一种新型骨形成蛋白2来源的环肽、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种新型骨形成蛋白2来源的环肽、制备方法及其应用 () 是由 柳毅 林振 吴刚 于 2019-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种新型骨形成蛋白2来源的环肽、制备方法及其应用,这种新型骨形成蛋白2来源的环肽选自如下的环化的多肽之一：序列为：1.CKIPKASSVPTELSAISMLYLGPGGDWIVAC；2.与1限定的多肽具有80％同源性；新型骨形成蛋白2来源的环肽的制备方法和新型骨形成蛋白2来源的环肽在制备促大体积骨缺损修复的复合材料中的应用。本发明的有益效果是：本发明应用的经过特殊修饰的BMP2环化多肽有高效诱导成骨作用,可以有效促进大体积骨缺损的修复；本发明应用经过特殊修饰的BMP2环化多肽为人源性多肽,具有良好的生物相容性,无免疫排斥等副作用；本发明应用的经过特殊修饰的BMP2环化多肽可以负载于多种生物材料,具有广泛的应用前景。()
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种新型骨形成蛋白2来源的环肽、制备方法及其应用。
背景技术
大体积骨缺损的修复一直是医学尚未攻克的重大课题之一。自体骨移植因手术时间长，供骨区疼痛等限制了其临床应用。同种异体骨、异种异体骨移植和大部分合成材料缺乏诱导骨再生潜能，因而无法单独用于大体积骨组织缺损的修复。骨形成蛋白(bonemorphogenetic protein,BMP)具有高效骨诱导效能，其家族中BMP2已经通过FDA认证，可用于临床上修复骨缺损和加速骨融合等方面的治疗，然而BMP蛋白的生产主要依靠的是基因重组的方法，其产率较低、临床应用成本过高、免疫原性较高等副作用限制了它的推广。因此以小分子BMP来源的多肽为基础的骨修复材料成为大体积骨缺损修复的研究热点。
小分子多肽可化学合成，成本低，产量高。多肽仅包含蛋白的关键功能肽段，结构相对简单，可避免大分子蛋白质中其它结构域引发的副作用，因此多肽免疫原性较低。此外，多肽体内可降解成小分子氨基酸，无副作用，安全性更高。然而结构简单的直链多肽在体内环境极易降解，难以长久发挥药效。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种新型骨形成蛋白2来源的环肽、制备方法及其应用。
通过对经过特殊修饰的BMP2环化多肽的作用进行了一系列相关研究，发现：
1)利用BMP2蛋白、直链肽和环肽诱导小鼠间充质干细胞(BMSC)成骨分化的实验中发现：ALP染色结果显示，BMP2环肽所诱导的ALP较直链肽有明显的优势，其效能接近BMP2蛋白。
体外细胞实验证实，BMP2环化多肽可以高效促进间充质干细胞粘附、伸展、迁移、抗炎、上调干细胞的血管化因子并激活间充质干细胞-内皮细胞形成血管样组织，其促进血管化能力较对照组提高2.8倍；
2)动物实验证实经过修饰的BMP2环肽支架材料可加速大鼠颅骨大面积骨缺损愈合速度，其骨缺损愈合较其他组快。
这种新型骨形成蛋白2来源的环肽，选自如下的环化的多肽之一：
1)序列为：CKIPKASSVPTELSAISMLYLGPGGDWIVAC；
2)与1)限定的多肽具有80％同源性。
本发明的环肽是合成多肽，可以是全部氨基酸序列或个别、多个氨基酸的取代、缺失和***变异的多肽及同源物，因为部分氨基酸的改变并不影响其实质功能，这是本领域研究人员共知的。
新型骨形成蛋白2来源的环肽在制备促大体积骨缺损修复的复合材料中的应用。
经过特殊修饰的BMP2环化多肽可明显促进大体积骨缺损修复的修复，将其与多种生物材料复合，均可取得相似的促进骨缺损修复作用。涉及的复合材料包括硅酸二钙等生物玻璃材料，羟基磷灰石、磷酸氢钙、磷酸三钙、磷酸八钙、硫酸钙等生物陶瓷，可降解天然高分子、合成高分子及生物陶瓷，具体包括壳聚糖、透明质酸盐、海藻酸钠、纤维素、淀粉、木质素、胶原、明胶、卡拉胶等天然材料及其衍生物，聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚羟基烷酸酯、聚硅氧烷、聚氨酯等合成高分子材料及其衍生物，以及以上材料所组成的复合材料等。
本发明所述的经过特殊修饰的BMP2环化多肽应用，可以与多种载体(生物相容性好，不影响多肽的活性)结合，载体可以是粉剂、颗粒、膏剂、水凝胶、膜、海绵、纤维支架材料等。经过特殊修饰的BMP2环化多肽用量为0.01-10μg。
本发明的经过特殊修饰的BMP2环化多肽的应用，其应用方式可以通过支架材料负载后植入或覆盖于骨缺损处。
本发明经过特殊修饰的BMP2环化多肽应用剂量为0.01-10μg/cm2，但是应用于临床的剂量及剂量范围需要结合许多因素，包括给药方式、载体、患者的身体状况及缺损的大小等等。
BMP2蛋白是经过FDA认证可用于临床上修复大体积骨缺损，本发明时对BMP2蛋白中的有效氨基酸序列进行修饰，BMP2环化多肽未发现动物有急性毒性反应，生物安全性好。
这种新型骨形成蛋白2来源的环肽的制备方法，包括如下步骤：
一.树脂溶涨
称取取代度为0.2-0.4mmol/g的0.6-1g 2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加DCM 15-20ml，振荡30min；
二.接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入2-4倍摩尔过量的Fmoc-Cys(Trt)-OH氨基酸，再加入9-11倍摩尔过量的DIEA，最后加入少量DMF溶解，振荡1h；用DMF和DCM交替清洗6-8遍；
三.脱保护
加10-20ml 15-25％哌啶DMF溶液10-20ml/g，5min，去掉后再加10-20ml 15-25％哌啶DMF溶液10-20ml/g，15min；
四.检测
抽掉哌啶溶液，取15-20g树脂，用乙醇洗2-4次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各1-2滴，105℃－110℃加热5-10min,变深蓝色为阳性反应；
五.洗
DMF 5-15ml/g两次，甲醇5-15ml/g两次，DMF 5-15ml/g两次；
六.缩合
保护氨基酸Fmoc-Leu-OH 3-4倍过量，HBTU3-4倍过量，均用少量DMF溶解，加入反应管后加入DIEA 9-11倍过量，反应40min；
七.洗
DMF 5-15ml/g一次，甲醇5-15ml/g两次，DMF 5-15ml/g两次；
八.重复二至七步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；
九.检测
DMF 5-15ml/g 3-4次，DCM 5-15ml/g 2-4次，DMF 5-15ml/g两次，抽干10min；茚三酮检测阴性；
十.洗
甲醇5-15ml/g 3-4次；
十一.从树脂上切割多肽
配制切割液，按照1g树脂用10ml切割液TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS0.5％；
将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照5-15ml/g，恒温震荡，时间：120min；
十二.吹干洗涤
将裂解液用氮气吹干，用***层析出来，再用***洗六次，然后常温挥干；即得粗品肽序；
十三.氧化成环
取粗品肽序10mg，加入100-120ml 5-6％d DMF溶液氧化巯基使之成环；
十四.用HPLC纯化多肽；
十五.最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品。
作为优选,步骤十四具体包括：
1)取粗品肽200mg放入器皿中；用2-5ml50％的乙腈水溶液溶清；超声2min；
2)用0.45um滤膜过滤溶解液；
3)分析：取3ul用分析级HPLC分析粗品；流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％,结束比例水5％，乙腈95％；
4)制备：将溶解好的样品，做进样准备；制备HPLC平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40min；收集从检测器出来的样品；
5)鉴定：将收集下来的样品，取样进行纯度和MS的鉴定。
本发明的有益效果是：
1)本发明应用的经过特殊修饰的BMP2环化多肽有高效诱导成骨作用，可以有效促进大体积骨缺损的修复。
2)本发明应用经过特殊修饰的BMP2环化多肽为人源性多肽，具有良好的生物相容性，无免疫排斥等副作用。
3)本发明应用的经过特殊修饰的BMP2环化多肽可以负载于多种生物材料，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为BMP2环肽结构图；
图2为BMP I型受体结构图；
图3为VEGF 2型受体结构图；
图4为BMP2环肽与BMP I型受体分子对接最优的结构图；
图5为BMP2环肽与VEGF 2型受体分子对接最优的结构图；
图6为检测成骨相关指标图；
图7观察细胞成管状连接结果图；
图8为Micro-CT扫描三维重建新生骨及新生血管结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。下述实施例的说明只是用于帮助理解本发明。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
合成实施例1：
CKIPKASSVPTELSAISMLYLGPGGDWIVAC固相多肽合成操作步骤：
一.树脂溶涨
称取取代度为0.35mmol/g的0.8g 2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min.
二.接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Cys(Trt)-OH氨基酸，再加入8倍摩尔过量的DIEA，最后加入少量DMF溶解，振荡1h。用DMF和DCM交替清洗6遍。
三.脱保护
加15ml20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加15ml20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min.
四.检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。
五.洗
DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
六.缩合
保护氨基酸(Fmoc-Leu-OH)三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量.反应40min.
七.洗
DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
8.重复二至七步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。
九.检测
DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，抽干10min。茚三酮检测阴性。
十.洗
甲醇(10ml/g)三次。
十一.从树脂上切割多肽
配制切割液(10/g)TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％
将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10ml/g，恒温震荡，时间：120min
十二.吹干洗涤
将裂解液用氮气尽量吹干，用***层析出来，再用***洗六次，然后常温挥干。即得粗品肽序。
十三.氧化成环
取粗品10mg，加入100ml 5％d DMF溶液氧化巯基使之成环。
十四.用HPLC纯化多肽
具体操作步骤：
1)取粗品肽200mg放入器皿中。用2-5ml50％的乙腈水溶液溶清。可以稍微超声2min。
2)用0.45um滤膜过滤溶解液。
3)分析：取3ul用分析级HPLC分析粗品。流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％,结束比例水5％，乙腈95％
4)制备：将溶解好的样品，做进样准备。制备HPLC平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。
5)鉴定：将收集下来的样品，取样进行纯度和MS的鉴定。
十五.最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品。
十六.将粉末状的多肽，密封包装，-20度保存。
合成实施例2：
CKIPKASSVPTELSAISMLYLGPGGDWIVAC固相多肽合成操作步骤：
一.树脂溶涨
称取取代度为0.3mmol/g的0.9g 2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加DCM(18ml/g)，振荡30min.
二.接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Cys(Trt)-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入少量DMF溶解，振荡1h。用DMF和DCM交替清洗6遍。
三.脱保护
加18ml20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加15ml20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min.
四.检测
抽掉哌啶溶液，取15g树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。
五.洗
DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
六.缩合
保护氨基酸(Fmoc-Leu-OH)三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量.反应40min.
七.洗
DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
8.重复二至七步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。
九.检测
DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，抽干10min。茚三酮检测阴性。
十.洗
甲醇(10ml/g)三次。
十一.从树脂上切割多肽
配制切割液(10ml)TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％
将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照1g:10ml，恒温震荡，时间：120min十二.吹干洗涤
将裂解液用氮气尽量吹干，用***层析出来，再用***洗七次，然后常温挥干。即得粗品肽序。
十三.氧化成环
取粗品10mg，加入100ml 5％d DMF溶液氧化巯基使之成环。
十四.用HPLC纯化多肽
具体操作步骤：
1，取粗品肽200mg放入器皿中。用4ml50％的乙腈水溶液溶清。可以稍微超声2min。
2，用0.45um滤膜过滤溶解液。
3，分析：取3ul用分析级HPLC分析粗品。流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％,结束比例水5％，乙腈95％
4，制备：将溶解好的样品，做进样准备。制备HPLC平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。
5，鉴定：将收集下来的样品，取样进行纯度和MS的鉴定。
十五.最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品。
十六.将粉末状的多肽，密封包装，-20度保存。
实施例3：经过修饰的BMP2环化多肽单纯滴加促进大鼠颅缺损修复的研究
将SD大鼠用3％的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉后，俯卧于手术台，固定四肢，颅顶骨部剃毛，1％碘消毒铺巾。分层切开皮肤筋膜骨膜，暴露颅顶骨，种植机1cm环钻600转/分，环切颅顶骨，切至近颅可见环形处成蓝紫色，用剥离子从一端撬起骨片，血管钳钳除1cm环形骨片，将经过修饰的BMP2环形多肽，经过修饰的直链多肽，单纯环肽，单纯直链多肽，BMP2蛋白和等量生理盐水分别滴加于颅骨缺损处，分层缝合骨膜、皮肤，碘消毒。术后3天内，每天注射庆大霉素预防感染，注射卡布洛芬镇痛，并分笼正常喂养。4周后取样本进行MicroCT，观察软件分析新骨形成的指标。
实施例4：负载BMP2环化多肽的胶原海绵应用于促进大鼠颅骨极限骨缺损修复。
将无经过修饰的BMP2环形多肽，经过修饰的直链多肽，单纯环肽，单纯直链多肽，BMP2蛋白和等量生理盐水分别溶于生理盐水，均匀滴加于胶原海绵上。冷冻干燥后，低温密封保存。将预先准备好的海绵植入颅骨缺损处，4周后取样本进行MicroCT后发现等量的BMP2环化多肽相比于空白对照组有明显的促进新生骨生成作用，新生骨量是空白组的近两倍。
如图1至图5所示，经过修饰的BMP2环肽与BMP I型、VEGF 2型受体对接示意图。BMP2环肽对于BMP I型受体、VEGF 2型受体同时具有高亲和力，这使得BMP2环肽能够快速诱导受体复合物形成并介导其细胞内信号通路。图1：BMP2环肽结构图；图2：BMP I型受体；图3：VEGF 2型受体；图4：BMP2环肽与BMP I型受体分子对接最优的结构图中表面相互作用，其中蓝色代表正电表面区，红色为负电表面区，绿色为疏水表面区；图5：BMP2环肽与VEGF 2型受体分子对接最优的结构图。
如图6所示，直链肽和环肽分别作用于人成骨细胞系(hFOB1.19)后检测成骨相关指标：(A)培养7天ALP染色显示：环肽诱导成骨效果明显优于直链肽，50ng/ml环肽效果优于蛋白BMP2。(B)矿化培养基诱导培养28天，茜素红染色显示：同等浓度的环肽诱导出的矿化结节面积显著高于等量的蛋白BMP2诱导量。(C)培养7天定量检测ALP发现：50ng/ml环肽诱导ALP的量显著高于蛋白BMP2。(D)28天茜素红定量分析显示：50ng/ml环肽诱导的矿化结节量是等量蛋白BMP2诱导面积的2.6倍。(LP：直链肽；CP：环肽；最后一组：BMP2蛋白。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001具有显著性差异；n.s.：无差异)。
如图7所示，四种肽和蛋白分别作用于HUVEC和BMSC后检测成血管、成骨相关指标：(A)3小时后观察细胞成管形态显示：修饰环肽效果最佳。(B)14天后检测细胞外基质矿化结果显示修饰环肽新生矿化结节明显高于其他组。(C)成管连接点统计分析显示：修饰环肽结点数量是BMP2蛋白组诱导的4倍。(D)矿化结节面积统计分析显示：修饰环肽较BMP2蛋白对矿化结节的生成有明显的促进作用。(L-BMP2：直链肽；C-BMP2：环肽；M-L-BMP2：修饰直链肽；M-C-BMP2：修饰环肽；最后一组：BMP2蛋白。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001具有显著性差异；n.s：无差异)。