半枝莲提取物的新用途
阅读说明：本技术 半枝莲提取物的新用途 (New application of sculellaria barbata extract ) 是由 徐闯 崔一喆 常仁旭 于 2019-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种半枝莲提取物在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。本发明还提供了半枝莲提取物的制备方法。本发明中的半枝莲提取物对非酒精性脂肪肝小鼠体内脂沉积具有抑制作用,并能够显著改善非酒精性脂肪小鼠炎性反应,半枝莲提取物对高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝具有预防作用。(The invention relates to an application of a barbed skullcap herb extract in preparing a medicament for treating non-alcoholic fatty liver disease. The invention also provides a preparation method of the sculellaria barbata extract. The herba scutellariae barbatae extract disclosed by the invention has an inhibiting effect on lipid deposition in a mouse with non-alcoholic fatty liver, can obviously improve inflammatory reaction of the mouse with non-alcoholic fatty liver, and has a prevention effect on the mouse with non-alcoholic fatty liver induced by high-fat diet.)
技术领域
本发明属于中药领域，涉及半枝莲提取物的新用途。
背景技术
非酒精性脂肪肝（NAFLD）是全球常见的肝脏疾病之一，已经成为21世纪全球最重要的公共健康问题。NAFLD发病机制较为复杂，目前被大家所公认的理论是“二次打击”学说；其中初次打击主要是由于各种原因导致的机体脂代谢异常造成的脂肪沉积，第二次打击主要是多种反应途径造成脂肪变性的肝细胞发生炎症、坏死等病理变化，最终可能会形成脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化。
目前大多数治疗脂肪肝的方法都是通过减肥和提高胰岛素敏感性来减少代谢综合征。目前，胰岛素增敏剂、抗氧化剂和降脂剂是最常用的三种药物，但是它们分别会导致体重增加和死亡率增加等副作用。罗格列酮长期以来被认为是治疗非酒精性脂肪肝的有效药物，它可以通过改善脂肪变性和转氨酶水平来治疗非酒精性脂肪肝，但是随后有研究表明罗格列酮在心血管方面具有危害，因此该药物再许多国家被禁止。他汀类药物是一种降胆固醇药物，也是一种非酒精性脂肪肝疾病常用的治疗药物，它可以通过抑制脂肪变性和脂肪性肝炎来治疗非酒精性脂肪肝。然而，一些研究表明，长期使用他汀类药物可能导致急性肾功能衰竭等疾病。总之，目前使用的药物都具有一定的副作用。而中药由于其副作用小的优势逐渐走进研究者的视野。中医药经过长期的实践探索，多种用于脂肪肝治疗及预防的中药复方和经典方剂被广泛应用。中药在治疗非酒精性脂肪肝方面有独特的优势，因此，开发来源广泛，安全可靠，效果明显，无毒副作用的中药作为替代药物，逐渐受到人们的关注。
半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的干燥全草,始载于蒋仪的《药镜拾遗赋》，“半枝莲，解蛇伤之仙草”，主治咽喉肿痛、湿热泄泻及跌打损伤等症，我国半枝莲主产于江西、江苏、广东、福建等地，现已被2015版《中国药典》所收录。半枝莲中含有红花素（carthamidin），高山黄钤甙（scutel-larin），硬脂酸（steraricacid），生物碱多糖等多种有效成分。半枝莲的粗提物和活性成分长期以来被用作治疗肝炎和肝细胞癌等肝病的药物，也可以改善某些细胞的炎症反应和氧化应激。半枝莲提取物还具有良好的抗氧化活性，通过调节肝脏氧化应激水平来抑制肝脏损伤，从而保护肝脏。现代药理活性研究表明，半枝莲还具有良好的抗肿瘤活性。目前，尚未发现半枝莲或其提取物用于非酒精性脂肪肝疾病的相关报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供半枝莲提取物的新用途，解决目前用于治疗非酒精性脂肪肝的药物一般为西药，副作用大的问题。
本发明的第二目的是提供上述半枝莲提取物的制备方法。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种半枝莲提取物在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
二、上述的半枝莲提取物的制备方法为：半枝莲饮片加入10倍重量的蒸馏水浸泡过夜后进行煎煮提取，加热至微沸，保持微沸50 min后过滤得中药液，剩余药渣加入8倍重量的蒸馏水，保持微沸30 min后过滤得中药液；最后合并两次药液，加热浓缩至生药浓度为1.5 g/mL即得。
采用上述技术方案的积极效果：本发明中的半枝莲提取物对非酒精性脂肪肝小鼠体内脂沉积具有抑制作用，并能够显著改善非酒精性脂肪小鼠炎性反应，半枝莲提取物对高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝具有预防作用。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
本实施例说明半枝莲提取物的制备。
半枝莲饮片按照1:10的重量比加入蒸馏水浸泡过夜后进行煎煮提取，加热至微沸，保持微沸50 min后过滤得中药液，剩余药渣按照1:8的重量比加入蒸馏水，保持微沸30min后过滤得中药液；最后合并两次药液，加热浓缩至生药浓度为1.5 g/mL即得。
实施例2
本实施例说明半枝莲对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠血液指标的影响。
小鼠正常饲喂适应7天后，然后随机分成5组：对照组（常规饮食+水），模型组（高脂饮食 +水），低剂量组（高脂饮食 + 3 g/kg半枝莲），中剂量组（高脂饮食 + 7.5 g/kg半枝莲）和高剂量组（高脂饮食 + 15 g/kg半枝莲）。实验开始后第4、6及8周，各组分别随机选择一只小鼠处死，观察动物造模情况。造模及预防过程持续8周，8周后小鼠禁食12小时，所有小鼠用***麻醉。
实验结束后，各组小鼠摘眼球取血后脱颈处死并进行解剖，新鲜肝脏采集后取少量组织块，加入适量稀释液（PBS），用球磨仪制成组织匀浆，按照ELISA试剂盒说明书进行肝脏指标检测；其余肝脏组织放入-80℃留存备用。
使用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶（TP）、血糖(GLU)、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、胆汁酸（TBA）的浓度，用ELISA方法使用酶标仪检测肝脏过氧化氢酶（CAT）、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)及过氧物歧化酶(SOD)的浓度。结果采用SPSS23软件进行统计分析，结果以平均值±标准差形式体现；组间采用方差分析进行显著性比较。
中药对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠血液指标影响见表1：
表1 小鼠血液生化指标
注：同行间标注“###”表示与对照组相比差异极显著(P < 0.001)，同行间标注“##”表示与对照组相比差异极显著(0.001 <P < 0.01)，标注“#”表示与对照组相比差异显著(0.01 < P < 0.05)；同行间标注“***”表示与模型组相比差异极显著(P < 0.001)，同行间标注“**”表示与模型组相比差异极显著(0.001 < P < 0.01)，标注“*”表示与模型组相比差异显著(0.01 < P < 0.05)；不标注表示差异不显著（P > 0.05）。
对于TG，半枝莲低浓度，中浓度以及高浓度均能极显著降低高脂饮食诱导的小鼠血清内TG含量（P < 0.001）；对于HDL，半枝莲低浓度组及高浓度组小鼠血清中HDL含量均极显著高于模型组小鼠(0.001 <P < 0.01)，半枝莲中浓度小鼠血清中HDL含量有所升高，但与模型组相比差异不显著（P > 0.05）；对于INS，与模型组相比，低浓度组小鼠血清中INS含量显著下降(0.01 < P < 0.05)，高浓度组极显著下降(0.001 <P < 0.01)，中浓度组小鼠血清中INS含量有下降趋势，但与模型组相比差异不显著；与模型组相比，高浓度组小鼠血清中TNF-α含量显著下降(0.01 < P < 0.05)；对于AST，低浓度及高浓度半枝莲均能极显著降低小鼠血清内AST水平（P < 0.001），中浓度组小鼠血清中AST含量与模型组相比同样有极显著下降(0.001 < P < 0.01)；对于ALT，与模型组相比，半枝莲低浓度组及半枝莲高浓度组小鼠血清ALT水平均有极显著下降（P < 0.001）。
实施例3
本实施例说明半枝莲对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠肝脏的影响。
新鲜肝脏采集后取少量组织块，加入适量稀释液（PBS），用球磨仪制成组织匀浆，按照ELISA试剂盒说明书进行肝脏指标检测。结果采用SPSS 23软件进行统计分析，结果以平均值±标准差形式体现；组间采用方差分析进行显著性比较。
中药对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠肝脏指标影响见表2：
表2 小鼠肝脏生化指标
对照组
模型组
低浓度
中浓度
高浓度
TG (mmol/L)
7.9±1.8
8.44±2.22
9.02±1.74
8.32±0.91
5.47±0.57**
TC(nmol/mL)
26.31±2.52
31.12±5.43<sup>#</sup>
23.58±1.73***
23.73±2.17***
23.02±1.25***
ALT (ng/mL)
4.45±0.3
5.26±0.75<sup>#</sup>
3.98±0.35***
3.65±0.68***
3.7±0.44***
AST (ng/mL)
10.67±2.36
11.04±3.53
9.45±2.54
6.14±3.18**
3.23±1.81***
TNF-α (ng/L)
26.31±2.52
31.12±5.43<sup>#</sup>
23.58±1.73***
23.73±2.17***
23.02±1.25***
IL-6 (ng/L)
9.33±5.01
14.15±3.92
11.07±4.59
5.58±2.15**
2.44±2.49***
注：同行间标注“###”表示与对照组相比差异极显著(P < 0.001)，同行间标注“##”表示与对照组相比差异极显著(0.001 <P < 0.01)，标注“#”表示与对照组相比差异显著(0.01 < P < 0.05)；同行间标注“***”表示与模型组相比差异极显著(P < 0.001)，同行间标注“**”表示与模型组相比差异极显著(0.001 < P < 0.01)，标注“*”表示与模型组相比差异显著(0.01 < P < 0.05)；不标注表示差异不显著（P > 0.05）。
由表2可知，半枝莲高浓度组小鼠肝脏内TG含量极显著低于模型组小鼠(0.001 <P< 0.01)；对于TC，与模型组相比，半枝莲低浓度组、中浓度组及高浓度组小鼠肝脏内TC含量均极显著下降(P < 0.001)；半枝莲低浓度组、中浓度组及高浓度组小鼠肝脏内ALT含量均极显著低于模型组小鼠(P < 0.001)；对于AST，与模型组相比，半枝莲中浓度组小鼠肝脏内AST含量极显著降低(0.001 < P < 0.01)，半枝莲高浓度组小鼠同样极显著下降(P <0.001)；对于TNF-α，半枝莲低浓度组、中浓度组及高浓度组小鼠肝脏内TNF-α含量均极显著低于对照组小鼠(P < 0.001)；对于IL-6，与模型组相比，半枝莲中浓度组小鼠肝脏内IL-6水平极显著低于模型组(0.001 < P < 0.01)，半枝莲高浓度组小鼠肝脏内IL-6水平同样极显著降低(P < 0.001)。
动物模型是人类研究疾病的基础和重要手段。采用高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝模型是国内最常用的造模方法，同时，该类模型还具备胰岛素抵抗、肥胖、高脂血症、高血糖等代谢综合征的组分表现。本实验中所采用的小鼠高脂模型建立方法是参照前人方法，在饲料中添加一定比例的胆盐和丙基硫氧嘧啶。胆盐和丙基硫氧嘧啶可以干扰肝脏的正常代谢，阻碍肝脏内源性脂肪转运，从而造成肝脏内脂肪的沉积，因此很快形成小鼠脂肪肝模型。
非酒精性脂肪肝发病过程中的一个重要特征是血清和肝脏TG及TC含量升高。在正常条件下，肝脏维持脂质代谢的稳定平衡状态，但长期高脂饮食的饲喂会导致肝脏中的脂质代谢紊乱。血清和肝脏中的TG、TC水平与脂质代谢有关，高水平的TC反映了脂质代谢的破坏；高水平的TG可能导致脂质过氧化的增加。TG与TC是肝脏脂肪变性的标志。根据我们的研究，半枝莲中浓度以及高浓度水提物的灌服能够极显著抑制小鼠血清内TG含量的升高（P <0.001），高浓度半枝莲水提物的灌服还能够极显著抑制小鼠肝脏内TG水平的上升(0.001 <P < 0.01)；半枝莲低浓度组、中浓度组及高浓度水提物的灌服能够极显著抑制小鼠肝脏内TC含量的升高(P < 0.001)。这表明半枝莲可有效改善肝细胞脂肪变性，防止脂肪肝的发展。
血清ALT与AST是肝损伤的敏感指标，能够直观准确的反映肝脏损伤情况。当1%的肝脏发生坏死时，血清中ALT与AST的活性就会发生变化。当非酒精性脂肪肝发生时，由于肝脏脂质沉积的增加从而诱发肝脏炎症反应，肝细胞膜被破坏，ALT由胞浆释放入血，血清中ALT水平随之升高；此外，过多的脂沉积还会造成肝脏线粒体损伤，导致AST由线粒体分泌入学，造成血清中AS水平升高。实验结果表明，与模型组相比，低浓度及高浓度半枝莲提取物的灌服能够极显著降低小鼠血清AST及ALT水平（P < 0.001）；此外，与模型组相比，半枝莲低浓度组、中浓度组及高浓度组小鼠肝脏内ALT含量均极显著下降(P < 0.001)；半枝莲高浓度组小鼠肝脏内AST含量同样极显著下降(P < 0.001)；表明半枝莲能够对小鼠非酒精性脂肪肝发病过程中的肝脏损伤进行预防。
炎症反应是介导NAFLD发病机制的另一个重要因素。当肝脏损伤发生时，肝细胞会分泌出大量的炎性因子，如白细胞介素-6(IL-6)，IL-6具有诱导炎性和肿瘤形成、调节免疫反应等作用，在非酒精性脂肪肝的人和动物血清中IL-6含量均表现明显升高。在本实验中，中浓度半枝莲水提物的灌服极显著降低了小鼠肝脏内IL-6的水平(0.001 < P < 0.01)，半枝莲高浓度水提物的灌服同样极显著抑制了小鼠肝脏内IL-6水平的升高(P < 0.001)。此外，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）同样是NAFLD发病过程中的一种重要细胞因子，TNF-α是机体炎症反应和免疫应答反应的主要调节因子，TNF-α可以通过增加氧自由基的产生和脂质过氧化等方面引起脂肪性肝炎和脂肪性纤维化。在本实验中，半枝莲水提物高浓度的灌服可以抑制小鼠血清中TNF-α的升高；对于小鼠肝脏TNF-α水平，半枝莲水提物低、中、高浓度均能够极显著抑制其增加(P < 0.001)。表明半枝莲水提物可以抑制NAFLD发病过程中肝脏炎性细胞因子的产生。
TNF-α活性增强可以促进脂肪分解引起血浆游离脂肪酸水平增高，从而导致胰岛素抵抗（IR）和高胰岛素血症。在脂肪组织中TNF-α水平与胰岛素抵抗呈正相关。IR是指各种原因导致机体代偿分泌过过多胰岛素，进而导致机体产生代谢综合征。胰岛素抵抗是NAFLD发病过程中的重要因素。IR也是肝脏脂肪沉积的主要原因，其通过脂肪分解及高胰岛素血症导致肝细胞脂沉积增加，沉积的脂质又会进一步对肝细胞进行破坏，同时刺激胰岛p细胞增加胰岛素的分泌，从而使血液中的胰岛素含量进一步增加。在本实验中，低浓度半枝莲水提物的灌服可以显著抑制小鼠血清中胰岛素含量的升高(0.01 < P < 0.05)，高浓度半枝莲水提物的灌服可以极显著降低小鼠血清中胰岛素水平(0.001 <P < 0.01)，表明半枝莲水提物对小鼠血清胰岛素水平的升高具有抑制作用，从而有效预防NAFLD发病过程中小鼠IR的发生。
综上所述，半枝莲对非酒精性脂肪肝小鼠体内脂沉积具有抑制作用，并能够显著改善非酒精性脂肪小鼠炎性反应。本发明结果显示，半枝莲对高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝具有预防作用。