一种决明子复方胶原脂质体及其应用
阅读说明：本技术 一种决明子复方胶原脂质体及其应用 (Cassia seed compound collagen liposome and application thereof ) 是由 李明媛 李萌 李世勤 贾琳 李媛 郁彭 于 2021-06-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种以决明子复方胶原脂质体为主的制备方法及其应用。一种决明子复方胶原脂质体,由以下原料按质量百分比制成：复方卵磷脂2.00-5.00％、决明子提取液12.00-25.00％、薄荷提取液12.00-25.00％、石斛提取液12.00-25.00％、荸荠提取液12.00-25.00％、红枸杞提取液12.00-25.00％、甘草提取液12.00-25.00％、胶原蛋白溶液8.00-16.00％。本发明以决明子复方胶原脂质体为主的应用兼具明目、保湿、美白、抗皱和高渗透的作用,且质地温和清爽,能够有效缓解眼疲劳,对眼睛的明目作用最为明显。(The invention discloses a preparation method and application of a cassia seed compound collagen liposome. The compound semen cassiae collagen liposome is prepared from the following raw materials in percentage by mass: 2.00-5.00% of compound lecithin, 12.00-25.00% of cassia seed extract, 12.00-25.00% of mint extract, 12.00-25.00% of dendrobe extract, 12.00-25.00% of water chestnut extract, 12.00-25.00% of lycium ruthenicum extract, 12.00-25.00% of liquorice extract and 8.00-16.00% of collagen solution. The application of the cassia seed compound collagen liposome as the main material has the effects of improving eyesight, preserving moisture, whitening, resisting wrinkles and high permeability, is mild and fresh in texture, can effectively relieve eye fatigue, and has the most obvious effect of improving eyesight.)
技术领域
本发明涉及脂质体及其应用技术领域，特别涉及一种以决明子复方胶原脂质体为主的制备方法及其应用。
背景技术
人的眼部肌肤薄弱，更容易受到外界环境侵害，也是最容易衰老的部位之一。这种衰老在眼部皮肤具体体现为皮肤厚度减少、含水率下降、皮肤松弛、细密皱纹增多、黑眼圈、眼周皮肤色素沉积、暗沉，其实质是皮肤的抗氧化能力下降、脂褐素堆积、胶原蛋白的合成能力下降、透明质酸含量减少、皮肤含水率下降等。
同时，现在越来越多的人因为长时间使用电脑、看电视、看书、在空调环境下办公和学习等而产生视觉疲劳，总是觉得眼睛干涩、酸胀、疼痛、视物模糊，甚至导致视力下降。
针对上述两个问题，大部分人的做法是在眼部皮肤尚未衰老或出现衰老征兆时涂抹具有相应功能的眼霜或其他护肤品，在眼睛出现不适时滴滴眼液缓解。若同时出现问题，处理较为麻烦。因此，若能开发一种具有保湿、美白、抗皱功能性的眼部专用护肤品，又能在眼睛不适时有效缓解眼疲劳，对眼睛具有明目和保护作用，将是拥有巨大的市场前景。
红枸杞，是茄科植物宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)的干燥成熟果实，是我国的传统名贵中药材，具有悠久的药用历史，始载于《神农本草经》，列为上品，《本草纲目》载曰：“枸杞，补肾生精，养肝，明目，坚精骨，去疲劳，易颜色，变白，明目安神，令人长寿”，其药用和保健价值备受历代医家的推崇。枸杞的主要分布地在我国西北的青海、宁夏、甘肃和新疆等地。枸杞作为我国传统药材，具有滋补肝肾，益精明目的作用。现代药理研究证实其具有调节免疫、保肝、抗氧化损伤、保护视力等作用。
夏枯草，为唇形科夏枯草属(Prunella vulgaris L.)植物，在我国河南、浙江、安徽等地均有分布，始载于《神农本草经》，位列下品，并记载有“主寒热，瘰疬，鼠瘘，头疮，破徵，散瘿结气，脚肿湿痹”；《丹溪心法》谓“补养血脉”；《滇南本草》曰“祛肝风，行经络。治口眼歪斜，止筋骨疼，疏肝气，开肝郁。治目珠肿痛，消散瘰疬。”可见古人对于夏枯草的功效及适应证已有深入的研究。夏枯草味辛、苦，寒，归肝、胆经，具有清火泻火、明目、散结消肿之功效，用于治疗目珠夜痛、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤等症。现代药理研究表明，夏枯草具有很好的抗肿瘤、抗炎免疫、抗氧化、降血糖、降血脂、降血压、明目等疗效。
密蒙花，别名染饭花、糯米花、蒙花，为马钱科醉鱼草属植物密蒙花(Buddlejaofficinalis Maxim.)的干燥花蕾和花序，多在春季花未开放时采收。其性甘，微寒，归肾经，具有清热泻火、养肝明目、退翳功效，用于明目退翳、目赤肿痛、多泪羞明等症状。许多中国古医学著作均对其有详细的记载。始载于《开宝本草》：主青盲肤翳、涩多眵泪，消目中赤脉，小儿麸豆及疳气攻眼，将其定义为眼科专用药；《本草经疏》中记载：此药甘以补血，寒以除热，肝血足而诸证无不愈矣；《本草求真》记载：密蒙花，味薄于气，佐以养血之药，更有力焉。
女贞子，为木犀科植物女贞(Ligustrum lucidum Ait)的干燥成熟果实。其性味甘、苦、凉，归肝、肾经。女贞子具有扶正固本、滋补肝肾、明目乌发的功效。《神农本草经》列之为上品，谓其“味苦平，主补中，安五脏，养精神，除百病”。李时珍谓其“果实强阴健腰膝，变白发，明目”。
荸荠，俗称马蹄，又名地栗、乌茶，荸荠是莎草科荸荠(Eleocharis dulcis(Burm.f.)Trin.)，属多年生草本植物，荸荠的地下茎广泛种植于我国长江以南各省。荸荠以地下球茎为食用器官，是一种药食同源的食物，肉质细嫩、汁多味甜、清脆爽口，有“地下雪梨”之美誉，北方视为“江南人参”。据《中药大辞典》记载：“荸荠性味甘、微寒、无毒，有温中益气、清热开胃、消食化痰之功效”。中医认为，荸荠性味甘寒，具有清热化痰、生津开胃、明目清音、消食醒酒等保健功效。
秦皮，为木犀科植物苦枥白蜡树(Fraxinus rhynchophylla Hance)、白蜡树(Fraxinus chinensis Roxb.)、尖叶白蜡树(Fraxinus szaboana Lingelsh.)、宿柱白蜡树(Fraxinus stylosa Lingelsh.)的干燥枝皮或干皮，是临床常用中药，始载于《神农本草经》，列为中品。秦皮主要化学成分为香豆素类化合物，还含有酚类、皂苷、鞣质、生物碱等，其主要功效为清热燥湿、平喘止咳、明目，临床上用于治疗肠炎、白带过多、慢性支气管炎、细菌性痢疾、目赤肿痛、迎风流泪、牛皮癣等。秦皮在我国分布广泛，资源丰富，是一种极有开发利用价值的药用植物。
谷精草，为谷精草(Eriocaulon buergerianum Koern.)植物的干燥带花茎的头状花序，广布于全世界热带及亚热带地区的砂质池塘或沼泽中，盛产于南美洲的热带；我国谷精草科生长多现于南部及西南部地区，生长环境多为沼泽、稻田等比较潮湿的环境。谷精草始载于宋代《开宝本草》曰“主疗喉痹，齿风痛，及诸疮疥。”《本草纲目》中记载“味辛、甘，性平，主治头风痛、目盲翳膜、痘后生翳，止血。”现代中医认为谷精草具有祛风散热、明目退翳的功效。
木贼，别名节节草，为木贼科植物(Equisetum hyemale L.)的全草，主产于东北、陕西、湖北等地。木贼首载于《嘉祐本草》，味甘、微苦，性平，其具有疏风散热、明目退翳、止血的功效。《本草纲目》载木贼有疏风散热、解肌退翳之功；问荆能“主结气瘤痛,上气气急”。现代医学研究证实木贼有散风热、退目翳、消积块、益肝胆、疗肠风、止血、去风湿及镇静抗惊厥等功能。
决明子，为豆科植物决明(Cassia obtusifolia L.)或小决明(Cassia tora L.)的干燥成熟种子，始载于《神农草本经》，并被列为上品。《本草纲目》中指出决明子“除肝胆风热，淫肤白膜，青盲”，《本草正义》中亦有“决明子明目，乃滋益肝肾，以镇潜补阴为义，是培本之正治”的记载。现代研究表明，决明子具有降血压、降血脂、保肝、明目、抗氧化、抑菌等作用。作为药食两用之品，决明子在临床防治疾病及养生等方面具有明显的作用，同时决明子在我国分布广泛、价格低廉，故而具有较好的开发利用前景。
石斛，为兰科石斛(Dendrobium nobile Lindl.)属植物，为我国传统名贵中药，又名金钗石、扁金钗、扁黄草等，其茎为传统中药石斛的来源之一，为历版中国药典所收载。石斛早在《神农本草经》中就有记载，《本草纲目》称它有“强阴益精、厚肠胃、补内孢不足、轻身延年”之功效。《本草衍义》、《本草纲目拾遗》及《本草从新》等历代本草都备加推崇，素有“千金草”之称。石斛，性微寒，味甘，用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热、目暗不明等，是石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛浸膏溶液、石斛清胃散等制剂的重要配伍。近年来研究发现，金钗石斛在抗肿瘤、降血糖等方面作用较显著。
薄荷，为唇形科植物薄荷(Mentha haplocalyx Briq)的干燥地上部分，主产于江苏、浙江、湖南等地，以江苏太仓为道地产区，有疏散风热、清热解表、利咽透疹、祛风消肿、利咽止痛之功效，常用于风热感冒、头痛目赤、喉痹、口疮、风疹、麻疹、胸胁胀闷等。薄荷最早收载于《唐本草》“主贼风，发汗，(治)恶气腹胀满，霍乱，宿食不消，下气”。在《本草纲目》中提到：“利咽喉、口齿诸病。治瘰疬，疮疥，风瘙瘾疹”。《中华人民共和国药典》中所载薄荷的功效是疏散风热、清利头目、利咽透疹、疏肝败坏气。薄荷其化学成分丰富，主要含有挥发油、黄酮类、蒽醌类、有机酸类、氨基酸、微量元素等。现代药理研究表明薄荷具有保肝利胆、兴奋人中枢神经以及抗炎镇痛、抗病毒、促进透皮吸收等作用。
甘草，为豆科植物乌拉尔甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.)、光果甘草(Glycyrrhiza glabraL.)或胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)的干燥根及根茎。主要来源于内蒙古、甘肃、新疆等地，具有补气、解毒、祛痰、止咳、清热、止痛等功效。甘草具“解百草毒”之功，常在组方中起解毒、调和诸药的作用。
胶原蛋白，作为生物体中最重要的结构蛋白之一，占总蛋白含量的25％～30％，主要存在于皮肤、骨骼和韧带中，起到支撑和保护机体的功能。动物皮肤中的胶原主要以白色透明、具有四级结构的Ⅰ型纤维状胶原为主。胶原蛋白与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系。胶原蛋白是生物科技产业最关键的原材料之一，在医学材料、化妆品、食品工业中均有广泛应用。胶原蛋白在化妆品方面具有显著的优点，因其具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，具有低抗原性、易被人体吸收、促进细胞成活与生长和促进血小板凝结等特性而被广泛应用于化妆品中。
脂质体以磷脂为主要材料构成的双分子层囊泡，最早由英国科学家发现，其结构类似生物膜。上世纪70年代，脂质体开始成为药物载体。由于其生物相容性、生物可降解性、无毒和无免疫原性优点，脂质体作为药物新剂型迅速发展，目前已有11种脂质体制剂上市。在透皮作用研究中，有研究表明，粒径为20～200nm的脂质体能作为局部用药的活性载体，借助细胞间隙途径渗透进入活体表皮。脂质体在化妆品中的优点除了高渗透以外，还有保护光、热、氧化不稳定的有效成分，保持活性和稳定的作用，通过角质层间隙进入皮肤深层细胞。
国内外鲜有含决明子的化妆品，而且由于决明子皮肤吸收效率低，故将决明子制备成决明子复方胶原脂质体的形式，能够在皮肤处持续释放药物而增加了药物浓度，从而明显增加药物的透过量，既有利于增大局部皮肤的药物浓度，又可以降低药物刺激等不良反应，有利于皮肤局部应用。因此，发明人将开发此含决明子复方胶原脂质体的眼部专用护肤品。
中国发明专利(专利申请号201711253559.5，公开号CN107929198A，申请日：2017-12-02)，发明名称为“一种眼霜配方”公开了一种眼霜，该眼霜由甘草酸浓缩粉、玫瑰精油、决明子粉、山金车萃取液等组成，与本发明的配方明显不同。
中国发明专利(专利申请号201610462469.6，公开号CN 107519338A，申请日：2016-06-22)，发明名称为“一种外用保护视力的中药组合物”公开了一种眼霜，该眼霜公开了该中药组分物的原料药由薄荷脑、苏合香、安息香、冰片、丹参、当归、野菊花、珍珠母、决明子、石决明、甘草等组成，外敷于眼眶周围，配合理疗仪使用。临床检测对视力障碍，眼困倦，酸痛，流泪，异物感等视觉疲劳有明显疗效。但所需原料成分较多，制备、生产繁琐，还需配合仪器共同使用，且以治疗为主，保护、预防性不明。
中国发明专利(专利申请号201911322832.4，公开号CN 110787113A，申请日：2019-12-20)，发明名称为“一种抗衰老眼霜及其制备方法”公开了一种眼霜，该眼霜添加了多种植物活性成分，其主要植物活性成分为大麻二酚(CBD)和虾青素，与本发明的主要成分明显不同。
本发明采用决明子复方胶原脂质体形式，与其他药食同源的中药植物有效活性成分配伍，各成分之间协同作用，起到行气活血、清肝明目的功效，能够促进眼周肌肤血液循环，增强细胞活力，修复受损细胞并为其提供丰富的营养成分，深层滋润眼周肌肤，延缓眼周皮肤衰老、改善已有细纹、保湿美白效果好，同时具有显著的明目效果，使用安全舒适，加之配方中所添加的胶原蛋白为天然皮肤支撑剂，安全性高，温和不刺激，通过脂质体靶向技术可以直达眼部肌肤，相比口服利用率更高，分布更集中，并且胶原蛋白对眼部皮肤有很强的亲和力，而且还具有良好的生物相容性，使眼部肌肤达到一个很好的油水平衡效果，更好地吸收营养。
发明内容
基于上述所提到的问题，本发明提供一种以决明子复方胶原脂质体为主的眼部专用护肤品，可以同时预防和解决眼部皮肤衰老和长时间用眼造成的不适感，起到明目的作用。本发明还以脂质体作为载体，既增加了药物成分的溶解度，还提高了药物的稳定性和药物的生物利用度。
本发明的目的是提供上述决明子复方胶原脂质体的制备方法。
本发明所采用的技术方案一是，一种决明子复方胶原脂质体配方，其特征在于：由以下原料按质量百分比制成：复方卵磷脂2.00-5.00％、决明子提取液12.00-25.00％、薄荷提取液12.00-25.00％、石斛提取液12.00-25.00％、荸荠提取液12.00-25.00％、红枸杞提取液12.00-25.00％、甘草提取液12.00-25.00％、胶原蛋白溶液8.00-16.00％。
本发明的另一目的是提供上述以决明子复方胶原脂质体为主的应用，具体表现为一种眼部专用护肤品的制备方法。
本发明所采用的技术方案二是，一种以决明子复方胶原脂质体为主的应用，具体表现为一种眼部专用护肤品，其特征在于：决明子复方胶原脂质体40.00-55.00％、决明子提取液1.00-3.00％、苯甲酸钠0.20-0.50％、红枸杞提取物0.50-1.00％、夏枯草提取物0.50-1.00％、密蒙花提取物0.50-1.00％、女贞子提取物0.50-1.00％、荸荠提取物0.50-1.00％、秦皮提取物0.50-1.00％、谷精草提取物0.50-1.00％、木贼提取物0.50-1.00％、熊果苷0.40-0.80％、茶多酚0.10-0.30％、透明质酸0.05-0.10％、橙皮素0.05-0.08％、烟酰胺0.80-2.00％、海藻糖3.00-5.00％、丙三醇3.00-7.00％、黄原胶5.00-10.00％、无菌蒸馏水30.00-50.00％。
本发明所采用的技术方案三是，一种决明子复方胶原脂质体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，用少量无水乙醇溶解复方卵磷脂，减压旋蒸至成膜；
步骤二，配置一定浓度的含决明子提取液、薄荷提取液、石斛提取液、荸荠提取液、红枸杞提取液、甘草提取液和胶原蛋白溶液的水化液，过滤，置于一定温度的水中预热；
步骤三，在相同条件下，加水化液水化，完全溶解后超声至溶液均匀澄清，过滤除菌，即得决明子复方胶原脂质体。
本发明的特点还在于，
步骤一中所述的复方卵磷脂包含蛋黄卵磷脂、无水奶油、胆固醇，蛋黄卵磷脂、无水奶油、胆固醇的质量比为(3～6)：3：1；复方卵磷脂与决明子提取液的质量比为(3～5)：100。
步骤一中所述的水化液，其决明子提取液、薄荷提取液、石斛提取液、荸荠提取液、红枸杞提取液、甘草提取液浓度为5～10mg/mL，胶原蛋白溶液的浓度为1～5mg/mL。
步骤二中所述的预热温度为45～50℃。
步骤中二、三所述的过滤为用0.22μm过滤膜过滤。
本发明所采用的技术方案四是，一种以决明子复方胶原脂质体为主的应用的制备方法，具体表现为一种眼部专用护肤品的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，按质量百分比称取原料黄原胶、透明质酸、海藻糖、丙三醇和苯甲酸钠混合置于磁力搅拌器上，设置适宜转速和温度，溶解搅拌至均匀，制得基础基质；
步骤二，在相同条件下，按质量百分比称取原料决明子提取液、夏枯草提取物、密蒙花提取物、女贞子提取物、荸荠提取物、秦皮提取物、谷精草提取物、木贼提取物、无菌蒸馏水、茶多酚、橙皮素、烟酰胺加入步骤一原料中，溶解搅拌至均匀；
步骤三，降低至一定温度，按质量百分比称取原料决明子复方胶原脂质体、熊果苷，加入步骤二原料中，搅拌至均匀，得到果冻状固体，即为所述眼部专用护肤品。
本发明的特点还在于，
步骤一中所述的转速设置为800～1800rpm，温度设置为70～80℃。
步骤三中所述的温度设置为40～45℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是，
一、本发明通过决明子复方胶原脂质体对眼部皮肤有一定的抗氧化作用，对眼部细胞有一定的明目作用，透明质酸和海藻糖有保湿作用，枸杞提取物有滋阴补血、明目养肝的作用，橙皮素有活血、抗氧化的作用，熊果苷和烟酰胺有美白的作用等，创新的形成了一个独特的配方，从配方上兼顾了明目、美白、保湿、抗皱、去浮肿等多项功能，同时还可以缓解长时间用眼所造成的不适感，以达到全方面护理的效果，给人们生活带来了便利。
二、本发明以决明子复方胶原脂质体作为载体的眼部专用护肤品，创新的采用了决明子复方胶原脂质体为有效成分的载体，能够实现有效成分的透皮递释，提高有效成分的稳定性。本发明利用脂质体技术既增加了有效成分的溶解度，还提高了有效成分的生物利用度。
三、本发明的决明子复方胶原脂质体配方中添加了天然皮肤支撑剂——胶原蛋白，主要存在于皮肤、骨骼和韧带中，起到支撑和保护机体的功能。因其具有可生物降解性以及生物活性，具有低抗原性、易被人体吸收、促进细胞成活与生长和促进血小板凝结等特性而被广泛应用于化妆品中。本发明通过脂质体靶向技术可以直达眼部肌肤，相比口服利用率更高，分布更集中，并且胶原蛋白对眼部皮肤有很强的亲和力，而且还具有良好的生物相容性，能有效地减少刺激，降低其他表面活性剂的潜在刺激性，可以更好地呵护眼部周围娇嫩的皮肤。
四、本发明选用的中药原料大都选用药食同源的药材，安全性高，毒副作用小，在中医方剂配理论的基础上，诸药共奏有保肝明目之功效。兼之本发明所选中药均来源广泛，价格低廉，功效明确多样，可利用空间大，使得本发明制备成本低、制备工艺易于工业化生产，且适用人群广，能够被更多地人所接受。
附图说明
图1为实施例三决明子复方胶原脂质体照片图；
可见此决明子复方胶原脂质体溶液为黄褐色澄清半透明，无分层，无沉淀的均一液体。
图2为实施例三决明子复方胶原脂质体的粒径分布图；
可见决明子复方胶原脂质体的平均粒径直径为95nm，全部在70～100nm之间，分布集中均匀，是良好的纳米分散体系。
图3为牛血清白蛋白标准曲线。
图4为不同浓度的实施例七的酪氨酸酶抑制率实验结果，结果显示实施例七具有良好的抗氧化效果。
图5为不同浓度的实施例八的DPPH自由基清除率实验结果，结果显示实施例八具有良好的抗氧化效果。
图6为加入0.8mg/mL的实施例一时受脂多糖(1μg/mL)刺激BV2细胞状态图片。
图7为加入0.6mg/mL的实施例二时受脂多糖(1μg/mL)刺激BV2细胞状态图片。
图8为只加入脂多糖(1μg/mL)时刺激BV2细胞状态图片。
图9为不同浓度的实施例一和实施例二保护脂多糖(1μg/mL)刺激BV2细胞存活率实验结果，结果显示实施例二比实施例一具有更好的保护效果。
图10为只加入双氧水(20μmol/mL)时刺激BV2细胞状态图片。
图11为不同浓度的实施例一和实施例二保护双氧水(1mmol/mL)刺激BV2细胞存活率实验结果，结果显示实施例二比实施例一具有更好的保护效果。
图12为不同浓度的实施例一和实施例二保护双氧水(20μmol/mL)刺激BV2细胞存活率实验结果，结果显示实施例二比实施例一具有更好的保护效果。
图13为只照射蓝光(照射时间为35min)时刺激BV2细胞状态图片。
图14为不同浓度的实施例一和实施例二保护蓝光(照射时间为35min)刺激BV2细胞存活率实验结果，结果显示实施例二比实施例一具有更好的保护效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明，仅用于解释本发明并不作为对本发明的限定。
对比例一
用超纯水配置浓度为1mg/mL的维生素C溶液，并用超纯水将维生素C溶液稀释成0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL。
对比例二
用无水乙醇配置浓度为1mg/mL的维生素C溶液，并用无水乙醇将维生素C溶液稀释成0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL。
实施例一
用含双抗和血清的MEM培养基配置浓度为10mg/mL的决明子提取液，过滤除菌，并用含双抗和血清的MEM培养基将决明子提取液稀释成8mg/mL、6mg/mL、4mg/mL、2mg/mL。
实施例二
用少量无水乙醇溶解复方卵磷脂，减压旋蒸至成膜；配置10mg/mL的含决明子提取液的水化液，过滤，置于50℃的水中预热；在相同条件下，加水化液水化，完全溶解后超声至溶液均匀澄清，过滤除菌，即得决明子脂质体。
上述实施例二中所述的复方卵磷脂包含蛋黄卵磷脂、无水奶油、胆固醇，其质量比为3：3：1。
实施例三
用少量无水乙醇溶解复方卵磷脂，减压旋蒸至成膜；配置10mg/mL的含决明子提取液、薄荷提取液、石斛提取液、荸荠提取液、红枸杞提取液、甘草提取液和5mg/mL胶原蛋白溶液的水化液，过滤，置于50℃的水中预热；在相同条件下，加水化液水化，完全溶解后超声至溶液均匀澄清，过滤除菌，即得决明子复方胶原脂质体。
上述实施例三中所述的复方卵磷脂包含蛋黄卵磷脂、无水奶油、胆固醇，其质量比为3：3：1。
实施例四
用含双抗和血清的MEM培养基配置浓度为10mg/mL的决明子提取液、金银花提取液、荸荠提取液、木贼提取液、秦皮提取液、密蒙花提取液、夏枯草提取液、胶原蛋白脂质体(制备方法同实施例一)、维生素C、决明子脂质体、甘草提取液、谷精草提取液、红枸杞提取液、女贞子提取液、薄荷提取液、石斛提取液、透明质酸提取液、没食子酸提取液，过滤除菌。
实施例五
用生理盐水配置5mg/mL的胶原蛋白水溶液。
实施例六
用少量无水乙醇溶解复方卵磷脂，减压旋蒸至成膜；配置5mg/mL的含胶原蛋白的水化液，过滤，置于50℃的水中预热；在相同条件下，加水化液水化，完全溶解后超声至溶液均匀澄清，过滤除菌，即得胶原蛋白脂质体。
上述实施例六中所述的复方卵磷脂包含蛋黄卵磷脂、无水奶油、胆固醇，蛋黄卵磷脂、无水奶油、胆固醇的质量比为3：3：1。
实施例七
用超纯水配置浓度为1mg/mL的决明子提取液，过滤除菌，并用超纯水将决明子提取液稀释成0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL。
实施例八
用无水乙醇配置浓度为1mg/mL的决明子提取液，过滤除菌，并用无水乙醇将决明子提取液稀释成0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL。
实施例九
按质量百分比称取原料黄原胶7％、透明质酸0.1％、海藻糖5％、丙三醇5％和苯甲酸钠0.2％混合置于磁力搅拌器上，设置1500rpm转速和75℃温度，溶解搅拌至均匀，制得基础基质；在相同条件下，按质量百分比称取原料决明子提取液2％、夏枯草提取物0.5％、密蒙花提取物0.5％、女贞子提取物0.5％、荸荠提取物0.5％、秦皮提取物0.5％、谷精草提取物0.5％、木贼提取物0.5％、无菌蒸馏水24.95％、茶多酚0.2％、橙皮素0.05％、烟酰胺1.5％加入上述原料中，溶解搅拌至均匀；降低至45℃，按质量百分比称取原料决明子复方胶原脂质体50％、熊果苷0.5％，加入步上述原料中，搅拌至均匀，制得眼霜。
实施例十
按质量百分比称取原料黄原胶7％、透明质酸0.1％、海藻糖5％、丙三醇5％和苯甲酸钠0.2％混合置于磁力搅拌器上，设置1500rpm转速和75℃温度，溶解搅拌至均匀，制得基础基质；在相同条件下，按质量百分比称取原料决明子提取液2％、夏枯草提取物0.5％、密蒙花提取物0.5％、女贞子提取物0.5％、荸荠提取物0.5％、秦皮提取物0.5％、谷精草提取物0.5％、木贼提取物0.5％、无菌蒸馏水29.95％、茶多酚0.2％、橙皮素0.05％、烟酰胺1.5％加入上述原料中，溶解搅拌至均匀；降低至45℃，按质量百分比称取原料决明子复方胶原脂质体45％、熊果苷0.5％，加入步上述原料中，搅拌至均匀，制得眼霜。
实施例十一
按质量百分比称取原料黄原胶7％、透明质酸0.1％、海藻糖5％、丙三醇5％和苯甲酸钠0.2％混合置于磁力搅拌器上，设置1500rpm转速和75℃温度，溶解搅拌至均匀，制得基础基质；在相同条件下，按质量百分比称取原料决明子提取液2％、夏枯草提取物0.5％、密蒙花提取物0.5％、女贞子提取物0.5％、荸荠提取物0.5％、秦皮提取物0.5％、谷精草提取物0.5％、木贼提取物0.5％、无菌蒸馏水34.95％、茶多酚0.2％、橙皮素0.05％、烟酰胺1.5％加入上述原料中，溶解搅拌至均匀；降低至45℃，按质量百分比称取原料决明子复方胶原脂质体40％、熊果苷0.5％，加入步上述原料中，搅拌至均匀，制得眼霜。
实施例十二
用含双抗和血清的MEM培养基配置浓度为10mg/mL的复配溶液，具体分组如下：
(1)石斛、红枸、甘草；(2)石斛、甘草、薄荷；(3)石斛、薄荷、荸荠；(4)石斛、红枸、薄荷；(5)石斛、红枸、荸荠；(6)石斛、甘草、荸荠；(7)红枸、甘草、薄荷；(8)红枸、甘草、荸荠；(9)甘草、薄荷、荸荠；(10)红枸、薄荷、荸荠；(11)石斛、红枸、甘草、薄荷；(12)石斛、甘草、薄荷、荸荠；(13)石斛、红枸、甘草、荸荠；(14)石斛、红枸、薄荷、荸荠；(15)红枸、甘草、薄荷、荸荠；(16)石斛、红枸、甘草、薄荷、荸荠。
试验例一 稳定性试验
将实施例九、十、十一制得的眼部专用护肤品，各取15g密封装好，分别置于烘箱(50±1℃)、室温(25±1℃)、冰箱(4±1℃)中45天，分别观察其外观状态是否有霉变、分层、沉淀的现象，以及眼部专用护肤品在皮肤上的吸收状态，结果如下表1所示。
表1稳定性试验结果
结果显示，在高温、常温、低温的环境下，实施例九在室温下明显分层，实施例十在高温下稍微分层，实施例十一无分层、无霉变、无沉淀的现象，性状稳定，并且在皮肤上的吸收状态良好，可以完全吸收。
试验例二 体外透皮试验
牛血清白蛋白标准曲线绘制：取牛血清标准品10mg于10mL超纯水中完全溶解，制得1mg/mL牛血清标品水溶液，再将其进行逐级稀释制得0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL、0.001mg/mL、0.1μg/mL，0.01μg/mL，0.001μg/ml标准品溶液。分别取上述各个浓度液体20μL，再分别加入100μL考马斯亮蓝G250染液于96孔板中，于595nm酶标仪测其吸光度。记录数据，绘制标准曲线。
取C57BL/6小鼠背部皮肤用硫化钠脱毛并除去皮下脂肪，用温的生理盐水洗净，剪成适当大小，用pH7.2的磷酸盐缓冲液(或生理盐水)洗净并浸泡30min后，用滤纸吸干表面水分，备用。采用Valia-Chien扩散池，将处理好的小鼠背部皮肤固定于供给室与接收室之间，角质层朝向供给室，供给液分别为实施例五和实施例六(胶原蛋白溶液和胶原蛋白脂质体分别为3mL，生理盐水为2mL)，胶原蛋白溶液和胶原蛋白脂质体浓度为5mg/mL，接收液为生理盐水，体积为5mL，有效透皮面积为0.95cm2。装置外接恒温水浴(33±0.1℃)，内置磁力搅拌子，转速为300r/min，试验过程中进行搅拌。每间隔1h接收室取出接收液200μL，并立即补充等体积的生理盐水。所取样品经0.45μm微孔滤膜过滤后，取上述接受液20μL加入100μL考马斯亮蓝G250染液，于595nm酶标仪测其吸光度。
胶原蛋白含量计算：将样品测定后的吸光度值带入至标准曲线线性方程中，即得其样品中胶原蛋白浓度，用考马斯亮蓝法检测渗透过的胶原蛋白浓度，结果如下表2所示。
表2不同时间点胶原蛋白脂质体透皮效率研究
通过表2可以看出胶原蛋白脂质体的透皮效果优于同等浓度胶原蛋白溶液。
试验例三 美白功效评价试验(酪氨酸酶活性抑制试验)
酪氨酸酶是黑色素合成途径中的限速酶，它主要通过影响酪氨酸转化成多巴，以及多巴氧化为多巴醌来影响黑色素的生成，通过抑制酪氨酸酶的活性来抑制黑色素的生成。因此，本发明通过测定实施例七对酪氨酸酶的抑制结果来评价其功效。
溶液的配置：
以常规配制方法制备pH6.8的磷酸盐缓冲液50mL；称取适量酪氨酸加水溶解，制备2mmol/L的酪氨酸溶液及浓度为500U/mL的酪氨酸酶溶液。
取96孔板，每孔加入pH 6.8的磷酸盐缓冲液100μL，上述酪氨酸溶液50μL，实施例七和对比例1各加入10μL。待混合均匀后，在冰浴中迅速加入酪氨酸酶溶液10μL，混匀，37℃孵育10min，于475nm处测定吸光度。
酪氨酸酶抑制率(％)＝[(A-B)-(C-D)]/[A-B]×100％
其中，A：未加实施例七的加酶混合液所测的吸光度；B：未加实施例七亦未加酶的混合液所测的吸光度；C：加实施例七和酶的混合液所测的吸光度；D：加实施例七而未加酶的混合液所测的吸光度，结果如下表3所示。
以上每个实验孔有3个复孔，即n＝3。
表3酪氨酸酶抑制率实验结果(n＝3)
由表3可以看出在0.2-0.6mg/mL浓度范围内，实施例七对酪氨酸酶活性的抑制有浓度依赖，并且随浓度的增加，实施例七的美白能力是不断增强的。
试验例四 抗氧化评价试验(DPPH自由基清除试验)
DPPH自由基是一种合成的、具有单电子、稳定的、以氮为中心的顺磁化合物。当自由基清除剂存在时，DPPH自由基接受一个电子或氢原子，形成稳定的DPPH-H化合物，使其甲醇(或乙醇)溶液从深紫色变为黄色，变色程度与其接受的电子数量(自由基清除活性)成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。因此，本发明通过测定实施例八对DPPH自由基清除结果来评价其功效。
溶液的配制：
称取4mg DPPH自由基粉末至100mL容量瓶中，用无水乙醇溶解，稀释定容，摇匀，得0.04mg/mL的DPPH溶液。
取96孔板，滴加100μLDPPH溶液，再分别加入100μL实施例八和对比例二，混合均匀，室温条件下避光反应20min，515nm测定紫外吸光度(B)，结果如表4所示。
对照组：0.2-1mg/mL的对比例二；实验组：10-50mg/mL的实施例八。
DPPH自由基清除率(％)＝(1-B/A)×100％
其中，A：空白吸光度；B：样品吸光度。
以上实验设置平行实验孔3个，即n＝3。
表4-1 DPPH自由基清除率实验结果
表4-2 DPPH自由基清除率实验结果
对比表4-1和4-2可以看出，实施例八的抗氧化活性具有浓度依赖性，与对比例二相比，实施例八抗氧化能力比较稳定、持久，更适宜添加进入护肤品中。
试验例五 明目功效评价试验
用脂多糖(1μg/mL)，双氧水(1mmol/L和20μmol/L)和蓝光(照射时间为35min)刺激BV2小胶质细胞，通过MTT法检测细胞的存活率，来检测实施例一和实施例二对BV2小胶质细胞的保护效果。
MTT法：检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在492nm、630nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
取96孔板，每孔加90μL细胞液，细胞密度为5×104个/mL，37℃，5％CO2孵育24h；每孔加实施例一和实施例二各10μL(1:10)预保护，1h后采用不同方式进行刺激(脂多糖、双氧水和蓝光照射)；2h后加每孔20μL MTT溶液，继续培4h；终止培养，加入盐酸异丙醇100μL溶解甲瓒，孵育10min；在酶联免疫检测仪上492nm、630nm波长处测得各孔的光密度值(OD值)；计算细胞存活率，结果如表5所示。
细胞存活率＝{(OD值-空白组OD值[均值])/(空白培养基组OD值-空白组OD}×100％
表5-1a脂多糖(1μg/mL)刺激BV2细胞存活率实验结果(实施例一)
浓度(mg/mL)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
空白对照
-0.51
0.03
0.48
1.678
2.14
实施例一+脂多糖
82.99
84.73
99.29
106.35
114.50
实施例一+脂多糖
82.08
80.52
107.44
113.95
96.92
实施例一+脂多糖
78.32
84.18
95.45
102.59
93.99
实施例一+脂多糖
75.85
88.94
104.05
112.48
100.95
实施例一+脂多糖
86.75
90.59
98.56
97.74
108.91
实施例一+脂多糖
90.96
87.66
106.25
120.54
114.77
+脂多糖
70.90
86.47
66.69
67.52
62.58
+完全培养基
103.32
94.62
109.64
127.14
96.46
从表5-1a中可以看出，在实施例一为0.8mg/mL时(如附图6)，细胞存活率最高，与脂多糖组(如附图8)对比，加药后也可以有效保护细胞并且维持正常增殖(此浓度下对细胞也不产生毒性，为最适宜决明子溶液浓度)。
表5-1b脂多糖(1μg/mL)刺激BV2细胞存活率实验结果(实施例二)
浓度(mg/mL)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
空白对照
-1.25
1.59
1.31
-1.01
-0.06
实施例二+脂多糖
126.22
130.98
132.26
134.19
122.56
实施例二+脂多糖
126.40
118.99
125.03
128.51
127.69
实施例二+脂多糖
118.62
118.62
128.69
120.18
121.28
实施例二+脂多糖
131.99
119.26
127.23
122.47
130.34
实施例二+脂多糖
118.25
127.32
142.16
131.17
126.04
实施例二+脂多糖
130.98
132.26
131.44
133.18
130.43
+脂多糖
70.91
86.48
66.70
67.52
62.58
+完全培养基
103.33
94.63
109.65
127.14
96.46
从表5-1b中可以看出，在实施例二浓度为0.6mg/mL时(如附图7)，细胞存活率最高，与脂多糖组(如附图8)对比，加药后可以有效保护细胞并且维持细胞增殖(此浓度下对细胞也不产生毒性，为最适宜决明子脂质体浓度)。
表5-2a双氧水(20μmol/L)刺激BV2细胞存活率实验结果(实施例一)
浓度(mg/mL)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
空白对照
1.26
2.16
4.84
-0.53
0.76
实施例一+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
26.33
24.14
28.51
33.29
41.45
实施例一+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
20.66
19.86
21.15
19.86
26.82
实施例一+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
19.16
21.35
26.33
27.52
31.60
实施例一+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
17.57
22.75
26.53
27.82
33.19
实施例一+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
22.05
22.05
27.02
26.82
33.29
实施例一+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
23.74
23.84
27.82
28.51
34.08
+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
18.67
15.68
12.40
13.79
15.38
+完全培养基
93.37
104.41
109.78
102.42
102.12
从表5-2a中可以看出，在实施例一为1.0mg/mL时，细胞存活率最高，与H2O2组(如附图10)对比，加药后对细胞具有一定的保护效果。
表5-2b双氧水(20μmol/L)刺激BV2细胞存活率实验结果(实施例二)
浓度(mg/mL)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
空白对照
1.36
-1.82
-1.13
-2.42
0.96
实施例二+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
51.39
39.95
29.31
23.14
9.91
实施例二+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
53.58
37.47
31.20
21.35
13.89
实施例二+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
55.87
38.36
25.73
19.86
13.99
实施例二+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
70.49
53.38
35.08
23.24
12.30
实施例二+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
63.53
54.38
35.68
23.14
16.98
实施例二+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
65.02
45.42
40.15
32.00
22.25
+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
18.67
15.68
12.40
13.79
15.39
+完全培养基
93.37
104.41
109.78
102.42
102.12
从表5-2b中可以看出，在实施例二为1.0mg/mL时，细胞存活率最高，与H2O2组(如附图10)对比，加药后对细胞具有一定的保护效果。
表5-2c双氧水(1mmol/L)刺激BV2细胞存活率实验结果(实施例一)
浓度(mg/mL)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
空白对照
-1.51
-0.60
0.41
-0.28
-0.82
实施例一+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
7.66
8.41
10.76
14.22
16.73
实施例一+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
7.18
7.88
10.92
13.96
17.53
实施例一+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
6.65
8.20
11.45
12.78
15.50
实施例一+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
6.17
7.77
10.49
15.50
16.78
实施例一+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
7.40
8.36
10.22
13.58
16.09
空白脂质体+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
15.77
14.70
15.18
15.24
13.16
+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
5.42
4.73
3.82
3.61
3.50
+完全培养基
103.61
106.17
99.66
109.26
100.78
从表5-2c中可以看出，在实施例一为1.0mg/mL时，细胞存活率最高，与H2O2组(如附图10)对比，加药后对细胞具有一定的保护效果。
表5-2d双氧水(1mmol/L)刺激BV2细胞存活率实验结果(实施例二)
浓度(mg/mL)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
空白对照
2.33
-0.66
1.37
0.52
0.62
实施例二+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
37.16
30.70
21.21
15.18
7.82
实施例二+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
36.04
29.85
22.33
14.65
8.36
实施例二+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
35.24
31.29
21.26
12.62
6.49
实施例二+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
36.66
30.92
22.12
15.34
7.93
实施例二+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
33.90
31.56
23.66
13.42
7.82
空白脂质体+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
14.86
12.73
13.16
13.26
12.62
+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
5.42
4.73
3.82
3.61
3.50
+完全培养基
103.61
106.17
99.66
109.26
100.78
从表5-2d中可以看出，在实施例二为1.0mg/mL时，细胞存活率最高，与H2O2组(如附图10)对比，加药后对细胞具有一定的保护效果。
表5-3a蓝光激BV2细胞存活率实验结果(实施例一)
浓度(mg/mL)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
空白对照
-1.34
-0.19
-0.41
0.10
0.38
实施例一+蓝光
11.58
14.81
19.26
24.29
28.81
实施例一+蓝光
11.72
15.46
18.54
24.29
29.53
实施例一+蓝光
15.74
17.90
18.76
23.50
28.30
实施例一+蓝光
11.01
15.10
17.54
22.85
26.94
实施例一+蓝光
10.36
14.31
16.75
18.90
25.51
实施例一+蓝光
10.79
15.46
18.11
24.21
28.52
照射蓝光
31.46
36.34
38.71
39.93
42.16
+完全培养基
100.08
101.88
92.26
110.49
113.00
从表5-3a中可以看出，在实施例一为1.0mg/mL时，细胞存活率最高，与照射蓝光组(如附图13)对比，加药后对细胞具有一定的保护效果。
表5-3b蓝光刺激BV2细胞存活率实验结果(实施例二)
从表5-3b中可以看出，在实施例二为1.0mg/mL时，细胞存活率最高，与照射蓝光组(如附图13)对比，加药后对细胞具有一定的保护效果。
综上所述，实施例二比实施例一具有更好的保护效果，不仅可以维持BV2细胞正常增值，还可以保持细胞的正常活性。
而后又进行了实施例四的明目效果的测评，依旧采用MTT法(蓝光照射15min)检测，结果如表6所示。
表6蓝光刺激BV2细胞存活率实验结果(实施例四)
1
2
3
平均值
空白培养基
0.92
0.31
0.68
0.64
照射蓝光组
64.10
64.69
64.34
64.37
决明子
30.46
30.87
31.75
31.02
金银花
44.64
49.10
46.63
46.79
荸荠
75.18
70.02
70.49
71.90
木贼
14.81
11.94
13.46
13.40
秦皮
63.51
56.48
63.87
61.29
密蒙花
70.55
73.30
67.73
70.53
夏枯草
61.99
62.69
57.65
60.78
胶原蛋白脂质体
44.94
47.69
44.64
45.76
维生素C
89.07
86.57
88.83
88.16
决明子脂质体
24.36
38.66
41.36
34.80
甘草
78.75
75.18
78.17
77.37
谷精草
13.23
14.57
13.87
13.89
红枸杞
78.40
75.59
79.05
77.68
女贞子
51.79
56.19
57.07
55.02
薄荷
76.76
69.43
77.23
74.47
石斛
76.35
81.74
80.98
79.69
透明质酸
140.06
111.99
117.85
123.30
没食子酸
80.41
76.28
74.96
77.22
从表6可以看出，中药提取物对于蓝光刺激BV2细胞的保护作用效果(从大到小)：
石斛＞红枸杞＞甘草＞薄荷＞荸荠
根据上述结果选取5种效果最好的中药提取物，配置出实施例十二，与实施例三比较，利用MTT法(蓝光照射15min)检测，结果如表7所示。
表7蓝光刺激BV2细胞存活率实验结果(实施例十二与实施例三)
从表7可以看出，实施例三的抗蓝光效果优于实施例十二，由此可以得出结论，本发明所采用的实施例三脂质体是最优的。
试验例六产品感官及效果测试
以实施例十一为实验组，市售两款普通眼霜作为对照组。选择志愿者(25-55岁)男性、女性各15人，随机平均分为3组，每天清洁皮肤后将实验组和对照组涂于面部，15天后观察效果。根据皮肤状态变化分别对不同项目进行打分(0-100分)，结果如下表8所示。
表8不同项目评分结果
实施例十一
对照组一
对照组二
渗透性
85.67±3.06
81.83±1.61
87.67±2.52
保湿性
95.17±2.36
87.17±2.84
83.67±2.08
清爽性
96.33±1.53
81.00±2.65
89.33±3.06
皱纹变化
90.67±3.21
81.33±1.53
89.67±1.53
肤色变化
87.67±3.06
90.67±3.06
82.67±2.52
水肿变化
93.17±1.26
85.83±1.76
82.33±3.51
眼疲劳改善
92.17±0.76
无
无
综合以上结果发现，本发明制得的决明子复方胶原脂质体(实施例十一)各项效果最优，特别具有其他眼霜产品不具有的缓解视疲劳功能。
如上即为本发明的实施例，上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表明发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围。本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
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