表达UGT2。对照菌X33、重组菌株1和重组菌株2在培养第3天时，取培养物上清、浓缩5倍的电泳图。a和b分别为重组菌株1和重组菌株2在各种甲醇浓度培养时分泌的UGT1和UGT2的电泳图。

图5纯化的UGT1和UGT2的SDS-PAGE图。重组菌株1和重组菌株2第3天培养物上清纯化后电泳，a为纯化的UGT1电泳图；b为纯化的UGT2电泳图。

图6用重组菌株1和重组菌株2一步法生产RebM过程中的菌株生长及蛋白浓度测定。

a为菌株EX-3和XS-35在4种实验条件下的生长曲线，b为菌株培养第3天和第4天的(即补料后第2天和第3天)培养物上清的蛋白浓度。1#：pH 6.0、EX-3和XS-35比例1:1、第2天补料；2#：pH 6.0、EX-3和XS-35比例1:2、第3天补料；3#：pH 7.3、EX-3和XS-35 比例1:1、第3天补料；4#：pH 7.3、EX-3和XS-35比例1:2、第2天补料。

具体实施方式

大肠杆菌TOP10F′(商品)。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

表达载体为pPICZalphaA/B/C、pPIC9K、pPIC9、pPinkα-HC、pYES2、YCplac33，YEplac195、 pHT01、pHT08或pHT43载体为公知。

实施例1转移糖苷酶UGT2和UGT1基因的合成及表达载体的构建

金斯瑞公司合成糖基转移酶UGT1基因，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.2 所示(SEQ ID NO.1是糖基转移酶UGT1的氨基酸序列)，将该基因通过分子生物学的方法连接至pPICZalphaA，获得序列表中SEQ ID NO.3所示的4954bp的pP-UGT1质粒。pP-UGT1质粒(图1)包含信号肽alpha因子的核苷酸序列(SEQ ID NO.9)。该质粒转化大肠杆菌TOP10F′得到的转化子，并从转化子中提取15μg(也可以是10μg)的pPIC-UGT1质粒(天根公司中量试剂盒)。用PmeI酶切成线性的SEQ ID NO.3所示的4954bp片段，经酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀线性SEQ ID NO.3所示的线性DNA片段，干燥后溶于无菌水，制成DNA浓度为 1μg/μL(也可以制成浓度为0.4μg/μL)的线形DNA溶液。

按照同样的方法合成序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列(SEQ ID NO.5是糖基转移酶UGT2的氨基酸序列)，用分子生物学的方法连接至pPICZalphaA获得长4861bp的pP-UGT2 质粒(序列表中SEQ ID NO.6)及其线性的含有UGT1基因的DNA溶液。

实施例2葡萄糖基转移酶UGT2和UGT1基因分别整合至巴斯德毕赤酵母染色体：

参照精编分子生物学实验指南(第四版)(P512-513)中的电穿孔转化制备酵母感受态细胞方法制备巴斯德毕赤酵母宿主菌X-33和Gs115的感受态细胞，将80μL巴斯德毕赤酵母宿主菌的感受态细胞与10μL的1μg/μL的pP-UGT1质粒的线形DNA溶液混匀后，转移到4℃ (也可以是0-4℃中的任意一值)预冷的电极杯中，冰浴5min，电压1500V，用eppendorf公司的电转仪进行电击，电击5ms，电击后立即加入1mL的4℃预冷的1M山梨醇水溶液到电极杯中，混匀，将混合液转移到15mL离心管中，29℃静置培养1h(可以是1-2h中的任意一值)，在含200μg/mL的Zeocin(Invitrogen公司出售)的YPD平板上涂100μL(也可以是在50μL-200μL中任一数值)培养后的混合液，29℃倒置培养直至第一种重组菌株1 出现。

用与上述同样的方法提取pP-UGT2质粒，线性化后通过电转化将UGT2基因转化到X-33 和Gs115的感受态细胞，获得第一种重组菌株2。

YPD固体培养基为酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L,琼脂18g/L。

实施例3含有葡萄糖基转移酶UGT1和UGT2基因的巴斯德毕赤酵母转化子的PCR鉴定

通过菌落PCR方法对实验室前期的转化子进行鉴定。以甘油管保存的菌离心后弃上清，浓缩的菌体作为PCR扩增模板，采用外源基因特异性引物如序列表中SEQ ID NO.7和序列表中SEQ ID NO.8所示的序列进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。

分别取20μL甘油菌，离心12000rpm/4℃/5min，弃上清，沉淀作为菌落PCR模板。在200μL PCR管内配制15μL反应体系2×Rapid Taq Master Mix 7.5μL，0.5μL的如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列为上、下游引物，无菌水6.5μL，用pP-UGT2 质粒为模板作为正对照；用野生型毕赤酵母基因组DNA为模板作为阴性对照；用无菌水为模板作为负对照。PCR反应热循环程序为95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸3min。配置1％琼脂糖凝胶(1％琼脂，1.5‰EB，TAE缓冲液)。取PCR产物点样，170V电泳30min。扫描电泳图。

PCR产物电泳，检测如图2所示。

含有UGT1基因转化子的PCR鉴定结果如图2a所示，PCR能扩增出1950bp的目标基因UGT1 和2.2kb的AOX1基因的条带，说明这些转化子的UGT1基因已经成功整合到巴斯德毕赤酵母X-33菌株染色体上(图2a)。含有UGT2基因转化子的PCR鉴定结果如图2b所示，PCR 能扩增出1857bp的目标基因和2.2kb的AOX1基因的条带条带，说明这些转化子的UGT2 基因已经成功整合到巴斯德毕赤酵母X-33菌株染色体上(图2b)。

实施例4甲醇诱导巴斯德毕赤酵母转化子的UGT1基因表达

①接种经实施例3鉴定的含有糖基转移酶基因UGT1的重组巴斯德毕赤酵母菌XE-3、 XE-4、XE-9、XE-12、XE-13、XE-14、XE-15、XE-16、XE-17、XE-18、XE-19、XE-20，以及巴斯德毕赤酵母宿主菌X33分别转接至2ml，pH＝5.5的YPD培养基预培养，220转/分钟，29℃培养至OD₆₀₀＝4；

②按1:100的体积比分别将步骤①的经预培养的菌液转接至25ml BMGY培养基中，220转/ 分钟，29℃培养至OD₆₀₀＝4；

③将步骤②培养的菌液分别转接至50ml pH＝5.5、甲醇的体积浓度为0.75％的BMMY培养基中，使菌液的浓度OD₆₀₀＝1，在220转/分钟，29℃摇床中培养，每24h补甲醇，甲醇的加入体积为培养基体积的0.75％，诱导重组菌分泌表达UGT1。为检测糖基转移酶基因UGT1能有效地表达且将目的蛋白分泌到重组巴斯德毕赤酵母菌的细胞外，从诱导后第1天至8天取重组菌生长的培养基进行粗酶液的活性测定、蛋白电泳及蛋白浓度测定。取样方式如下：取500 μl培养基，离心后，取上清测定酶活。随着诱导时间的增加，目的蛋白UGT1分泌的越多，而对照菌株巴斯德毕赤酵母宿主菌X33则没有目的蛋白UGT1的分泌(图3上图)，各个菌株分泌表达的UGT1也有所差异，其中重组菌XE3和XE4等菌株分泌的重组蛋白UGT1的量较大。XE-3菌株表达目标蛋白UGT1的表达水平最高，命名为重组菌株1。重组菌株1在培养1-7天时UGT1皆能表达，在第3天时表达水平就已经达到较高的水平。

步骤①和②中培养的转速也可以是200-250转/分钟中的任意一值；培养温度也可以是 28℃-30℃中的任意一值；培养菌的浓度OD₆₀₀也可以是2-6中的任意一值。步骤③中BMMY培养基中甲醇的体积浓度为0.5％-1％中任意一值；菌体的浓度OD₆₀₀也可以是0.8-1.5范围中任意一值；转速也可以是200-250转/分钟中的任意一值；培养温度也可以是28℃-30℃中的任意一值，每24h补甲醇,甲醇的加入体积为培养基体积的0.5％-1％中的任意一值。

BMGY培养基为10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，13.4g/L酵母氮基，100mM磷酸钾,4x10^-4g/L生物素，10g/L甘油，余量为水。

BMMY培养基为10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，13.4g/L酵母氮基，100mM磷酸钾,4x10^-4g/L生物素，甲醇的体积浓度为0.5％-1％，余量为水。

MMH培养基为13.4g/L酵母氮基，4x10^-4g/L生物素，甲醇的体积浓度为0.5％-1％，余量为水。

BMMH培养基为13.4g/L酵母氮基，100mM磷酸钾,4x10^-4g/L生物素，甲醇的体积浓度为0.5％-1％，余量为水。

重组菌株1包含有UGT1基因的工程菌株，宿主细胞也可以是酿酒酵母或枯草芽孢杆菌。

当宿主细胞为巴斯德毕赤酵母时，表达载体为pPIC9K、pPIC9或pPinkα-HC。

宿主细胞为酿酒酵母选用表达载体为pYES2、YCplac33，YEplac195、

宿主细胞为枯草芽孢杆菌时选用表达载体为pHT01、pHT08或pHT43。

为使目标蛋白有效分泌宿主菌株细胞外，选用的信号肽为alpha因子(核酸序列为SEQ ID NO.9)、xyn2s(核酸序列为SEQ ID NO.10)，phoA(核酸序列为SEQ ID NO.11)、phoD(核酸序列为SEQ ID NO.12)、amyE(核酸序列为SEQ ID NO.13)、MFalpha(核酸序列为SEQID NO.14)和SED1(核酸序列为SEQ ID NO.15)。

实施例5甲醇诱导巴斯德毕赤酵母转化子的UGT2基因表达

①接种巴斯德毕赤酵母宿主菌X33及经实施例3鉴定的含有葡萄糖基转移酶基因UGT2 的重组巴斯德毕赤酵母菌XS-21、XS-22、XS-28、XE-35等，分别转接至2ml，pH＝5.5的YPD 培养基预培养，220转/分钟，29℃培养至OD₆₀₀＝4；

②按1:100的体积比分别将步骤①的经预培养的菌液转接至25ml BMGY培养基中，220转/ 分钟，29℃培养至OD₆₀₀＝4；

③将步骤②培养的菌液分别转接至50ml pH＝5.5、甲醇的体积浓度为0.75％的BMMY培养基中，使菌液的浓度OD₆₀₀＝1，在220转/分钟，29℃摇床中培养，每24h补甲醇，甲醇的加入体积为培养基体积的0.75％，诱导重组菌分泌表达UGT2。为检测糖基转移酶基因UGT2能有效地表达且将目的蛋白分泌到重组巴斯德毕赤酵母菌的细胞外，从诱导后第1天至8天取重组菌生长的培养基进行粗酶液的活性测定、蛋白电泳及蛋白浓度测定。取样方式如下：取500 μL培养基，离心后，取上清测定酶活。随着诱导时间的增加，UGT2分泌的越多，而对照菌株巴斯德毕赤酵母宿主菌X33则没有目的蛋白UGT2的分泌(图3下图)，各个菌株分泌表达的UGT2也有所差异，其中重组菌XS-35菌株分泌的重组蛋白UGT2的量最大，命名为重组菌株2。

重组菌株2包含有UGT2基因的工程菌株，宿主细胞也可以是酿酒酵母或枯草芽孢杆菌。

当宿主细胞为巴斯德毕赤酵母时，表达载体为pPIC9K、pPIC9或pPinkα-HC。

宿主细胞为酿酒酵母选用表达载体为pYES2、YCplac33，YEplac195、

宿主细胞为枯草芽孢杆菌时选用表达载体为pHT01、pHT08或pHT43。

实施例6甲醇浓度对重组菌产UGT1和UGT2的影响

按照实施例3所述的方法分别在含甲醇浓度为0.5％、0.75％、1.0％、1.25％、1.5％的BMMY 中培养重组菌株1，考察其在BMMY培养基中糖基转移酶的生长及表达趋势，考察诱导重组菌株1分泌生产UGT1的最适甲醇浓度。SDS-PAGE和蛋白浓度测定的结果均表明重组菌株1 表达目的蛋白的最适宜的甲醇浓度为0.75％，其次是1.0％和1.25％，1.5％或0.5％时也有较高蛋白的分泌表达(图4上图)。按照实施例4所述的方法分别在含甲醇浓度为0.25％、0.5％、 0.75％、1.0％、1.5％和2.0％的BMMY中培养重组菌株2，考察诱导重组菌株2分泌生产UGT2的最适甲醇浓度。SDS-PAGE和蛋白浓度测定的结果均表明甲醇浓度对重组菌株XS-35的生长和表达均有影响,甲醇浓度过高，对毕赤酵母的生长可能有毒害作用。过低浓度会使诱导碳源不足，生物量和表达量都下降，维持适当的甲醇浓度是保证高表达量的关键。本实验说明重组菌株2分泌表达蛋白UGT2最适的甲醇浓度为0.75％(图4下图)，0.25％、0.5％、1.0％、 1.5％，2.0％也皆有较高的UGT2表达(图4下图)。

实施例7UGT1和UGT2的纯化及生物活性检测

采用Merk公司的Ni-NTA His.Bind树脂对XE-3和XS-35菌株的第3天发酵液上清进行纯化。取20mL培养物13000g/4℃/30min离心，上清液用0.45μm滤膜抽滤，抽滤后的样品加入到Milipore公司10kD的超滤管，5000g/4℃/20min离心，在超滤管中加入1× Ni-NTA结合缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl)补足体积到13mL，按上述条件离心，浓缩至2mL。取2mL 50％Ni-NTA His·Bind树脂(Novagen，139311725)加入重力柱(Biorad，732-1010)中，加入2mL超滤浓缩后的蛋白液与6mL的1×Ni-NTA结合缓冲液，轻柔摇动混匀，结合(200rpm/4℃/1h)。收集流出液，加入1mL漂洗缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4，300mmol/LNaCl，2mmol/L咪唑)漂洗1次；4mL洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，150mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白。用3.5mL 10mmol/L磷酸缓冲液清洗平衡脱盐层析柱(GE，PD-10，Sephadex G-25填料)，上述洗脱后的4mL蛋白样品用10mmol/L磷酸缓冲液补体积至5mL，分别加入到平衡好的脱盐层析柱中2.5mL，弃去流出液，用3.5mL 10mmol/L磷酸缓冲液洗脱目的蛋白，得到去咪唑的纯化蛋白。纯化脱盐后的纯酶有明显的目的条带，说明UGT1和UGT2成功的被分离纯化出来(图5)。

纯化的UGT1和UGT2用于催化实验：500μL反应体系中加入50mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.2)，0.5g/L RebA，3mmol/L MgCl₂，1mmol/L UDPG，70μL的纯酶，30℃反应2 天。纯化的UGT2用于催化实验：500μL反应体系中加入50mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.2)， 0.5g/LRebA或者RebD，3mmol/L MgCl2，1mmol/L UDPG，70μL的纯酶，30℃反应2天。反应完成后，加入500μL 60％(v/v)乙腈，振荡混匀后，室温下12000rpm离心10min，上清液过0.2μm有机膜。HPLC采用Luna C18反相键合硅胶分离柱(4.6mm×250mm，5μ m)，流动相采用乙腈：磷酸钠缓冲溶液(pH 2.6)＝32:68，流速1mL/min，柱温40℃。采用紫外检测器VWD和示差折光检测器RID，VWD检测器波长210nm，RID检测器光学单元温度 40℃，进样量20μL。每分钟酶催化底物分子生产1μmol产物所需的酶量为1个单位U。比活力指每毫克酶蛋白所具有的酶活，单位U/mg。纯化的蛋白UGT1浓度测为0.232mg/mL、 UGT1重组酶的比活为0.011U/mg，说明能成功地从重组菌株1的培养物中纯化出有活性的重组酶UGT1。纯化的蛋白UGT2浓度为0.232mg/mL、UGT2重组酶的比活为0.016U/g。磷酸缓冲溶液的浓度是1-100mmol/L，底物RebA的浓度可以是0.5-20g/L，MgCl₂的浓度可以是0 或者是0.5-20mmol/L中的任意一值，0.3-3mmol/LUDPG，1-70μL的纯酶，30℃反应0.5-72 小时。

实施例8重组菌株1和重组菌株2的混菌发酵

按照实施例3和4所述的方法在BMMY培养基中培养两个菌株，pH控制在5至6、甲醇浓度0.75％-1.0％、混菌比例1:1或2:1。发酵4天，取120μL上清液至实施例6所述的酶促体系中反应48h，考察0.4-0.6g/L的RebA转化RebM的效率。RebA的转化率分别为44.89％、50.35％、69.24％和52.46％。RebM生产量分别为0.15、0.17、0.23和0.18g/L，收率分别为37.41％、41.96％、57.70％和43.71％。通过正交实验分析表明，理论上在0.75％甲醇、pH6.0 的条件下2:1接种重组菌株1和重组菌株2至BMMY中，所产生的粗酶液催化RebA生成RebM 的转化收率最高。这些结果表明含有UGT1和UGT2的混菌培养物能一步法催化RebA生成RebM。上述实验也可以是重组菌株1和重组菌株2混合培养的时间可以是0-10天，pH可以为3-7，温度为26-30度。可以取1-120ul的培养物加入到实施例6所述的酶促反应体系中，底物莱鲍迪苷A的终度可为0.5-120g/L，反应1-240小时。

实施例9

一步法合成莱胞迪苷M的方法，包括如下步骤：

(1)将能够分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1和能够分泌表达糖基转移酶UGT2的重组菌2混合培养2h；所述重组菌1和重组菌2的接种时的细胞浓度的比为1:0.7，重组菌1和重组菌2的总浓度控制在菌液的吸光值OD600为1，培养基的pH＝5.5，含有甲醇的培养基中的甲醇的体积浓度为0.5％；

(2)向步骤(1)获得的培养液中加入终度为0.5g/L底物莱鲍迪苷A，加入终浓度为0.2mM 尿苷二磷酸葡萄糖，加入终浓度为0.5mM的硫酸镁，每24小时加入终浓度为0.5％的甲醇，反应, 得到莱胞迪苷M。莱胞迪苷M的收率为36.50％。

实施例10

一步法合成莱胞迪苷M的方法，包括如下步骤：

(1)将能够分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1和能够分泌表达糖基转移酶UGT2的重组菌2混合培养2天；所述重组菌1和重组菌2的接种时的细胞浓度的比为1:1，重组菌1和重组菌 2的总浓度控制在菌液的吸光值OD600为1，含有甲醇的培养基的pH＝6.0，含有甲醇的培养基中的甲醇的体积浓度为0.75％；

(2)向步骤(1)获得的培养液中加入终度为2g/L底物莱鲍迪苷A，加入终浓度为1.5mM 尿苷二磷酸葡萄糖，加入终浓度为5mM的氯化镁，每24小时加入终浓度为0.75％的甲醇，反应, 得到莱胞迪苷M。莱胞迪苷M的收率为56.50％。

实施例11

一步法合成莱胞迪苷M的方法，包括如下步骤：

(1)将能够分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1和能够分泌表达糖基转移酶UGT2的重组菌2混合接种在含有甲醇的培养基中培养3天；所述重组菌1和重组菌2的接种时的细胞浓度的比为1:2，重组菌1和重组菌2的总浓度控制在菌液的吸光值OD600为1，含有甲醇的培养基的 pH＝8.0，含有甲醇的培养基中甲醇的体积浓度为1.5％；

(2)向步骤(1)获得的培养液中加入终度为20g/L底物莱鲍迪苷A，加入终浓度为1.5mM 尿苷二磷酸葡萄糖，加入终浓度为5mM的氯化镁，每24小时加入终浓度为1.5％的甲醇，反应, 得到莱胞迪苷M。莱胞迪苷M的收率为28.10％。

序列表

<110> 中化健康产业发展有限公司

天津大学

<120> 一步法合成莱鲍迪苷M的方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Phe Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly

1 5 10 15

Met His Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro

20 25 30

Cys Leu Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser

35 40 45

Phe Val Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro

50 55 60

Ala Leu Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val

65 70 75 80

Glu Gly Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp

85 90 95

Arg Pro Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala

100 105 110

Ala Pro Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile

115 120 125

Val Asp Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys

130 135 140

Val Pro Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser

145 150 155 160

Ile Ala Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala

165 170 175

Ala Gly Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg

180 185 190

Met Lys Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu

195 200 205

Arg Phe Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser

210 215 220

Cys Val Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg

225 230 235 240

Gly Lys Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly

245 250 255

Arg Arg Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Pro Ala Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu

275 280 285

Gly Val Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly

290 295 300

Thr Arg Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala

305 310 315 320

Asp Leu Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val

325 330 335

Val Ala Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala

340 345 350

Val Gly Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly

355 360 365

Leu Met Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln

370 375 380

Gly Pro Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val

385 390 395 400

Ala Arg Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala

405 410 415

Ala Ile Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln

420 425 430

Ala Lys Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His

435 440 445

Glu Arg Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Asp

450 455 460

Leu Val Pro Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu

465 470 475 480

Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His

485 490 495

His

<210> 2

<211> 1758

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgaa ttcatggact ctggttactc ttcttcttac 300

gctgctgctg ctggtatgca cgttgttatc tgtccatggt tggctttcgg tcacttgttg 360

ccatgtttgg acttggctca aagattggct tctagaggtc acagagtttc tttcgtttct 420

actccaagaa acatctctag attgccacca gttagaccag ctttggctcc attggttgct 480

ttcgttgctt tgccattgcc aagagttgaa ggtttgccag acggtgctga atctactaac 540

gacgttccac acgacagacc agacatggtt gaattgcaca gaagagcttt cgacggtttg 600

gctgctccat tctctgaatt tttgggtact gcttgtgctg actgggttat cgttgacgtt 660

ttccaccact gggctgctgc tgctgctttg gaacacaagg ttccatgtgc tatgatgttg 720

ttgggttctg ctcacatgat cgcttctatc gctgacagaa gattggaaag agctgaaact 780

gaatctccag ctgctgctgg tcaaggtaga ccagctgctg ctccaacttt cgaagttgct 840

agaatgaagt tgatcagaac taagggttct tctggtatgt ctttggctga aagattctct 900

ttgactttgt ctagatcgtc tttggttgtt ggtagatcgt gtgttgaatt tgaaccagaa 960

actgttccat tgttgtctac tttgagaggt aagccaatca ctttcttggg tttgatgcca 1020

ccattgcacg aaggtagaag agaagacggt gaagacgcta ctgttagatg gttggacgct 1080

caaccagcta agtctgttgt ttacgttgct ttgggttctg aagttccatt gggtgttgaa 1140

aaggttcacg aattggcttt gggtttggaa ttggctggta ctagattctt gtgggctttg 1200

agaaagccaa ctggtgtttc tgacgctgac ttgttgccag ctggtttcga agaaagaact 1260

agaggtagag gtgttgttgc tactagatgg gttccacaaa tgtctatctt ggctcacgct 1320

gctgttggtg ctttcttgac tcactgtggt tggaactcta ctatcgaagg tttgatgttc 1380

ggtcacccat tgatcatgtt gccaatcttc ggtgaccaag gtccaaacgc tagattgatc 1440

gaagctaaga acgctggttt gcaagttgct agaaacgacg gtgacggttc tttcgacaga 1500

gaaggtgttg ctgctgctat cagagctgtt gctgttgaag aagaatcttc taaggttttc 1560

caagctaagg ctaagaagtt gcaagaaatc gttgctgaca tggcttgtca cgaaagatac 1620

atcgacggtt tcatccaaca attgagatcg tacaaggact tggtacctcg agccgcggcg 1680

gccgccagct ttctagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac 1740

catcatcatc atcatcat 1758

<210> 3

<211> 4954

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt 960

tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga 1020

agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt tactcagatt tagaagggga 1080

tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat aacgggttat tgtttataaa 1140

tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta tctctcgaga aaagagaggc 1200

tgaagctgaa ttcatggact ctggttactc ttcttcttac gctgctgctg ctggtatgca 1260

cgttgttatc tgtccatggt tggctttcgg tcacttgttg ccatgtttgg acttggctca 1320

aagattggct tctagaggtc acagagtttc tttcgtttct actccaagaa acatctctag 1380

attgccacca gttagaccag ctttggctcc attggttgct ttcgttgctt tgccattgcc 1440

aagagttgaa ggtttgccag acggtgctga atctactaac gacgttccac acgacagacc 1500

agacatggtt gaattgcaca gaagagcttt cgacggtttg gctgctccat tctctgaatt 1560

tttgggtact gcttgtgctg actgggttat cgttgacgtt ttccaccact gggctgctgc 1620

tgctgctttg gaacacaagg ttccatgtgc tatgatgttg ttgggttctg ctcacatgat 1680

cgcttctatc gctgacagaa gattggaaag agctgaaact gaatctccag ctgctgctgg 1740

tcaaggtaga ccagctgctg ctccaacttt cgaagttgct agaatgaagt tgatcagaac 1800

taagggttct tctggtatgt ctttggctga aagattctct ttgactttgt ctagatcgtc 1860

tttggttgtt ggtagatcgt gtgttgaatt tgaaccagaa actgttccat tgttgtctac 1920

tttgagaggt aagccaatca ctttcttggg tttgatgcca ccattgcacg aaggtagaag 1980

agaagacggt gaagacgcta ctgttagatg gttggacgct caaccagcta agtctgttgt 2040

ttacgttgct ttgggttctg aagttccatt gggtgttgaa aaggttcacg aattggcttt 2100

gggtttggaa ttggctggta ctagattctt gtgggctttg agaaagccaa ctggtgtttc 2160

tgacgctgac ttgttgccag ctggtttcga agaaagaact agaggtagag gtgttgttgc 2220

tactagatgg gttccacaaa tgtctatctt ggctcacgct gctgttggtg ctttcttgac 2280

tcactgtggt tggaactcta ctatcgaagg tttgatgttc ggtcacccat tgatcatgtt 2340

gccaatcttc ggtgaccaag gtccaaacgc tagattgatc gaagctaaga acgctggttt 2400

gcaagttgct agaaacgacg gtgacggttc tttcgacaga gaaggtgttg ctgctgctat 2460

cagagctgtt gctgttgaag aagaatcttc taaggttttc caagctaagg ctaagaagtt 2520

gcaagaaatc gttgctgaca tggcttgtca cgaaagatac atcgacggtt tcatccaaca 2580

attgagatcg tacaaggact tggtacctcg agccgcggcg gccgccagct ttctagaaca 2640

aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac catcatcatc atcatcattg 2700

agtttgtagc cttagacatg actgttcctc agttcaagtt gggcacttac gagaagaccg 2760

gtcttgctag attctaatca agaggatgtc agaatgccat ttgcctgaga gatgcaggct 2820

tcatttttga tactttttta tttgtaacct atatagtata ggattttttt tgtcattttg 2880

tttcttctcg tacgagcttg ctcctgatca gcctatctcg cagctgatga atatcttgtg 2940

gtaggggttt gggaaaatca ttcgagtttg atgtttttct tggtatttcc cactcctctt 3000

cagagtacag aagattaagt gagaccttcg tttgtgcgga tcccccacac accatagctt 3060

caaaatgttt ctactccttt tttactcttc cagattttct cggactccgc gcatcgccgt 3120

accacttcaa aacacccaag cacagcatac taaattttcc ctctttcttc ctctagggtg 3180

tcgttaatta cccgtactaa aggtttggaa aagaaaaaag agaccgcctc gtttcttttt 3240

cttcgtcgaa aaaggcaata aaaattttta tcacgtttct ttttcttgaa attttttttt 3300

ttagtttttt tctctttcag tgacctccat tgatatttaa gttaataaac ggtcttcaat 3360

ttctcaagtt tcagtttcat ttttcttgtt ctattacaac tttttttact tcttgttcat 3420

tagaaagaaa gcatagcaat ctaatctaag gggcggtgtt gacaattaat catcggcata 3480

gtatatcggc atagtataat acgacaaggt gaggaactaa accatggcca agttgaccag 3540

tgccgttccg gtgctcaccg cgcgcgacgt cgccggagcg gtcgagttct ggaccgaccg 3600

gctcgggttc tcccgggact tcgtggagga cgacttcgcc ggtgtggtcc gggacgacgt 3660

gaccctgttc atcagcgcgg tccaggacca ggtggtgccg gacaacaccc tggcctgggt 3720

gtgggtgcgc ggcctggacg agctgtacgc cgagtggtcg gaggtcgtgt ccacgaactt 3780

ccgggacgcc tccgggccgg ccatgaccga gatcggcgag cagccgtggg ggcgggagtt 3840

cgccctgcgc gacccggccg gcaactgcgt gcacttcgtg gccgaggagc aggactgaca 3900

cgtccgacgg cggcccacgg gtcccaggcc tcggagatcc gtcccccttt tcctttgtcg 3960

atatcatgta attagttatg tcacgcttac attcacgccc tccccccaca tccgctctaa 4020

ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag tctaggtccc tatttatttt tttatagtta 4080

tgttagtatt aagaacgtta tttatatttc aaatttttct tttttttctg tacagacgcg 4140

tgtacgcatg taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga cgctcgaagg 4200

ctttaatttg caagctggag accaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 4260

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 4320

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 4380

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 4440

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc 4500

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 4560

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 4620

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 4680

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 4740

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 4800

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 4860

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 4920

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gatc 4954

<210> 4

<211> 1395

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggaaaaca agactgagac tactgttaga agaagaagaa gaatcatctt gttcccagtt 60

ccttttcaag gtcatattaa cccaattttg caattggcta acgttttgta ctctaagggt 120

ttctctatca ctatcttcca tactaacttc aataagccaa agacttctaa ctaccctcac 180

ttcactttta gattcatttt ggataacgat ccacaagatg aaagaatttc taatttgcca 240

actcatggtc ctttggctgg tatgagaatc ccaattatta acgaacacgg tgctgatgag 300

ttgagaagag aattggagtt gttgatgttg gcttctgaag aggatgaaga ggtttcttgt 360

ttgattactg atgctttgtg gtactttgct caatctgttg ctgattcttt gaacttgaga 420

agattggttt tgatgacttc ttctttgttc aatttccatg ctcacgtttc tttgccacaa 480

ttcgatgaat tgggttactt ggatcctgat gataagacta gattggaaga gcaggcttct 540

ggttttccaa tgttgaaggt taaggatatc aagtctgctt actctaactg gcaaatcttg 600

aaggagatct tgggtaaaat gatcaagcaa actaaggctt cttctggtgt tatttggaac 660

tcttttaagg agttggaaga gtctgaattg gagactgtta ttagagagat tccagctcca 720

tctttcttga ttccattgcc taaacatttg actgcttctt cttcttcttt gttggatcac 780

gatagaactg ttttccaatg gttggatcaa caaccacctt cttctgtttt gtacgtttct 840

ttcggttcta cttctgaagt tgatgagaaa gatttcttgg aaattgctag aggtttggtt 900

gattctaagc aatctttctt gtgggttgtt agaccaggtt ttgtcaaagg ttctacttgg 960

gttgaaccat tgcctgatgg tttcttggga gagagaggta gaattgttaa atgggttcct 1020

caacaagaag ttttggctca tggtgctatt ggtgcttttt ggactcactc tggttggaac 1080

tctactttgg aatctgtttg tgagggtgtt ccaatgattt tctctgattt tggtttggat 1140

caacctttga atgctagata catgtctgat gttttgaagg ttggtgttta tttggaaaac 1200

ggttgggaaa gaggtgagat tgctaatgct attagaagag ttatggttga tgaagaggga 1260

gagtacatca gacaaaacgc tagagttttg aagcaaaaag ctgatgtttc tttgatgaaa 1320

ggtggttctt cttacgaatc tttggagtct ttggtttctt acatttcttc tttgcatcat 1380

catcatcatc attga 1395

<210> 5

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Phe Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10 15

Ile Ile Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu

20 25 30

Gln Leu Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe

35 40 45

His Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr

50 55 60

Phe Arg Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn

65 70 75 80

Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn

85 90 95

Glu His Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu

100 105 110

Ala Ser Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu

115 120 125

Trp Tyr Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu

130 135 140

Val Leu Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu

145 150 155 160

Pro Gln Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg

165 170 175

Leu Glu Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile

180 185 190

Lys Ser Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys

195 200 205

Met Ile Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe

210 215 220

Lys Glu Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro

225 230 235 240

Ala Pro Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser

245 250 255

Ser Ser Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln

260 265 270

Gln Pro Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu

275 280 285

Val Asp Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser

290 295 300

Lys Gln Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser

305 310 315 320

Thr Trp Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg

325 330 335

Ile Val Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile

340 345 350

Gly Ala Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val

355 360 365

Cys Glu Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro

370 375 380

Leu Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu

385 390 395 400

Glu Asn Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val

405 410 415

Met Val Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu

420 425 430

Lys Gln Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu

435 440 445

Ser Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu His His His His

450 455 460

His His

465

<210> 6

<211> 4861

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6