具体实施方式

本发明的一个目的是提供包含鱼油和果汁的组合物在治疗炎症和/或其中炎症是病因的疾病/病症中的用途。WO 2007/064222(其为本发明人自己的专利)中描述了组合物和组合物的制备。

本发明中所使用的组合物在以下研究中显示为具有高生物利用度的ω-3来源，其中源自ω-3的脂质介质出人意料地在体内抗炎性过程中被有效递送和利用。

在本发明中，研究了组合物在治疗炎症和其中炎症是病因的不同疾病/病症中的用途。所述炎症或疾病/病症是ALS(肌萎缩侧索硬化)、包括MCI(轻度认知损害(mildcognitive impairment))的AD(阿尔茨海默病)、COPD(慢性阻塞性肺病)、URTI(上呼吸道感染)以及超重和肥胖。

用本发明的组合物治疗的疾病/病症的另一些实例是哮喘、囊性纤维化、类风湿性关节炎、手术后认知下降、卒中、冠状动脉疾病、糖尿病和代谢脆弱(metabolic frailty)。

同样，炎性肠病、创伤性脑损伤(脑震荡)、卒中恢复、恶病质和少肌症(sarcopenia)应该被提及为可从所述组合物受益的病症。

这些疾病的共同特征是潜在的炎症，特别是慢性炎症。

在下文中，呈现了多个研究和一些结果：

1.ALS(肌萎缩侧索硬化)

该研究的目的是研究11位ALS患者中体内的外周血单核细胞中基线炎性基因转录以及托珠单抗(tozilizumab，)的影响并且还测量了比较FRS-R得分(功能评定量表)的治疗之前和之后的残疾。Fiala等，(将要出版)。患者自由服用营养补充剂。三位患者服用了本发明中所用的组合物，转录结果与ALSFRS-R得分的结果(肌萎缩侧索硬化功能评定量表)一起呈现在实施例1中。

ALS是不治之症并且迫切需要新的治疗方法。在ALS患者中，脊髓和外周血中的炎症被清楚显出。炎症由通过胱天蛋白酶(caspase)1、白介素1(IL1)、IL6和趋化因子信号传到聚集的超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)活化巨噬细胞来驱动。

研究11位ALS患者中体内的外周血单核细胞中基线炎性基因转录和托珠单抗(细胞因子拮抗剂)输液的影响，托珠单抗抑制了全局白介素-6(IL6)信号传导，这是慢性类风湿性疾病中的关键机制。

研究中的患者自己报告ALSFRS-R得分。肌萎缩侧索硬化功能评定量表(ALSFRS-R)是0至48的得分，其利用MND评估患者中的残疾。其由Cedarbaum和同事开发(CedarbaumJM.The ALSFRS-R:a revised ALS functional rating scale that incorporatesassessments of respiratory function.BDNF ALS Study Group(Phase III).J NeurolSci 1999；169:13-21)。有十二个问题，一些询问关于日常活动以及患者需要多少帮助，并且一些关于特定症状。

总之，似乎使用本发明的组合物降低了炎性mRNA的表达并且显示出减缓了ALS的进展(通过FRS-R得分的下降测量的)。

进一步的细节参见实施例1以及图1A和图1B。

2.对来自ALS患者的巨噬细胞的研究

本研究是本发明研究1的后续研究。目的是研究来自ALS患者和对照的细胞样品中抗炎性介质的产生。

研究了来自ALS患者和对照的巨噬细胞样品。所述研究包括介质(如例如：RvD1、RvD2、RvE1、RvE2、7Mar1、PGE2、LXA4、18-HEPE、17-HDOH)的研究。

3.研究患有COPD的患者

本研究的目的是鉴定本发明的组合物在经受严重的(住院治疗的)恶化的患有COPD的患者中的潜在益处并且确定本发明对气管和全身性炎症生物标志物的影响并且最后确定本发明组合物对提高经历肺康复患者的运动能力的影响。

COPD是由对吸入气体和微粒的异常炎性应答引起的非常普遍的疾病。其是进行性病症，表现为影响气管和肺泡腔的肺病理学的发展，这导致可限制生活质量和功能性表现的症状。吸入的刺激物通常为烟草烟雾，但是职业性灰尘和环境污染会可变化涉及。炎症的特征在于炎症的特定模式，其中关键炎性细胞是巨噬细胞、CD8⁺、T-淋巴细胞和中性粒细胞。

近年来的研究已经确认COPD还影响除了肺以外的器官并且具有多种全身性表现。目前治疗策略的目标在于肺，使用吸入治疗是护理的现行标准。COPD患者的详细临床研究已经确认，许多个体表现出营养不良的证据，饮食通常是不良的并且肌肉功能受到损害。这导致利用现在指示具有低BMI或体重减轻病史的患者的口服补充剂提高营养状态的策略的开发。

富集口服补充剂(其提供潜在的附加治疗益处以简单地提高卡路里或蛋白质摄入)的开发在治疗这些通常具有提高的能量需求(可能由于提高的呼吸肌肉活动引起)并且同时咀嚼和吞咽均会受损的患者中尤其重要。然而，先前建议在COPD预防和管理中饮食和营养物可能是重要因素(Schools等)，因为体重减轻是重要的负面因素。参与研究的患者是45岁至80岁确诊的患者。试验周期长达六个月。

进一步的细节参见实施例2。

4.COPD 2

本研究是上述研究编号3的后续研究，并且包括模拟COPD中情况的细胞研究，其中研究了巨噬细胞和其他细胞的炎性标志物。研究的目的是比较本发明的组合物对细胞中炎症的影响，其中所述细胞经受本发明的组合物或者包含ω-3的其他组合物。

提出炎性标志物(尤其是TNF-α和IL-8)的修饰与COPD的高度相关。参见(Int J ofChronic Obstructive Pulmonary Disease 2010:5 217-222；Tumor necrosis factor-alpha levels in healthy smokers and nonsmokers)和Saris H等,Biochem Pharmacol2010,Mar1；79(5(:698-701；IL-8production by macrophages is synergisticallyenhanced when cigarette smoke is combined with TNF-alpha。

5.使用组合物对围手术期神经认知结果的影响。

本项目的目的是研究大外科手术之后ω-3必需脂肪酸补充(作为提高内生性消散素产生的方式)对通常影响整形外科患者的术后结果(包括认知功能和疼痛)的影响。

现行的假说是，在外科手术之前提前地，每天给予本发明的组合物补充4周，1)预防和改善手术后认知下降；2)缓解慢性和急性手术后疼痛的体征；3)在大整形外科手术之后改善组织/骨愈合。使用现有技术神经心理学测试。

作为探索性目的，我们测试了ω-3补充对健康志愿者的影响，以理解4周的每日SmartFish(本发明的组合物)对ω-3指数(血液中AA:EPA，ω-6:ω-3)和消散素生产有多大影响。总之，该研究探究了由ω-3必需脂肪酸提高的消散素生产与围手术期结果(认知、疼痛、愈合)之间的关系。

外科手术和危重病通常导致认知障碍，其目前仍然没有有效的预防性治疗。据估计急性认知功能障碍(谵妄)在14％至24％的普通住院治疗之后患者中发生，其中在亚急性和姑息情况中或在进入重症监护室(Intensive Care Unit，ICU)之后水平高达70％，经常见于尤其是在老年患者中(1)。外科手术和谵妄之后的认知轨迹(Cognitive trajectory)会在术后第一年期间进一步恶化，导致在多个方面长期干扰，包括学习和记忆、注意力集中、推理、抽象思维、语言理解、社会融合、方向感，并可造成永久痴呆。受损的认知恢复(无论是急性或长期持久的)还与更高的一年死亡率、功能下降相关并代表了医疗保健成本的显著负担。

使用整形外科手术(其经常在人中导致认知功能障碍)的小鼠模型，我们先前定义了神经炎症的发生和外科手术诱发的认知下降背后的全身性炎症的关键作用。近年来，我们首次报道了消散素在小鼠整形外科手术之后调节手术后神经炎症和认知下降中的新作用。

消散素和保护素是在自限性炎症消退期间由n-3脂肪酸的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)产生的局部脂质介质家族。Serhan等首先描述了来自多不饱和脂肪酸的这些强效抗炎性和专门性促消退脂质介质(specialized proresolving lipidmediator，SPM)。这些包括来自花生四烯酸的脂氧素、源自长链n-3脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)的E-系列消散素以及源自n-3脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)的D-系列消散素保护素/神经保护素和maresin。越来越多的证据表明消散素在缺血再输注、实验性结肠炎、微生物败血症、卒中等之后免受多种临床疾病模型(例如肾损伤)中的作用。啮齿动物模型中，RvD1也涉及减轻炎性和手术后疼痛二者的抗伤害感受剂(antinociceptive agent)。最近，RvD1和17R差向异构体AT-RvD1两者在健康供体外周血中进行鉴定，但是没有研究评估SPM在围手术期情况和作为较差外科手术预后的生物标志物的作用。

进一步的细节参见实施例3。

6.对囊性纤维化的研究

本研究的目的是研究在患有囊性纤维化的患者中长期补充脂肪酸(即本发明的组合物)对临床状态的影响。

自50多年前，公知的是患有囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)的患者具有低水平的必需脂肪酸亚油酸(linoleic acid，LA)，而且在血浆和组织中的长链多不饱和脂肪酸(long-chain polyunsaturated fatty acid，LCPUFA)DHA降低(Kuo PT,Huang NN,BassettDR.,J Pediatr 1962；60:394-403；Underwood BA,Denning CR,Navab M.,Ann NY AcadSci1972；203:237-47)。1975之后，当新生儿施用Intralipid后恢复胰腺功能时(Elliott RB,Robinson PG.,Arch Dis Child.1975Jan；50(1):76-8)进行了多个短期的试验，显示出对生长(Kusoffsky E等,JPGN 1983；2(3):434-8；Steinkamp G等,JPGN 2000；34:418-23；Maqbool A等,JPGN 2008；47:635-44)和肺功能(Lloyd-Still JD等,ActaPediatr 1996；85:1426-32；Lai HJ等,Pediatrics.2009,2月；123(2):714-22)的较小影响。将ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸组合的最近研究显示，与仅补充ω-3脂肪酸(未获得临床益处)相比，一些参数的显著提高(Oliveira G等,tic Arch Bronconeum.2010；46(2):70-77Oliver C,JahnkeN,Cochrane Database SystRev.2011,Aug 10；(8):CD002201；Alicandro G等,Prostagland Leurkotr Ess Fatty Acids 2013；88:163-9)。鉴定基因之前进行的长期小对照研究中，在肾和肝参数中发现了改善(Strandvik B.Acta Paediatr Scand 363:58-65,1989；Strandvik B.Ann Nestlé2006；64:131-40)。与其他国际中心相比，在瑞典的CF患者中，非常长期但无对照地用富含ω-6的油和Intralipid治疗导致了在相对大的患者群中关于生长、骨矿物质密度、肺功能、减轻肺部加重和低临床感染状态非常良好的临床状况(Strandvik B.,Ann Nestlé2006；64:131-40)。然而，缺乏长期对照研究，所以其他治疗方式(如早期高身体活动)有可能对瑞典患者的良好临床状态具有较大的重要性。在这项研究中，包括50名携带2个严重突变(例如dF508，394delTT)的CF和胰功能不全的患者。患者保持其PERT和维生素以及对于肺部症状和感染的普通治疗。患者每日随机接受具有LA的果汁(900mg)和本发明的组合物(DHA 400mg，EPA 200mg)，或高油酸向日葵油(1.5g)12个月。随机化是由发生器产生并只对25ml的果汁进行编号，所以患者和护理人员将都不被告知补充的类型。

进一步的细节参见实施例4。

7.根据本发明的组合物选择性地改善超重和肥胖青少年的胰岛素敏感性，其中基线代谢类型预测应答

该研究的目的是研究本发明的组合物是否将改善14至18岁儿童的胰岛素敏感性。

改变膳食摄入，从而使更多的儿童消耗高脂肪、能量密集和微量营养物稀释的饮食(IUNA，2008)。大于56％的爱尔兰青少年>35％的能量来自膳食脂肪，并且三分之一的青少年根本不食用水果(IUNA，2008)。这种模式的膳食摄入不符合健康饮食指南，并且这种不平衡的营养物摄入正在驱动这个年轻群体中超重和肥胖的普遍增多(Jennings A,WelchA,van Sluiis EM,Griffin SJ,Cassidy A(2011)Diet Quality is independentlyassociated with weight status in children aged 9-10years.J Nutr.141(3):453-9)。

肥胖和糖尿病的新型模型的特征在于亚急性慢性炎症和胰岛素抵抗(Hu FB,Meigs JB,Li TY,Rifai N,Manson JE.Inflammatory markers and risk of developingtype 2diabetes in women.Diabetes 2004；53:693–700.Irish Universities NutritionAlliance(IUNA).2008.National Teen’s Food Survey)。机理数据表明提高免疫细胞浸润的发炎脂肪组织产生促炎性细胞因子(Weisberg,S.P.,等,Obesity is associated withmacrophage accumulation in adipose tissue.J Clin Invest,2003.112(12):第1796-808页；Nishimura,S.,等,CD8+effector T cells contribute to macrophagerecruitment and adipose tissue inflammation in obesity.Nat Med,2009.15(8):第914-20页)。

这些细胞因子依次通过下调胰岛素信号传到途径的关键组分来妨碍胰岛素敏感性(McGillicuddy FC,Chiquoine EH,Hinkle CC,Kim RJ,Shan R,Roche HM,Smyth EM和Reilly MP(2009)IFNγattenuates insulin signalling,lipid storage anddifferentiation in human adipocytes via activation of the JAK/STAT pathway.JBiol Chem.284(46):31936-44)。然而儿童肥胖正在世界范围内提高，这种促炎性状态及其代谢综合征和糖尿病预测的影响在早期生活中是相对未知的。

随着儿童肥胖以迅速的步伐提高，重要的是建立非药理学治疗在降低超重和肥胖儿童中所见的亚急性慢性炎症中的作用。先前的研究已经说明：在成人中，膳食干预可减弱伴随肥胖的慢性炎性状态(Bakker GC,van ErkMJ,Pellis L,Wopereis S,Rubingh CM,Cnubben NH,Koositra T,van Ommen B,Hendriks HF.An anti-inflammatory dietarymix modulates inflammation and oxidative and metabolic stress in overweightmen:a nutrigenomics approach.Am J Clin Nutr 2010,Apr；91(4):1044-59)。

一些食品含有已知具有抗炎性特性的营养物(Puglisi MJ,FernandezML.Modulation of C-reactive protein,tumor necrosis factor-alpha,andadiponectin by diet,exercise,and weight loss.J Nutr.2008,Dec；138(12):2293-6)。这样的食品包括鱼以及水果和蔬菜。

本研究的结果表明本发明组合物的胰岛素增敏作用的异质性。尽管非应答者的相似BMI，应答者的胰岛素抵抗和血脂异常代谢类型增强了抗炎性营养方法的影响。这举例说明了个体化营养的情况中的潜在效力优化。进一步细节参见实施例5。

8.对糖尿病和冠状动脉疾病的研究

该研究的目的是研究ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)是否涉及改善患有2型糖尿病和冠状动脉疾病的患者中的凝血、血小板活化、炎症和氧化应激的生物标志物。

患有2型糖尿病和冠状动脉疾病的患者的心血管事件风险在提高。在糖尿病患者中，冠状动脉疾病是发病率和死亡率的最常见的病因。已经假定高血糖在冠状动脉疾病中的有害影响中涉及的数种机制，即，增强的氧化应激、血液凝固和血小板的活化、炎症的刺激和内皮细胞功能障碍。所有这些也已在2型糖尿病中进行了报道(Undas A,Ariens RA.,Arterioscler Thromb Vasc Biol.2011,Aug 11.[Epub ahead of print]PubMed PMID:21836064；Undas A等,J Thromb Haemost.2011,Apr；9(4):870-3.doi:10.1111/j.1538-7836.2011.04198.x.PubMed PMID:21251200；Undas A等,Blood.2009,Nov 5；114(19):4272-8.Epub 2009Aug 18.PubMed PMID:19690336)。此外，我们已经表明：在糖尿病患者和体外的条件两者下的高血糖与提高凝血酶生成和血小板活化有关，不利地改变了纤维蛋白凝块性质并降低了纤维蛋白溶解。

我们最近还证明：将n-3PUFA添加至阿司匹林和氯吡格雷组合中显著增强了经皮冠状动脉介入之后血小板对氯吡格雷的应答(Celinska-Lowenhoff M等,kow).ThrombHaemost.2011,Aug；106(2):379-81.Epub 2011,Jun 9.PubMed PMID:21655678)。

另外，我们已经证明，添加至经历PCI的冠状动脉疾病患者的标准治疗中的n-3PUFA显著降低了凝血酶的形成、氧化应激并有利地改变纤维蛋白凝块性质(Gajos G等,(OMEGA-PCI clot).Arterioscler Thromb Vasc Biol.2011,Jul；31(7):1696-702.Epub2011,May 26.PubMed PMID:21617138)。

n-3PUFA上的这些性质可尤其有益于患有冠状动脉疾病和伴随糖尿病的患者。

进一步细节参见实施例6。

9.对运动诱发的哮喘、呼吸生理学和炎症的研究

研究的目的是检查激发测试(provocation test)之后呼出的一氧化氮。运动之前和之后，参与者服用200ml(本发明的组合物)一天两次(4g DHA/EPA/天)。在与研究组相同的时间，对照组接受饮品一天两次。

10.在运动员群体中对URTI(上呼吸道感染)之影响的研究。

该研究的目的是研究在本发明组合物(下文中，Smartfish果汁或只是Smartfish)膳食摄入对运动员群体中URTI发生率的影响。

运动对URTI发生率的影响是重要的，不仅考虑到比赛运动员和休闲运动者，而且考虑到特定群体(例如，老年人)已经由于免疫系统受损而处于危险中。

结果表现出在用Smartfish治疗的组中每个患者URTI发作数量降低并且症状总天数显著降低的趋势。

因此，结果表明本发明的组合物可用于治疗上呼吸道感染。

进一步细节参见实施例7。

11.LPS刺激的巨噬细胞的免疫调节作用

该研究的目的是研究本发明的组合物(下文中，Smartfish果汁或只是Smartfish)是否对在LPS处理的巨噬细胞培养物的炎性过程具有积极影响，并比较Smartfish果汁与良好品质鱼油的影响。

从该研究中证明Smartfish果汁降低了来自LPS刺激的人巨噬细胞的促炎性细胞因子TNF-α的分泌。此外，已证明在LPS刺激的人巨噬细胞中，Smartfish果汁降低了炎症和应激应答中涉及的基因(tnf-α、IL8、nfκb、gpx和bax)的表达。Smartfish果汁的影响比类似良好品质的对照鱼油显著更好。

进一步细节参见实施例8。

12.来自AD患者的巨噬细胞中的消散素水平

研究的目的是检查抗炎性介质消散素D1的产生并研究在患有阿尔茨海默病患者的细胞样品中本发明的组合物(下文中称为Smartfish)是否具有提高消散素D1量的能力。

如先前所提到的消散素是源自EPA和DHA的氧化代谢物，即使是在纳摩尔至皮摩尔浓度范围中，其也具有强大的抗炎和免疫调节作用。

来自该研究的结果清楚地表明：本发明的组合物显著有助于提高巨噬细胞中的消散素水平。

进一步细节参见实施例9。

上面提到的研究的主要焦点是揭示本发明中所使用的组合物在治疗炎症和/或其中炎症是基本病因的疾病中的出人意料地有益影响。

这些研究的结果表明：炎性过程被改变并且炎症应答之后的恢复也得到改善。因此，认为使用本发明的组合物对患有慢性炎症(因为本发明的组合物提供了营养支持的目的)和疾病(通过ω-3代谢物的供应改善了炎症之后恢复平衡的营养活性在愈合过程中是重要的)的患者有益。

本发明所用的组合物作为海洋生物乳剂(marine emulsion)表现出具有高的稳定性，并且可具有低的氧化并保持脆弱营养物完整和强效，这进而导致了吸收的提高和高的生物利用度。

组合物包含：

a)脂肪酸，其具有低totox值，尤其是足以获得医学和/或营养作用的浓度的ω-3脂肪酸，和

b)包含天然存在的抗氧化剂的果汁；

c)乳化剂。

WO 2007/064222中描述了组合物的不同方面，但是组合物的进一步修饰可用于本发明。

组合物中的鱼油通常导致不期望的鱼的味道和余味。用于本发明的组合物具有为例如好味道饮品的优点，这可以是经历味道改变和食欲不振的患者的重要先决条件。

因此，本发明的一个方面涉及作为水包油型乳剂的包含鱼油和果汁之组合的组合物在治疗炎症和/或其中炎症是病因的疾病中的用途，其中所述鱼油选自totox值低于20并且基于鱼油的总重量ω-3含量按重量计高于10％的鱼油，并且其中使用合适的乳化剂来稳定乳剂。

使用本发明的组合物可有利于治疗任何炎症或其中炎症是病因的疾病。

在本发明中，研究了组合物在治疗炎症和其中炎症是病因的不同疾病/病症中的用途。所述的炎症或疾病/病症为ALS(肌萎缩侧索硬化)、包括MCI(轻度认知损害)的AD(阿尔茨海默病)、COPD(慢性阻塞性肺病)、URTI(上呼吸道感染)以及超重和肥胖。

在另一个实施方案中，本发明的组合物可用于治疗选自以下组或其任意组合的疾病：哮喘、囊性纤维化、类风湿性关节炎、手术后认知下降、卒中、冠状动脉疾病、糖尿病和代谢脆弱。

同样，炎性肠病、创伤性脑损伤(脑震荡)、卒中恢复、恶病质和少肌症应该被提及为可能从组合物受益的可能的病症。

鱼油可选自合适品质(即氧化的水平应该较低)的任何鱼油制剂。为了获得合适的品质，作为totox值所给出的氧化水平(2倍的过氧化值(peroxide value，PV)加上茴香胺值(anisidine value，AV))应该低于20。在一个优选实施方案中，totox值可低于10。这种合适品质的鱼油通常为具有非常弱的鱼腥味和味道的澄清油。

在不同鱼油制剂中，ω-3脂肪酸的含量大为不同。优选ω-3脂肪酸的含量较高。根据一些优选实施方案，用于本发明组合物的鱼油中ω-3脂肪酸的含量应该为基于鱼油的重量按重量计至少10％，优选至少16％或者最优选高于30％。

本发明的一个优选实施方案提供了这样一种组合物，其中鱼油的含量为基于组合物的总重量按重量计约0.5％至15％，更优选地为2％至7％，最优选为约2％至5％。

在本发明的另一些实施方案中，果汁的含量为基于组合物的总重量按重量计约20％至95％。果汁可选自具有合适高水平抗氧化剂的水果和/或浆果。进一步优选的是水果具有最小水平的起氧化剂作用的金属离子。

优选的果汁可选自以下的组：石榴、杏、葡萄柚、柑橘(orange)、蔓越莓(cranberry)、玫瑰果(rosehip)、菠萝、黑果腺肋花楸(black chokeberry)、桑葚(mulberry)、云莓(cloudberry)、针叶樱桃(acerola)、覆盆子(raspberry)、西瓜、桃、葡萄、樱桃、蒲桃(jambolao)、苹果、芒果、梨、野樱梅(aronia)、百香果(passion fruit)、柠檬和猕猴桃(kiwi)。此外，果汁可选自甜菜根、胡萝卜、越橘(lingonberry)(牙疙疸(cowberry))、番石榴(quava)、黑莓(blackberry)，或绿色蔬菜(greens)如羽衣甘蓝(kale)、菠菜、芹菜、欧芹(parsley)或黄瓜。然而，可使用适用于稳定鱼油氧化的任何果汁。可通过将水添加至果汁浓缩液和果汁原浆(juice purée)中获得正常即用果汁来制备果汁。果汁还可以是鲜榨果汁(fresh pressed juice)。

另外，根据本发明所使用的组合物可包含酸奶粉末或其他粉末，例如大麻奶粉(hemp milk powder)、杏仁奶粉或燕麦奶粉。通过添加这样的添加剂，使组合物增稠得到诱人的稠度。所添加的量可以是基于组合物的总重量按重量计5％至10％。

在一个实施方案中，组合物不含任何乳品成分。

组合物中还可添加维生素，优选维生素D。作为一个实例，维生素D的量为每200ml单位剂量中1μg至2000μg，优选每200ml单位剂量中5μg至50μg，最优选每200ml单位剂量中10μg至20μg。还可添加包括叶酸的维生素B。同样，可添加如硒和锌的矿物质。

为了稳定包含鱼油和果汁的水包油型乳剂，使用合适的乳化剂。合适的乳化剂可选自以下的组：乳固体(milk solid)、乳清蛋白、燕麦蛋白和豌豆蛋白(pea protein)。乳化剂可以是例如Grindsted或Lacprodan，但是可使用任何合适的乳化剂。此外，本发明可包含增稠剂，所述增稠剂可优选为优选来自燕麦的果胶，更优选来自水果(例如柑橘属)的果胶。

在本发明的又一个优选实施方案中，组合物可包含甜味剂、矫味剂、抗氧化剂和防腐剂。优选的防腐剂和甜味剂可分别为山梨酸钾和木糖醇。

根据本发明的一种优选抗氧化剂是生育酚。

在一个实施方案中，组合物不添加任何额外的天然不存在的抗氧化剂。

在本发明的又一个优选实施方案中，组合物可以以约300mg/天至约5000mg/天，优选约3000mg/天，更优选约2000mg/天并且最优选约1100mg/天的EPA和DHA的剂量施用。为了实现治疗效果，剂量可以更低或者甚至更高。组合物可以以50ml至300ml，优选100ml，更优选200ml的体积范围作为饮品施用。需要本发明组合物的人可每天饮用一个或若干个单位剂量的饮品。体重等将是用于剂量计算的参数；因此，剂量可在个体之间各不相同。

在本发明的一个优选实施方案中，组合物可以是可饮用的、是胶囊形式或粉末形式。

在另一个实施方案中，本发明组合物可被用作辅助治疗或者与所使用的其他治疗剂组合使用以治疗特定疾病或紊乱，例如，用于治疗所涉及的炎性疾病或者其中炎症是病因的疾病的常规药物。

术语“组合”意指将本发明组合物和其他治疗剂以这样的量施用并通过这样的施用时间分离以产生治疗效果。本发明组合物和其他治疗剂可以同时施用或者先后用于治疗其中炎症是病因的疾病的炎症。本发明组合物和其他治疗剂可以是单独制剂的形式或在组合制剂中配制在一起。“其他治疗剂”中包括放射治疗。

WO 2007/064222中描述了组合物的一些不同方面，但是组合物的进一步修饰可用于本发明。因此，本发明的一个方面涉及包含乙酰水杨酸和/或其衍生物和/或类似物的所述组合物以及所述组合物用于治疗炎症和/或其中炎症是病因的疾病的用途。

最近已经表明：阿司匹林帮助触发消散素的产生，进一步报道：阿司匹林通过不同的途径触发更长效形式的消散素D3的产生。切断这些消散素或消退炎症成为破坏性病症(例如炎性肺病、心脏病和关节炎)的基础。

在一个实施方案中，所述炎症和/或其中炎症是病因的疾病是ALS(肌萎缩侧索硬化)、包括MCI(轻度认知损害)的AD(阿尔茨海默病)、COPD(慢性阻塞性肺病)、URTI(上呼吸道感染)以及超重和肥胖。

在另一个实施方案中，本发明的组合物可用于治疗选自以下组或其任意组合的疾病：哮喘、囊性纤维化、类风湿性关节炎、手术后认知下降、卒中、冠状动脉疾病、糖尿病和代谢脆弱。

同样，在炎性肠病、创伤性脑损伤(脑震荡)、卒中恢复、恶病质和少肌症中应该被提及为可从组合物受益的病症。

因此，本发明的一个方面涉及包含作为水包油型乳剂的鱼油和果汁之组合以及20mg/剂量至200mg/剂量的乙酰水杨酸和/或其衍生物的组合物的用途，其中所述鱼油选自totox值低于20并且基于鱼油的总重量ω-3含量按重量计高于10％的鱼油，并且其中使用合适的乳化剂来稳定所述乳剂。

鱼油可选自适当品质的任何鱼油制剂，即氧化水平应该低。为了具有适当的质量，作为totox值给出的氧化水平(2倍过氧化值(PV)加上茴香胺值(AV))应该为低于20。在一个优选的实施方案中，totox值可低于10。适当品质的这种鱼油通常为具有非常轻微鱼腥气味和味道的澄清油。

在不同鱼油制剂中，ω-3脂肪酸的含量大为不同。优选的是ω-3脂肪酸的含量较高。根据一些优选的实施方案，本发明组合物中所使用的鱼油中的ω-3脂肪酸含量应该为基于鱼油的重量按重量计至少10％，优选至少16％或者最优选地高于30％。

在本发明的一个优选实施方案中，提供了一种组合物，其中鱼油含量为基于组合物的总重量按重量计约0.5％至15％，更优选2％至7％，最优选约2％至5％。

在本发明的一个实施方案中，乙酰水杨酸的含量可以是20mg/剂量至2000mg/剂量，优选50mg/剂量至1000mg/剂量，更优选80mg/剂量至500mg/剂量。甚至更低或更高的剂量可以是优选的。

在本发明的另一些实施方案中，果汁的含量为基于组合物的总重量按重量计约20％至95％。果汁可选自具有合适高水平抗氧化剂的水果和/或浆果。进一步优选的是，水果具有最低水平的起氧化剂作用的金属离子。

优选的果汁可选自以下组：石榴、杏、葡萄柚、柑橘、蔓越莓、玫瑰果、菠萝、黑果腺肋花楸、桑葚、云莓、针叶樱桃、覆盆子、西瓜、桃、葡萄、樱桃、蒲桃、苹果、芒果、梨、野樱梅、百香果、柠檬和猕猴桃。此外，果汁可选自甜菜根、胡萝卜、越橘(牙疙疸)、番石榴、黑莓，或绿色蔬菜如羽衣甘蓝、菠菜、芹菜、欧芹或黄瓜。然而，可使用适用于稳定鱼油氧化的任何果汁。可通过将水添加至果汁浓缩液和果汁原浆中获得正常即用果汁来制备果汁。果汁还可以是鲜榨果汁。

此外，根据本发明所使用的组合物可包含酸奶粉末或其他粉末，例如大麻奶粉、杏仁奶粉或燕麦奶粉。通过添加这样的添加剂，使组合物增稠得到诱人的稠度。所添加的量可以是基于组合物的总重量按重量计5％至10％。

在一个实施方案中，组合物不含任何乳品成分。

组合物中还可添加维生素，优选维生素D。作为一个实例，维生素D的量为每200ml单位剂量中1μg至2000μg，优选每200ml单位剂量中5μg至50μg，最优选每200ml单位剂量中10μg至20μg。还可添加包括叶酸的维生素B。同样，可添加如硒和锌的矿物质。

为了稳定包含鱼油和果汁的水包油型乳剂，使用合适的乳化剂。合适的乳化剂可选自以下的组：乳固体、乳清蛋白、燕麦蛋白和豌豆蛋白。乳化剂可以是例如Grindsted或Lacprodan，但是可使用任何合适的乳化剂。此外，本发明可包含增稠剂，所述增稠剂可优选为优选来自燕麦的果胶，更优选来自水果(例如柑橘属)的果胶。

在本发明的又一个优选实施方案中，组合物可包含甜味剂、矫味剂、抗氧化剂和防腐剂。优选的防腐剂和甜味剂可分别为山梨酸钾和木糖醇。

根据本发明的一种优选抗氧化剂是生育酚。

在一个实施方案中，组合物不添加任何额外的天然不存在的抗氧化剂。

在本发明的又一个优选实施方案中，组合物可以以约300mg/天至约5000mg/天，优选约3000mg/天，更优选约2000mg/天并且最优选约1100mg/天的EPA和DHA的剂量施用。为了实现治疗效果，剂量可以更低或者甚至更高。组合物可以以50ml至300ml，优选100ml，更优选200ml的体积范围作为饮品施用。需要本发明组合物的人可每天饮用一个或若干个单位剂量的饮品。体重等将是用于剂量计算的参数；因此，剂量可在个体之间各不相同。

在本发明的一个优选实施方案中，组合物可以是可饮用的，胶囊形式或粉末形式。

实施例

实施例1

ALS

在基线下，与年龄匹配的对照相比，10位ALS患者的外周血核细胞(PBMS)表现出炎性基因的上调(组1)或下调(组2)。在基线下，一半的ALS对象具有强的炎性活化(组1)(与对照相比，8个基因上调>4倍,P<0.05)并且另外一半(组2)具有弱的活化(组2)。所有患者表现出MMP1、CCL7、CCL13和CCL24上调大于4倍。组1患者中的托珠单抗输注与炎性基因的下调相关，而组2患者中的这些基因上调。

炎症作为细胞因子(白介素-1β(IL1β)、IL6、TNFα)的炎性基因存在于外周血中，并且在组1中ALS患者的外周血单核细胞中的趋化因子(CCL3、CCL20、CXCL2、CXCL3、CXCL5)高度上调。

两位接受本发明组合物的患者表现出炎性基因强的下调。

在一位所述患者中，6个基因上调并且26个基因下调。在组1的基线下，11个基因上调并且21个基因下调。在对照中，10个基因上调并且24个基因下调(图1A)。在第二位所述患者中，4个基因上调并且28个基因下调。在组1的基线下，8个基因上调并且13个基因下调(图1B)。

总之，似乎使用本发明的组合物降低了炎性mRNA的表达。

在组1(高炎症)和组2(低炎症)中所有患者治疗之前FRS-R得分的比较表明：组1中每月的下降(范围为0.59至2.6)高于组2(范围为0.3至0.7)。在表1中，五位患者用编号1治疗8个月，编号2治疗2个月，编号6治疗4个月，编号7治疗5个月以及编号11治疗4个月(表1)。三位患者表现出每月FRS-R点损失的强烈减弱，编号1：2.6损失至0.4损失，编号6：从0.7损失至1点提高，编号11：从3.5损失至0.5损失。所述三位患者是接受本发明组合物的患者。总之，看来使用组合物减缓了ALS进展(如通过FRS-R得分下降所测量的)。

表1

*患者#

**组1＝强炎症；组2＝弱炎症

***在第一次血液测试时

实施例2

COPD

这项研究设计是随机化安慰剂对照临床试验。研究人群是适于早期康复计划的初步诊断为COPD恶化而进入医院的对象。20位对象，每个治疗臂中10位。患者在40岁至80岁之间。患者接受本发明的组合物。

入选标准为：

1.确诊为COPD并且初步入院诊断为COPD恶化的进入UHS的45岁至80岁的患者。

2.愿意提供参与研究的书面同意书。

3.能够参与所有研究过程的对象。

排除标准为：

1.不能咽下口服补充剂或安慰剂的患者。

2.已知不耐受补充剂或安慰剂的任何组分的患者。

3.在收治期间需要插管和通气(ventilation)或无创通气的患者。

4.已经接受口服营养补充剂的患者。

5.长期服用口服类固醇或其他全身性免疫抑制药物的患者。

6.具有在研究者看来会混淆研究结果的共存疾病(co-morbidities)的患者，包括活跃癌症诊断、不受控制的糖尿病、不受控制的心脏病(包括心律失常、心力衰竭和心绞痛)、TB、痴呆。

7.在研究者看来不适合临床参与研究的任何对象。

评估方法为：

1)症状、生理学变量和相关不良事件的临床指标。

2)对血液、呼出的空气和痰进行的临床实验室评价(严重程度、免疫应答和生物标志物)。

3)肺功能的变化以及功能状态和身体组成的测量。

4)呼吸症状的日志(daily diary)。

统计学方法：

人口统计学：提供描述性统计学。

不良事件：描述。

MITT分析治疗臂与安慰剂臂之间结果的差异。

实施例3

围手术期神经认知结果

研究设计：

随机化的安慰剂对照设计包括在局部或全身麻醉下经历选择性全髋关节置换的患者。

功效分析(power analysis)。

在口头和书面知情同意书之后，研究中包括计划了整形外科手术的老年高危患者>65岁(男性和女性)。在外科手术前，患者被随机分配饮用(ω-3补充组)或安慰剂对照饮品4周。

入选标准：

1.超过65岁的男性和女性的患者。ASA身体状况I-II

2.全髋关节置换

3.获得同意书

排除标准：

1.患者拒绝参与试验

2.持续吸烟/使用尼古丁

3.失能神经精神紊乱(MMSE得分≤24，诊断为痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂、精神抑郁)或显著认知下降的其他体征

4.具有神经学后遗症的卒中病史

5.计划了区域麻醉的外科手术

6.严重心和/或肾和/或肝损害

7.凝血病

8.慢性疾病的终端阶段

9.服用非甾体类抗炎药(NSAID)的患者

10.承认为B-葡萄糖>15mmol/L控制不良的糖尿病的患者

11.假定的不合作或无法律行为能力(legal incapacity)

12.手术前或随后手术后B-血红蛋白<90g/L

13.BMI值>25或<18.5

14.食物过敏、不耐受乳糖或存在于饮品中的其他成分

对象退出：

研究对象可以在任何时间自由永久终止其参与预定的研究评估而不需要提供理由，或研究对象也可通过其法定代表人永久停止。如果调查者因为任何医疗理由而推荐，研究对象也可以永久终止其参与这项研究。所有退出理由都记录在参与者CRF上。

研究设计概述：

外科手术前约4周，同意的对象随机使用计算机生成的代码来接受(本发明的组合物)或安慰剂对照饮品。信息收集：

1.人口统计学(体重、身高(length)、BMI)和常规生命体征记录(例如，血压、脉搏率)。

2.静脉血取样(总体积为10ml的静脉血，用于炎性生物标志物、离体全血试验和ω-3指数)。

3.手术前认知成套测试(test batter)(根据ISPOCD协议，参见Moller JT等，Lancet 1998)。

4.以NPS方式的疼痛(pain ad modum NPS)。

在外科手术之前，患者进入手术前单元以经历：

1.体重和常规生命体征记录

2.静脉血取样(总体积为10ml的静脉血，用于炎性生物标志物、离体全血试验和ω-3指数)

3.手术前认知成套测试(根据ISPOCD协议)

4.疼痛NPS(累积疼痛的评估)

在外科手术当天，向研究组成员再次施加电子CRF以记录外科手术之前、期间、之后的标准生命体征。外科手术期间，在植入物插入时收集5ml血液并且外科手术结束时收集5ml血液来测量炎性生物标志物。外科手术之后，收集多至24小时的尿。然后，将患者转移至手术后单元，在此以VAS的方式记录额外的生命体征，包括疼痛和PONV得分。通过每天两次(即早上和晚上)记录NPS，评估外科手术之后在最初72小时期间的手术后疼痛。每隔24小时，记录两个研究组的IV和口服对乙酰氨基酚(mg/24小时)、非甾体抗炎化合物(mg/24小时)和阿片样物质(mg/24小时，在转换成经口阿片样等同物之后)的总消耗。72小时之后，NPS的每日测量(早晨和晚上)以及NSIAD(mg/24小时)和阿片类物质(mg/24小时，在转换成经口阿片类等同物之后)的消耗通过自施用的患者问卷来收集。

从手术后第一天到手术后第三天，连续记录相关生命体征，包括睡眠日志、疼痛和PONV得分。外科手术之后一周(或尽可能接近)，患者返回到手术前单元以记录：

1.常规生命体征并分析B-血红蛋白以确保手术后血红蛋白水平>90g/L(参见上文排除标准)

2.静脉血取样(总体积为10ml的静脉血，用于炎性生物标志物和ω-3指数)

3.手术后认知成套测试(根据ISPOCD协议)

外科手术之后三个月(约90天)，患者返回至手术前单元以记录：

1.常规生命体征并分析B-血红蛋白以确保手术后血红蛋白水平>90g/L(参见上文排除标准)

2.静脉血取样(总体积为10ml的静脉血用于炎性生物标志物、离体全血测试、ω-3指数，并且额外10ml用于炎性生物标志物的基因分析)

3.手术后认知成套测试(根据ISPOCD协议)

在电子CRF中记录研究协议的所有以下部分：生命体征数据、认知测验结果、实验室测试以及疼痛相关的信息、PONV和睡眠卫生并保存在计算机中用于进一步的分析。

实施例4

囊性纤维化

在知情同意之后，包括50位具有携带2个严重突变(例如，dF508，394delTT)和胰腺功能不全的CF患者。排除标准为妊娠、移植和低于6岁至7岁的年龄(由于囊的尺寸和肺功能测试)。患者保持其普通PERT和维生素治疗和用于治疗肺部症状和感染的治疗。患者每天随机化接受包含具有LA(900mg)和ω3-LCPUFA(DHA 400mg，EPA 200mg)或橄榄油(1.5g)之果汁的本发明组合物(本发明的组合物)12个月。随机化是由发生器产生并且只有对200毫升的果汁进行编号，所以患者和照顾者都不被告知补充的类型。

方法：

在治疗的开始和结束时进行食品登记(24小时召回)，包括食品频率问卷。在6个月进行额外24小时召回用于没有在与脂肪酸相关的普通饮食中发生变化的对照。

在研究开始和结束时，CF患者将进行年度检查，所以除了分析8-异前列烷(isoprostane)的尿样品(以检查脂质过氧化)以外不需要进行额外的调查。在开始和结束时检查血浆细胞因子和常规感染参数(WBC、CRP、Ig G、IL-6、Il-8)和肝功能测试(ASAT、ALAT、γGT、PK)和肾测试(尿素、肌酸酐)。肺测试(包括NO和FEV 1)也包括在年度检查中。在所有患者中，感染恶化数目与前一年同一时间的感染恶化数目进行比较。

结果:

初步结果：生长(体重、身高、BMI、皮肤皱襞(skin fold)、MMAC)。二次结果：感染和抗生素治疗数目。感染参数。

实施例5

超重和肥胖

根据本发明的组合物选择性地提高超重和肥胖青少年的胰岛素敏感性，其中基线代谢类型预测应答。

介绍：

抗炎性营养方法可减弱肥胖诱导的胰岛素抵抗。然而，临床研究的结果并不完全一致，保证更加注重对象间可变性(特别是年轻群体中)处于高风险下的决定因素。基线代谢类型可部分地辨别应答者与非应答者。

研究的方法：

通过8周的随机化、交叉、安慰剂对照干预，在超重和肥胖青少年(n＝58；平均值±SD年龄15.9±1.6岁；BMI 32.1±6.5kg/m²)中，确定本发明组合物的代谢作用。证明HOMA-IR中>10％的改善的对象(稳态模型评估；使胰岛素抵抗量化的模型)被归类为应答者。

结果：

本发明的组合物充当抗炎性营养补充并且选择性地降低了40％对象中的HOMA-IR(应答者；补充剂-32.05±18.02％相对于安慰剂13.13±54.09％，p＝0.004)。与非应答者相比，应答对象表现出不利的预治疗代谢类型，其特征在于HOMA-IR、总胆固醇和LDL胆固醇提高，尽管BMI相似(分别为p＝0.001、p＝0.029、p＝0.024、p＝0.236)。逐步多个回归分析证实基线HOMA-IR和LDL:HDL比例为HOMA-IR应答于抗炎性补充的显著的独立预测因子(R²＝0.432，p<0.001)。正在进行的分析定义了差异应答的分子基础。

结论：这些结果表明异质性相对于本发明组合物的胰岛素增敏效果。尽管与非应答者BMI类似，应答者的胰岛素抵抗和血脂异常的代谢类型也增强了抗炎性营养方法的影响。这举例说明了个性化营养的情况下潜在效力的优化。

下表2示出了在超重和肥胖青少年(n＝23)中补充本发明组合物和安慰剂之前和之后的炎性标志物。

表2:

超重和肥胖青少年(n＝23)中抗炎性和安慰剂补充之前和之后的炎性标志物

下表3示出了在超重和肥胖男孩(n＝23)中与安慰剂补充相比，基线下和本发明组合物补充8周之后的人体测量和生物化学特征。

下表4示出了应答者和非应答者对本发明组合物补充的基线特征。

还参见图2和图3。

实施例6

糖尿病和冠状动脉疾病

该研究是一项前瞻性、单中心、双盲、安慰剂对照的随机化研究。

将患有糖尿病和冠状动脉疾病的患者随机分配接受包含1000mg的二十碳五烯酸和1000mg的二十二碳六烯酸的本发明组合物的临床营养组合物(n-30)或安慰剂(n-30)3至6个月(根据资金)。对血细胞计数(RBC、WBC、Hgb和血小板)、炎症和肾标志物的基本参数进行评估。

对一些具体凝血测试测量两次：在研究开始和在治疗期结束时。我们计划进行：纤维蛋白生成测试、凝血酶-抗凝血酶(TAT)复合物的血浆水平、凝血酶原片段1.2、血浆纤维蛋白凝块渗透性(Ks)和8-异前列腺素F2α(8-异-PGF2α，氧化应激标志物)。对于生物标志物的详细列表参见表5(最终列表将取决于资金)。通过肱动脉流介导的扩张(FMD)和充血剪应力(HSS)测试来评估血管和内皮功能。

表5

在患有糖尿病和冠状动脉疾病的患者中，建立用于n-3PUFA潜在影响测试的心血管标志物。

实施例7

对运动人群中URTI(上呼吸道感染)影响的研究。

研究的背景资料

一个访问GP的主导原因是上呼吸道感染(URTI)，例如咳嗽、感冒、耳感染、咽炎和喉炎(Graham,1990,The epidemiology of acute respiratory tract infections inchildren and adults:a global perspective.Epidemiologic Reviews 12,149-178)。此外，已经证明平均每年每个成年人将经受2至5次的感冒(Heath等,1992,Exercise andupper respiratory tract infections.Is there a relationship？Sports Med 14,353-365)，使得这些疾病的社会经济成本(例如工作日内的损失和医疗费用)相当可观的。因此，当务之急，我们很好地理解已知降低URIT的风险并且因此减轻相关的社会经济负担的任何机制。

公知的是，运动有益于健康并且当前的建议表明每个成年人应该每周5天中累积30分钟的运动(Haskell等,2007,Physical activity and public health:updatedrecommendation for adults from the American College of Sports Medicine andthe American Heart Association.Med Sci Sports Exerc 39,1423-1434)。最近的证据已经用来支持这样的假设：高强度运动在改善健康上比低/中等强度的运动更有效(Babraj等,2009,Infectious episodes in runners before and after the Los AngelesMarathon.J Sports Med Phys Fitness 30,316-328)。然而，提高进行运动的量和强度也可具有一些不利的后果，例如提高URTI风险。确实，两个流行病学研究表明：在急性进行的耐力运动后恢复的运动员中，与没有运动的对照相比，运动后的URTI的发生率是后者的2倍(Peters&Bateman,1983,Ultramarathon running and upper respiratory tractinfections.An epidemiological survey.S.Afr.Med J 64,582-584；Nieman等,1990,Infectious episodes in runners before and after the Los Angeles Marathon.JSports Med Phys Fitness 30,316-328)。在多种运动和体育之后，进一步的研究发现了类似的结果。

运动对URTI发生率的影响是很重要的，不仅考虑到比赛运动员和休闲运动者，而且考虑到特定群体(例如，老年人)已经由于免疫系统受损而处于危险中(综述参见Mazzeo,1994,The influence of exercise and aging on immune function.Med Sci SportsExerc 26,586-592)。衰老的过程包括免疫功能降低被认为部分地造成老年人群中致命细菌和病毒感染的发生率提高(Woods等,2002,Can exercise training improve immunefunction in the aged？Ann N Y.Acad Sci 959,117-127)。衰老还通常与慢性轻度炎症相关，其表示为与功能限制紧密相关的炎性细胞因子和急性期蛋白水平的提高(Brinkley等,2009,Chronic Inflammation Is Associated With Low Physical Function in OlderAdults Across Multiple Comorbidities.The Journals of Gerontology Series A:Biological Sciences and Medical Sciences 64A,455-461)。为了克服或降低这样的功能变化，鼓励老年人群参与体育活动以改善肌肉功能和疾病发作。另一方面，这样的运动也对老年对象是有害的，与年轻人相比，老年对象清楚表现出其免疫功能的显著衰减(Bruunsgaard&Pedersen,2000,Special feature for the Olympics:effects ofexercise on the immune system:effects of exercise on the immune system in theelderly population.Immunol Cell Biol 78,523-531)。因此，需要鉴定可用于改善很多群体运动后的免疫功能的任何可能的策略，使他们获得经常运动的好处，同时降低URTI的风险。

可用于提高免疫功能的一个可能的方法是改变必需脂肪酸的营养摄入。n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)(两者见于鱼油中)在体外显示出免疫调节作用。此外，在最近我们已经进行的研究中，我们发现鱼油消耗可以提高自然杀伤(natural killer，NK)细胞活性和外周血单核细胞(PBMC)IL-2的产生(Gray等,2012.Fish oil supplementation augments post-exercise immune function in youngmales.Brain,Behavior,and Immunity in press.)。然而，不清楚的这些免疫变化是否对URTI发生率有任何影响。

试验目标和目的

本项目的目的是研究饮食摄入本发明的组合物(在下文中为Smartfish果汁或者只是Smartfish)对在运动人群中URTI发生率的影响。

试验设计

参与者

将招募60位18岁至45岁的健康志愿者(男性和女性)来进行研究。将通过联系当地运动/体育俱乐部招募参与者。每星期，他们将参与至少3个小时的中度至高强度的训练。如果参与者有心血管、代谢或血液病病史，其将被排除在外，参与者将通过初步健康屏幕问卷调查来确定。参与者将被要求在研究期间避免服用任何膳食补充剂。

预实验操作

将获得预补充唾液样品。这涉及参与者被动地流涎到预称量的bijou管中3分钟。然后，管将再次被称重以允许计算唾液流量。

实验方案

参与者将被随机分配(性别匹配的)到对照组或Smartfish组以进行16周的研究。Smartfish组将消耗作为每天基于两份果汁的饮品的本发明组合物，每份饮品含0.5g的EPA和0.5g的DHA，总计每天2g的组合的EPA/DHA。安慰剂组将接受相同的饮品(不含EPA和DHA)。将由公司Smartfish AS提供安慰剂和鱼油饮品两者。

将通过将产生随机数表的独立的第三方进行随机化。参与者将被要求以这种方式补充他们的饮食16周时间。

在此期间，我们将要求参与者采用国际身体活动问卷记录其以周为基础的身体活动水平(IPAQ:https://sites.google.com/site/theipaq/)。在日常生活中，参与者也将被要求完成Wisconsin上呼吸症状调查(Wisconsin Upper Respiratory Symptom Survey，WURSS)，并记录因任何感冒/咳嗽等而服用的任何非处方药或处方药治疗。参加者将被给予加盖地址的信封，以周为基础将这些表格寄回并且也可以选择以电子的方式填写这些。

样品分析

将测量唾液IgA和溶菌酶以给出唾液抗微生物状态的指示，这是因为这些标志物与URTI发生率之间的相关性(例如，Nieman等,2006.Relationship between salivaryIgAsecretion and upper respiratory tract infection following a 160-km race.JSports Med Phys Fitness 46,158-162.)。将使用市售的ELISA试剂盒进行该分析。

统计学

由于这是初步试验性研究，没有进行正式功效计算。我们设计了包括在类似研究中使用的对象的数目的研究(Gleeson等,2011,Daily probiotic's(Lactobacillus caseiShirota)reduction of infection incidence in athletes.Int J Sport Nutr ExercMetab 21,55-64.)，观察降低URTI发生率的膳食干预。

将通过双向重复测量ANOVA和在适当情况下配对t-检验来分析数据。

结果

图4示出了在16周干预期间对照组和Smartfish组中患有URTI(上呼吸道感染)的患者的结果。如图4上图所概述的，虽然不显著，但是在用Smartfish治疗的组中存在降低每位患者的URTI发作次数的趋势。此外，与对照组相比，Smartfish组中症状天数的总数量显著降低(P<0.05)。

因此，结果清楚地表明本发明的组合物可用于治疗上呼吸道感染。

研究正在进行之中，并且进一步的数据将在稍后阶段获得。

实施例8

对LPS刺激的巨噬细胞的免疫调节作用

背景

本研究的目的是测试本发明的组合物(以下称Smartfish果汁或者仅称Smartfish)对炎性过程是否具有积极影响，并且将Smartfish果汁的效果与良好品质鱼油的效果进行比较。

巨噬细胞对调节免疫应答和炎症的发生是重要的。在组织和培养物中，巨噬细胞由单核细胞分化得到。这些细胞产生许多不同的化学物质(包括细胞因子、酶、补体蛋白和调节因子)并且所述细胞还刺激其他免疫细胞。LPS是革兰氏阴性细菌外膜的重要组分并诱导炎性细胞因子(如巨噬细胞和内皮细胞中的肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素-6(IL-6)的表达。人单核细胞的LPS刺激显示出激活许多细胞内信号传到途径，包括IκB激酶(IKK)-NF-κB信号传到途径和三个丝裂原活化的蛋白激酶信号传到途径(ERK1和2、JNK以及p38)(Guha等,2001)。这些信号传到途径激活了转录因子(例如NF-κB(P50/P65)和AP-1(c-Fos/c-Jun))，其协调诱导炎性介质的许多基因。数种炎性细胞因子由氧化应激诱导并且将诱导其他细胞因子的释放并提高氧化应激。这使得细胞因子在慢性炎症和其他免疫应答中是重要的。

向培养物中的巨噬细胞添加LPS引发炎性应答并且因此成为测试Smartfish果汁对炎性反应之影响的良好模型系统。

材料和方法

细胞培养

将细胞维持在37℃、5％CO₂的加湿孵育箱中，并且所有细胞培养溶液获自Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)。正常悬浮生长的THP-1细胞得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manasas,VA,美国)。在含有10％FCS、0.05mM 2-巯基乙醇、2mmol/1L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养THP-1细胞。每周3次对细胞进行传代培养。通过在12孔培养板(1mL细胞悬液，其中每孔10⁶个细胞/ml)中用100ng/mL的佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA，Sigma-Aldrich)处理THP-1细胞72小时来实现分化成巨噬细胞样表型。用预热的培养基(如上RPMI，但没有巯基乙醇)将粘附的分化的细胞洗涤两次并在实验开始之前静置48小时。

在添加0.5ng/ml LPS(大肠杆菌O55:B5)之前，以指定的浓度用Smartfish、良好品质的1812鱼油或血清-DMSO对照刺激分化的THP-1细胞单培养物24小时。孵育6小时之后收集上清液。

以关于EPA和DHA的相同浓度将Smartfish果汁(Nutrifriend 2000[2500mgω-3,2000mg EPA/DHA])和良好品质的1812鱼油(TOTOX低于20)添加到细胞中。鱼油中EPA和DHA的浓度是Smartfish的19.6倍大。因此，将0.5mg/ml鱼油和9.8mg/ml Smartfish作为具有血清和DMSO的乳剂添加至细胞中。

实验一式两份进行并重复4次。

ELISA

使用酶联免疫吸附测定(ELISA)确定细胞培养物上清液中IL-6和TNF-α的浓度。将悬于包被缓冲液(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH 9.6)的单克隆小鼠抗人IL-6或TNF-α抗体(BD Bioscience Pharmingen,San Diego,CA,US)添加至MaxiSorpTM ELISA板(Nunc,Roskilde,Denmark)并在4℃孵育过夜。将板用含有0.01％Tween-20的PBS洗涤三次并通过用PBS中的5％BSA在室温下孵育1小时来封闭非特异性结合位点。用PBS-Tween洗涤五次之后，将在来自Sanquin(Amsterdam,Netherlands)高性能工作强度的ELISA(HPE)缓冲液中稀释的样品和人重组IL-6或TNF-α标准物(BD Bioscience Pharmingen)添加至所述板，其然后在室温下孵育1.5小时，随后用PBS-Tween洗涤五次。然后，用HPE缓冲液中的生物素化的小鼠抗人IL-6或TNF-α单克隆抗体(BD Bioscience Pharmingen)将板孵育1小时。在另外的洗涤步骤之后，添加HPE缓冲液中的链霉亲-辣根过氧化物酶缀合物(BD BiosciencePharmingen)并且在室温下孵育30分钟。然后将板洗涤五次，每次洗涤之间间隔30秒。在添加包含H₂O₂的0.05M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中的3,3`,5,5`-四甲基联苯胺(Sigma-Aldrich)之后显色。10分钟之后，通过添加1N H₂SO₄停止反应并且使用Spectrostar纳米板阅读器(BMG LABTECH,Offenburg,德国)测量450nm下的吸光度。

基因表达

使用RNeasy Plus mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA,USA)分离RNA。使用NanoDrop 1000分光光度计(NanoDrop Technologies,美国)评价RNA的浓度和纯度。通过使用Taqman反转录酶试剂(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)在20μL反应体积中由300ng RNA制备cDNA。在以下条件下在PCR仪中进行cDNA合成：25℃保持10分钟，48℃保持60分钟以及95℃保持5分钟。qPCR的反应混合物由4μl稀释的(1:10)cDNA、1μl正向引物和反向引物(最终浓度为0.5μM；表6)和5μl SYBR Green-I Master(Roche Applied Science,德国)组成。包括对于每个引物对的标准曲线以评估引物效率。对所有样品进行平行分析并且对于每个引物对进行用水代替cDNA的非模板对照。在以下条件下，qPCR反应使用LightCycler480(Roche Diagnostics Gmbh,德国)进行：在95℃下预孵育5分钟；扩增45个循环：在95℃下15秒和60℃下1分钟(解链曲线在95℃下进行5秒和65℃下进行1分钟)，在40℃下冷却10秒。使用ef1a作为参照基因根据ΔΔCt法(Pfaffl 2001)计算相对基因表达水平。

表6

结果和讨论

细胞因子的分泌

通过ELISA分析Smartfish和良好鱼油对促炎性细胞因子TNF-α和IL-6分泌的影响。Smartfish和良好鱼油对TNF-α的基础分泌没有显著的影响(图5)。在对照细胞中，添加LPS刺激炎症应答将TNF-α的分泌从11pg/ml显著提高至2500pg/ml。与对照相比，添加良好鱼油显著降低了LPS诱导的TNF-α分泌。有趣地，添加Smartfish甚至比良好鱼油具有更强烈地降低LPS诱导之TNF-α分泌的效果，将TNF-α分泌降低至与基础分泌相当的水平。

获得的IL-6分泌谱与获得的TNF-α的谱不同(图6)。与对照和良好鱼油相比，Smartfish显著降低了IL-6的基础分泌和LPS诱导的IL-6分泌两者，而与对照相比，良好鱼油对LPS诱导的IL-6分泌没有显著影响。在THP-1衍生巨噬细胞中，相同的良好鱼油先前降低了LPS诱导的IL-6分泌。这种矛盾的理由不明显。然而，IL-6可充当促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子二者。作为抗炎性细胞因子，IL-6对TNF-α具有抑制作用。因此，在该实验中，IL-6可充当抗炎性细胞因子并且这与LPS诱导的TNF-α分泌上所见的抑制作用相一致。

基因表达

与对照细胞和添加良好鱼油的培养基中培养的细胞相比，用Smartfish果汁培养的LPS诱导的巨噬细胞显示出促炎性标志物如tnfα、nfkb和IL8的基因表达下调(图7和8)。Smartfish果汁中培养的细胞还显示出比对照细胞和良好鱼油中培养的细胞更低的bax基因表达水平(参与细胞凋亡)以及更低的gpx基因表达水平的趋势(参与氧化应激应答)(图9)。

通过这项研究已经证明：Smartfish果汁降低了来自人巨噬细胞的促炎性细胞因子TNF-α的分泌。此外，已经证明：Smartfish果汁降低了人巨噬细胞中参与炎症和应激应答的基因(tnf-α、IL18、nfκb、gpx和bax)的表达。Smartfish果汁的效果比仅使用与Smartfish果汁中的鱼油具有相似良好品质的鱼油显著更好。

因此，出人意料地示出，作为水包油型乳剂的包含鱼油和果汁之组合的本发明的组合物可用于治疗炎症，而且与Smartfish果汁中所包含的鱼油相似品质的对照良好鱼油没有表现出相同程度的对炎性参数的积极影响。

特别地，发现TNF-α分泌降低并且IL-8的基因表达下调。提出所述炎性标志物的改变与COPD高度相关。参见Int J of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 2010:5217-222；Tumor necrosis factor-alpha levels in healthy smokers and nonsmokers和Saris H等.,Biochem Pharmacol 2010,Mar 1；79(5(:698-701；IL-8production bymacrophages is synergistically enhanced when cigarette smoke is combined withTNF-alpha。

实施例9

来自AD患者的巨噬细胞中的消散素水平

研究的目的是检查抗炎性介质消散素D1的产生并研究本发明的组合物(下文中称为Smartfish)是否能够提高患有阿尔茨海默病的患者的细胞样品中消散素D1量。

如先前所提到的，消散素是源自EPA和DHA的氧化代谢物，其即使是在纳摩尔至皮摩尔浓度范围内也具有强大的抗炎和免疫调节作用。

因此，对于观察本发明的组合物是否对从患有AD的患者中分离的巨噬细胞中消散素的水平有任何影响有极大的兴趣。

用于该研究的本发明组合物是以商标Nutrifriend 2000制造的包含2000mg EPA/DHA的基于果汁的饮品。所述饮品由Smartfish AS制造并且在下文称为Smartfish。

材料和方法

补充Smartfish的患者每天将消耗一份基于果汁的饮品(即，2000mg EPA/DHA)。在补充Smartfish之前和之后至少3个月，对来自AD患者的巨噬细胞进行测试。

用Smartfish的体外刺激：

通过在具有10％自体血清的IMDM培养基中培养10至15天来在外周血单核细胞(PBMC)的细胞培养物中制备AD患者的巨噬细胞。当巨噬细胞分化时，其用或不用1:100稀释的Smartfish过夜处理并收获到甲醇中，通过使用氮气蒸发除去甲醇。

通过消散素D1 EIA试剂盒#500380(Cayman)对消散素D1进行测试。消散素是源自EPA和DHA的氧化代谢物，并且是当需要结束炎性应答时有助于除去炎性细胞并恢复组织的分子机制的一部分。

结果

当如上文概括的，当用Smartfish体外刺激时，补充Smartfish之前AD患者的巨噬细胞中RvD1的水平显著提高。如下表7所示，在患者JB中RvD1水平从8pg提高至13.6pg并且在患者AM中从37.4pg提高至75.9pg。因此，在来自没有饮用Smartfish的AD患者的巨噬细胞的体外Smartfish刺激之后，观察到RvD1水平的2×提高。

在每天每日补充一份Smartfish之后，在患者JB中进行相似的分析。在没有体外刺激的巨噬细胞中，RvD1水平从8pg提高至21.3pg。如果进一步体外刺激，则RvD1水平将适度地从21.3pg提高至28.6pg。

表7:

巨噬细胞中的RvD1(pg)

#每天补充本发明的组合物之前

*每天补充本发明的组合物约3个月之后

这项研究的结果清楚地表明：在体内和体外两者中，本发明的组合物显著有助于提高来自患有AD之患者的巨噬细胞中消散素的水平。

研究正在进行，因此，进一步的结果将在未来获得。

本申请母案的原始权利要求作为本说明书的一部分并入本文：

1.作为水包油型乳剂的包含鱼油和果汁之组合的组合物，其用于治疗炎症和/或其中炎症是病因的疾病，其中所述鱼油选自totox值低于20且基于所述鱼油的总重量ω-3含量按重量计高于10％的鱼油，并且其中使用合适的乳化剂来稳定所述乳剂。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述炎症或疾病/病症选自以下的组或其任意组合：上呼吸道感染(URTI)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、包括轻度认知损害(MCI)的阿尔茨海默病(AD)、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)以及超重和肥胖。

3.权利要求1所述的组合物，其中所述疾病选自以下的组或其任意组合：哮喘、囊性纤维化、卒中、糖尿病、包括脑震荡的创伤性脑损伤、手术后认知下降、冠状动脉疾病和类风湿性关节炎。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述鱼油的totox值低于10。

5.根据权利要求1中任一项所述的组合物，其中所述鱼油的含量为基于所述组合物的总重量按重量计约0.5％至15％。

6.根据权利要求1中任一项所述的组合物，其中所述果汁的含量为基于所述组合物的总重量按重量计约20％至95％。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述果汁选自具有合适的高水平的抗氧化剂的水果和浆果。

8.根据权利要求6或7所述的组合物，其中所述果汁选自以下的组：石榴、杏、葡萄柚、柑橘、蔓越莓、玫瑰果、菠萝、黑果腺肋花楸、桑葚、云莓、针叶樱桃、覆盆子、西瓜、桃、葡萄、樱桃、蒲桃、苹果、芒果、梨、野樱梅、百香果和猕猴桃。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述乳化剂选自以下的组：乳固体、乳清蛋白、燕麦蛋白和豌豆蛋白。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含果胶。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含甜味剂、矫味剂、抗氧化剂和防腐剂。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于以约300mg/天至约5000mg/天、优选约3000mg/天、更优选约2000mg/天并且最优选约1100mg/天的EPA和DHA的剂量施用。

13.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物是可饮用的，或者为胶囊或粉末形式。

14.根据权利要求1所述的组合物和治疗剂用于治疗炎性疾病或其中炎症是病因的疾病的组合用途。