阅读说明：本技术 一种编码重组人骨形态发生蛋白质-2的氨基酸序列 (Amino acid sequence of coding recombinant human bone morphogenetic protein-2 ) 是由 曹建新 曾以申 于 2018-07-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,公开了一种新的重组人骨形态发生蛋白质-2(rhBMP-2)的氨基酸序列及其编码的核苷酸序列,以及rhBMP-2的制备方法。本发明通过对rhBMP-2基因的核苷酸序列进行进一步优化,筛选出能够表达具有良好异位诱导成骨活性以及具有较好复性纯化效果的rhBMP-2的新的氨基酸序列。应用本发明所构建的工程菌能够诱导产生表达水平约为55%的重组rhBMP-2蛋白,所产生的目的蛋白相对于现有的重组rhBMP-2更易复性纯化,显示了出较好的复性纯化效果以及更高的诱导成骨活性。(The invention relates to the field of biotechnology, and discloses an amino acid sequence of a novel recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2), a nucleotide sequence coded by the amino acid sequence and a preparation method of the rhBMP-2. The invention screens out a new amino acid sequence which can express the rhBMP-2 with good ectopic induction osteogenesis activity and better renaturation purification effect by further optimizing the nucleotide sequence of the rhBMP-2 gene. The engineering bacteria constructed by the invention can induce and generate recombinant rhBMP-2 protein with an expression level of about 55%, and the generated target protein is easier to renaturate and purify compared with the existing recombinant rhBMP-2, thereby showing better renaturation and purification effect and higher induced osteogenesis activity.)

一种编码重组人骨形态发生蛋白质-2的氨基酸序列

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说，它涉及一种新的重组人骨形态发生蛋白质-2(rhBMP-2)的氨基酸序列及其编码的核苷酸序列，以及rhBMP-2的制备方法。

背景技术

骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子(Transforminggrowth factor,TGF)-β超家族的成员，其具有独特的诱导成骨活性，能在骨与关节损伤大段骨缺损修复和脊柱融合等方面发挥重要作用。目前，已从多种动物如牛、猪、羊、兔、鼠和人等的骨基质中分离出多种BMP，其中人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的诱导成骨效应最佳，是骨骼系统形成不可或缺的因子。BMP-2是一种酸性糖蛋白，含有396个氨基酸残基，由N端的信号肽、中间的前肽和C端的成熟肽三部分组成。成熟肽由114个氨基酸组成，是发挥诱导成骨作用的部分，其含有7个半胱氨酸残基，其中6个形成分子内二硫键，另一个用于形成分子间二硫键。成熟肽的同源或异源二聚体才具有生物活性，其中单体各形成3对二硫键，在两个单体之间形成一对链间二硫键，二硫键的正确配对与否直接影响其生物活性和稳定性。此外，成熟肽55位天冬酰胺残基上有糖基化位点，但其生物活性并不受糖基化的影响。BMP-2已被美国FDA批准用于骨质损伤、额面修复及脊柱融合，然而，新鲜人骨质来源有限且骨质中的BMP-2含量较少，每千克皮质骨里仅含1-2μg，难以满足临床需要。而且其提取工艺复杂，产物纯度和活性难以保证。因此，利用基因工程技术手段，从基因重组表达方面生产该蛋白质成为了研究热点。

当前，rhBMP-2的制备主要通过真核表达载体和原核表达载体两种方式进行。国外较多采用真核表达系统，如CHO、COS及杆状病毒系统。真核表达产物多为分泌型，并且进行糖基化加工，rhBMP-2属于分泌型蛋白且兼具糖基化位点，因此真核表达系统是其较为理想的表达系统。通过真核表达系统制备的产物活性相对较高，但存在表达量低、生产成本高、周期长、不利于大规模生产等缺点。目前，国内外医用rhBMP-2多采用以大肠杆菌为宿主的原核表达系统来生产，通常得到rhBMP-2成熟肽的不同长短片段。由于原核表达系统不具备真核细胞对多肽链翻译后加工修饰的过程，真核基因蛋白不能进行正确折叠和翻译后加工(如形成二硫键、糖基化、聚合、蛋白酶降解等)，使得其生物活性和利用度受到制约。同时，原核表达系统中表达的真核蛋白质通常以非活性方式在细菌的细胞质中聚集成不溶性的包涵体，须经过变性、复性等处理使其恢复天然活性。中国发明专利CN1215171C公开了一种生产截断型重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽的方法，所述截断型重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽为人工合成编码BMP-2C端107个氨基酸残基的核苷酸序列，并在第一个氨基酸密码子之前加上了起始密码子ATG，将第二个氨基酸精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)残基，氨基酸序列为MKKLKSSCKR HPLYVDFSDV GWNDWIVAPP GYHAFYCHGE CPFPLADHLN STNHAIVQTLVNSVNSKIPK ACCVPTELSA ISMLYLDENE KVVLKNYQDM VVEGCGCR；该发明的基因工程菌所产生的人截短型BMP-2的量达到细菌总可溶蛋白量的30-50％，具有一定的成骨活性。中国发明专利CN101787369B公开了一种优化的重组人骨形态发生蛋白-2的DNA序列及其编码蛋白的制备和用途，该发明通过优化DNA序列，得到具有完整成熟肽(114个氨基酸残基)的rhBMP-2，产品纯度超过95％，经纯化二聚体收率约为21％。现有的几种rhBMP-2成熟肽片段制备rhBMP-2的复性、纯化效果相对较差，并且终产物生物活性不高。解决上述问题的办法之一是利用基因工程重组技术对成熟肽基因进行分析，在不影响和改变蛋白质分子结构的基础上，对目标基因的核苷酸序列进行进一步优化，筛选出能够表达具有良好异位诱导成骨活性以及具有较好复性纯化效果的rhBMP-2的新的氨基酸序列。

发明内容

本发明的目的之一提供一种新的重组人骨形态发生蛋白质-2(rhBMP-2)的氨基酸序列，使之表达的蛋白质易于复性纯化，具有较好的复性、纯化效果，具有较高的生物活性和骨修复能力。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

优化rhBMP-2的氨基酸序列，设计新的重组人骨形态发生蛋白质-2的氨基酸序列如下：

KRLK SSCKR HPLYV DFSDV GWNDW IVAPP GYHAF YCHGE CPFPL ADHLN STNHAIVQTL VNSVN SKIPK ACCVP TELSA ISMLY LDENE KVVLK NYQDMVVEGC GCR(SED ID No.1)。

进一步地，上述蛋白序列的N端加入起始密码子(AUG)所编码的甲硫氨酸M，氨基酸序列如下：

MKRLK SSCKR HPLYV DFSDV GWNDW IVAPP GYHAF YCHGE CPFPL ADHLN STNHAIVQTL VNSVN SKIPK ACCVP TELSA ISMLY LDENE KVVLK NYQDM VVEGC GCR(SED ID No.2)。

这样的氨基酸序列也包括被糖基化修饰过的氨基酸序列，例如被PEG修饰过的氨基酸序列。

通过对密码子进行优化，将所有稀有密码子去除，变成大肠杆菌偏好的密码子，其优化的DNA序列如下所示：

ATGAAACGTCTGAAAAGCAGCTGCAAACGTCACCCGCTGTACGTTGATTTCAGCGATGTTGGCTGGAACGATTGGATCGTTGCGCCGCCGGGCTACCACGCGTTCTACTGCCACGGCGAATGCCCGTTCCCGCTGGCGGATCACCTGAACAGCACCAACCACGCGATCGTTCAGACCCTGGTTAACAGCGTTAACAGCAAAATCCCGAAAGCGTGCTGCGTTCCGACCGAACTGTCTGCGATCTCAATGCTGTACCTGGATGAAAACGAAAAAGTTGTTCTGAAAAACTACCAGGATATGGTTGTTGAAGGTTGCGGTTGCCGTTAA(SED ID No.3)。

本发明的另一个目的是提供一种制备重组人骨形态发生蛋白质-2的方法，包括以下步骤：(1)设计编码重组人骨形态发生蛋白质-2的氨基酸序列和DNA序列；(2)构建表达载体，转化大肠杆菌宿主细胞；(3)筛选阳性克隆进行培养，诱导目标蛋白表达；(4)表达产物复性、纯化，得到所述重组人骨形态发生蛋白质-2。

优选的，该载体在真核细胞，例如CHO细胞中进行表达，这样在真核中表达会有糖基化修改的蛋白，这种氨基酸序列被糖基化修改也具有活性，也是本发明的范围。或者，对该蛋白进行体外进行人工修改，例如采用PEG进行修饰，从而大大提高其稳定性。我们的实验发现，通过体外表达的蛋白，通过人工修饰和不修饰进行活性的比较，修饰后的蛋白的稳定性提高了35-50％左右。

作为优选，步骤(4)中采用稀释法进行复性，复性液蛋白质终浓度控制在0.05-0.5mg/ml。

作为优选，步骤(4)中采用多步离子交换层析进行纯化，具体步骤如下：(1)将复性好的重组人骨形态发生蛋白质-2溶液上样于平衡好的强阴离子柱，上样完毕后用平衡缓冲液A冲洗到达基线；(2)用洗脱缓冲液A进行盐梯度逐步增加的梯度进行洗脱，收集主峰；(3)将从强阴离子柱洗脱收集的目标峰溶液混合，上样于弱阳离子柱，上样完毕后用平衡缓冲液B冲洗到达基线；(4)用洗脱缓冲液B进行盐梯度逐步增加的梯度进行洗脱，收集主峰。

作为优选，所述的平衡缓冲液A包含10-50mM的Tris-HCl、1-5M的尿素、1％-10％的甘露醇，pH为8.5-8.9；所述的洗脱缓冲液A包含10-50mM的Tris-HCl、1-5M的尿素、1％-10％的甘露醇、1-5M的NaCl，pH为8.5-8.9；所述的平衡缓冲液B包含10-50mM的磷酸缓冲液PB、1-5M的尿素、1％-10％的甘露醇，pH为6.0-6.5；所述的洗脱缓冲液B包含10-50mM的磷酸缓冲液PB、1-5M的尿素、1％-10％的甘露醇、1-5M的NaCl，pH为6.0-6.5。

本发明通过对rhBMP-2基因的核苷酸序列进行进一步优化，筛选出能够表达具有良好异位诱导成骨活性以及具有较好复性纯化效果的rhBMP-2的新的氨基酸序列。应用本发明所构建的工程菌能够诱导产生表达水平约为55％的重组rhBMP-2蛋白，所产生的目的蛋白相对于现有的重组rhBMP-2更易复性纯化，显示了出较好的复性纯化效果，纯化的目的蛋白收率大于60％或者约为60％，纯度高于98％；并且所表达形成的重组rhBMP-2具有更高的诱导成骨活性，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1是本发明采用的pET28质粒图谱。

图2是质粒pET28的多克隆位点。

图3是rhBMP-2诱导表达SDS-PAGE电泳分析图。

图4是SDS-PAGE电泳分析复性结果图，其中，1：分子量标准；2-7：经复性的rhBMP-2二聚体。

图5是SDS-PAGE电泳分析纯度结果图，其中，A为强阴离子柱收集目的峰电泳图，B为弱阳离子柱收集目的峰电泳图，1：分子量标准；2-10：收集的目的峰。

图6是rhBMP-2的毛细管电泳纯度分析，UV214nm检测。

图7是rhBMP-2小鼠肌袋异位成骨实验放射学检查及诱导形成的新骨，其中，1为108肽重组rhBMP-2的诱导成骨效果图，2为本发明的氨基酸序列所表达的rhBMP-2的诱导成骨效果图，3为109肽重组rhBMP-2的诱导成骨效果图，4为115肽重组rhBMP-2的诱导成骨效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，这些阐述仅仅是表明该发明是如何实现的，但是并不是对本发明做进一步的限制。除非另外指明，本发明所使用的术语均与所属技术领域人员通常理解的含义相同。

在本发明中，若非特指，所有的百分比均为重量/重量(w/w)，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。因甲硫氨酸M的密码子(ATG)是蛋白质翻译过程的起始密码子，因此所述具体实施例以N端包含甲硫氨酸M的氨基酸序列SED ID NO.2进行实验。

实施例1新的rhBMP-2氨基酸序列的设计及重组rhBMP-2表达载体的构建

1、设计新的编码重组人骨形态发生蛋白质-2的氨基酸序列如下:

KRLK SSCKR HPLYV DFSDV GWNDW IVAPP GYHAF YCHGE CPFPL ADHLN STNHAIVQTLVNSVN SKIPK ACCVP TELSA ISMLY LDENE KVVLK NYQDM VVEGC GCR(SED ID No.1)

进一步地，上述氨基酸序列的N端加入起始密码子(ATG)所编码的甲硫氨酸M，氨基酸序列如下：

MKRLK SSCKR HPLYV DFSDV GWNDW IVAPP GYHAF YCHGE CPFPL ADHLN STNHAIVQTL VNSVN SKIPK ACCVP TELSA ISMLY LDENE KVVLK NYQDM VVEGC GCR(SED ID No.2)

进一步地，通过对密码子进行优化，将所有稀有密码子去除，变成大肠杆菌偏好的密码子，同时在其末端加上酶切位点BamHI(GGATCC)，其优化的DNA序列如下所示：

ATGAAACGTCTGAAAAGCAGCTGCAAACGTCACCCGCTGTACGTTGATTTCAGCGATGTTGGCTGGAACGATTGGATCGTTGCGCCGCCGGGCTACCACGCGTTCTACTGCCACGGCGAATGCCCGTTCCCGCTGGCGGATCACCTGAACAGCACCAACCACGCGATCGTTCAGACCCTGGTTAACAGCGTTAACAGCAAAATCCCGAAAGCGTGCTGCGTTCCGACCGAACTGTCTGCGATCTCAATGCTGTACCTGGATGAAAACGAAAAAGTTGTTCTGAAAAACTACCAGGATATGGTTGTTGAAGGTTGCGGTTGCCGTTAA(SED ID NO.3)

2、构建表达载体、转化大肠肝菌宿主细胞，构建表达工程菌以及重组蛋白质的表达过程

选择pET28a原核表达载体作为重组rhBMP-2蛋白的表达载体，pET28a质粒图谱见图1所示。将SED ID NO.3所述的基因片段经过酶切后***到表达载体中，完成载体构建。pET28a载体具有T7lac启动子，T7能够确保外源***基因的高效表达，lac乳糖操纵子能使基因在没有诱导剂时保持较低的本底表达，pET28a载体的多克隆位点如图2所示。

(1)构建表达载体

将pET28a载体用NcoI酶切后补平，再用BamHI酶切，同时将合成的rhBMP-2(SED IDNO.3)用BamHI酶切，反应体系为：反应总体积20μL，ddw12μL，质粒DNA 5μL，10X Buffer K2μL，BamHI1μL。

酶切后的质粒在1％的琼脂糖胶上分离，并将目的片段从胶上切割下来，用Axygen公司的gel recovery试剂盒做凝胶回收目的片段。

回收DNA片段后，将pET28a载体片段和rhBMP-2基因片段用T4DNA连接酶连接。连接反应体系为：反应总体积10μL，pET28a4μL，rhBMP-24μL，10X DNA ligase Buffer 1μL，T4DNA ligase 1μL。16℃下连接反应1小时。

(2)转化大肠肝菌宿主细胞

连接反应完成后，用热激转化法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5a细胞中。转化过程为：将连接产物加入到大肠杆菌感受态细胞中，放置于冰上30min后，将感受态细胞放入42℃水浴锅中，热激90sec，然后迅速将离心管***冰上，放置1-2min后加入1mL LB培养基，将离心管放置到摇床中，37℃，160rpm培养1小时。离心收集大肠杆菌，将其涂布到加入卡那霉素的LB固体培养基中，并将平板放入37℃生化培养箱中培养过夜。第二天，挑取单克隆，用PCR方法鉴定是否***外源基因，PCR反应体系为：反应总体积20μL，ddw9μL，2X Taqpre-mix 10μL，T7promoter(10μM)0.5μL，rhBMP-2reverse primer(10μM)0.5μL。

取部分挑取的单克隆菌落的细胞，加入到PCR反应体系中，在Bio-Rad PCR仪上进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环后，72℃继续延伸15min。

PCR鉴定正确的单克隆，用T7promoter引物测序，检测rhBMP-2序列的正确性。测序正确的单克隆重新接种到加入卡那霉素的LB培养基中，于摇床中37℃，250rpm培养，并提取质粒备用。重组质粒命名为pET28a-rhBMP-2。

(3)rhBMP-2表达载体转化大肠杆菌表达菌株

采用BL21(DE3)表达菌株来表达重组rhBMP-2蛋白。将重组质粒pET28a-rhBMP-2加入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，放置冰上30分钟，并将水浴锅加热到42℃备用。冰上放置30分钟后，将含有大肠杆菌BL21(DE3)的离心管放入42℃水浴锅中，热激90sec，然后迅速将离心管***冰上，放置1-2分钟。加入1ml LB培养基，将离心管放置到摇床中，37℃，160rpm培养1小时。离心收集大肠杆菌BL21(DE3)，将其涂布到加入卡那霉素的LB固体培养基中，并将平板放入37℃生化培养箱中培养过夜。第二天，挑取单克隆，用PCR方法鉴定BL21(DE3)是否转入重组质粒，PCR反应体系为：反应总体积20μL，ddw 9μL，2X Taq pre-mix 10μL，T7promoter(10μM)0.5μL，rhBMP-2reverse primer(10μM)0.5μL。

取部分挑取的单克隆菌落的细胞，加入到PCR反应体系中，在Bio-Rad PCR仪上进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环后，72℃继续延伸15min。

PCR鉴定正确的单克隆，转接到含有卡那霉素的LB培养基中，在摇床中37℃250rpm培养。等到菌液的OD600达到0.6-0.8时，将菌液取出，加入80％的无菌甘油至终浓度10％，并将其放入-20℃保存备用。

(4)重组rhBMP-2的表达

将甘油保存的含有pET28a-rhBMP-2的BL21(DE3)菌株按体积比1:1000接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃,100-200rpm条件下持续摇瓶培养至对数期。采用不同浓度的诱导剂IPTG，不同诱导时间和不同诱导温度等参数进行rhBMP-2蛋白诱导表达。诱导培养结束后，在3500rpm，4℃，20min条件下离心，收集菌体后，经SDS-PAGE电泳分析蛋白表达量，从中选择rhBMP-2表达量最高的组合作为rhBMP-2蛋白诱导表达最优化的实验参数。实验发现，当IPTG浓度为1.0mM，诱导温度为37℃，诱导时间为5h时，蛋白表达量最大，约为55％左右(图3)。

实施例2重组rhBMP-2的复性和纯化

(1)复性

用超声破碎法将细菌破碎后，将rhBMP-2蛋白形成的包涵体提取出来，对包涵体进行洗涤，然后用变性剂盐酸胍溶解包涵体。采用稀释法进行复性，复性液蛋白质终浓度控制在0.05-0.5mg/ml。将rhBMP-2变性蛋白液连续缓慢地加入复性缓冲液中做稀释复性，加入完毕后继续缓慢搅拌几分钟，静置复性2-20天。经过复性后，rhBMP-2成熟肽单体形成二聚体，其中单体各形成3对分子内二硫键，两个单体通过分子间二硫键形成二聚体。复性结束后，取样进行SDS-PAGE电泳，据此判断复性率和复性效果。

根据图4的结果，每500mL诱导菌液可获得溶解包涵体蛋白150.2mg，目的蛋白rhBMP得率约为80％，得率较高。

(2)纯化

采用多步离子交换层析进行纯化，具体纯化步骤如下：

1)将复性好的rhBMP-2溶液上样于平衡好的强阴离子柱，上样完毕后用平衡缓冲液A冲洗到达基线，所述的平衡缓冲液A包含10-50mM的Tris-HCl、1-5M的尿素、1％-10％的甘露醇，pH为8.5-8.9。

2)用洗脱缓冲液A进行盐梯度逐步增加的梯度进行洗脱，收集主峰，SDS-PAGE电泳分析(图5A)。所述的洗脱缓冲液A包含10-50mM的Tris-HCl、1-5M的尿素、1％-10％的甘露醇、1-5M的NaCl，pH为8.5-8.9。

3)将从强阴离子柱洗脱收集的目标峰溶液混合，上样于弱阳离子柱，上样完毕后用平衡缓冲液B冲洗到达基线，所述的平衡缓冲液B包含10-50mM的磷酸缓冲液PB、1-5M的尿素、1％-10％的甘露醇，pH为6.0-6.5。

4)用洗脱缓冲液B进行盐梯度逐步增加的梯度进行洗脱，收集主峰，SDS-PAGE电泳分析。所述的洗脱缓冲液B包含10-50mM的磷酸缓冲液PB、1-5M的尿素、1％-10％的甘露醇、1-5M的NaCl，pH为6.0-6.5。

图5B显示，回收的目的蛋白为单一条带，纯度大于98％。经过数据分析，复性液总可溶蛋白为150.2mg，纯化后rhBMP-2产量为89.3mg，得率约为60％。

进一步应用毛细管电泳分析表明样品纯度为98.5％(图6)。

实施例3重组rhBMP-2的C2C12体外细胞测活

C2C12细胞(间充质干细胞)培养于DMEM高糖培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100g/mL链霉素)，培养条件为37℃、5％CO₂，每1-2d用0.25％的胰酶消化传代备用。将C2C12细胞接种于24孔板中，待细胞融合至30％左右时，加入重组rhBMP-2连续培养。培养5天后，弃去培养基，用预冷的PBS缓冲液冲洗2次，裂解液裂解5min后，离心取上清液按试剂盒操作说明定量测定碱性磷酸酶ALP活性。

对照试验：

为了比较本发明所述新的氨基酸序列所表达的重组rhBMP-2的生物活性，发明人选用另外三种已被报道的多肽进行对照试验。根据已报道的氨基酸序列和基因序列构建工程菌，采用本发明所述的方法诱导表达、复性纯化得到相对应的重组rhBMP-2。所选用另外三种多肽的氨基酸序列如下所示：

1、115肽(N端含甲硫氨酸，公开于发明专利CN101787369B)

MQAKHKQRKR LKSSCKRHPL YVDFSDVGWN DWIVAPPGYH AFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNS VNSKIPKACC VPTELSAISM LYLDENEKVV LKNYQDMVVE GCGCR(SEQ IDNo.4)

2、109肽(N端含甲硫氨酸)

MRKRLKSSCK RHPLYVDFSD VGWNDWIVAP PGYHAFYCHG ECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIP KACCVPTELS AISMLYLDEN EKVVLKNYQD MVVEGCGCR (SEQ ID No.5)

3、108肽(N端含甲硫氨酸，公开于发明专利CN1215171C)

MKKLKSSCKR HPLYVDFSDV GWNDWIVAPP GYHAFYCHGE CPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPK ACCVPTELSA ISMLYLDENE KVVLKNYQDM VVEGCGCR (SEQ ID No.6)

4、本发明设计的序列(N端含甲硫氨酸)

MKRLK SSCKR HPLYV DFSDV GWNDW IVAPP GYHAF YCHGE CPFPL ADHLN STNHAIVQTL VNSVN SKIPK ACCVP TELSA ISMLY LDENE KVVLK NYQDM VVEGC GCR (SED ID No.2)

与115肽相比，本发明的氨基酸序列是从rhBMP-2成熟肽氨基酸残基所截取的107个氨基酸序列；109肽是从rhBMP-2成熟肽氨基酸残基所截取的108个氨基酸序列；108肽是从rhBMP-2成熟肽氨基酸残基所截取的107个氨基酸序列，并将第二个氨基酸精氨酸残基(R)突变为赖氨酸残基(K)。

试验结果如下表所示：

表1 C2C12细胞测活结果

从上述结果可知，本发明所述的氨基酸序列表达的重组rhBMP-2的C2C12细胞测活结果远远高于另外三种，表明C2C12细胞在本发明所设计的重组rhBMP-2作用下能更好地向成骨细胞分化。

有学者认为rhBMP-2愈接近完整成熟肽的长度，其成骨活性愈好(林松等,生物化学与生物物理学报,1996,28(1):8)。本发明惊奇的发现，本发明的截短型多肽的促进C2C12细胞分化活性远远高于成熟肽，可能是因为成熟肽的肽链较长，肽链在氢键的作用下容易形成螺旋状结构，使肽链上的活性位点容易被包埋在疏水腔中，影响其与细胞膜表面受体的结合，而肽链变短会使得空间位阻的影响减少；也可能是因为成熟肽氮末端肽段不具有活性，或者成熟肽氮末端肽段可能具有内切蛋白酶活性，在一定条件下会引起rhBMP-2自身降解，从而影响其活性。具体的原因有待进一步研究。

109肽是从rhBMP-2成熟肽氨基酸残基所截取的108个氨基酸序列，与本发明相比，其肽链氮端多一个精氨酸残基(R)，实验发现其促进C2C12细胞分化的活性也明显低于本发明，可能是因为成熟肽第108位的精氨酸残基的存在会引起rhBMP-2自身降解。进一步地，已公开的108肽与本发明相比，其肽链第二个氨基酸精氨酸残基(R)突变为赖氨酸残基(K)，发现该氨基酸残基的突变会降低重组蛋白的活性，由此推断rhBMP-2成熟肽第106位的精氨酸残基的突变会影响其生物活性。

实施例4三种载体对重组rhBMP-2诱导小鼠肌袋异位成骨的影响

将重组rhBMP-2水溶液分别与高浓度明胶、壳聚糖或天然珊瑚混合，采用抽真空的方法，使重组rhBMP-2与三种载体均匀复合形成复合材料。每个载体含有100μg rhBMP-2，冻干、环氧乙烷消毒备用。

将6只正常的ICR雄性小鼠随机分为三组，每组2只。用1％戊巴比妥钠麻醉后，后肢股部去毛消毒，切开皮肤，分离肌间隙，分别植入一定量的上述复合材料。其中，第1组植入的材料以高浓度明胶作为载体，第2组以壳聚糖作为载体，第3组以天然珊瑚作为载体。给小鼠一定的抗生素防止感染，然后逐层缝合肌肉和皮肤，消毒创口，正常饲养。埋植实验完成3周后，将小鼠进行放射学检查(X光)，查看小鼠后肢是否出现骨组织。进一步将小鼠处死，取出埋植区的骨组织，称量里面所含有的骨的重量。

放射学检查结果显示第1组小鼠异位成骨明显，与小鼠自体骨黏连紧密。进一步称量骨重量发现，以高浓度明胶作为载体时，平均骨重为0.706g，以壳聚糖作为载体时，平均骨重为0.266g，以天然珊瑚作为载体时，平均骨重为0.345g。上述结果说明，以高浓度明胶为载体可以促进异位成骨，这可能是因为明胶的分子结构更适合于成骨的要求，使得rhBMP-2与周围组织均匀接触，持续保持其活性并延长作用时间。

实施例5四种重组rhBMP-2诱导小鼠肌袋异位成骨

为了进一步比较本发明所述新的氨基酸序列的重组rhBMP-2的生物活性，发明人以实施例3所述的另外三种已被报道多肽的重组rhBMP-2进行对照试验(重组蛋白的制备参照本发明所述方法进行)。实验以高浓度明胶作为载体分别与四种rhBMP-2形成复合材料，每种复合材料各含有100μg相应的rhBMP-2。

将8只正常的ICR雄性小鼠随机分为四组，每组2只。用1％戊巴比妥钠麻醉后，后肢股部去毛消毒，切开皮肤，分离肌间隙，分别植入一定量的上述4种复合材料。3周后进行放射学检查(X光)和成骨量检测。

放射学检查结果如图7A所示，第2组小鼠异位成骨明显，与小鼠自体骨黏连紧密。进一步称量骨重量发现，本发明所制备的rhBMP-2相较于其他三种重组蛋白具有更好的成骨诱导活性。

表2四种rhBMP-2诱导小鼠肌袋异位成骨结果

rhBMP通过诱导未分化的间充质细胞C2C12分化形成成骨细胞，从而促进新骨形成。本发明所述氨基酸序列的重组rhBMP-2相较于其他三种重组rhBMP具有显著的促进C2C12细胞分化活性，进而显示出了显著的成骨活性。

上述技术方案仅体现了本发明的优选实施方式，不能理解为对本发明准许范围内的限制，凡根据本发明做出的变形和改进，均属于本发明保护范围。

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序列表

<110> 浙江瑞谷生物科技有限公司

<120> 一种编码重组人骨形态发生蛋白质-2的氨基酸序列

<130> 18-100070-00005889

<141> 2018-07-24

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe

1 5 10 15

Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His

20 25 30

Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu

35 40 45

Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn

50 55 60

Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile

65 70 75 80

Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr

85 90 95

Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

100 105

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 2

Met Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp

1 5 10 15

Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr

20 25 30

His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His

35 40 45

Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val

50 55 60

Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala

65 70 75 80

Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn

85 90 95

Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

100 105

<210> 3

<211> 327

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 3

atgaaacgtc tgaaaagcag ctgcaaacgt cacccgctgt acgttgattt cagcgatgtt 60

ggctggaacg attggatcgt tgcgccgccg ggctaccacg cgttctactg ccacggcgaa 120

tgcccgttcc cgctggcgga tcacctgaac agcaccaacc acgcgatcgt tcagaccctg 180

gttaacagcg ttaacagcaa aatcccgaaa gcgtgctgcg ttccgaccga actgtctgcg 240

atctcaatgc tgtacctgga tgaaaacgaa aaagttgttc tgaaaaacta ccaggatatg 300

gttgttgaag gttgcggttg ccgttaa 327

<210> 4

<211> 115

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 4

Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys

1 5 10 15

Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp

20 25 30

Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys

35 40 45

Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val

50 55 60

Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys

65 70 75 80

Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn

85 90 95

Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys

100 105 110

Gly Cys Arg

115

<210> 5

<211> 109

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 5

Met Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val

1 5 10 15

Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly

20 25 30

Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp

35 40 45

His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser

50 55 60

Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser

65 70 75 80

Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys

85 90 95

Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

100 105

<210> 6

<211> 108

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 6

Met Lys Lys Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp

1 5 10 15

Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr

20 25 30

His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His

35 40 45

Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val

50 55 60

Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala

65 70 75 80

Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn

85 90 95

Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

100 105