阅读说明：本技术 一种纳米花负载农药制剂及其制备方法 (Nano flower-loaded pesticide preparation and preparation method thereof ) 是由 周成刚 满虹宇 季英超 郭森 李子坤 曹晟涵 刘彦雪 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种纳米花负载农药制剂及其制备方法,其中纳米花由如下方法制备而成：(1)将金属化合物加入至pH＝4.5的磷酸盐缓冲溶液中,配制成浓度为0.01-3mg/mL的金属离子溶液；(2)将蛋白加入至pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中,配制成浓度为0.01-1.0mg/mL的蛋白溶液；(3)将步骤(1)制得的金属离子溶液加入至步骤(2)制得的蛋白溶液中,经搅拌、超声分散、抽滤、洗涤、冷冻干燥制得纳米花。本发明制备的纳米花负载农药制剂由于内部为纳米孔洞,具有较大比表面积,因而载药量高,且产率高,生物相容性好,具有很好的缓释效果,适用于农林业害虫的胃毒或触杀。(The invention discloses a nano flower-loaded pesticide preparation and a preparation method thereof, wherein the nano flower is prepared by the following method: (1) adding a metal compound into a phosphate buffer solution with the pH value of 4.5 to prepare a metal ion solution with the concentration of 0.01-3 mg/mL; (2) adding the protein into a phosphate buffer solution with the pH value of 7.4 to prepare a protein solution with the concentration of 0.01-1.0 mg/mL; (3) and (3) adding the metal ion solution prepared in the step (1) into the protein solution prepared in the step (2), and stirring, ultrasonically dispersing, filtering, washing and freeze-drying to obtain the nanoflower. The nanometer flower-loaded pesticide preparation prepared by the invention has high drug loading, high yield, good biocompatibility and good slow release effect due to the nanometer holes inside and larger specific surface area, and is suitable for stomach toxicity or contact poisoning of agricultural and forestry pests.)

一种纳米花负载农药制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及农药制剂技术领域，具体涉及一种纳米花负载农药制剂及其制备方法。

背景技术

传统农药多具有广谱性，在杀死害虫的同时会对其他有益的昆虫和鸟类造成伤害，破坏生态平衡，经常使用农药会使害虫产生抗药性，从而加大了用药量及用药次数。此外，传统农药的利用率低，通常为10％左右，其余残留在环境中，对环境造成污染，大量散失的农药挥发到空气中，随排水或者流水进入水体中，或沉聚在土壤中，污染农畜渔果产品，并可通过食物链转移到人体，危害人类健康。近年来，由于纳米粒子具有尺寸小、比表面积大、缓释控释、良好的生物相容性和生物降解性等优点，在医学、制药、材料和农业等各个领域得到了广泛的应用。由于纳米粒子介导的基因或DNA在植物中的转移可以抵御害虫的入侵，因此，纳米粒子可以用于制备杀虫剂和驱虫化学品等。

申请号为201410577506.9，发明名称为一种BSA/Zn₃(PO₄)₃杂化纳米花的制备方法的专利，公开了一种纳米花的制备方法，通过该方法制备的纳米花存在产率低的问题，而且没有公开关于将纳米花应用至生产农药制剂中的相关研究，更没有公开关于如何通过纳米花提高农药制剂载药量的相关研究。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种纳米花负载农药制剂及其制备方法，通过本发明获得具有层状结构的纳米花，将配制好的农药与之混合，获得新型纳米花-农药载体体系，该方法制备的纳米花负载农药制剂由于内部为纳米孔洞，具有较大比表面积，因而载药量高，且产率高，生物相容性好，具有很好的缓释效果，适用于农林业害虫的胃毒或触杀。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种纳米花，由如下方法制备而成：

(1)将金属化合物加入至pH＝4.5的磷酸盐缓冲溶液中，配制成浓度为0.01-3mg/mL的金属离子溶液；

(2)将蛋白加入至pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中，配制成浓度为0.01-1.0mg/mL的蛋白溶液；

(3)将步骤(1)制得的金属离子溶液加入至步骤(2)制得的蛋白溶液中，经搅拌、超声分散、抽滤、洗涤、冷冻干燥制得纳米花。

优选的，步骤(1)中，所述金属化合物为含锌化合物、含铜化合物和含钙化合物中的任一种。

更优选的，所述金属化合物为硝酸锌。

优选的，步骤(2)中，所述蛋白为牛血清白蛋白、α-乳清蛋白、漆酶、脂肪酶中的任一种。

更优选的，所述蛋白为牛血清白蛋白。

优选的，步骤(3)中，金属离子溶液与蛋白溶液的体积比为(15-25)：(2-4)。

优选的，步骤(3)中，所述搅拌是在转速为150-500rpm下搅拌3h。

优选的，步骤(3)中，超声分散时间为1min。

优选的，步骤(3)中，用0.1m的纳滤膜进行抽滤。

优选的，步骤(3)中，洗涤是用去离子水反复洗涤3-4次。

优选的，步骤(3)制得的纳米花粒径为4-6μm。

优选的，所述纳米花由层状结构的薄壁纳米花瓣组成。

本发明的第二方面，提供上述纳米花在制备农药制剂中的用途。

本发明的第三方面，提供一种纳米花负载农药制剂的制备方法，包括如下步骤：

将上述制得的纳米花分散至乙腈中，制得纳米花-乙腈溶液，将农药溶于乙腈中，制得农药-乙腈溶液，将农药-乙腈溶液搅拌加入至纳米花-乙腈溶液中，经搅拌、抽滤、洗涤、冷冻干燥制得纳米花负载农药制剂。

优选的，所述纳米花-乙腈溶液的纳米花浓度为0.01-0.1mg/mL。

优选的，所述农药-乙腈溶液的农药浓度为0.01-0.2mg/mL。

优选的，农药-乙腈溶液与纳米花-乙腈溶液的体积比为1:(10-100)。

优选的，所述农药为阿维菌素、吡虫啉、毒死蜱、杀螟丹中的任一种。

本发明的第四方面，提供利用上述方法制备的纳米花负载农药制剂。

优选的，纳米花负载农药制剂的载药量为79-85％。

本发明的有益效果：

1、本发明纳米花是由蛋白与金属离子借助磷酸盐缓冲液中的磷酸根离子和氯离子反应形成的具有纳微米尺寸的不同花状结构。本发明以牛血清白蛋白为蛋白源，溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，磷酸根离子附着在蛋白表面，以硝酸锌为金属离子源，溶解在pH＝4.5的磷酸缓冲溶液中，将两种溶液搅拌混合，锌离子首先与过量的磷酸根离子形成磷酸锌，再与牛血清白蛋白配位形成层状结构，搅拌3小时后，抽滤获得具有层状结构的纳米花，将配制好的农药与之混合，获得新型纳米花-阿维菌素农药载体体系，制备的纳米花负载农药制剂由于内部为纳米孔洞，以及薄壁纳米花瓣间的空隙使纳米花具有较大比表面积，因而载药量高，且产率高，生物相容性好，具有很好的缓释效果，适用于农林业害虫的胃毒或触杀。

2、本发明解决了传统农药利用率低、对环境的污染的问题，避免害虫产生抗药性，所使用的载体材料无毒，纳米花的载药量高，粒径稳定，缓释效果好，制备过程安全无毒。

3、牛血清白蛋白无毒，具有良好的生物相容性、生物可降解、环境友好等优点，纳米花的制备过程简单高效，无毒无污染。纳米花的载药量高，具有缓释控释能力，阿维菌素包埋吸附在纳米花中，有效防止阿维菌素的快速光解，大大提高了药物的利用率，并且减少药剂的施用次数，实现农药减量，环境友好。

4、本发明纳米花负载农药制剂的制备过程简单，成本低，对设备要求低，安全，高效，利于生态环境的保护，具有广阔的大田施用前景。

附图说明

图1为本发明反应2小时制备的纳米花-农药的扫描电镜形貌图。

图2为本发明反应2.5小时制备的纳米花-农药的扫描电镜形貌图。

图3为本发明反应3小时优化制备的纳米花-农药的扫描电镜形貌图。

图4为本发明载药纳米花与对比例纳米花的缓释效率对比图，在200小时内，本发明纳米花释放曲线还在上升趋势，未出现饱和释放，此时还在继续释放，而对比例纳米花载药在70多个小时就已经达到释放饱和。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，现有的纳米花存在产率低的技术问题，并且没有关于将纳米花应用至生产农药制剂中的相关研究，更没有关于如何通过纳米花提高农药制剂载药量的相关研究。基于此，本发明提供了一种纳米花负载农药制剂，本发明以牛血清白蛋白为蛋白源，溶解在pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，磷酸根离子附着在蛋白表面，以硝酸锌为金属离子源，溶解在pH＝4.5的磷酸缓冲溶液中，将两种溶液搅拌混合，锌离子首先与过量的磷酸根离子形成磷酸锌，再与牛血清白蛋白配位形成层状结构，搅拌3小时后，抽滤获得具有层状结构的纳米花，将配制好的农药与之混合，获得新型纳米花-阿维菌素农药载体体系，制备的纳米花负载农药制剂由于内部为纳米孔洞，以及薄壁纳米花瓣间的空隙使纳米花具有较大比表面积，因而载药量高，且产率高，生物相容性好，具有很好的缓释效果，适用于农林业害虫的胃毒或触杀。

纳米花的形貌会直接影响负载农药的效果，而蛋白源溶液和金属离子源溶液混合搅拌的时间会影响所制备的纳米花的形貌，本申请在研究过程中发现，在制备纳米花-农药时，纳米花最开始的状态是球形，这个过程很短，然后球开始层状裂开，像花骨朵一样缓缓展开，最终状态如图3所示。图1-图3是不同搅拌时间下所制备的纳米花负载农药后的扫描电镜形貌图，图中的球状体是纳米花，后面的孔洞(网状结构)是纳滤膜，因为纳米花-农药是通过抽滤获得的，将自然干燥纳米花的纳滤膜剪下来部分，放到导电胶上面做的测试，孔洞(网状结构)并不是实验产品，只是一个承载的工具。负载的农药是分子，是看不到的，只能通过紫外分光光度计测量得到。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的市售原料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：制备纳米花负载农药制剂

(1)取30mg硝酸锌于烧杯中，加入10mLpH＝4.5的磷酸缓冲溶液，搅拌溶解，配制浓度为3mg/mL的硝酸锌溶液；

(2)取1mg牛血清白蛋白于烧杯中，加入100mLpH＝7.4的磷酸缓冲溶液，搅拌溶解，配制浓度为0.01mg/mL牛血清白蛋白溶液；

(3)将20mL硝酸锌溶液搅拌加入到3mL牛血清白蛋白溶液中，300rpm下搅拌3小时，超声分散1分钟，用0.1μm的纳滤膜抽滤，去离子水反复洗涤，冷冻干燥，获得纳米花；

(4)取(3)中纳米花分散在乙腈中，纳米花浓度为0.05mg/mL，另取阿维菌素溶于乙腈，阿维菌素浓度为0.02mg/mL，将阿维菌素-乙腈溶液搅拌加入到纳米花-乙腈溶液中，阿维菌素-乙腈溶液与纳米花-乙腈溶液的体积比为1:20，继续搅拌48小时，用0.1μm的纳滤膜抽滤，去离子水反复洗涤，冷冻干燥，获得纳米花负载阿维菌素的农药制剂。所得纳米花的产率为95.3％，农药制剂的载药量为81.5％。

其中，纳米花产率＝(纳米花的实际产量/纳米花的理论计算产量)×100％

纳米花的载药量＝[(总的阿维菌素加入量-未吸附的阿维菌素的质量)/载有阿维菌素的纳米花的质量]×100％

载有阿维菌素的纳米花的质量通过紫外分光光度计测量，然后利用标准曲线计算出浓度，再乘以溶液体积，换算出质量。

实施例2：制备纳米花负载农药制剂

(1)取30mg硝酸锌于烧杯中，加入10mLpH＝4.5的磷酸缓冲溶液，搅拌溶解，配制浓度为3mg/mL的硝酸锌溶液；

(2)取5mg牛血清白蛋白于烧杯中，加入100mLpH＝7.4的磷酸缓冲溶液，搅拌溶解，配制浓度为0.05mg/mL牛血清白蛋白溶液；

(3)将20mL硝酸锌溶液搅拌加入到3mL牛血清白蛋白溶液中，300rpm下搅拌3小时，超声分散1分钟，用0.1μm的纳滤膜抽滤，去离子水反复洗涤，冷冻干燥，获得纳米花；

(4)取(3)中纳米花分散在乙腈中，纳米花浓度为0.05mg/mL，另取阿维菌素溶于乙腈，浓度为0.02mg/mL，将阿维菌素-乙腈溶液搅拌加入到纳米花-乙腈溶液中，阿维菌素-乙腈溶液与纳米花-乙腈溶液的体积比为1:30，继续搅拌48小时，用0.1μm的纳滤膜抽滤，去离子水反复洗涤，冷冻干燥，获得纳米花负载阿维菌素的农药制剂。所得纳米花的产率为93.7％，农药制剂的载药量为79.2％。

实施例3：制备纳米花负载农药制剂

(1)取30mg硝酸锌于烧杯中，加入10mLpH＝4.5的磷酸缓冲溶液，搅拌溶解，配制浓度为3mg/mL的硝酸锌溶液；

(2)取2mg牛血清白蛋白于烧杯中，加入100mLpH＝7.4的磷酸缓冲溶液，搅拌溶解，配制浓度为0.02mg/mL牛血清白蛋白溶液；

(3)将20mL硝酸锌溶液搅拌加入到3mL牛血清白蛋白溶液中，450rpm下搅拌3小时，超声分散1分钟，用0.1μm的纳滤膜抽滤，去离子水反复洗涤，冷冻干燥，获得纳米花；

(4)取(3)中纳米花分散在乙腈中，浓度为0.05mg/mL，另取阿维菌素溶于乙腈，浓度为0.02mg/mL，将阿维菌素-乙腈溶液搅拌加入到纳米花-乙腈溶液中，阿维菌素-乙腈溶液与纳米花-乙腈溶液的体积比为1：100，继续搅拌72小时，用0.1μm的纳滤膜抽滤，去离子水反复洗涤，冷冻冷干，获得纳米花负载阿维菌素的农药制剂。所得纳米花的产率为97.7％，农药制剂的载药量为84.2％。

对比例：制备纳米花负载农药制剂

(1)配制含有0.6g/L牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)，标记该溶液为溶液I；配制浓度为0.5mol/L的氯化锌水溶液，标记该溶液为溶液II；将溶液I加入到三角瓶中，磁力搅拌下加入溶液II，溶液I与溶液II的体积比为25:1；磁力搅拌下，室温反应12h后，经过离心、水洗、冷冻干燥即得纳米花。

(2)取(1)中纳米花分散在乙腈中，浓度为0.05mg/mL，另取阿维菌素溶于乙腈，浓度为0.02mg/mL，将阿维菌素-乙腈溶液搅拌加入到纳米花-乙腈溶液中，阿维菌素-乙腈溶液与纳米花-乙腈溶液的体积比为1：100，继续搅拌72小时，用0.1μm的纳滤膜抽滤，去离子水反复洗涤，冷冻冷干，获得纳米花负载阿维菌素的农药制剂。所得纳米花的产率为78.1％，农药制剂的载药量为55.2％。

对比例与实施例3相比，在于纳米花的制备方法不同，对比例制备的纳米花产率、载药量明显低于各个实施例。

本发明牛血清蛋白溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，一方面是为了溶解，另一方面是为了提供磷酸根离子，磷酸根离子参与纳米花的合成反应。用pH＝4.5的磷酸盐缓冲溶液溶解硝酸锌得到的纳米花产率高，产率高的原因是低酸的作用和磷酸根离子的供应充足，同时赋予了纳米花更高的利用价值，如载药性能。通过本发明方法得到的纳米花的尺寸是5微米左右，见图3，比常规方法制备的粒径小，使其具有更高的利用价值，更好的载药性。若硝酸锌溶于水，与蛋白反应得到的纳米花产率低，而且反应时间长，之所以选用pH＝4.5的磷酸盐缓冲溶液，除了制备的纳米花产率高外，还能使得到的纳米化更均匀，过酸不适合制备纳米花，而pH大于5.5溶解的硝酸锌会出现沉淀，使后期反应无法正常继续，影响纳米花的产率和载药量。

本发明实施例3制备的载药纳米花与对比例纳米花的缓释效率对比见图4，由图4可以看出，在200小时内，本发明纳米花负载农药的释放曲线还在上升趋势，未出现饱和释放，此时还在继续释放，而对比例的纳米花载药在70多个小时就已经达到释放饱和。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。