阅读说明：本技术 一种通过免疫荧光检测药物对胰岛细胞摄脂影响的方法 (Method for detecting influence of drug on pancreatic islet cell lipid uptake through immunofluorescence ) 是由 余琦 张云婷 卫梦倩 于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种通过免疫荧光检测药物对胰岛细胞摄脂影响的方法,按照以下步骤具体实施：先将胰岛细胞培养长至3×10<Sup>6</Sup>～5×10<Sup>6</Sup>个,将胰岛细胞进行传代培养,传代培养后吸取一定量的细胞悬液,接种至共聚焦小皿,待细胞贴壁后进行饥饿处理,再用药物单剂量干预细胞；再采用Dil-LDL孵育干预后的细胞,使用PBS清洗三次、使用多聚甲醛固定,弃去液体,用去离子进行水洗；水洗后使用DAPI染色,染色后弃去液体,用去离子水洗,水洗后对细胞进行干燥处理,并在荧光显微镜下观察细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇的情况。本发明的实验过程采样均匀,结果可信度高。(The invention discloses a method for detecting the influence of a medicament on the lipid uptake of islet cells through immunofluorescence, which is specifically implemented according to the following steps: firstly, islet cells are cultured to grow to 3 × 10 6 ～5×10 6 Secondly, subculturing the islet cells, sucking a certain amount of cell suspension after subculturing, inoculating the islet cells to a confocal dish, performing starvation treatment after the cells adhere to the wall, and interfering the cells with single dose of the medicine; then incubating the cells for stem prognosis by using Dil-LDL, washing the cells for three times by using PBS, fixing the cells by using paraformaldehyde, discarding liquid, and washing the cells by using deionized water; washing with water, staining with DAPI, removing liquid after staining, washing with deionized water, drying the cells after washing, and observing the condition of low density lipoprotein cholesterol uptake of the cells under a fluorescence microscope. The experimental process of the invention has uniform sampling and high result reliability.)

一种通过免疫荧光检测药物对胰岛细胞摄脂影响的方法

技术领域

本发明属于基础医学科研设备技术领域，具体涉及一种通过免疫荧光检测药物对胰岛细胞摄脂影响的方法。

背景技术

血脂水平异常是引发糖尿病非常重要的因素之一。其中，低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)内流和胞内胆固醇蓄积是引起胰岛细胞功能紊乱的潜在危险因素。胰岛细胞功能受损会导致胰岛素分泌出现问题，绝对或相对不足时，会引起血糖上升甚至引发糖尿病。本发明是通过免疫荧光检测胰岛细胞摄入低密度脂蛋白的量，从而检测药物对胰岛细胞摄脂的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过免疫荧光检测药物对胰岛细胞摄脂影响的方法，通过此方法可以检测胰岛细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇的情况。

本发明所采用的技术方案是，一种通过免疫荧光检测药物对胰岛细胞摄脂影响的方法，具体包括以下步骤：

步骤1、将胰岛细胞培养长至3×10⁶～5×10⁶个，将胰岛细胞进行传代培养，传代培养后吸取一定量的细胞悬液，接种至共聚焦小皿，待细胞贴壁后进行饥饿处理，再用他汀类药物单剂量干预细胞；

步骤2、采用Dil-LDL孵育步骤1得到的细胞，再使用PBS清洗三次，再使用多聚甲醛固定，弃去液体，再用去离子进行水洗；

步骤3、使用DAPI对步骤2水洗后的细胞进行染色，染色后弃去液体，用去离子水洗3次，每次3min；

步骤4、将步骤3得到的细胞进行干燥处理；

步骤5、在荧光显微镜下观察步骤4得到的细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇的情况。

本发明的特点还在于，

步骤1中传代培养为一传四，接种至共聚焦小皿中细胞悬液的体积为500μL，饥饿处理时间为12h，干预细胞时间为48h。

步骤1中胰岛细胞为胰岛β细胞株MIN6细胞。

步骤2中Dil-LDL孵育细胞的时间为4～6h，多聚甲醛的浓度为4％，多聚甲醛固定细胞的体积为1～2mL，多聚甲醛固定细胞的时间为20～30min，去离子水水洗3～5次，每次5s。

步骤3中DAPI染色的体积为1～2mL，DAPI染色的时间为5min。

步骤4中干燥温度为40～80℃，干燥时间为2～5min。

步骤5中进行荧光检测时，在共聚焦小皿盖子上划分九宫格区域进行荧光拍照。

步骤5中荧光检测的倍数为20倍镜，感光度为ISO800。

本发明的有益效果是：本发明通过免疫荧光检测判断胰岛细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇的变化，可以得出结论：胰岛细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇增多，免疫荧光强度明显增大，并且本发明的实验过程采样均匀，结果可信度高。本发明的方法为检测胰岛功能提供了一种新的方法，在辅助科研实验及检验医学等方面具有很大的应用前景。

附图说明

图1为本发明通过显微镜检测拍照时的示意图；

图2为本发明实施例1的荧光检测的结果示意图；

图3为本发明实施例2的荧光检测的结果示意图；

图4为本发明实施例3的荧光检测的结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明一种通过免疫荧光检测药物对胰岛细胞摄脂影响的方法，具体包括以下步骤：

步骤1、将胰岛细胞在T25瓶培养长至3×10⁶～5×10⁶个，将胰岛细胞进行传代，一传四培养后吸取500μL细胞悬液，接种至共聚焦小皿，待接种后的细胞贴壁后，饥饿处理12h，将他汀类药物单剂量干预细胞48h。

上述胰岛细胞为胰岛β细胞株MIN6细胞。

步骤2、用荧光标记的低密度脂蛋白(Dil-LDL)孵育步骤1得到的细胞4～6h，再使用无菌磷酸生理缓冲液(PBS)清洗三次，再使用1～2mL4％的多聚甲醛固定1～2min，弃去液体，用去离子水洗三次，每次5秒。

步骤3、使用1～3mL的DAPI对步骤2得到的细胞进行染色，染色后弃去液体，用去离子水洗3次，每次3min。

步骤4、将步骤3得到的细胞在60℃干燥2～5min。

步骤5、在荧光显微镜下观察步骤4得到的细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇的情况。

具体操作过程为：关闭荧光通道，打开荧光激发器电源，预热15min，将步骤4得到的细胞置入，预热期间打开显微镜光源，找到需要观察的细胞，选用合适的物镜并调整焦距，待预热结束，关闭显微镜光源，打开荧光通道，在20倍镜、ISO800的条件下，绿光激发红光检测低密度脂蛋白，手动调整曝光时间检测时，用细笔轻轻划线分为9宫格，如图1所示，每格照一张，面积大的部分可酌情多照一张。

实施例1阿托伐他汀对小鼠β细胞株MIN6细胞摄脂的影响

步骤1、胰岛β细胞株MIN6细胞在T25瓶培养长至3×10⁶～5×10⁶个，将细胞进行一传四培养，培养后吸取500μL细胞悬液，接种至共聚焦小皿。待接种后的细胞贴壁后，饥饿12h，将阿托伐他汀单剂量干预细胞48h。

步骤2、用Dil-LDL孵育细胞6h，用PBS缓冲液洗三次，1mL的4％多聚甲醛固定20min，去离子水洗三次，每次5s。

步骤3、用1mL DAPI染色5min，去离子水洗3次，每次3min。

步骤4、将步骤3得到的细胞在60℃干燥2min。

步骤5、在荧光显微镜下观察细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇的情况。

荧光检测的具体步骤为：

步骤a、关闭荧光通道，打开荧光激发器电源，预热15mn。

步骤b、将步骤4得到的细胞置入，预热期间打开显微镜光源，找到需要观察的细胞，选用合适的物镜并调整焦距。

步骤c、待预热结束，关闭显微镜光源，打开荧光通道，在20倍镜、ISO800的条件下，绿光可以激发出红光检测步骤b中细胞的低密度脂蛋白，DAPI蓝光曝光时间为3.5～5.5ms；低密度脂蛋白红光曝光时间150ms～220ms，得到的结果如图2所示，第一张图为对照组，第二张和第三张为分别用20ng/mL，40ng/mL的阿托伐他汀培养过的实验组，由图2可知，对照组与实验组相比较，灰度明显增强，说明阿托伐他汀培养后的细胞中，摄入低密度脂蛋白明显增多，由此可以证明阿托伐他汀使MIN6细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇增多。

实施例2辛伐他汀对小鼠β细胞株MIN6细胞摄脂的影响

步骤1、胰岛β细胞株MIN6细胞在T25瓶培养长至3×10⁶～5×10⁶个，将细胞进行传代，一传四，吸取500μL细胞悬液，接种至共聚焦小皿，待接种后的细胞贴壁后，饥饿12h，将辛伐他汀单剂量干预细胞48h。

步骤2、Dil-LDL孵育步骤1得到的细胞6h，用PBS缓冲液洗三次，2mL 4％多聚甲醛固定20min，去离子水洗三次，每次5s。

步骤3、用2mL DAPI染色5min，去离子水洗3次，每次3min。

步骤4、将步骤3得到的细胞在60℃干燥2min。

步骤5、荧光显微镜下观察细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇的情况。

荧光检测的具体步骤为：

步骤a、关闭荧光通道，打开荧光激发器电源，预热15mn。

步骤b、将步骤4得到的细胞置入，预热期间打开显微镜光源，找到需要观察的细胞，选用合适的物镜并调整焦距。

步骤c、待预热结束，关闭显微镜光源，打开荧光通道，在20倍镜、ISO800的条件下，绿光可以激发出红光检测步骤b中细胞的低密度脂蛋白，DAPI蓝光曝光时间为3.5～5.5ms；红光曝光时间为150～220ms，得到的结果如图3所示，第一张图为对照组，第二张和第三张为分别用20ng/mL，40ng/mL的辛伐他汀培养过的实验组，由图3可知，对照组与实验组相比较，灰度明显增强，说明辛伐他汀培养后的细胞中，摄入低密度脂蛋白明显增多，由此可以证明辛伐他汀使MIN6细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇增多。

实施例3：双酚A对小鼠β细胞株MIN6细胞摄脂的影响

步骤1、胰岛β细胞株MIN6细胞在T25瓶培养长至3×10⁶～5×10⁶个，将细胞进行传代，一传四，吸取500μL细胞悬液，接种至共聚焦小皿，待接种后的细胞贴壁后，饥饿12h，将双酚A单剂量干预细胞48h。

步骤2、Dil-LDL干预步骤1得到的细胞6h，用PBS缓冲液洗三次，2mL 4％多聚甲醛固定20min，去离子水洗三次，每次5s。

步骤3、用2mL DAPI染色5min，去离子水洗3次，每次3min。

步骤4、将步骤3得到的细胞在60℃干燥2min。

步骤5、荧光显微镜下观察细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇的情况。

荧光检测的具体步骤为：

步骤a、关闭荧光通道，打开荧光激发器电源，预热15mn。

步骤b、将步骤4得到的细胞置入，预热期间打开显微镜光源，找到需要观察的细胞，选用合适的物镜并调整焦距。

步骤c、待预热结束，关闭显微镜光源，打开荧光通道，在20倍镜、ISO800的条件下，绿光可以激发出红光检测步骤b中细胞的低密度脂蛋白，DAPI蓝光曝光时间为3.5～5.5ms；红光曝光时间为150～220ms，得到的结果如图4所示，第一张图为对照组，第二张为用5×10^-8M双酚A培养过的实验组，由图4可知，对照组与实验组相比较，灰度明显增强，说明双酚A培养后的细胞中，摄入低密度脂蛋白明显增多，由此可以证明双酚A使MIN6细胞摄入低密度脂蛋白胆固醇增多。