井冈霉素在制备几丁质酶的抑制剂中的应用
阅读说明：本技术 井冈霉素在制备几丁质酶的抑制剂中的应用 (Application of validamycin in preparation of chitinase inhibitor ) 是由 王思彤 陈艳 罗雨嘉 蒋鑫怡 钟樊 周敏 王世贵 唐斌 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了井冈霉素在制备几丁质酶的抑制剂中的应用。本发明提供了井冈霉素在制备几丁质代谢相关蛋白活性抑制剂中的应用,Validamycin能够导致显著抑制海藻糖酶活性及几丁质酶活性,并导致草地贪夜蛾几丁质的相对含量显著升高,此外还使昆虫生长发育缓慢,在蜕皮时发生畸形甚至死亡,有效浓度为1μg/μl,本发明能够应用于害虫防治中新型杀虫剂的开发。(The invention discloses application of validamycin in preparation of an inhibitor of chitinase. The Validamycin can obviously inhibit trehalase activity and chitinase activity, and can obviously increase the relative content of spodoptera frugiperda chitin, and in addition, the growth and development of insects are slow, the insects have malformation and even die during molting, and the effective concentration is 1 mu g/mu l.)
技术领域
本发明涉及昆虫防治技术领域，特别是涉及井冈霉素在制备几丁质酶的抑制剂中的应用。
背景技术
昆虫是世界上种类最繁、数量最多的动物群体，因多数以植物为食所以其中的一大部分成为了农业、园艺和林业中最大的危害之一，它们可以直接或间接通过传播植物病毒给植物造成损害并让人类付出高额的经济代价。随着农业的快速发展，农药的使用量也在逐年增加，由于作物对农药的蓄积作用，许多种类的害虫对杀虫剂具有抗药性或交叉抗药性，据统计目前至少586种昆虫对325中化学杀虫剂中的≥1种具有抗性，采用传统、单一的农药控制害虫的为害将会越来越困难。现在害虫防治的重要手段之一就是调控害虫的生长发育，其中的关键点在于找到能够起靶标调控作用并适合开发的生物农药。
在昆虫中，海藻糖是主要的血糖，作为即时能量为昆虫的生长发育和生命活动提供所需能量来源，并且在应对非生物胁迫中起着至关重要的作用，从而提高昆虫的生命力和活动能力。海藻糖酶(Trehalase，Tre)是一种催化海藻糖水解为葡萄糖的酶，也是昆虫体内合成几丁质途径的第一个酶。由于海藻糖酶及其基因的重要性，其已经成为害虫控制的重要靶标之一，具有实际农药意义的有效新型海藻糖酶抑制剂产品正在开发，例如各类海藻糖酶抑制剂相继出现，效果较好的有井冈霉素(Validamycin)、井冈霉亚基胺A、Trehazolin等，抑制作用主要是通过与海藻糖酶活性位点上的氨基酸相互结合形成复合物，竞争性地抑制海藻糖酶的活性来实现的。研究发现海藻糖酶的表达被抑制后，通过调控昆虫的内部代谢能够杀死害虫。几丁质代谢就是海藻糖酶的主要内部代谢之一。
几丁质由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine，GlcNAc)残基通过β-1，4-糖苷键连接从而形成的多糖，在自然界中广泛分布，具有多种功能。在昆虫中几丁质是表皮和围食膜的主要结构成分，为了促进生长和发展，昆虫定期降解旧基质层并合成新基质层，这就需要几丁质酶(Chitinase，CHT)的参与，抑制几丁质酶活性的小分子可以干扰几丁质在几丁质组织中的周转和其他生理过程，例如昆虫中几丁质酶的酶活性丧失会导致严重的外骨骼缺陷和致命，昆虫几丁质酶具有重要的生理意义和独特的结构特征，这表明昆虫几丁质酶是很有前途的农药靶点。然而，目前还没有已知的针对几丁质酶的杀虫剂。
以几丁质酶作为害虫控制靶标的潜在杀虫剂，其杀虫机理以及杀虫效果的研究对开发出新型杀虫剂具有十分重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种井冈霉素在制备几丁质代谢相关蛋白抑制剂中的应用，井冈霉素能够使草地贪夜蛾的海藻糖酶活和几丁质酶活含量显著降低，累积几丁质从而导致幼虫生长发育缓慢甚至是虫体畸形死亡，有效浓度为1μg/μl，本发明能够应用于害虫防治中新型杀虫剂的开发。
本发明提供了井冈霉素在制备几丁质酶的抑制剂中的应用。优选的，所述抑制剂中井冈霉素的有效浓度不小于1μg/μl。优选的，所述几丁质酶来自草地贪夜蛾。优选的，抑制剂在使用时，通过喂食或注射的方式。更优选的，抑制剂使用的对象为草地贪夜蛾幼虫。
本发明又提供了一种几丁质酶的抑制剂，活性成分为井冈霉素。优选的，所述抑制剂中井冈霉素的有效浓度不小于1μg/μl，更优选为1μg/μl。
本发明还提供了所述抑制剂在防治草地贪夜蛾中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了井冈霉素在制备几丁质代谢相关蛋白活性抑制剂中的应用，Validamycin能够导致显著抑制海藻糖酶活性及几丁质酶活性，并导致草地贪夜蛾几丁质的相对含量显著升高，此外还使昆虫生长发育缓慢，在蜕皮时发生畸形甚至死亡，有效浓度为1μg/μl，本发明能够应用于害虫防治中新型杀虫剂的开发。
附图说明
图1为草地贪夜蛾注射Validamycin 48h后的海藻糖酶酶活性变化检测结果图，其中，A：可溶性海藻糖酶酶活；B：膜结合海藻糖酶酶活，*表示P＜0.05，差异显著，**表示P＜0.01，差异极显著，下同。
图2为草地贪夜蛾注射Validamycin 48h后的糖含量变化检测结果图，其中，A：葡萄糖；B：海藻糖；C：糖原。
图3为草地贪夜蛾注射Validamycin 48h后几丁质酶活性变化检测结果图。
图4为草地贪夜蛾注射Validamycin 48h后几丁质的相对含量检测结果图。
图5为草地贪夜蛾注射Validamycin后的变态发育情况检测结果图，其中，A：注射48h后草地贪夜蛾的死亡个数及畸形表型，B：草地贪夜蛾的化蛹率，C：草地贪夜蛾的羽化率。
图6为草地贪夜蛾注射Validamycin后的生长发育情况检测结果图，其中，A：草地贪夜蛾4龄至6龄的幼虫长度以及蛹长，B：草地贪夜蛾化蛹后的蛹重，C：草地贪夜蛾的自4龄起到羽化为止每个龄期所需的发育时间(即发育历期)。
具体实施方式
草地贪夜蛾是原产与美洲的重要的杂食性农业害虫，该虫具有适生范围广、传播速度快(夜飞行可达100千米)、繁殖能力强(产卵1000以上)、贪食性等特点，对玉米等禾本科植物危害极大，当玉米田里发现该害虫时说明其已爆发成灾。在下述实施例中以草地贪夜蛾为例对本发明进行了详细说明。
井冈霉素(Validamycin，technical)购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。
实施例1：草地贪夜蛾注射Validamycin后海藻糖代谢调控作用的变化
1.实验材料：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)来自本实验室饲养种群，供试虫源来自浙江农科院。草地贪夜蛾的饲养条件为：温度26±1℃；光周期16∶8h(白天∶黑夜)，湿度60±10％。草地贪夜蛾幼虫为人工饲料饲养(表1)，成虫以10％蜂蜜水模拟花蜜获取营养。
表1草地贪夜蛾幼饲料配方
2.草地贪夜蛾Validamycin的显微注射：用无菌水配制1μg/μl浓度的井冈霉素注射液。注射前首先用标准毛细管定量每次显微注射器仪泵出的井冈霉素注射液的体积，并通过调整气压来调整井冈霉素注射液的体积，注射体积为300nl。将3龄草地贪夜蛾幼虫置于冰上使其行动缓慢，然后在Leica解剖镜下将针头插入注射于其第2、第3胸足间并将井冈霉素注射入体内，注射后将其放至装有新鲜饲料的饲养盒中单头饲养，以正常饲养的草地贪夜蛾为对照组，于注射后48h取样。
3.草地贪夜蛾注射Validamycin 48h后海藻糖酶活的变化
草地贪夜蛾注射Validamycin 48h后海藻糖酶活性的测定：取10头草地贪夜蛾，加入2颗灭菌的小钢珠，放入组织破碎仪中破碎，程序为：55Hz，120s；破碎完后将小钢珠倒出，加入200μl PBS超声破碎30min；破碎后加800μl PBS，4℃，1000×g，离心20min；取350μl上清4℃，20800×g，超离心1h；吸出超离心后的上清用于可溶性海藻糖酶活性和蛋白浓度的测定；沉淀用PBS洗两次并用PBS悬浮，该悬浮液用于膜结合型海藻糖酶活性和蛋白浓度的测定。利用葡萄糖分析试剂盒(Sigma)进行海藻糖酶浓度的测定，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)进行蛋白浓度的测定，酶活性单位为mmol glucose/μg protein/minute，结果如图1所示。
图1表明注射1μg/μl Validamycin的48h后草地贪夜蛾的可溶性海藻糖酶活与膜结合型海藻糖酶活均极显著降低，与对照组相比分别降低了88.7％和68.9％，这说明Validamycin对草地贪夜蛾海藻糖酶的抑制效果显著，特别是对可溶性海藻糖酶活具强的抑制作用。
4.草地贪夜蛾注射Validamycin 48h后体内糖含量的变化
分别取150μl上述3所述的20800×g离心的上清液、20800×g沉淀悬浮液至EP管中，制成样品，配置葡萄糖标曲。标曲和样品利用葡萄糖分析试剂盒(Sigma)，用酶标仪测540nm处的吸光度，进行葡萄糖含量测定，葡萄糖含量单位为nmol/μg protein。分别取30μl的1000×g上清、20800×g上清液、20800×g沉淀悬浮液至EP管中，制成样品。以1.6mM海藻糖标准液进行2×梯度稀释配制0.8mM、0.4mM、0.2mM、0.1mM、0.05mM用于制作标准曲线。利用蒽酮法处理样品与标曲，用酶标仪测630nm处的吸光度，进行海藻糖含量测定，总糖原含量单位为nmol/μg protein。取160μl1000×g上清样品加入32μl 0.1U/L的淀粉转葡萄糖苷酶，40℃水浴4h，取水浴后样品150μl至新的EP管中，加入300μl葡萄糖分析试剂，混匀，制成样品，配置葡萄糖标曲。利用葡萄糖分析试剂盒，用酶标仪测540nm处的吸光度，进行总糖原含量测定，总糖原含量单位为nmol/μg protein。结果如图2所示。
图2表明在显著抑制海藻糖酶活之后造成了海藻糖代谢紊乱，葡萄糖、海藻糖、糖原均较对照组相比含量上升，其中海藻糖的含量为极显著上升，糖原含量显著上升，葡萄糖含量虽然也上升了但是与对照组相比无显著变化。
实施例2：草地贪夜蛾注射Validamycin 48h后几丁质代谢相关蛋白调控的作用
1.草地贪夜蛾注射Validamycin 48h后几丁质酶活的变化
根据苏州科铭生物技术有限公司的几丁质酶(Chitinase)试剂盒说明书进行几丁质酶活测定，样品为实施例1中显微注射48h后的草地贪夜蛾幼虫，测定方法如下：称取约0.1g组织，加入1ml提取液进行冰浴匀浆，然后10000×g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测，测定操作见表2。根据吸光度值计算几丁质酶活性，计算公式为：几丁质酶活性(mg/h/g鲜重)＝(ΔA+0.2753)÷6.4108×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T×10＝3.899×(ΔA+0.2753)÷W(V反总：反应体现总体积，1ml；V样：反应体系中样品体积，0.4ml；V样总：加入提取液体积，1ml；W：样品质量，g；10，稀释倍数)。
表2几丁质酶活测定操作表
结果见图3所示，1μg/μl Validamycin也可显著抑制草地贪夜蛾的几丁质酶，与对照组相比注射Validamycin的几丁质酶活下降了52.7％，这说明对于草地贪夜蛾来说Validamycin不仅是强的海藻糖酶抑制剂，还是强的几丁质酶抑制剂。
2.草地贪夜蛾注射Validamycin 48h后几丁质含量的变化
首先将实施例1方法注射1μg/μl Validamycin 48h后的1头草地贪夜蛾用蒸馏水洗干净装入1.5ml的EP管中，用研磨棒研磨后于4℃下加入0.5ml的6％KOH溶液充分混匀，80℃水浴加热90min，于4℃12000×g离心20min，弃上清且沉淀重悬于1ml的PBS缓冲液中，再于4℃12000×g离心20min，弃上清且沉淀重悬于200μl的Mcllvaine’s buffer溶波中，加入5μl Chitinase from Streptomyces griseus水解几丁质，37℃温浴3d；然后12000×g离心1min取60μl的上清液加入60μl 0.27mol/L的硼酸钠混匀后12000×g离心1min，99.9℃水浴10min；取出降至室温后加入600μl 1×DMAB，最后37℃温浴20min，于585nm波长下测定吸光度值并计算几丁质含量。
结果如图4所示，注射了Validamycin的几丁质含量显著增高，是对照组几丁质含量的1.77倍，表明在抑制几丁质酶活后几丁质无法被降解从而积累。
实施例3：Validamycin对昆虫生长发育的效果评价
1.草地贪夜蛾注射Validamycin后的变态发育情况
对实施例1方法注射1μg/μl Validamycin的草地贪夜蛾每隔24h进行表型观察，畸形表型用相机(Canon，EOS 50D)拍摄，并于每天统计其化蛹率、羽化率、死亡率。图5所示，注射Validamycin的草地贪夜蛾化蛹率及羽化率与对照组相比无明显差异，但是自4龄起注射Validamycin的死亡率开始高于对照组的死亡率并且直到发育为成虫死亡率均一直高于对照组。与正常草地贪夜蛾相比注射Validamycin死亡的草地贪夜蛾因无法蜕皮而死的个数较多，且死亡个体与正常个体相比长度明显缩短，表明Validamycin对草地贪夜蛾的变态发育具一定影响。
2.草地贪夜蛾注射Validamycin 48h后的幼虫生长发育情况
对实施例1方法注射1μg/μl Validamycin的草地贪夜蛾每隔24h用直尺测量幼虫体长，待其化蛹后称量其蛹重并测量蛹长，同时观察草地贪夜蛾幼虫的蜕皮情况记录其自4龄起每个龄期所需的发育时间。图6A显示，注射Validamycin后草地贪夜蛾每个龄期的虫体长度与对照组相比基本无显著差异，但是发现化蛹后的蛹重与对照组相比增加了12.1％(图6B)。在图6C中，CK组的草地贪夜蛾在4龄、5龄、6龄、预蛹、蛹所需的发育时间分别为0.83天、1.37天、2.13天、1.76天、7.29天，注射Validamycin后4龄、5龄、6龄、预蛹、蛹的发育时间分别为1.93天、1.70天、2.97天、0.83天、7.88天，其中4龄、5龄、6龄、蛹的发育时间与对照组相比均显著长于对照组，仅预蛹时间显著短于对照组，但是总体发育历期显著长于对照组，这说明注射Validamycin能够使草地贪夜蛾发育缓慢。
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