阅读说明：本技术 一种脂肪组织的冻存方法 (Cryopreservation method of adipose tissues ) 是由 龙婕 姜南 陈娟 孟宪星 董琪 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：一种脂肪组织的冻存方法,步骤一、使用多孔注水针头在取材部位皮下均匀注射适量肿胀麻醉液,麻醉满意后,用吸脂针头接注射器,直接利用注射器管形成的负压将脂肪组织抽吸到注射器内,得到脂肪组织混合物,备用；步骤二、将抽取的脂肪组织混合物加适量生理盐水,上下倒置充分混匀后,静置,颗粒脂肪浮于上层,弃下层液体,将上层清洗去除大部分血液成分至颜色黄亮；然后置于控温离心机中离心,取颗粒脂肪组织,备用；步骤三、配置海藻糖溶液和油脂的混合液作为冻存液；步骤四、将颗粒脂肪组织与冻存液按1:1体积比混合,放入4℃冰箱2h后移入–20℃冰箱,4 h后移入–80℃深低温冰箱冷冻,12 h后移入液氮中冻存。本发明的冻存方法可保持冻存脂肪组织的活力。(A method for freezing adipose tissues comprises the steps of firstly, injecting a proper amount of swelling anesthetic liquid under the skin of a material-taking part by using a porous water injection needle, connecting a liposuction needle to a syringe after anesthesia is satisfied, and directly sucking the adipose tissues into the syringe by using negative pressure formed by the syringe tube to obtain an adipose tissue mixture for later use; step two, adding a proper amount of normal saline into the extracted adipose tissue mixture, inverting the mixture up and down, fully and uniformly mixing the mixture, standing the mixture until granular fat floats on the upper layer, discarding the liquid on the lower layer, and cleaning the upper layer to remove most blood components until the color is yellow and bright; centrifuging in a temperature-controlled centrifuge, and collecting granular adipose tissues for later use; step three, preparing a mixed solution of trehalose solution and grease as a frozen stock solution; and step four, mixing the granular adipose tissues with the freezing solution according to the volume ratio of 1:1, putting the mixture into a refrigerator at 4 ℃ for 2 hours, transferring the mixture into a refrigerator at 20 ℃ below zero, transferring the mixture into a deep low temperature refrigerator at 80 ℃ below zero for 4 hours for freezing, and transferring the mixture into liquid nitrogen for freezing after 12 hours. The cryopreservation method can keep the activity of the cryopreserved adipose tissues.)

一种脂肪组织的冻存方法

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，具体为一种脂肪组织的冻存方法。

背景技术

自体脂肪颗粒是一种理想的软组织填充材料；但移植脂肪颗粒的低存活率和高吸收率是困扰脂肪移植在临床中广泛开展和应用的主要问题。少量、反复、多次注射是目前提高脂肪成活率的理想方。但反复抽吸脂肪不仅增加了患者的痛苦，也增加了医疗风险和费用，因而一次抽取较多脂肪用于之后进行的分次移植，能很大程度上解决以上问题，同时也能够减少医务人员的工作量。“一次抽脂，多次注射”依赖于体外脂肪冻存技术的提高。在以往的研究中，多以生理盐水、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)作为冻存基础液，但经生理盐水保存后细胞的细胞活性低；而DMSO有一定的毒性，不能用于临床上脂肪细胞回输。

目前，现有的冷冻脂肪技术对脂肪细胞活力有一定的损伤。学者Shoshanni认为造成脂肪细胞活力损伤的主要原因在于冷冻和复温过程，而不在于冻存时间的长短。人颗粒脂肪组织在经历了降温，冻结等过程后，其组织中脂肪细胞的活力和移植成活率低于新鲜的人颗粒脂肪组织，其中主要原因包括：一是降温时细胞内生成粗大的树枝状冰晶直接破坏细胞结构；另一方面则是细胞在降温过程中氧化应激产生过多过氧化物，使细胞活力受损，加速了细胞的凋亡。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提出一种脂肪组织的冻存方法，可排除冰晶形成对细胞造成的机械性损伤，采用了添加抗氧化剂的冷冻液保存，有利于保持冷冻贮存脂肪组织的活力。

本发明为了解决上述问题所提出的技术方案为：一种脂肪组织的冻存方法，包括以下步骤：

步骤一、脂肪组织抽取：使用多孔注水针头在取材部位皮下均匀注射适量肿胀麻醉液，麻醉满意后，用吸脂针头接注射器，直接利用注射器管形成的负压将脂肪组织抽吸到注射器内，得到脂肪组织混合物，备用；

步骤二、脂肪组织的纯化：将抽取的脂肪组织混合物加适量生理盐水，上下倒置充分混匀后，静置，颗粒脂肪浮于上层，弃下层液体，将上层清洗去除大部分血液成分至颜色黄亮；然后置于控温离心机中，800-1200rpm离心2-4 min，取颗粒脂肪组织，备用；

步骤三、配置冻存液：配置0.35 mol/L的海藻糖溶液和油脂的混合液作为冻存液，其中海藻糖溶液与油脂的体积比为1：（1-3）；

步骤四、颗粒脂肪组织的冻存：将颗粒脂肪组织与冻存液按1:1体积比混合，放入4℃冰箱2 h后移入–20 ℃冰箱，4 h后移入–80 ℃深低温冰箱冷冻，12 h 后移入液氮中冻存。

本发明中，作为优选的，所述步骤一中，所述的注射器为20mL注射器。

本发明中，作为优选的，所述步骤二中，所述保温离心机离心分离后的混合物分上、中、下三层，上层为破裂脂肪细胞溢出的脂滴，中层为颗粒脂肪组织，下层为水分和少量纤维组织，弃上、下层，保留中间层颗粒脂肪组织。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有400-800IU/mL的超氧化物歧化酶。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有5-25mmol/mL谷胱甘肽。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有2-4mg/mL 生育酚。

本发明中，作为优选的，所述冻存液的配制方法为：将0.35mol/L的海藻糖溶液与和油脂混合，而后装入冻存管中，再添加调定浓度为400-800IU/mL的超氧化物歧化酶（SOD）或/和5-25mmol/mL的谷胱甘肽（GSH）或/和2-4mg/mL 的生育酚（VE）即可。

本发明中，作为优选的，所述步骤四中，将纯化的脂肪装入专用脂肪冻存袋，抽取脂肪冻存液缓慢加入脂肪冻存袋中，充分混合后，排出空气，用热合机将连接管封口；将冻存袋置入4 ℃疫苗箱转移至冻存室，放4℃冰箱2 h后移入–20 ℃冰箱，4 h后移入–80 ℃深低温冰箱冷冻，12 h 后移入液氮中冻存。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述的一种脂肪组织的冻存方法，，一方面，用海藻糖溶液作为一种新型脂肪细胞稳定剂，油脂为较好的溶剂，两者混合后能较好地保持冷冻脂肪细胞活性，是一种较为理想的脂肪冻存保护剂，且海藻糖不溶于脂肪，故而加入油脂作为有机溶剂，能够作为载体，将海藻糖“携带”进入脂肪组织细胞中，从而对脂肪组织细胞进行有效的降温保护，可排除冷冻降温过程中冰晶的形成对细胞造成的机械性损伤；

另一方面，抗氧化剂的加入不仅可抑制活性氧的产生，还可直接清除活性氧，或通过直接作用于抗氧化反应环节元件而提高内源性抗氧化物质的水平或抑制氧酶的表达而减少活性氧的产生。因此，抗氧化剂的干预会有效提高冻存人颗粒脂肪组织的活力，避免降温过程中细胞由于氧化应激而形成过多的过氧化物。总之，本申请所述的冻存液有利于人颗粒脂肪组织的冷冻保存。

通过本申请所述的脂肪组织冻存液，从理论和技术上真正实现一次吸脂、长期使用；为临床上应用冷冻人颗粒脂肪组织移植填充治疗因各种原因所致的软组织缺陷提供理论与技术依据；同时避免反复取材而给受术者增加的吸脂手术痛苦，降低受术者的治疗费用；另一方面也可减少医务人员的工作量及医疗资源，在脂肪填充移植中，脂肪抽取的时间占据整个手术的时间的一半以上，为了尽可能减少脂肪细胞损伤，医生往往采用注射器形成负压手动吸脂。

通过脂肪组织的冻存，可建立体外脂肪库，患者将可终身使用自体脂肪移植，甚至可将年轻时的脂肪组织储存用于将来软组织老化萎缩时的抗衰老治疗。该技术具有广泛的临床应用前景，必将深受广大医生和患者欢迎，所获得的研究数据可为将来人类建立脂肪库提供相关的实验室数据及理论参考，也可为人类其它组织或器官的冷冻保存提供一定的参考依据。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种脂肪组织的冻存方法，包括以下步骤：

步骤一、脂肪组织抽取：使用多孔注水针头在取材部位皮下均匀注射适量肿胀麻醉液，麻醉满意后，用吸脂针头接注射器，直接利用注射器管形成的负压将脂肪组织抽吸到注射器内，得到脂肪组织混合物，备用；

步骤二、脂肪组织的纯化：将抽取的脂肪组织混合物加适量生理盐水，上下倒置充分混匀后，静置，颗粒脂肪浮于上层，弃下层液体，将上层清洗去除大部分血液成分至颜色黄亮；然后置于控温离心机中，800rpm离心2 min，取颗粒脂肪组织，备用；

步骤三、配置冻存液：配置0.35mol/L的海藻糖溶液和油脂的混合液作为冻存液，其中海藻糖溶液与油脂的体积比为1：1；

步骤四、颗粒脂肪组织的冻存：将颗粒脂肪组织与冻存液按1:1体积比混合，放入4℃冰箱2 h后移入–20 ℃冰箱，4 h后移入–80 ℃深低温冰箱冷冻，12 h 后移入液氮中冻存。

本发明中，作为优选的，所述步骤一中，所述的注射器为20mL注射器。

本发明中，作为优选的，所述步骤二中，所述保温离心机离心分离后的混合物分上、中、下三层，上层为破裂脂肪细胞溢出的脂滴，中层为颗粒脂肪组织，下层为水分和少量纤维组织，弃上、下层，保留中间层颗粒脂肪组织。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有400IU/mL的超氧化物歧化酶。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有5mmol/mL谷胱甘肽。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有2mg/mL 生育酚。

本发明中，作为优选的，所述冻存液的配制方法为：将0.35mol/L的海藻糖溶液与油脂混合，而后装入冻存管中，再添加调定浓度为400IU/mL的超氧化物歧化酶（SOD）和5mmol/mL的谷胱甘肽（GSH）和2mg/mL 的生育酚（VE）即可。

本发明中，作为优选的，所述步骤四中，将纯化的脂肪装入专用脂肪冻存袋，抽取脂肪冻存液缓慢加入脂肪冻存袋中，充分混合后，排出空气，用热合机将连接管封口；将冻存袋置入4 ℃疫苗箱转移至冻存室，放4℃冰箱2 h后移入–20 ℃冰箱，4 h后移入–80 ℃深低温冰箱冷冻，12 h 后移入液氮中冻存。

实施例2：

一种脂肪组织的冻存方法，包括以下步骤：

步骤一、脂肪组织抽取：使用多孔注水针头在取材部位皮下均匀注射适量肿胀麻醉液，麻醉满意后，用吸脂针头接注射器，直接利用注射器管形成的负压将脂肪组织抽吸到注射器内，得到脂肪组织混合物，备用；

步骤二、脂肪组织的纯化：将抽取的脂肪组织混合物加适量生理盐水，上下倒置充分混匀后，静置，颗粒脂肪浮于上层，弃下层液体，将上层清洗去除大部分血液成分至颜色黄亮；然后置于控温离心机中， 1200rpm离心4 min，取颗粒脂肪组织，备用；

步骤三、配置冻存液：配置0.35mol/L的海藻糖溶液和油脂的混合液作为冻存液，其中海藻糖溶液与油脂的体积比为1：3；

步骤四、颗粒脂肪组织的冻存：将颗粒脂肪组织与冻存液按1:1体积比混合，放入4℃冰箱2 h后移入–20 ℃冰箱，4 h后移入–80 ℃深低温冰箱冷冻，12 h 后移入液氮中冻存。

本发明中，作为优选的，所述步骤一中，所述的注射器为20mL注射器。

本发明中，作为优选的，所述步骤二中，所述保温离心机离心分离后的混合物分上、中、下三层，上层为破裂脂肪细胞溢出的脂滴，中层为颗粒脂肪组织，下层为水分和少量纤维组织，弃上、下层，保留中间层颗粒脂肪组织。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有600IU/mL的超氧化物歧化酶。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有15mmol/mL谷胱甘肽。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有2.5mg/mL 生育酚。

本发明中，作为优选的，所述冻存液的配制方法为：将0.35mol/L的海藻糖溶液与油脂混合，而后装入冻存管中，再添加调定浓度为100-600IU/mL的超氧化物歧化酶（SOD）和15mmol/mL的谷胱甘肽（GSH）和2.5mg/mL 的生育酚（VE）即可。

本发明中，作为优选的，所述步骤四中，将纯化的脂肪装入专用脂肪冻存袋，抽取脂肪冻存液缓慢加入脂肪冻存袋中，充分混合后，排出空气，用热合机将连接管封口；将冻存袋置入4 ℃疫苗箱转移至冻存室，放4℃冰箱2 h后移入–20 ℃冰箱，4 h后移入–80 ℃深低温冰箱冷冻，12 h 后移入液氮中冻存。

实施例3：

一种脂肪组织的冻存方法，包括以下步骤：

步骤一、脂肪组织抽取：使用多孔注水针头在取材部位皮下均匀注射适量肿胀麻醉液，麻醉满意后，用吸脂针头接注射器，直接利用注射器管形成的负压将脂肪组织抽吸到注射器内，得到脂肪组织混合物，备用；

步骤二、脂肪组织的纯化：将抽取的脂肪组织混合物加适量生理盐水，上下倒置充分混匀后，静置，颗粒脂肪浮于上层，弃下层液体，将上层清洗去除大部分血液成分至颜色黄亮；然后置于控温离心机中，1000rpm离心3 min，取颗粒脂肪组织，备用；

步骤三、配置冻存液：配置0.35mol/L的海藻糖溶液和油脂的混合液作为冻存液，其中海藻糖溶液与油脂的体积比为1：2；

步骤四、颗粒脂肪组织的冻存：将颗粒脂肪组织与冻存液按1:1体积比混合，放入4℃冰箱2 h后移入–20 ℃冰箱，4 h后移入–80 ℃深低温冰箱冷冻，12 h 后移入液氮中冻存。

本发明中，作为优选的，所述步骤一中，所述的注射器为20mL注射器。

本发明中，作为优选的，所述步骤二中，所述保温离心机离心分离后的混合物分上、中、下三层，上层为破裂脂肪细胞溢出的脂滴，中层为颗粒脂肪组织，下层为水分和少量纤维组织，弃上、下层，保留中间层颗粒脂肪组织。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有650IU/mL的超氧化物歧化酶。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有8mmol/mL谷胱甘肽。

本发明中，作为优选的，所述步骤三的冻存液中还添加有3mg/mL 生育酚。

本发明中，作为优选的，所述冻存液的配制方法为：将0.35mol/L的海藻糖溶液与油脂混合，而后装入冻存管中，再添加调定浓度为650IU/mL的超氧化物歧化酶（SOD）和8mmol/mL的谷胱甘肽（GSH）和3mg/mL 的生育酚（VE）即可。

本发明中，作为优选的，所述步骤四中，将纯化的脂肪装入专用脂肪冻存袋，抽取脂肪冻存液缓慢加入脂肪冻存袋中，充分混合后，排出空气，用热合机将连接管封口；将冻存袋置入4 ℃疫苗箱转移至冻存室，放4℃冰箱2 h后移入–20 ℃冰箱，4 h后移入–80 ℃深低温冰箱冷冻，12 h 后移入液氮中冻存。

上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。