膀胱癌检测装置和方法
阅读说明：本技术 膀胱癌检测装置和方法 (Bladder cancer detection device and method ) 是由 克拉西米尔·阿塔纳索夫·瓦西里夫 梅勒妮·麦格雷戈 乔纳森·格利德尔 乔丹·李 于 2018-04-12 设计创作，主要内容包括：提供了一种用于从尿液或者源自尿液的流体中选择性捕获目标膀胱癌细胞的装置。所述装置包括具有一个或者多个细胞捕获表面的基底,每一细胞捕获表面包含在所述基底上的官能化膜和共价结合到所述官能化膜上的一种或者多种目标膀胱癌细胞选择性结合试剂。(devices for selectively capturing targeted bladder cancer cells from urine or urine-derived fluids are provided, the devices comprising a substrate having or more cell capture surfaces, each cell capture surface comprising a functionalized membrane on the substrate and or more targeted bladder cancer cell-selective binding reagents covalently bound to the functionalized membrane.)
优先权文件
本申请要求于2017年4月12日提交的、题为“BLADDER CANCER DETECTION DEVICEAND METHOD”的澳大利亚临时专利申请No.2017901350的优先权，其内容通过引用全部并入本文。
技术领域
本公开涉及用于从尿液选择性地捕获和/或检测膀胱癌细胞、或其生物标记物的装置和方法。所述装置和方法可以特别地应用在及时检测(point of care)诊断装置和方法中。
背景技术
膀胱是泌尿道(renal tract)中最常见的癌症部位并且最常见的组织学类型是移行上皮细胞癌(transitional cell carcinoma)。患有一种膀胱癌的病人发生其它泌尿道癌症的风险很高并且复发率特别高(70％)(Dawam 2012；Youssef和Lotan 27 2011)。因此，有必要对患有膀胱癌的病人进行有规律的和无限期的监控。
目前，通过侵入性的昂贵技术例如膀胱镜检查监控膀胱癌(Bryan等2014a)，这至今被认为是临床医师的黄金护理标准。需要更便宜的、侵入性较小的精准测试。(Lotan等2009；Ploeg等2009)
用于诊断膀胱癌的一种可能的非侵入性方式是分析患者的尿液。临床相关的***的癌细胞通常流落入尿液中。(Deden 1954；Kiyoshima等2016；McGrew 1961；Murphy1990)尿液中脱落肿瘤细胞的存在是排尿的细胞学检查的基础，对于膀胱癌检测而言这是当前唯一的非侵入性常规护理标准。(Deden 1954；Gaston和Pruthi 2004；McGrew 1961；Papanicolaou和Marshall 1945；Zhang等2001)然而，尿液细胞学的功效是有争议的，该测试的灵敏度是不尽人意地低(〈40％)。(Andersson等2014；40 Mitra和Cote 2010)细胞学上低敏感度的原因是肿瘤细胞、特别是低级肿瘤细胞、与正常细胞共有许多相似之处例如通常相当的细胞形态学。(Brimo等2009；Murphy等1984)仅仅基于细胞形态来区分恶性细胞和良性细胞是困难的。出于此原因，细胞学检查需要经验丰富的医学专业人员和分析时间。(Bryan等2014a)
尿液细胞学者所面临的另一个挑战是在尿蛋白、残骸(debris)和其它背景细胞中获得感兴趣的细胞的清晰视场。(Bastacky等1999)通常，除了癌症之外的病症诱导相似的症状并导致增加的尿液细胞构成，这些包括但不限于感染、或者肾疾病。(OliveiraArcolino 50等2015)为了最大限度地减小背景，不得不全面地处理天然尿液，该过程增加了样品分析时间和成本。(Wronska等2014)
因此需要提供能够从尿液选择性和灵敏地捕获膀胱癌细胞的装置和方法从而降低对昂贵且费时的方法例如尿液细胞学和膀胱镜监测的依赖性。
发明内容
本公开源自我们发现流落在膀胱癌患者的尿液中的肿瘤细胞可以从未经处理的尿液或者天然尿液中被选择性地免疫捕捉并聚集在生物材料平台上。具体地，我们发现膀胱癌上皮癌细胞(bladder cancer carcinoma cell)可以被选择性地捕获在被生物活性上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体官能化的基底表面上。EpCAM被选择作为特定的捕获配体，因为它是最众所周知的上皮癌(carcinoma)特异性抗体。(Bryan等2014b；Patriarca等2012)
在第一方面中，本文提供了一种用于从尿液或者源自尿液的流体中选择性捕获目标膀胱癌细胞的装置，所述装置包括具有一个或者多个细胞捕获表面的基底，每一细胞捕获表面包含在所述基底上的官能化膜和共价结合到所述官能化膜上的一种或者多种目标膀胱癌细胞选择性结合试剂。
在第二方面中，本文提供了一种用于从尿液或者源自尿液的流体中选择性捕获目标膀胱癌细胞的微流控装置，所述装置包括具有一个或者多个细胞捕获微通道的基底，每一细胞捕获微通道包含在其表面上的官能化膜和共价结合到所述官能化膜上的一种或者多种目标膀胱癌细胞选择性结合试剂。
在第三方面中，本公开提供了一种从尿液或者源自尿液的流体中选择性捕获目标膀胱癌细胞的方法，所述方法包括：
提供尿液或者源自尿液的流体的样品；
提供具有一个或者多个细胞捕获表面的基底，每一细胞捕获表面包含在所述基底上的官能化膜和共价结合到所述官能化膜上的一种或者多种目标膀胱癌细胞选择性结合试剂；
将所述尿液或者源自尿液的流体的样品与所述一个或者多个细胞捕获表面在使得来自所述尿液的至少一部分所述目标膀胱癌细胞(如果存在的话)与所述细胞捕获表面结合的条件下接触。
所述第三方面的方法可以进一步包括检测在所述一个或者多个细胞捕获表面上的目标膀胱癌细胞。可以使用癌症特异性荧光活性化合物例如ALA 5、氨基己糖氨基酮戊酸盐(hexaminolevulinate)或者金丝桃素检测被捕获的膀胱癌细胞。
在第四方面中，本公开提供了一种将来自尿液或者源自尿液的流体中的目标膀胱癌细胞固定在基底表面上的方法，所述方法包括：
提供尿液或者源自尿液的流体的样品；
提供具有一个或者多个细胞捕获表面的基底，每一细胞捕获表面包含在所述基底上的官能化膜和共价结合到所述官能化膜上的一种或者多种目标膀胱癌细胞选择性结合试剂；
将所述尿液或者源自尿液的流体的样品与所述一个或者多个细胞捕获表面在使得来自所述尿液的至少一部分所述目标膀胱癌细胞(如果存在的话)与所述细胞捕获表面结合的条件下接触。
在第五方面中，本公开提供了一种诊断或者监测哺乳动物中的膀胱癌的方法，所述方法包括：
提供从所述哺乳动物获得的尿液或者源自尿液的流体的样品；
提供具有一个或者多个细胞捕获表面的基底，每一细胞捕获表面包含在所述基底上的官能化膜和共价结合到所述官能化膜上的一种或者多种目标膀胱癌细胞选择性结合试剂；
将所述尿液或者源自尿液的流体的样品与所述一个或者多个细胞捕获表面在使得来自所述尿液的至少一部分所述目标膀胱癌细胞(如果存在的话)与所述细胞捕获表面结合的条件下接触；和
分析结合到所述细胞捕获表面的所述目标膀胱癌细胞。
在第五方面的实施方案中，分析结合到所述细胞捕获表面的所述目标膀胱癌细胞的步骤包括使用癌症特异性荧光活性化合物检测所述目标膀胱癌细胞。所述癌症特异性荧光活性化合物可以是ALA 5、氨基己糖氨基酮戊酸盐(hexaminolevulinate)或者金丝桃素。
附图说明
将参照这里的附图讨论本公开的实施方案：
图1是本公开的非侵入性诊断方法的一个示意图；
图2概述了来自western blots分析、免疫组织染色分析和FACS分析的结果，其确认了通过膀胱癌细胞系的癌症特异性EpCAM膜蛋白的表达；
图3显示了FACS分析的结果，其识别了EpCAM和E-钙粘蛋白(E-Cadherin)作为潜在的癌症特异性膜表记物；
图4显示了western blots分析，其确认了通过FACS获得的EpCAM表达结果；
图5显示了免疫组织染色分析结果，其确认了所述FACS和western blots结果；
图6显示了将膀胱癌细胞选择性捕获到官能化流体微通道中的证据，其与正和负对照微通道比较。从左到右给出了被捕获的细胞数目和百分比、灵敏性和特异性的结果。左边的图显示了在漂洗3类微通道之前(播种)和之后(捕获)存在于所述基底上的健康细胞(F001)和膀胱癌(RT4)细胞的数目：对照＝普通PPOx表面，阻断＝阻断的PPOx基底，EpCAN＝EpCAM官能化PPOx基底。中间的图显示了针对至少三个被测试表面而言每一视场所捕获的细胞百分比。右边的图显示了对于来自所述癌细胞捕获实验的被检测表面而言计算的灵敏性和特异性。
图7显示了对于真实尿液中掺入的低细胞数目而言的细胞捕获灵敏性和选择性，对于两种不同的示范膀胱癌细胞系(HDF:左柱；HT1376:右柱)而言；
图8显示了在流动条件下从5mL含有仅仅1000个掺入细胞的真实尿液中捕获的3级膀胱癌细胞HT1376；
图9显示了在癌细胞和健康细胞的共培养中癌细胞特异性红色荧光，以及用在体外测试中的荧光标记物浓度优化研究的荧光光谱结果；
图10显示了确认的膀胱癌患者尿液样品的细胞构成的实例，具有蓝色核染色和红色癌症特异性荧光；
图11显示了来自具有确认的移行上皮细胞癌(transitional cell carcinoma)的一个患者的尿液样品的癌细胞捕获结果的实例。癌细胞包含蓝色(核染色)和显眼的红色荧光(BF:左柱；Dapi:中间柱；HexAla:右柱)；
图12显示了来自健康患者的尿液样品的癌细胞捕获结果的负对照实例(BF:左柱；Dapi:中间柱；HexAla:右柱)；
图13显示了相同样品的所述癌细胞检测装置结果和来自细胞学和膀胱镜检查的结果之间的直接比较；
图14说明了用在自动计数软件中以确认被捕获在微通道中的细胞的癌症特性的标准；和
图15显示了在50：50与健康人***成纤维细胞(HFF)共培养中的癌细胞系HT1376和HT1197的理想状态的图像，其显示在右边的荧光显微图中。上部图像与亮场图像重叠以看见存在的非荧光健康细胞。在该图的左边绘制的数据中，在每一浓度和时间点显示的绘制数据从左到右为：HFF；HT1197；HT1376；EJ138；RT4细胞。
具体实施方式
在第一方面中，本文提供了一种用于从尿液或者源自尿液的流体中选择性捕获目标膀胱癌细胞的装置，所述装置包括具有一个或者多个细胞捕获表面的基底，每一细胞捕获表面包含在所述基底上的官能化膜和共价结合到所述官能化膜上的一种或者多种目标膀胱癌细胞选择性结合试剂。
有利地，第一方面的所述装置可以用于能够从尿液中选择性捕获膀胱癌细胞的及时检测(point of care)装置。在过去的数十年中，一些试验性尿液标记物测试已经变得可以获得。(Tetu 0000)开发这些分子测试的目的是通过检测可溶性癌症特异性生物标记物来完善细胞学。(Onal等2015)然而，至今，尚且没有一项这些及时检测被引入临床指南，因为它们用于诊断尿路上皮肿瘤的附加值有待鉴定。(
第一方面的装置被用于从尿液中选择性捕获目标膀胱癌细胞。膀胱壁具有若干层，所述层由不同类型的细胞构成。大部分膀胱癌始于膀胱的最内侧衬里(the innermostlining)，也就是尿路上皮(urothelium)或者移行上皮(transitional epithelium)。随着癌症发展进入或者通过膀胱壁的其它层，其变得更加高级并可能更加难以治疗。随着时间的推移，所述癌症可能生长到膀胱外部和进入附近结构。因此，用于从尿液中选择性和灵敏地捕获癌细胞的装置和方法是重要的。
泌尿上皮癌(Urothelial carcinoma)，又称作移形上皮细胞癌(TCC,transitional cell carcinoma)，是迄今为止最常见的膀胱癌类型。这些癌症始于排布于膀胱内部的泌尿上皮细胞。泌尿上皮细胞也排布尿道的其它部位，例如连接至输尿管的肾部分、多个输尿管、和尿道。若干其它类型的癌症可能始于膀胱，包括鳞状细胞癌(squamouscell carcinoma)、腺癌(adenocarcinoma)、小细胞癌(small cell carcinoma)、和肉瘤(Sarcoma)。如本文使用的，术语“膀胱癌”和类似术语是指上皮癌(carcinoma)、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、和肉瘤中的任何一个或者多个。第一方面的所述装置可以被设计为从尿液中捕获这些膀胱癌细胞中的任何一种或者多种。
第一方面的所述装置包括基底。可以使用任何合适的基底，条件是可以在所述基底的表面上形成官能化膜并且可以在典型的操作条件下将所述膜保持在所述基底的表面上。合适的基底材料包括玻璃、硅、陶瓷、金属、塑料、聚合物材料、纸、纸层叠体、纤维素、碳纤维、生物材料、包含生物分子的表面、包含小有机分子的表面、包含无机分子的表面等。所述塑料可以选自由以下实例组成的组：聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物、聚偏二氟乙烯(polyvinyl-difluoride)、尼龙、聚氯乙烯、前述的共聚物、和前述的混合物。在实施方案中，所述基底为玻璃。在另一些实施方案中，所述基底为硅。
所述基底具有一个或者多个细胞捕获表面。所述一个或者多个细胞捕获表面可以以一个或者多个特征形成在所述基底的表面上。所述一个或者多个特征可以为孔的形式，例如呈96孔板形式，或者它们可以是任何尺寸、几何形状或者构造的一个或者多个流体流动路径。所述一个或者多个流体流动路径可以呈一个或者多个通道(开放或者闭合的)形式，例如在“流通”型诊断装置中常用的通道。在一些实施方案中，所述基底包含微流控特征，例如微流控装置中的微流控通道。如本文使用的，术语“微流控”以及其变体是指所述芯片、装置、设备、基底或者相关设备包含具有至少一个亚毫米、典型地小于100μm并大于1μm的尺度的流体控制特征。此外，术语“微通道”以及其变体是指具有至少一个亚毫米、典型地小于100μm并大于1μm的尺度的通道。
在某些实施方案中，所述装置是微流控装置。因此，在第二方面中，本文提供了一种用于从尿液或者源自尿液的流体中选择性捕获目标膀胱癌细胞的微流控装置，所述装置包括具有一个或者多个细胞捕获微通道的基底，每一细胞捕获微通道包含在其表面上的官能化膜和共价结合到所述官能化膜上的一种或者多种目标膀胱癌细胞选择性结合试剂。
在某些实施方案中，所述微通道如美国专利申请公开No.2011/0294187中描述的，其内容通过引用全部并入本文。具体地，可以以三维(3D)图案限定所述微通道。该3D图案使得能够影响所述微通道内的流动特性(flow profile)，这反过来提高了流动样品尿液与所述细胞捕获表面之间的相互作用，并因此显著地提升所述细胞捕获效率。在一些实施方案中，所述微通道表面由聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)制得。
所述第一方面和第二方面的装置被用于从尿液或者源自尿液的流体中选择性捕获目标膀胱癌细胞。尿液是含有水、盐、尿素、残骸、蛋白质、细胞的复杂混合物，如之前讨论的，这种复杂性向尿液细胞学者提出了挑战。与此对照，所述第一方面和第二方面的装置的选择性是指仅有癌细胞被固定，因此克服了复杂性、细胞外构成(extracellularity)和细胞形态学的问题。
如之后更详细论述的，所述第一方面和第二方面的装置的选择性通过使用一种或者多种结合试剂而产生，所述结合试剂选择性地结合感兴趣的癌细胞和，更具体地，选择性地结合所述感兴趣的癌细胞的生物标记物。如本文使用的，术语“选择性捕获”以及当与捕获目标膀胱癌细胞相关使用时的类似术语是指，从含有所述目标癌细胞、其它癌细胞、和其它细胞的异源混合物(heterologous mixture)中，所述目标癌细胞优先地结合以使得它们被保持在所述基底上并且所述非目标细胞可以被冲洗走或者另外从所述表面上被除去。
可以使用所述第一方面和第二方面的装置捕获的所述目标膀胱癌细胞可以选自以下实例组成的组中的一种或者多种：泌尿上皮癌细胞、鳞状细胞癌(squamous cellcarcinoma)细胞、腺癌细胞、小细胞癌细胞、和肉瘤尿细胞(sarcoma urine cell)。
在某些实施方案中，所述第一方面和第二方面的装置被用于从人类捕获目标膀胱癌细胞。然而，如本领域技术人员将意识到的，来自其它有机体的目标膀胱癌细胞可以用于疾病和药物评价的动物模型中。因此，所述目标膀胱癌细胞可以来自其它哺乳动物，包括啮齿类动物(大鼠、小鼠、仓鼠、天竺鼠等)、灵长类动物、农场动物(包括绵羊、山羊、猪、牛、马等)和宠物(狗、猫等)。
所述第一方面和第二方面的装置的细胞捕获表面包含在所述基底上的官能化膜。所述官能化膜可以包含任何无机、有机和/或生物材料、可以通过共价键或者离子键附着至所述基底的表面并含有可用于共价结合或者离子结合到目标膀胱癌细胞选择性结合试剂的一种或者多种官能团的分子或者分子混合物。如之后更详细论述的，在许多情况中所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂将是生物分子，例如肽、蛋白质或者抗体，因此所述官能化膜的一种或者多种官能团优选地能够结合到生物分子上的羧酸基团、羧酸酯/盐基团、氨基或者酰氨基。
适合共价连接所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂的化学体的实例。合适的化学体包括噁唑啉类、环氧化物类、醛类、酸酐类、硫醇类、EDC/NHS相关的化学体、点击化学体(click chemistries)、异氰酸酯/盐类、腈类和亚胺类。
在某些实施方案中，所述官能化膜是聚合物。所述聚合物可以通过经典的聚合技术形成。因此，可以通过使用合适的聚合试剂聚合合适的起始单体或者预聚物而在所述基底的表面上形成聚合物，如本领域已知的。
在另一些实施方案中，可以通过等离子体聚合而形成所述官能化膜。因此，在某些实施方案中，所述官能化膜是通过一种或者多种官能起始物质的等离子体聚合而形成的等离子体聚合物。可以使用本文中描述的条件将包含噁唑啉、环氧、醛、酸酐、硫醇、异氰酸酯、腈和亚胺的起始物质等离子体聚合以形成包含噁唑啉、环氧、醛、酸酐、硫醇、异氰酸酯、腈和亚胺基团的等离子体聚合物，所述基团然后可以与所述膀胱癌细胞选择性结合试剂反应从而与其形成共价键。
聚合所述一种或者多种官能起始物质从而形成等离子体聚合的官能化膜所需的条件可能包括约10W至约50W的功率、约1分钟至约7分钟的沉积时间、和/或约1.1至约3x10-1mbar的单体压力。取决于等离子体沉积设备设计和功率耦合效率，一些其它沉积条件将可以适用。
可以使用的起始物质的非限定性实例包括2-取代的噁唑啉类、4-取代的噁唑啉类、5-取代的噁唑啉类、2,4-二取代的噁唑啉类、2,5-二取代的噁唑啉类、4,5-二取代的噁唑啉类、2,4,5-三取代的噁唑啉类、丙醛、甲基丙烯酸缩水甘油酯、和烯丙基缩水甘油醚。
在某些实施方案中，所述官能化膜是等离子体聚合的聚噁唑啉("PPOx")。如本文使用的，术语“聚噁唑啉”是指由至少一种噁唑啉起始物质或者单体形成的均聚物或者共聚物。所述噁唑啉聚合物可能或者可能不包含完整的噁唑啉结构体。所述聚噁唑啉聚合物可以是通过至少一种噁唑啉起始物质或单体和至少一种共聚单体的等离子体聚合形成的共聚物。可以基于它可能提供给所述聚噁唑啉聚合物所希望的性质和/或其对等离子体聚合的适用性(例如其蒸气压力或者挥发性)选择所述共聚单体。所述共聚单体可以选自由以下组成的组，但不限于此：硅烷类、硅氧烷类、碳氟化合物、烃类、反应性官能单体、有机基单体(organo-based monomer)、和不饱和单体例如N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰氨、二甲基丙烯酰氨、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基取代的聚乙二醇或聚丙二醇、乙烯基吡啶、和乙烯基磺酸。
可以通过在使得所述噁唑啉单体聚合以在所述基底的表面上形成所述等离子体聚合的聚噁唑啉聚合物的条件下将基底的表面暴露于包含噁唑啉单体蒸气的等离子体而制备在所述基底的表面上的等离子体聚合的聚噁唑啉聚合物和官能化膜。
聚合所述噁唑啉单体以形成等离子体聚合的聚噁唑啉聚合物所需要的条件可能包括约10W至约50W的功率、约1分钟至约7分钟的沉积时间、和/或约1.1至约3x 10-1mbar的单体压力。持续大于5分钟时间的大于30W的功率是聚合所述噁唑啉单体以形成等离子体聚合的聚噁唑啉聚合物的特别合适的条件，因为它们提供了厚度大于约30nm的稳定的等离子体聚合的聚噁唑啉聚合物膜。然而，厚度大于1nm并以一系列其它条件沉积的涂层也可能是合适的。
在真空室内于降低的压力下形成包含噁唑啉单体蒸气的等离子体。因此，将基底的表面暴露于包含噁唑啉单体蒸气的等离子体的步骤可以包括将所述基底放置在室内、密封所述室、在所述室内形成等离子体、将包含所述噁唑啉单体的蒸气引入所述室、和将所述基底保持在适合所述噁唑啉单体聚合的温度从而在所述表面上形成聚合物膜。本领域技术人员将理解等离子体是电激活的离子化的一种气体或者多种气体，当激活时(例如点火)，形成可改变直接暴露于等离子体放电的物质的高度反应性环境。可以在宽范围的压力(例如，10mTorr至高于大气压力(例如，10倍大气压或者更高))下操作所述等离子体沉积步骤。所述等离子体可以由惰性气体(例如氦气、氖气、氩气、氪气、氙气、氡气)和所述噁唑啉单体(或者根据官能化膜的化学特性所需的其它合适单体)的组合组成。可以在一定范围的频率(低频直流(DC)和交流(AC)、脉冲DC、射频(RF)、和微波)下形成所述等离子体。
以上等离子体聚合条件也可以根据需要用于从其它官能起始物质形成等离子体聚合物。
所述噁唑啉单体可以是在噁唑啉环的2-、4-、或5-位的任何位置上具有取代基或者具有这些取代基的组合的取代的噁唑啉。任何这些噁唑啉类可以被用于形成所述等离子体聚合的聚噁唑啉聚合物，条件是它们在所使用的等离子体沉积条件下为蒸气。在实施方案中，所述噁唑啉单体选自由以下组成的组：2-取代的噁唑啉类、4-取代的噁唑啉类、5-取代的噁唑啉类、2，4-二取代的噁唑啉类、2，5-二取代的噁唑啉类、4，5-二取代的噁唑啉类、和2，4，5-三取代的噁唑啉类。所述噁唑啉环上的一个或者多个取代基可以选自由以下组成的组：卤素、OH、NO2、CN、NH2、任选取代的C1-C12烷基、任选取代的C2-C12烯基、任选取代的C2-C12炔基、任选取代的C2-C12杂烷基、任选取代的C3-C12环烷基、任选取代的C2-C12杂环烷基、任选取代的C2-C12杂环烯基、任选取代的C6-C18芳基、任选取代的C1-C18杂芳基、任选取代的C1-C12烷氧基、任选取代的C2-C12烯氧基、任选取代的C2-C12炔氧基、任选取代的C2-C12杂烷氧基、任选取代的C3-C12环烷氧基、任选取代的C3-C12环烯氧基、任选取代的C1-C12杂环烷氧基、任选取代的C2-C12杂环烯氧基、任选取代的C6-C18芳氧基、任选取代的C1-C18杂芳氧基、任选取代的C1-C12烷基氨基、SO3H、SO2NH2、SO2R、SONH2、SOR、COR、COOH、COOR、CON RR'、NRCOR'、NRCOOR'、NRSO2R'、N RCON R'R"和NRR'。在一些实施方案中，所述噁唑啉单体包括2-取代的噁唑啉。在特定实施方案中，所述噁唑啉单体是2-烷基-2-噁唑啉。所述烷基取代基可以是C1-C12烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。
在特定实施方案中，所述噁唑啉单体选自由以下组成的组：2-烷基-2-噁唑啉类和2-芳基-2-噁唑啉类。所述2-烷基-2-噁唑啉类的烷基取代基可以是C1-C10烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。所述烷基取代基可以是任选取代的。所述2-芳基-2-噁唑啉类的芳基取代基可以是C5-C10芳基、例如任选取代的苯基、任选取代的萘基、任选取代的噻吩基、任选取代的吲哚基等。
可以在所述等离子体聚合的聚噁唑啉聚合物沉积之前处理所述基底的表面。例如，可以通过用清洁剂、水或者合适的溶剂清洁来处理所述表面。作为选择，或者另外地，可以通过在等离子体室内将所述表面暴露于空气从而活化该表面来处理所述表面。
所述等离子体聚合的官能化膜可以具有大于30nm的厚度，例如大约30nm、40nm、大约50nm、大约60nm、大约70nm、大约80nm、大约90nm或者大约100nm的厚度。
存在于聚噁唑啉类的ω-末端上的噁唑啉环的反应性已经被用于与蛋白质和药物在溶液中共轭。所述噁唑啉环的反应性被认为导致通过与羧酸官能团反应而形成共价酰氨键。等离子体沉积的涂层使得完整的噁唑啉环能够保持在所述表面，然而当使用表面制备的其它技术时通常不是这种情况。保持所述反应性化学官能团随后使得能够方便和迅速地共价偶联蛋白质、抗体等。
所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂可以为选择性结合所述目标膀胱癌细胞的任何分子。所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂可以是生物分子。所述生物分子可以例如选自氨基酸类、肽类、蛋白质类、核酸适配体类、核酸类、DNA分子、RNA分子、抗体、生长因子、抗微生物试剂、抗血栓形成试剂(antithrombogenic agent)、和细胞附着蛋白质。所述生物分子可以呈包含该生物分子的颗粒或者纳米颗粒的形式。
所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂可以通过所述官能化膜上的一种或者多种官能团与所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂之间的直接反应而被附着至所述官能化膜。例如，所述官能化膜内的氨基可以与所述膀胱癌细胞选择性结合试剂的羧基、羧酸酯/盐基团、或者醛基反应。如果需要的话，可以促进或者催化所述官能化膜上的所述一种或者多种官能团与所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂之间的反应。例如，可以通过偶联试剂例如碳二亚胺偶联试剂(例如EDC、DCC、DIC)、三氨基磷鎓偶联试剂(例如BOP、PyBOP、PyBrOP)或者四甲基铵/四甲基脲鎓偶联剂(例如HATU、HBTU、HCTU)来促进所述官能化膜上的所述一种或者多种官能团与所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂之间的反应。
可以在所述官能化膜与所述目标膀胱癌细胞结合试剂之间使用交联剂结构体。
所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂可以是允许所述装置选择性地捕获所述膀胱癌细胞的任何无机、有机和/或生物分子。所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂可以包含至少两种官能团。所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂的第一官能团是能够附着至所述官能化膜的一种或者多种官能团(如前文所述的)的结构体。
所述合适的目标膀胱癌细胞选择性结合试剂的选择是取决于所感兴趣的特定目标膀胱癌细胞群的一个选择事宜。
所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂的第二官能团能够结合细胞。所述第二官能团与所述细胞之间的结合可以是直接的或者间接的。对于与细胞的直接结合，所述第二官能团本身包括能够识别和捕获细胞的活性基团。可以特别地选择所述活性基团以识别和捕获所感兴趣的特定细胞类型，并且可以通过本领域已知的任何方式实现细胞识别和捕获。例如，细胞识别可以基于化学反应或者生物反应，包括但不限于，肽识别、核酸识别和/或化学识别。细胞识别也可以基于非化学或非生物反应，例如，但不限于，电动识别或者基于尺寸的分类。
为了间接地结合细胞，所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂的第二官能团通过单独的细胞结合试剂被附着至细胞。所述细胞结合试剂是本领域公知的。所述细胞结合试剂可以为单一组分或者为包含两个或者更多组分的复合物的形式，只要所述组分中的至少一种能够结合目标细胞。例如，除了直接所述结合细胞的组分之外，所述细胞结合试剂或者复合物可能包含附着至所述结合细胞的组分上的额外组分。
例如，所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂，或者所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂的一个组分，可以是抗体、淋巴因子、荷尔蒙、生长因子、或者特异性地结合目标膀胱癌细胞的任何其它细胞结合分子或者物质。
在某些实施方案中，所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂是一种或者多种抗体，或者其片段。所述抗体可以选自：多克隆抗体或者单克隆抗体，包括全人源抗体；单链抗体(多克隆和单克隆)；抗体的片段(多克隆和单克隆)例如Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv；嵌合抗体和其抗原结合片段；和域抗体(domain antibodies，dAbs)以及其抗原结合片段，包括驼源抗体(chimeric antibodies)。在某些具体实施方案中，所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂是单克隆抗体。在其它某些具体实施方案中，所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂是多克隆抗体。
单克隆抗体技术使得能够制备单克隆抗体形式的特异性细胞结合试剂。用于产生单克隆抗体的技术是本领域公知的。所述抗体可以通过例如用感兴趣的抗原免疫接种小鼠、大鼠、仓鼠或者任何其它哺乳动物而制得。感兴趣的抗原可以包括完整的目标膀胱癌细胞、从所述目标癌细胞分离的抗原、全病毒、削弱的全病毒、或者病毒蛋白例如病毒壳蛋白。也可以使用敏化人源细胞。产生单克隆抗体的另一种方法是使用scFv(单链可变区)、特别地人源scFv、的噬菌体库.
所述目标膀胱癌细胞选择性结合试剂也可以是两个或者更多个不同类型抗体的组合。
因此，所述第一和第二方面的装置可以包括能够选择性捕获目标膀胱癌细胞的固定官能抗体。在某些具体实施方案中，所述抗体是抗上皮细胞粘附分子(anti-EpCAM)，其特异性地结合尿液中的EpCAM表达癌细胞。泌尿上皮癌是这样的EpCAM表达癌细胞类型。其它EpCAM表达癌细胞类型包括对应于HT1197、HT1376、RT4和EJ 138膀胱癌细胞系的那些。作为实例，HTC116细胞是EpCAM的表达水平特别高的上皮癌细胞类型。可以使用的其它抗体包括E-钙粘蛋白(E-cadherin)、CA19-9、CD146、CD147、CD10、CD44、CD24、CD133、CD166、粘液素(例如MUC1和MUC4)、钙粘素(CDH 1-28)、尿溶蛋白、和Lewis抗原抗体。
一个重要的挑战是尽管尿液样品中的离子浓度和pH的高变化性也能够使得所述抗体保持强烈地结合到所述细胞捕获表面。该挑战通过使用之前描述的聚噁唑啉等离子体聚合物将所述抗体共价结合到所述基底而克服。在本文提供的实例中，分步优化所述基底以通过人工尿液并最终通过真正的患者尿液从生理缓冲液分离在生物相关媒质中加入的癌细胞。针对足细胞(肾上皮细胞)测试所述装置对癌细胞的选择性，该肾上皮细胞也会出现在患病者的尿液中(Sir Elkhatim等2014)。
也可以使用非抗体分子来靶向特异性目标膀胱癌细胞群。
一旦被捕获在所述基底的所述细胞捕获表面，可以通过洗涤，例如用PBS，将目标膀胱癌细胞与尿液和尿液的其它组分分离。
可以使用本领域技术人员已知的若干方法中的任何一种检测和/或分析被捕获的目标膀胱癌细胞。可以使用光学显微镜观察被捕获的目标膀胱癌细胞。可以通过荧光(fluorescent)或者发光(luminescent)标记来检测被捕获的目标膀胱癌细胞。例如，可以使用荧光显微镜术使得被捕获的目标膀胱癌细胞成像。然后可以计数结合到所述表面上的细胞数目。
有利地，可以使用癌症特异性荧光活性化合物在体外将被捕获的膀胱癌细胞与健康细胞区分。例如，ALA 5是被癌细胞代谢更快的化合物，从而导致可以用于辨别被捕获的癌细胞的发光作用。可以使用的其它癌症特异性荧光活性化合物包括氨基己糖氨基酮戊酸盐(hexaminolevulinate)和金丝桃素(hypericin)。
如果希望的话，可以从所述基底的所述捕获表面选择性地释放被捕获的癌细胞。
在第三方面中，本公开提供了一种从尿液或者源自尿液的流体中选择性捕获目标膀胱癌细胞的方法，所述方法包括：
提供尿液或者源自尿液的流体的样品；
提供具有一个或者多个细胞捕获表面的基底，每一细胞捕获表面包含在所述基底上的官能化膜和共价结合到所述官能化膜上的一种或者多种目标膀胱癌细胞选择性结合试剂；
将所述尿液或者源自尿液的流体的样品与所述一个或者多个细胞捕获表面在使得来自所述尿液的至少一部分所述目标膀胱癌细胞(如果存在的话)与所述细胞捕获表面结合的条件下接触。
所述第三方面的方法可以进一步包括检测在所述一个或者多个细胞捕获表面上的目标膀胱癌细胞。
在第四方面中，本公开提供了一种将来自尿液或者源自尿液的流体中的目标膀胱癌细胞固定在基底表面上的方法，所述方法包括：
提供尿液或者源自尿液的流体的样品；
提供具有一个或者多个细胞捕获表面的基底，每一细胞捕获表面包含在所述基底上的官能化膜和共价结合到所述官能化膜上的一种或者多种目标膀胱癌细胞选择性结合试剂；
将所述尿液或者源自尿液的流体的样品与所述一个或者多个细胞捕获表面在使得来自所述尿液的至少一部分所述目标膀胱癌细胞(如果存在的话)与所述细胞捕获表面结合的条件下接触。
在第五方面中，本公开提供了一种诊断或者监测哺乳动物中的膀胱癌的方法，所述方法包括：
提供从所述哺乳动物获得的尿液或者源自尿液的流体的样品；
提供具有一个或者多个细胞捕获表面的基底，每一细胞捕获表面包含在所述基底上的官能化膜和共价结合到所述官能化膜上的一种或者多种目标膀胱癌细胞选择性结合试剂；
将所述尿液或者源自尿液的流体的样品与所述一个或者多个细胞捕获表面在使得来自所述尿液的至少一部分所述目标膀胱癌细胞(如果存在的话)与所述细胞捕获表面结合的条件下接触；和
分析结合到所述细胞捕获表面的所述目标膀胱癌细胞。
本文描述的装置和方法提供了用于从尿液中捕获目标膀胱癌细胞的迅速和选择性方法。目前用于膀胱癌的尿液诊断测试是昂贵的并且具有有限的灵敏度和特异性。本文描述的装置和方法提供了用于检测尿液中的癌细胞的第一代特异性尿样测试。等离子体沉积的聚噁唑啉的独特反应性被用于在微通道中共价结合癌症特异性抗体。分散在患者尿液中的癌细胞在宽细胞浓度范围上被成功地以高达99％选择性和100％灵敏度捕获。所述捕获平台的流程化两步制备方法代表了医学诊断上的重大进步。
实施例
物料
具体的供料由多克隆山羊抗人EpCAM亲和纯化多克隆抗体(bio scientific,AF960)、Alexa fluor 630驴抗山羊二次抗体(Novex)、RPMI1640媒质、McCoy’s 5A改性媒质、ibidi通道粘撕式载玻片VI 0.4和细胞追踪染料(Oregon green染料和CMPTX red染料,life technology)组成。从Sigma购买磷酸盐缓冲液(PBS)。基底阻断媒质由PBS和0.01w％脱脂乳粉组成。人工尿液由0.17M NaCl、0.08M KCl、0.52M NaH4PO4和700mg/L尿素组成，所有试剂从Sigma购买。(Haddad 2006)天然尿液样本(10mL,晨尿)从健康的捐赠者获得。获得伦理审查批号442.13/HREC/13/SAC/283以从Southern Adelaide Clinical HumanResearch Ethics Committee(SAC HREC EC00188)采集临床样本。
实施例1-96孔板等离子体聚合物基底的制备
对于细胞捕获而言，使用96孔板(Corning,Costar)和显微镜级载玻片(Objekttrager)作为固体基底。使用硅片用于等离子体聚合物膜厚度测量。
在等离子体沉积之前，在食人鱼溶液(H2O2:H2SO4,1:3)中洗涤载玻片和硅片，并用milliQ超纯水充分地漂洗。如所获得的状态使用无菌96孔板。
如前面所述的通过连续式等离子体沉积将噁唑啉基薄膜涂层沉积到所述固体基底上。(Macgregor-Ramiasa等2015b；Ramiasa等2015)简单地说，将定制的平行板等离子体反应器放置在真空(2.10-2mbar)下，和在所述室中用针阀接种2-甲基-2-噁唑啉前体(Sigma-Aldrich,Australia)直到达到每分钟8标准立方厘米(sccm)的恒定单体流速。然后以连续射频功率50W点燃所述等离子体并将所述膜沉积3分钟。在进一步表征或者官能化之前将以此方式获得的等离子体沉积的聚噁唑啉(PPOx)薄膜保持在干燥器中不超过1周。
等离子体沉积的聚噁唑啉膜的物理-化学分析
在MilliQ超纯水、磷酸盐缓冲液(PBS)、人工尿液和天然尿液中培养之后通过椭圆偏振技术(变角光谱型椭偏仪,J.A Woolam Co.Inc.,USA)在硅片上测量所述PPOx膜的厚度。通过X-射线光电子光谱法(SPECS SAGE,Germany,单色Mg Kα辐射源,15KV,10mA)确定所述等离子体沉积的聚噁唑啉薄膜的原子组成。于120eV的通过能量以及1eV的分辨率下，在0和1100eV之间获得全谱扫描图。用飞行时间二次离子质谱(PHI TRIFT V nano ToF,Physical Electronics,USA)来表征所述等离子体沉积的聚噁唑啉薄膜的化学性质。
实施例2–微流控等离子体聚合物基底的制备
用实施例1中描述的方法形成PPOx涂覆的显微镜载玻片。然后使用标准技术在所述PPOx涂覆的显微镜载玻片和Ibidi IV 0.4 sticky
实施例3-抗体与等离子体聚合物基底的共价连接
细胞捕获“室”由标准的96孔板的单独孔(实施例1)或者微通道(实施例2)组成。使用等离子体沉积的聚噁唑啉与羧酸的独特反应性将抗体不可逆地结合到所述等离子体聚合物基底上。(Macgregor-Ramiasa等2015a；Schmidt等1994；Tillet等2011)于10μg.mL-1将Anti-EpCAM抗体溶解在100％PBS中，将50μL轻微地移液到所述等离子体聚合物基底上并使得其于4℃结合过夜。然后吸取所述抗体溶液和通过在0.1mg.mL-1溶液中培养15分钟的方式用脱脂乳阻断所述活性聚合物表面。用PBS完全漂洗所述基底。用ToF SIMS分析确认所述抗体在所述PPOx基底上的固定。
实施例4-EpCAM标记物在癌细胞中被过表达
用三种独立的方法表明EpCAM和其它抗体例如E-钙粘蛋白在多种膀胱癌细胞系上被过表达，如图2所示的。
所研究的膀胱癌细胞系是膀胱癌HT1197、HT1376、RT4和EJ 138。这些细胞系对应于不同的癌症等级，如在图3显示的整个FACS数据集表所概括的。对照细胞系是成纤维细胞和健康的上皮PNT2***细胞。western blots、FACS和免疫染色的全部数据集显示在图3中。
western blots(图4)确认了FACS的EpCAM表达结果:对照成纤维细胞是EpCAM负；癌细胞是EpCAM正，除了EJ138；健康上皮PNT2是EpCAM正。
免疫染色结果(图5)确认了FACS和western blots:对照成纤维细胞是EpCAM负；癌细胞HT1376是EpCAM正，不是EJ138。
实施例5-来自尿液的加入癌细胞的选择性捕获
我们证实膀胱癌细胞系中的EpCAM的过表达使得它们捕获进入官能化的流控通道。我们已经显示了可以捕获RT4细胞(图6)。我们还证实了其它膀胱癌细胞系，例如HT1376,是选择性和灵敏性地被捕获(图7)。
在进行捕获实验之前用红色(celltracker CMPTX)和绿色(CellTrace Oregongreen)荧光染料将膀胱癌细胞系(RT4,HT1376或HT1197)和健康对照细胞(F001)成纤维细胞分别染色。一旦被荧光标记，以不同的绝对数目和比例将所述细胞加入真正的健康尿液样品。将50uL所述加入的尿液样品引入所述EpCAM官能化微通道和对照微通道。用脱脂乳蛋白阻断所述负对照微通道的表面以阻止细胞吸附。所述正对照通道的表面由生物相容性的等离子体沉积的聚噁唑啉涂层组成，其促进非特异性细胞结合。在15到30分钟的培养后，吸取所述尿液并用PBS缓冲液漂洗所述通道。从所述通道表面的最少四张低放大倍数的荧光图像(以红色和绿色滤光器两者捕获的)确定所有三种类型的通道中结合的细胞数。
实施例6-膀胱癌细胞可以被选择性地和灵敏性地捕获
另外在其中以低数目加入健康患者尿液的膀胱癌细胞系被捕获在EpCAM官能化PPOx流控通道内的流动条件下进行实验。图8显示了在以下流动条件下捕获的癌细胞：
-加入5mL尿液中的1000HT1376膀胱癌细胞；
-以6uL/min的流速流动通过通道的细胞；和
-于10uL/min下PBS缓冲液漂洗。
结果显示可以在流动条件下捕获靶向的细胞。这表明被表面固定的抗体在这些极端条件下仍然被结合并且是官能性的。
实施例7-从真正的患者尿液样品捕获癌细胞
尽管在加入细胞实验中容易人工地以红色或者绿色将癌症细胞和健康细胞分别染色，在真正的癌症患者中需要一种新的方式来确认所述被捕获的细胞确实是癌症性质的。
我们使用基于膀胱镜检查所采用的现有规程的一种方法来提高癌症细胞和健康细胞之间的视觉差别。
癌症特异性荧光难以在单细胞尺度(与全肿瘤相对)下和在体外(与用于膀胱镜检查的体内相对)应用，因为诱导荧光是微弱的并且容易漂白。
然而，我们使用三种不同的癌症特异性荧光活性化合物(5-ALA、其衍生物氨基己糖氨基酮戊酸盐和金丝桃素)以根据它们不同的荧光，在体外区分共培养中的癌细胞系与健康细胞(图9)。
图10显示了真正癌症患者样品的细胞构成的实例。可疑癌细胞的团块清楚地表现出特异性红色荧光。
在与掺入细胞实验相同的条件下进行捕获实验：分别采用阻断的通道和普通的PPOx通道作为负对照和正对照。测试通道由EpCAM官能化的PPOx通道组成。在测试之前将Hex ALA添加到尿样中，与DAPI核染色一起，从而能够区分细胞和其它代谢物。
图11中显示了确认有膀胱癌的一个患者样品的结果。
在漂洗通道之前和之后计数所有细胞，我们在“亮场事件”，标记BF的灰色条柱(＝任何类型的结合细胞还有其它类别的代谢物)，在标记为DAPI的蓝色条柱上的细胞(＝独特的蓝色dapi染色)和带有标记为Hexala的红色条柱的“可疑”细胞之间进行区分。后者对应于均具有胞核红色荧光的实体。在EpCAM通道中以比在阻断通道中显著更大的比例捕获了具有癌细胞的独特特征(大核、不规则形状、独特的红色荧光)的细胞，EpCAM/阻断的比值为12.6。
图12中显示了一个已知健康样品的实例。在该情形中所述样品的细胞构成少得多，并且在阻断通道或者EpCAM通道上捕获的可疑细胞的数目之间不存在显著差别，数目都非常少。这里EpCAM/阻断的比值小于1。
实施例8-可以在EpCAM官能化的等离子体聚合物上从真正患者样品中捕获癌细胞并且可以用ala-5诱导荧光确认这些细胞的特性
分析更多的患者，并将测试的结果与细胞学和膀胱镜检查的结果比较，这被认为是就膀胱癌诊断而言的黄金标准。
我们实验中得到的EpCAM/阻断比与膀胱镜检查的结果关联很好，并且可以确定通过细胞学检查结果的阈值(图13)。
测试三个经确认的健康细胞的样品，为此我们的测试系统地反馈低EpCAM/阻断比值，即低于3。测试确认有膀胱癌的五个患者的样品。在那五个样品中，有两个被膀胱镜检查和细胞学检查认为是癌症正结果。那两个样品是我们的测试反馈最高的EpCAM/阻断比，高于12。两个被膀胱镜检查认为低等级癌症，但是根据细胞学结果是负值。一个被膀胱镜检查标记为“肿瘤”，但是被细胞学检查仅认为是高度可疑的。对于最后三个样品而言，我们的测试反馈为介于4和7之间的中等EpCAM/阻断值。
基于从这些患者样品搜集的结果，采用3作为阈值，我们的测试能够区别健康和低等级癌症。
实施例9-自动计数软件
可以使用软件自动地基于细胞荧光颜色(红色+蓝色)、荧光强度、形状、和尺寸选择标准来辨识被捕获的癌细胞(图14)。传统地，由于不规则的大细胞核、较高的核与细胞质比例、较暗(细胞核中更多DNA)、比肉芽肿、多瘤病毒、管型(casts)更小但比细菌、RBC大，通过细胞学检查来辨识癌细胞。与此对照，可以在本文公开的装置中辨识细胞，因为癌细胞的细胞核呈现蓝色，Ala5正值的细胞呈现红色，并且所述癌细胞一般具有大于10微米和小于30nm的尺寸。
实施例10-癌症特异性光敏剂用的最佳条件
研究用于癌症特异性光敏剂(经活体，ex-vivo)的最佳条件。具体地，对于不同的培养时间测试用于氨基己糖氨基酮戊酸(HexAla-5)的浓度范围。结果提供在图15中，其表明健康细胞(HFF)和四种不同癌细胞系的平均荧光之间的差别对于5-100mM(左上)之间的HexAla浓度和2-8h之间(左下)的培养时间而言是清楚的。在右边以荧光显微图像显示癌细胞系HT1376和HT1197以50：50与健康人***成纤维细胞(HFF)共培养的理想状况的图像。上方图像是与亮场图像的叠加从而看见存在的非荧光健康细胞。
本领域技术人员将理解本发明不限于用于所描述的特定应用。本发明也不限于就这里描述或者描绘的具体要素和/或特征而言的优选实施方案。将意识到本发明不限于所公开的一个或者多个实施方案，而是能够在不偏离所附权利要求书描述和限定的发明范围的情况下进行多种重组、变换和替换。
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