阅读说明：本技术 一种冷冻保存动物***的方法 (Method for cryopreservation of animal sperm ) 是由 许红喜 卫喜明 宋伟红 甘文平 孙晓玉 张洪涛 韩志强 于 2016-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种冷冻保存动物精子的方法,包括以下步骤：(1)将采集到的动物精液放入保温瓶内,温度保持在20-35℃；(2)用动物精子稀释液按精子数300-1000万/mL稀释,灌装并封口,得到细管精液；(3)以0.1-0.5℃/min的速度降温至0-4℃；(4)静置1h-2h；(5)将细管精液放在液氮上方,距离液氮面高度1.0cm-2.0cm,温度为零下100℃-120℃,熏蒸5min-15min,直接投到液氮里,得到细管冻精,在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。本发明解决了传统方法在保存动物精子时,观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生的问题。(The invention relates to a method for cryopreservation of animal sperm, comprising the following steps: (1) putting the collected animal semen into a vacuum flask, and keeping the temperature at 20-35 ℃; (2) diluting with animal sperm diluent according to sperm number of 300-; (3) cooling to 0-4 deg.C at a speed of 0.1-0.5 deg.C/min; (4) standing for 1-2 h; (5) putting the tubule semen above liquid nitrogen, with a height of 1.0-2.0 cm from the liquid nitrogen surface, fumigating at-100 deg.C to 120 deg.C for 5-15 min, directly adding into liquid nitrogen to obtain tubule frozen semen, and packing the tubule frozen semen into gauze bag in liquid nitrogen for use. The invention solves the problems that when animal sperms are preserved by the traditional method, the observation visual field is not clear, the pollution is easy, the survival time is short, and the antibiotic is not used in a standard way, so that the production of super bacteria is caused.)

一种冷冻保存动物***的方法

本发明是分案申请，原中国专利申请号为：201610494390.1，申请日为：2016年6月29日，原申请的专利名称为：动物***稀释液及其制备方法和利用该稀释液冷冻、冷藏保存***的方法。

技术领域

本发明属于动物技术领域，尤其涉及一种冷冻保存动物***的方法。

背景技术

动物***在保存时，通常以冷冻或冷藏的方法进行。在保存时，一般会加入动物源稀释液。现有技术中，由于保存过程中操作不合理或动物源稀释液的配方不合适，会影响动物***的活力和保存时间。例如，加入卵黄稀释液会引入其他动物源的病原微生物，给人工授***畜群带来疾病，特别是在配制稀释液时加入大量的抗生素，不规范使用抗生素以致超级细菌产生。卵黄稀释液现用现配不易保存不用的蛋清或蛋壳在垃圾桶内不及时处理实验室容易有臭鸡蛋的味道，污染环境。卵黄稀释液在显微镜下观察***活力，由于存在卵黄颗粒使视野不清晰，不易于观察。也有研究者利用无动物源的物质制备动物***稀释液，但是该稀释液利用的物质如咖啡因属于禁销药品，不适合大批量推广应用，而且有***活力不持久、存活时间短的问题。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种冷冻保存动物***的方法。

本发明的目的是为了解决传统方法制备的动物***稀释液的观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生的问题，而提供了动物***稀释液及其配制方法和利用该稀释液冷冻、冷藏保存***的方法。

本发明的动物***稀释液由丙三醇、葡萄糖、果糖、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、脱脂小麦蛋白粉（蛋白质、小麦蛋白肽）、脱脂豌豆蛋白粉(蛋白质、K因子、胡萝卜素、维生素Bt、维生素E、维生素C)、脱脂花生蛋白粉(蛋白质、钙、磷、铁、硫胺素，棕榈酸、维生素A、B、C、E、K)、脱脂大豆蛋白粉（蛋白质、卵磷脂、植物免疫因子、植物微量元素）和灭菌蒸馏水组成。

本发明提供一种动物***稀释液，由50mL-100mL丙三醇、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖、20g-30g三羟甲基氨基甲烷、10g-20g柠檬酸、0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉、0.1g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉、0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉和180mL-190mL灭菌蒸馏水组成。

本发明的有益效果：本发明通过合理的设置各组分以及各组分的配比，具有***活力持久、存活时间长等优点。本发明解决了传统方法的动物***稀释液的观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生的问题。

上述的动物***稀释液可以按以下步骤制备：

（1）用分析天平称20g-30g三羟甲基氨基甲烷，然后取180mL-190mL灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；

（2）分别称取：分别称取0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉、0.1g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉和0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤（1）的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入4℃冷藏沉降24h-48h；

（3）弃去步骤（2）中的沉淀物，得上清液；在分析天平上分别称取10g-20g柠檬酸、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖和50mL-100mL丙三醇加入上述上清液中，超声波混匀裂解细菌和病毒，放入4℃冷藏得到动物***稀释液。

采用上述方案的有益效果：通过上述方法制备的动物***稀释液，具有***活力持久、存活时间长等优点。本发明解决了传统方法的动物***稀释液的观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生的问题。

进一步，步骤（2）超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入4℃冷藏沉降24h。

采用上述方案的有益效果：采用上述参数可以进一步提高动物***稀释液的品质。

进一步，脱脂豌豆蛋白粉的质量为0.5g-1g或0.1g-0.5g。

上述的动物***稀释液的制备方法按以下步骤进行：

（1）用分析天平称20g-30g三羟甲基氨基甲烷，然后取180mL-190mL灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；

（2）分别称取：分别称取0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉、脱脂豌豆蛋白粉（0.5g-1g或0.1g-0.5g）、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉和0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤（1）的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入0-8℃冷藏沉降24h-48h；

（3）弃去步骤（2）中的沉淀物，得上清液；在分析天平上分别称取10g-20g柠檬酸、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖和50mL-100mL丙三醇加入上述上清液中，超声波混匀裂解细菌和病毒，放入4℃冷藏得到动物***稀释液。

采用上述方案的有益效果：可以进一步提高动物***稀释液的品质。

优选的，脱脂豌豆蛋白粉的质量为0.1g。

优选的，所述三羟甲基氨基甲烷的质量为20g，灭菌蒸馏水的体积为180mL。

优选的，柠檬酸质量为10g或12g。

优选的，葡萄糖质量为10g或15g。

优选的，脱脂大豆蛋白粉的质量为0.5g，脱脂花生蛋白粉的质量0.5g，脱脂小麦蛋白粉的质量0.2g。

优选的，果糖质量为10g，丙三醇体积为50mL。

采用上述方案的有益效果：采用上述参数可以进一步提高动物***稀释液的品质，提高动物***稀释液的使用效果。

本发明提供一种利用动物***稀释液冷冻保存***的方法，按以下步骤进行：

（1）将采集到的动物***放入保温瓶内，温度保持在20-35℃；

（2）将步骤（1）中的动物***用分光光度计测量密度，用动物***稀释液按***数300-1000万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的***灌装到细管中并封口，得到细管***；

（3）将步骤（2）中的细管***放到降温柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降温，降到0-4℃；

（4）将步骤（3）中的细管***平衡1h-2h；

（5）将步骤（4）的细管***放在液氮上方，距离液氮面高度1.0cm-2.0cm，温度约为零下100℃-120℃，熏蒸5min-15min，直接投到液氮里，在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。

本发明的有益效果：本发明采用的上述保存方法具有***活力持久、存活时间长等优点。

进一步，所述动物***稀释液，由50mL-100mL丙三醇、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖、20g-30g三羟甲基氨基甲烷、10g-20g柠檬酸、0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉、0.1g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉、0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉和180mL-190mL灭菌蒸馏水组成。

本发明解决了传统方法在保存动物***时，观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生等问题。

上述动物***稀释液按以下步骤制备：

（1）用分析天平称20g-30g三羟甲基氨基甲烷，然后取180mL-190mL灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；

（2）分别称取：分别称取0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉、0.1g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉和0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤（1）的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入4℃冷藏沉降24h-48h；

（3）弃去步骤（2）中的沉淀物，得上清液；在分析天平上分别称取10g-20g柠檬酸、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖和50mL-100mL丙三醇加入上述上清液中，超声波混匀裂解细菌和病毒，放入4℃冷藏得到动物***稀释液。

进一步，脱脂豌豆蛋白粉的质量可以为0.1g-0.5g。例如，脱脂豌豆蛋白粉的质量为0.1g。三羟甲基氨基甲烷的质量为20g，灭菌蒸馏水的体积为180mL，柠檬酸质量为10g或12g，葡萄糖质量为10g或15g，脱脂大豆蛋白粉的质量为0.5g，脱脂花生蛋白粉的质量0.5g，脱脂小麦蛋白粉的质量0.2g，果糖质量为10g，丙三醇体积为50mL。

本发明的有益效果：采用上述动物***稀释液可以进一步提高保存的动物***的活力的持久性、延迟动物***的存活时间。

进一步，步骤（1）中，温度保持在28℃；步骤（2）中，用动物***稀释液按***数500万/mL稀释。步骤（3）中，以0.2℃/min的速度降温，降到4℃。步骤（4）中，细管***平衡1h。步骤（5）中，距离液氮面高度2.5cm，温度为零下110℃，熏蒸10min。

采用上述方案的有益效果：采用上述参数，可以进一步提高***活力以及存储时间。

本发明提供一种利用动物***稀释液冷藏保存***的方法，按以下步骤进行：

（1）将采集到的动物***放入保温瓶内，温度保持在20-35℃；

（2）将步骤（1）中的***用分光光度计测量密度，用动物***稀释液按***数300-1000万/mL稀释（即***数与动物***稀释液体积的比例为300-1000万：1mL），用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的***灌装到冻精细管中并封口；

（3）将步骤（2）中的细管***放到降温柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降温，降到0-4℃备用。

本发明的有益效果：本发明采用的上述保存方法具有***活力持久、存活时间长等优点。本发明解决了传统方法在保存动物***时，观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生等问题。

进一步，所述动物***稀释液，由50mL-100mL丙三醇、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖、20g-30g三羟甲基氨基甲烷、10g-20g柠檬酸、0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉、0.1g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉、0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉和180mL-190mL灭菌蒸馏水组成。

本发明的有益效果：采用上述动物***稀释液可以进一步提高保存的动物***的活力的持久性、延迟动物***的存活时间。

进一步，上述动物***稀释液按以下步骤制备：

（1）用分析天平称20g-30g三羟甲基氨基甲烷，然后取180mL-190mL灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；

（2）分别称取：分别称取0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉、0.1g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉和0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤（1）的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入4℃冷藏沉降24h-48h；

（3）弃去步骤（2）中的沉淀物，得上清液；在分析天平上分别称取10g-20g柠檬酸、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖和50mL-100mL丙三醇加入上述上清液中，超声波混匀裂解细菌和病毒，放入4℃冷藏得到动物***稀释液。

进一步，脱脂豌豆蛋白粉的质量为0.1g-0.5g。优选的，脱脂豌豆蛋白粉的质量为0.1g。三羟甲基氨基甲烷的质量为20g，灭菌蒸馏水的体积为180mL，柠檬酸质量为10g或12g，葡萄糖质量为10g或15g，脱脂大豆蛋白粉的质量为0.5g，脱脂花生蛋白粉的质量0.5g，脱脂小麦蛋白粉的质量0.2g，果糖质量为10g，丙三醇体积为50mL。

采用上述方案的有益效果：进一步提高动物***稀释液的品质。

进一步，步骤（1）中，温度保持在28℃。

进一步，步骤（2）中，用动物***稀释液按***数600万/mL稀释。

进一步，步骤（3）中，以0.4℃/min的速度降温。

进一步，步骤（3）中，降到4℃备用。

采用上述方案的有益效果：采用上述参数，可以进一步提高***活力以及存储时间。

综上所述，本发明相对于现有技术的优点：

1.相对于现有技术而言，本发明的动物***稀释液中添加植物提取物（植物蛋白、植物多肽、植物微量元素、植物因子、卵磷脂、免疫因子、维生素、棕榈酸、钠和钾等无机离子），对提高冷冻或冷藏保存的***活力和延长保存时间起了重要的作用，避免了添加***咖啡因，咖啡因虽能提高***活力但缩短了存活时间，咖啡因是禁销药品，妨碍了大量配制和使用推广；避免添加抗生素和滥用抗生素以致超级细菌产生。避免动物源稀释液如卵黄稀释液会引入其他动物源的病原微生物，给人工授***畜群带来疾病。

2.在原技术添加大豆蛋白粉的基础上又改进添加脱脂大豆蛋白粉、脱脂花生蛋白粉、脱脂豌豆蛋白粉和脱脂小麦蛋白粉，与现有技术相比本方法制得的动物***稀释液使冷冻的***活力提高1%-3%个点，冷藏保存的***存活时间延长1-2天。

3.经过改进动物***稀释液现有配制方法，得到5倍浓缩和保质期1年的***稀释液。

4.可以工厂化生产动物***稀释液来冷冻、冷藏保存***，省时省力，推广应用前景广阔。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方案，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式的动物***稀释液由由50mL-100mL丙三醇、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖、20g-30g三羟甲基氨基甲烷、10g-20g柠檬酸、0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉、0.5g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉、0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉和180mL-190mL灭菌蒸馏水组成。

具体实施方式二：如具体实施方式一所述的动物***稀释液的制备方法按以下步骤进行：

（1）用分析天平称20g-30g三羟甲基氨基甲烷，然后取180mL-190mL灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；

（2）分别称取：分别称取0.5g-1g脱脂大豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉和0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤（1）的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入0-8℃冷藏沉降24h-48h；

（3）弃去步骤（2）中的沉淀物，得上清液；在分析天平上分别称取10g-20g柠檬酸、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖和50mL-100mL丙三醇加入上述上清液中，超声波混匀裂解细菌和病毒，放入4℃冷藏得到动物***稀释液。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是，所述三羟甲基氨基甲烷的质量为20g。其他步骤与参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是，灭菌蒸馏水的体积为180mL。其他步骤与参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是，步骤（2）超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入4℃冷藏沉降24h。其他步骤与参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二不同的是，步骤（3）在分析天平上分别称取10g柠檬酸、10g葡萄糖、10g果糖和50mL丙三醇。其他步骤与参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式七：利用具体实施方式一所述的动物***稀释液冷冻保存***的方法按以下步骤进行：

（1）将采集到的动物***放入保温瓶内，温度保持在20-35℃；

（2）将步骤（1）中的动物***用分光光度计测量密度，用动物***稀释液按***数300-1000万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的***灌装到细管中并封口；

（3）将步骤（2）中的细管***放到降温柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降温，降到0-4℃；

（4）将步骤（3）中的细管***静置1h-2h；

（5）将步骤（4）的细管***放在液氮上方，距离液氮面高度1.0cm-2.0cm，温度为零下100℃-120℃，熏蒸5min-15min，直接投到液氮里，在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。

具体实施方式八：利用具体实施方式一所述的动物***稀释液冷藏保存***的方法按以下步骤进行：

（1）将采集到的动物***放入保温瓶内，温度保持在20-35℃，带到实验室；

（2）将步骤（1）中的***用分光光度计测量密度，用稀释液按***数300-1000万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的***灌装到冻精细管中并封口；

（3）将步骤（2）中的细管***放到降温柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降温，降到0-4℃备用。

实施例1

动物***稀释液由50mL丙三醇、15g葡萄糖、10g果糖、20g三羟甲基氨基甲烷、12g柠檬酸、0.2g脱脂小麦蛋白粉、0.1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g脱脂花生蛋白粉、0.5g脱脂大豆蛋白粉和180mL灭菌蒸馏水组成。

本实施例的动物***稀释液的制备方法按以下步骤进行：

（1）用分析天平称三羟甲基氨基甲烷和灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；所述三羟甲基氨基甲烷的质量与灭菌蒸馏水的体积比为20.00g：180mL；

（2）分别称取：0.5g脱脂大豆蛋白粉、0.1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g脱脂花生蛋白粉,0.2g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤（1）的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌、病毒等微生物，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入4℃冷藏沉降24h；

（3）弃去步骤（2）中的沉淀物，得上清液；在分析天平上称取12g柠檬酸、15g葡萄糖、10g果糖和50mL丙三醇加入上述上清液中，超声波混匀裂解蛋白、细菌、病毒等微生物，放入4℃冷藏得到动物***稀释液。

利用动物***稀释液冷冻保存***的方法按以下步骤进行：

（1）将采集到的狗的***放入保温瓶内，温度保持在28℃；

（2）将步骤（1）中的动物***用分光光度计测量密度，用本发明提供的动物***稀释液按***数500万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的***灌装到细管中并封口；

（3）将步骤（2）中的细管***放到降温柜中，以0.2℃/min的速度降温，降到4℃；

（4）将步骤（3）中的细管***平衡1h；

（5）将步骤（4）的细管***放在液氮上方，距离液氮面高度2.5cm，温度约为零下110℃，熏蒸10min，直接投到液氮里，在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。

本发明利用动物***稀释液冷藏保存***的方法按以下步骤进行：

（1）将采集到的狗的***放入保温瓶内，温度保持在28℃；

（2）将步骤（1）中的***用分光光度计测量密度，用稀释液按***数600万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的***灌装到冻精细管中并封口；

（3）将步骤（2）中的细管***放到降温柜中，以0.4℃/min的速度降温，降到4℃备用。

本实施例得到的动物***稀释液冷冻保存的***活力为0.48，存活时间为7-12天，冷藏保存的***的***活力为0.6，存活时间为10-15天。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。