用于促进半月板修复的功能化支架
阅读说明：本技术 用于促进半月板修复的功能化支架 (Functional scaffold for promoting meniscus repair ) 是由 马丁·洛茨 李光一 于 2018-03-16 设计创作，主要内容包括：本文公开了包含脱细胞半月板组织的支架,其中所述支架与肝素和生长因子共价缀合。本文还提供了在有需要的对象中修复和/或治疗组织损伤的方法,其包括：提供包含脱细胞半月板组织的支架；和通过将支架植入撕裂处中来修复和/或治疗组织损伤,其中支架与肝素和生长因子共价缀合。(Disclosed herein are scaffolds comprising decellularized meniscal tissue, wherein the scaffolds are covalently conjugated to heparin and a growth factor. Also provided herein are methods of repairing and/or treating tissue damage in a subject in need thereof, comprising: providing a scaffold comprising decellularized meniscal tissue; and repairing and/or treating the tissue damage by implanting a scaffold into the tear, wherein the scaffold is covalently conjugated to heparin and a growth factor.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月17日提交的美国临时专利申请第62/472917号的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明在美国国立卫生研究院(NIH)授予的授权号AG007996的政府支持下完成。政府拥有本发明的一定权利。
技术领域
本公开涉及支架以及使用该支架进行组织修复和/或再生的方法。
背景技术
本文中的所有出版物均以引用方式并入，其程度如同具体和单独地指出每个单独的出版物或专利申请通过引用而并入。以下描述包括可用于理解本发明的信息。不承认本文提供的任何信息为现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者具体或暗含地引用的任何出版物是现有技术。
半月板撕裂是最常见的膝损伤之一。由于膝关节强力扭曲、旋转或过度弯曲而发生撕裂。半月板撕裂会导致膝疼痛、肿胀、僵硬以及膝伸展受限。半月板撕裂，尤其是发生在内侧三分之一处的最普遍形式，通常不会自发愈合，并且是发生膝骨关节炎(OA)的主要风险因素。因此，半月板修复策略对于预防与OA相关的残疾和疼痛至关重要。
尽管目前存在针对半月板损伤的几种治疗方法，但是这些治疗选择并不会使半月板修复或再生。大多数半月板损伤通过半月板部分切除术来治疗。虽然患者可能短期内对此疗法反应良好，但他们往往在术后数年发展为OA。去除的组织的量与软骨变性的程度和速度有关。当大部分半月板组织受到损伤的影响时，将进行半月板全切除术。如果患者在半月板全切除术后感到疼痛同时没有出现明显的关节变性，则可以采用半月板同种异体移植物进行二次治疗。但是，同种异体移植物的使用受到组织可获得性和有限的适应症的限制。
半月板修复和再生由来源于邻近的滑膜和关节囊的成纤维细胞的迁移和增殖所介导。这些细胞产生纤维血管瘢痕组织，该纤维血管瘢痕组织在适当的环境条件下，例如氧浓度和静水压力下，经历纤维软骨化生的过程，从而导致纤维组织转变成纤维软骨。成纤维细胞不会重新合成纤维软骨组织。因此，需要外部环境刺激来将纤维***转变成纤维软骨。因此，仍然需要能够促进半月板组织再生的新型组织修复装置、以及使用这种组织修复装置的方法。
发明内容
本文公开的各种实施方案包括支架，该支架包含：脱细胞半月板组织，其中支架与肝素和生长因子共价缀合。在一个实施方案中，生长因子选自PDGF(血小板衍生生长因子)、TGFβ(转化生长因子β)、VEGF(血管内皮生长因子)、CTGF(***生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、以及其他趋化因子例如CCL20、CXCL3、CXCL6、CCL3、CCL3L1。在一个实施方案中，生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)。在一个实施方案中，PDGF是PDGF-AA、PDGF-BB和/或PDGF-AB。在一个实施方案中，该支架还包含干细胞。在一个实施方案中，该支架还包含半月板细胞。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织包含胶原纤维，并且其中胶原纤维的取向与半月板缺陷的取向匹配。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织包含孔。在一个实施方案中，通过胶原酶消化、机械穿刺和/或施加激光在脱细胞半月板组织中形成孔。在一个实施方案中，支架在施用后至少10天的时间内以基本上一级的动力学释放生长因子。在一个实施方案中，支架在施用后至少20天的时间内以基本上一级的动力学释放生长因子。在一个实施方案中，支架在施用后至少30天的时间内以基本上一级的动力学释放生长因子。在一个实施方案中，支架的拉伸强度是类似的但没有与肝素和生长因子共价缀合的脱细胞半月板组织的拉伸强度的至少两倍。在一个实施方案中，支架的拉伸强度是类似的但没有与肝素和生长因子共价缀合的脱细胞半月板组织的拉伸强度的至少三倍。在一个实施方案中，支架的拉伸模量大于0.6杨氏模量(MPa)。在一个实施方案中，生长因子为10ng/mL支架至1mg/mL支架。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织基本上为片状。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织具有三维形式。在一个实施方案中，支架为医用敷料形式。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织来源于哺乳动物。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织来源于人。在一个实施方案中，支架处于无菌条件下并包装在无菌容器中。
本文公开的各种实施方案还包括修复和/或治疗有需要的对象中的组织损伤的方法，其包括：提供包含脱细胞半月板组织的支架；和通过将支架植入到撕裂处来修复和/或治疗组织损伤，其中支架与肝素和生长因子共价缀合。在一个实施方案中，组织损伤是组织中的撕裂。在一个实施方案中，组织是半月板组织。在一个实施方案中，生长因子选自PDGF(血小板衍生生长因子)、TGFβ(转化生长因子β)、VEGF(血管内皮生长因子)、CTGF(***生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、以及其他趋化因子例如CCL20、CXCL3、CXCL6、CCL3、CCL3L1。在一个实施方案中，生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)。在一个实施方案中，PDGF是PDGF-AA、PDGF-BB和/或PDGF-AB。在一个实施方案中，支架募集新的细胞群以引发半月板组织的无血管区域或血管区域中的修复。在一个实施方案中，优化支架以实现从宿主细胞到支架的有效细胞浸润和迁移。在一个实施方案中，通过关节镜手术将脱细胞支架植入到半月板撕裂处。在一个实施方案中，支架在施用后至少10天的时间内以基本上一级的动力学释放生长因子。在一个实施方案中，支架在施用后至少20天的时间内以基本上一级的动力学释放生长因子。在一个实施方案中，支架在施用后至少30天的时间内以基本上一级的动力学释放生长因子。在一个实施方案中，支架的拉伸强度是类似的但没有与肝素和PDGF共价缀合的脱细胞半月板组织的拉伸强度的至少两倍。在一个实施方案中，支架的拉伸强度是类似的但没有与肝素和PDGF共价缀合的脱细胞半月板组织的拉伸强度的至少三倍。在一个实施方案中，支架的拉伸模量大于0.6杨氏模量(MPa)。在一个实施方案中，PDGF为10ng/ml/mL支架至1mg/mL支架。在一个实施方案中，修复和/或治疗组织中的撕裂的方法还包括第二治疗方案。在一个实施方案中，第二治疗方案包括非手术治疗，例如休息、冰疗、加压、抬高和/或物理治疗。在一个实施方案中，第二治疗方案包括外科手术治疗，例如外科手术修复、半月板部分切除术和/或半月板全切除术。在一个实施方案中，对象是哺乳动物。在一个实施方案中，对象是人。在一个实施方案中，对象是马。
本公开的其他实施方案包括试剂盒，其包括：无菌容器，该无菌容器包含与肝素和生长因子共价缀合的支架；和使用试剂盒的说明。在一个实施方案中，生长因子选自PDGF(血小板衍生生长因子)、TGFβ(转化生长因子β)、VEGF(血管内皮生长因子)、CTGF(***生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、以及其他趋化因子例如CCL20、CXCL3、CXCL6、CCL3、CCL3L1。在一个实施方案中，生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)。在一个实施方案中，PDGF是PDGF-AA、PDGF-BB和/或PDGF-AB。在一个实施方案中，试剂盒还包括用于将支架递送至损伤的半月板的工具。在一个实施方案中，递送工具是医用胶、医用缝合线、医用钉和/或医用锚。在一个实施方案中，支架是生物脱细胞支架。在一个实施方案中，支架得自脱细胞的天然半月板组织。在一个实施方案中，脱细胞支架募集新的细胞群以引发无血管区域或血管区域中的修复。在一个实施方案中，肝素缀合使得能够缓慢释放生长因子。在一个实施方案中，缓慢释放持续最长30天的时间。
本公开的实施方案还包括一种装置，该装置包括：与肝素和生长因子共价缀合的脱细胞支架，其中该装置用于修复组织。在一个实施方案中，生长因子选自PDGF(血小板衍生生长因子)、TGFβ(转化生长因子β)、VEGF(血管内皮生长因子)、CTGF(***生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、以及其他趋化因子例如CCL20、CXCL3、CXCL6、CCL3、CCL3L1。在一个实施方案中，生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)。在一个实施方案中，脱细胞支架是生物脱细胞支架。在一个实施方案中，脱细胞支架得自脱细胞天然半月板组织。在一个实施方案中，脱细胞支架具有与天然半月板相似的生物学和机械特性。在一个实施方案中，生长因子募集新的细胞群以引发无血管区域中的修复。在一个实施方案中，优化脱细胞支架以实现从宿主细胞到支架的有效细胞浸润和迁移。在一个实施方案中，装置使得能够缓慢释放生长因子。在一个实施方案中，缓慢释放持续最长30天的时间。
本公开的实施方案还包括诱导细胞迁移的方法，其包括：提供脱细胞半月板支架以固定一种或多于一种生长因子；和诱导细胞迁移至脱细胞半月板支架。在一个实施方案中，一种或多于一种生长因子是PDGF。在一个实施方案中，将肝素用于固定。在一个实施方案中，将脱细胞半月板支架直接植入到对象。在一个实施方案中，对象是哺乳动物。在一个实施方案中，对象是人。
通过以下结合附图的详细描述，本发明的其他特征和优点将变得显而易见，附图通过举例的方式示出了本发明的各种实施方案。
附图说明
示例性实施方案在参考图中示出。本文公开的实施方案和附图旨在被认为是说明性的而非限制性的。
图1根据本文的实施方案描述了在半月板撕裂愈合期间用于纤维软骨形成分化的方法。
图2根据本文的实施方案描述了通过细胞募集实现的整合性愈合的新技术。
图3根据本文的实施方案描述了来自牛半月板的脱细胞半月板支架(DMS)。
图4根据本文的实施方案描述了在肝素缀合的DMS上的PDGF-BB固定的示意图。
图5根据本文的实施方案描述了牛半月板的脱细胞和PDGF缀合。(A)脱细胞半月板块的图像；(B)DNA含量；(C)甲苯胺蓝染色的DMS的图像；(D)甲苯胺蓝含量的定量。
图6根据本文的实施方案描述了PDGF-BB从DMS释放的动力学。将PDGF-BB与DMS或经肝素涂覆的DMS缀合，并将DMS在37℃下培养长达16天。将每种类型的DMS与100ng PDGF-BB缀合。在指定的时间点收集上清液，并通过ELISA分析PDGF-BB。结果来自3个独立的实验。
图7根据本文的实施方案描述了半月板样品的抗PDGFRβ免疫组织化学。(A)和(B)人的半月板；(C)和(D)离体培养2周后的***牛半月板外植体中的DMS，将DMS与肝素和50ng/ml PDGF-BB缀合；(E)来自(C)和(D)的抗PDGFRβ阳性细胞(％)。
图8根据本文的实施方案描述了对比DAPI图像，其中(A)天然牛半月板；(B)***半月板外植体中的DMS；(C)***半月板外植体中的经PDGF涂覆的DMS。培养2周后的***牛外植体中的经PDGF-BB(50ng/ml)涂覆的DMS的染色图像；(D)DAPI；(E)番红O；(F)天狼猩红。黑色箭头表示新产生的ECM。
图9根据本文的实施方案描述了培养2周后与肝素和PDGF-BB(200ng/ml)缀合的DMS。(A)DAPI染色；(B)番红O染色；(C)天狼猩红染色的偏振光视图。
图10根据本文的实施方案描述了在2周和4周离体培养后的拉伸试验。
图11根据本文的实施方案描述了通过肝素缀合进行的生长因子固定。
图12根据本文的实施方案描述了离体模型。
图13根据本文的实施方案描述了离体培养后的机械试验。
图14根据本文的实施方案描述了在人半月板和牛半月板中的抗PDGFRβ(2周)。
图15根据本文的实施方案描述了与***的DMS一起培养的损伤半月板外植体中的细胞迁移。培养2周的外植体DAPI染色的切片(每组n＝3至6，40x)。(a.)天然未损伤的半月板；(b.)未与DMS一起培养的损伤的半月板；(c.)与DMS一起培养的损伤的半月板；(d.)与PDGF-DMS一起培养的损伤的半月板；(e.)迁移细胞数的图。数据代表来自3个独立实验的6个至8个值的平均值。
图16根据本文的实施方案描述了番红O和天狼猩红染色分析(2周和4周)。
图17根据本文的实施方案描述了与DMS一起培养的损伤的半月板外植体的机械性能。向损伤的外植体中***DMS或PDGF缀合的DMS，并培养2周和4周。通过拉至失效来测量拉伸性能。数据代表来自3个独立实验的7个至10个值的平均值。
图18根据本文的实施方案描述了DMS或PDGF缀合的DMS的离体培养。(A)DAPI染色和(B)定量分析，(C)抗PDGFRβIHC和(D)定量分析，(E)2周后的组织学图像，(F)2周和4周后的拉伸试验。
图19根据本文的实施方案描述了PDGF-HEP-DMS的制备：DMS由脱细胞的牛半月板制成。在0.1(重量/体积)％肝素与DMS缀合后，将PDGF与肝素缀合的DMS结合。
图20根据本文的实施方案描述了抗PDGFRβ阳性细胞的定量分析：阳性细胞占牛半月板外植体内总细胞数的百分比。离体培养2周后，***DMS的牛半月板外植体(A)；***50ng/ml经PDGF-BB涂覆的DMS的牛半月板外植体(B)；***100ng/ml经PDGF-BB涂覆的DMS的牛半月板外植体(C)；***200ng/ml经PDGF-BB涂覆的DMS的牛半月板外植体(D)。
图21根据本文的实施方案描述了在离体培养2周后，***DMS的牛半月板外植体的番红O和天狼猩红染色：***50ng/ml经PDGF-BB涂覆的DMS的外植体(A，B)；***100ng/ml经PDGF-BB涂覆的DMS的外植体(C，D)；***200ng/ml经PDGF-BB涂覆的DMS的外植体。
图22根据本文的实施方案描述了离体培养2周后，***DMS和经PDGF涂覆的DMS的牛半月板外植体的免疫组织化学：抗-聚集蛋白聚糖(A)；抗1a1型胶原蛋白(B)；抗MKX(C)；抗2a1型胶原蛋白(D)。
图23根据本文的实施方案描述了损伤的半月板外植体中的PDGFRβ阳性细胞。培养2周的外植体的抗PDGFRβ染色切片(每组n＝3至6，40x)。(a.)天然未损伤的半月板；(b.)未与DMS一起培养的损伤的半月板；(c.)与DMS一起培养的损伤的半月板；(d.)与PDGF-DMS一起培养的损伤的半月板；(e.)迁移细胞数的图。数据代表来自3个独立实验的6个至8个值的平均值。
图24根据本文的实施方案描述了在损伤的半月板外植体中的ECM形成。(a-b.)番红O染色：2周和4周的天然无损伤的半月板；(c-d.)番红O染色：2周和4周的无DMS的损伤的半月板；(e-f.)番红O染色：与DMS一起培养2周和4周的损伤的半月板；(g-h.)番红O染色：与PDGF-DMS一起培养2周和4周的损伤的半月板；(i-j.)天狼猩红染色：与DMS一起培养2周和4周的损伤的半月板；(k-l.)天狼猩红染色：与PDGF-DMS一起培养2周和4周的损伤的半月板；(m-n.)番红O阳性染色面积(占总面积的％)和通过天狼猩红染色评估的DMS与外植体之间的整合％，并显示为总界面面积的整合界面％。
图25根据本文的实施方案描述了DMS的胶原纤维取向与半月板缺陷中的胶原纤维取向的对齐。在限定的方向上收集组织，(a)垂直穿刺圆柱形的AVAS切片；(b)水平穿刺圆柱形的AVAS切片；(c)垂直穿刺圆柱形的VAS切片；和(d)水平穿刺圆柱形的VAS切片。
图26根据本文的实施方案描述了DMS的胶原酶消化。在一个实施方案中，胶原酶消化促进细胞迁移和浸润。
图27根据本文的实施方案描绘了PDGF缀合的DMS诱导细胞迁移和增殖。
图28根据本文的实施方案描绘了PDGF缀合的DMS诱导细胞迁移和增殖。
具体实施方式
本文引用的所有参考文献、出版物和专利均通过引用整体并入，如同完全阐述了它们一样。除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。Hornyak等人,Introduction to Nanoscience andNanotechnology,CRC Press(2008)；Singleton等人,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology第三版,J.Wiley & Sons(New York,NY 2001)；March,AdvancedOrganic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第七版,J.Wiley&Sons(NewYork,NY 2013)；以及Sambrook和Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第四版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012)，为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指导。本领域技术人员将认识到可用于本发明的实践中的许多类似于或等同于本文所述的方法和材料。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。
半月板撕裂是最常见的膝关节损伤。半月板撕裂，尤其是发生在内侧三分之一处的最普遍形式，通常不会自发愈合，并且是发生膝骨关节炎的主要风险因素。
如本文所述，并且根据本文的各种实施方案，发明人已经开发了用于整合性半月板愈合的新型趋化性脱细胞半月板移植物。发明人已经表征了用于宿主细胞浸润的脱细胞半月板支架(DMS)；在体外检查了DMS的PDGF涂覆对细胞募集和半月板修复的影响；并使用动物模型测试了经PDGF涂覆的DMS在半月板整合性愈合中的功效。
在一个实施方案中，发明人已经表明，仅趋化生长因子可以被施加到支架上而没有任何外源细胞，并且预期迁移到损伤区域的内源细胞进行了愈合过程。在一个实施方案中，发明人发现，PDGF对祖细胞具有强的趋化作用。在一个实施方案中，发明人已经表明，向作为支架的脱细胞半月板施用PDGF能够通过内源细胞迁移治愈半月板损伤。
在各种实施方案中，发明人已经表明，肝素缀合的脱细胞半月板支架在至少两周内结合并缓慢释放PDGF-BB。在另一个实施方案中，发明人已经表明，在无血管半月板的缺陷处***经PDGF处理的支架使PDGFRβ表达增加且细胞迁移到缺陷区域中。在另一个实施方案中，番红O和天狼猩红染色显示出支架和损伤外植体之间的组织整合。在另一个实施方案中，用经PDGF涂覆的支架处理的损伤外植体的拉伸性能显著好于没有用经PDGF涂覆的支架处理的情况。
在一个实施方案中，本文公开的支架包含脱细胞半月板组织，其中所述支架与肝素和生长因子共价缀合。在一个实施方案中，生长因子选自PDGF(血小板衍生生长因子)、TGFβ(转化生长因子β)、VEGF(血管内皮生长因子)、CTGF(***生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、以及其他趋化因子，例如CCL20、CXCL3、CXCL6、CCL3、CCL3L1。在一个实施方案中，生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)。在一个实施方案中，PDGF是PDGF-AA、PDGF-BB和/或PDGF-AB。在一个实施方案中，支架还包含干细胞。在一个实施方案中，支架还包含半月板细胞。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织包含胶原纤维，并且其中胶原纤维的取向与半月板缺陷的取向匹配。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织包含孔。在一个实施方案中，通过胶原酶消化、机械穿刺和/或施加激光在脱细胞半月板组织中形成孔。在一个实施方案中，支架在施用后至少10天，或施用后至少20天，或施用后至少30天的时间内以基本上一级的动力学释放生长因子。在一个实施方案中，支架在施用后至少1天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天或30天的时间内以基本上一级的动力学释放生长因子。在一个实施方案中，支架的拉伸强度是类似的但没有与肝素和生长因子共价缀合的脱细胞半月板组织的拉伸强度的至少两倍。在一个实施方案中，支架的拉伸强度是类似的但没有与肝素和生长因子共价缀合的脱细胞半月板组织的拉伸强度的至少三倍。在一个实施方案中，支架的拉伸模量大于0.6杨氏模量(MPa)。在一个实施方案中，生长因子为10ng/mL支架至1mg/mL支架。在一个实施方案中，生长因子为1ng/mL至1μg/mL、或1μg/mL至500μg/mL、或500μg/mL至1mg/mL、或1mg/mL至10mg/mL。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织基本上为片状。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织具有三维形式。在一个实施方案中，支架为医用敷料形式。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织来源于哺乳动物。在一个实施方案中，脱细胞半月板组织来源于人。在一个实施方案中，支架处于无菌条件并包装在无菌容器中。
在一个实施方案中，与DMS缀合的生长因子可以是PDGF(血小板衍生生长因子)、TGFβ(转化生长因子β)、VEGF(血管内皮生长因子)、CTGF(***生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、以及其他趋化因子例如CCL20、CXCL3、CXCL6、CCL3、CCL3L1。在一个实施方案中，PDGF是PDGF-AA、PDGF-BB和/或PDGF-AB。在一个实施方案中，施加的生长因子剂量为10ng/ml至1mg/ml。在一个实施方案中，支架的来源可以是半月板组织。半月板可以来源于人类或其他哺乳动物。在一个实施方案中，可以制备三维形式的DMS以填充较大的半月板缺陷。脱细胞过程和肝素/PDGF的缀合与本文所述的关于DMS片相似。在一个实施方案中，PDGF缀合的支架还可用于附接干细胞或半月板细胞(天然的或通过在生长因子或病毒基因转移中的预培养而进行修饰)，用于植入半月板缺陷中。在一个实施方案中，在关节镜手术期间，将肝素/PDFG缀合的DMS***半月板缺陷中。通过使用胶水、缝线、钉或锚来固定DMS。在一个实施方案中，可以另外修饰支架以促进组织损伤的治疗。例如，在一个实施方案中，为了促进细胞迁移，使DMS的胶原纤维取向与半月板缺陷的胶原纤维取向匹配。这通过从半月板水平切割DMS并以相同取向***肝素/PDGF缀合的DMS来实现。在另一个实施方案中，为了促进细胞迁移和浸润，通过使用胶原酶消化、机械穿刺或施加激光在DMS的致密胶原纤维网络中形成孔。
在一个实施方案中，本文公开了修复和/或治疗有需要的对象中的组织损伤的方法，其包括：提供包含脱细胞半月板组织的支架；和通过将支架植入撕裂处中来修复和/或治疗组织损伤，其中支架与肝素和生长因子共价缀合。在一个实施方案中，组织损伤是组织中的撕裂。在一个实施方案中，组织是半月板组织。在一个实施方案中，生长因子选自PDGF(血小板衍生生长因子)、TGFβ(转化生长因子β)、VEGF(血管内皮生长因子)、CTGF(***生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、以及其他趋化因子例如CCL20、CXCL3、CXCL6、CCL3、CCL3L1。在一个实施方案中，生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)。在一个实施方案中，PDGF是PDGF-AA、PDGF-BB和/或PDGF-AB。在一个实施方案中，支架募集新的细胞群以引发半月板组织的无血管区域或血管区域中的修复。在一个实施方案中，优化支架以实现从宿主细胞到支架的有效细胞浸润和迁移。在一个实施方案中，通过关节镜手术将脱细胞支架植入半月板撕裂处。在一个实施方案中，支架在施用后至少10天的时间内以基本上一级的动力学释放生长因子。在一个实施方案中，支架在施用后至少20天的时间内以基本上一级的动力学释放生长因子。在一个实施方案中，支架在施用后至少30天的时间内以基本上一级的动力学释放生长因子。在一个实施方案中，支架的拉伸强度是类似的但没有与肝素和PDGF共价缀合的脱细胞半月板组织的拉伸强度的至少两倍。在一个实施方案中，支架的拉伸强度是类似的但没有与肝素和PDGF共价缀合的脱细胞半月板组织的拉伸强度的至少三倍。在一个实施方案中，支架的拉伸模量大于0.6杨氏模量(MPa)。在一个实施方案中，PDGF为10ng/mL支架至1mg/mL支架。在一个实施方案中，修复和/或治疗组织中的撕裂的方法还包括第二治疗方案。在一个实施方案中，第二治疗方案包括非手术治疗，例如休息、冰疗、加压、抬高和/或物理治疗。在一个实施方案中，第二治疗方案包括外科手术治疗，例如外科手术修复、半月板部分切除术和/或半月板全切除术。在一个实施方案中，对象是哺乳动物。在一个实施方案中，对象是人。在一个实施方案中，对象是马。
在一个实施方案中，发明人开发了一种新型支架，其可以***损伤的半月板病灶处以促进整合性组织愈合。具体地，在各种实施方案中，公开了用于制备人脱细胞半月板(具有适当的胶原蛋白取向)的方法；脱细胞半月板的肝素和PDGF-BB缀合的方法；以及将脱细胞半月板支架***撕裂的半月板中的方法。牛半月板外植体被用来产生半月板撕裂。PDGF-BB缀合的半月板支架的***导致细胞向支架迁移，产生了新的胶原细胞外基质，从而弥补了缺陷并改善了生物力学性能。在一个实施方案中，脱细胞半月板可在关节镜检查期间***半月板撕裂处以促进半月板损伤的愈合并防止慢性膝关节疼痛和功能障碍。
在一个实施方案中，本文公开了一种装置，该装置包括：与肝素和生长因子共价缀合的脱细胞支架，其中该装置用于修复组织。在一个实施方案中，该生长因子选自PDGF(血小板衍生生长因子)、TGFβ(转化生长因子β)、VEGF(血管内皮生长因子)、CTGF(***生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、以及其他趋化因子例如CCL20、CXCL3、CXCL6、CCL3、CCL3L1。在一个实施方案中，生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)。在一个实施方案中，脱细胞支架是生物脱细胞支架。在一个实施方案中，脱细胞支架得自脱细胞的天然半月板组织。在一个实施方案中，脱细胞支架具有与天然半月板相似的生物学和机械特性。在一个实施方案中，生长因子募集新的细胞群以引发无血管区域或血管区域的修复。在一个实施方案中，优化脱细胞支架以实现从宿主细胞到支架的有效细胞浸润和迁移。在一个实施方案中，所述装置使得能够缓慢释放生长因子。在一个实施方案中，缓慢释放持续最长30天的时间。
在一个实施方案中，本文公开了诱导细胞迁移的方法，其包括：提供脱细胞半月板支架以固定一种或多于一种生长因子；并诱导细胞迁移至脱细胞半月板支架。在一个实施方案中，一种或多于一种生长因子是PDGF。在一个实施方案中，将肝素用于固定。在一个实施方案中，将脱细胞半月板支架直接植入对象。在一个实施方案中，对象是人。在一个实施方案中，对象是马。
在各种实施方案中，本公开提供了肝素缀合的DMS，其显示出PDGF-BB的强效固定，从而使PDGF-BB被缓慢释放。经PDGF-BB涂覆的DMS促进内源性半月板细胞向缺陷区域和支架中的迁移。形成了新的基质，该基质桥接了天然半月板和支架之间的空间，这与改善的生物力学性能有关。经PDGF-BB涂覆的DMS是用于半月板撕裂整合性愈合的有前途的方法。
本公开内容还涉及包含支架的试剂盒。该试剂盒可用于实施本发明的修复和/或治疗组织中的撕裂的方法。该试剂盒是材料或组成部分的集合，包括至少一种本发明的支架。因此，在一些实施方案中，试剂盒包含无菌容器，该无菌容器包含与肝素和生长因子共价缀合的支架；和使用试剂盒的说明。在一个实施方案中，生长因子选自PDGF(血小板衍生生长因子)、TGFβ(转化生长因子β)、VEGF(血管内皮生长因子)、CTGF(***生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、以及其他趋化因子例如CCL20、CXCL3、CXCL6、CCL3、CCL3L1。在一个实施方案中，生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)。在一个实施方案中，试剂盒还包含用于将支架递送至损伤的半月板的工具。在一个实施方案中，递送工具是医用胶、医用缝合线、医用钉和/或医用锚。在一个实施方案中，支架是生物脱细胞支架。在一个实施方案中，支架得自脱细胞的天然半月板组织。在一个实施方案中，脱细胞支架募集新的细胞群以引发无血管区域的修复。在一个实施方案中，肝素缀合使得能够缓慢释放生长因子。在一个实施方案中，缓慢释放持续最长30天的时间。
配置在本发明试剂盒中的组成部分的确切性质取决于其预期目的。例如，一些实施方案被配置用于治疗和/或治愈组织中的撕裂的目的。在一个实施方案中，试剂盒特别被配置用于治疗哺乳动物对象的目的。在另一个实施方案中，试剂盒特别被配置用于治疗人类对象的目的。在其他实施方案中，试剂盒被配置用于兽医应用、治疗对象例如但不限于农场动物、家畜和实验室动物。
试剂盒中可以包括使用说明。“使用说明”通常包括有形表达形式，其描述了在使用试剂盒的组成部分以实现期望的结果，例如治疗、修复和/或愈合组织中所采用的技术。任选地，试剂盒还包含其他有用的组成部分，例如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、涂抹器、移液或测量工具、包扎材料或本领域技术人员容易认识到的其他有用的物品。
装配在试剂盒中的材料或组成部分可以以保持它们的可操作性和实用性的任何方便和合适的方式提供给从业者。例如，组成部分可以是溶解的、脱水的或冻干的形式；它们可以在室温、冷藏或冷冻温度下提供。组成部分通常包含在合适的包装材料中。如本文所用，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒内容物例如本发明的组合物等的一种或多于一种物理结构。包装材料通过众所周知的方法构造，优选地以提供无菌、无污染的环境。试剂盒中使用的包装材料是通常用于药学或生物医药术领域的那些包装材料。如本文所用，术语“包装”是指能够容纳各个试剂盒组成部分的合适的固体基质或材料，例如玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装可以是玻璃小瓶，用于容纳适量的含有脱细胞支架的本发明组合物，该脱细胞支架涂覆有趋化生长因子。包装材料通常具有外部标签，其指示试剂盒和/或其组成部分的内容物和/或目的。
在以下实施例中进一步描述本公开的实施方案。这些实施例仅仅是说明性的，并不以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
实施例
实施例1
总体方案
膝关节强力扭曲、旋转或过度屈曲会导致半月板创伤性撕裂。半月板撕裂会导致膝疼痛、肿胀、僵硬以及膝伸展受限。当前解决半月板撕裂的外科方法包括缝合和半月板切除术。然而，内侧三分之一处无血管区域的半月板撕裂通常不能自发地愈合或在外科手术后愈合，并且是导致膝骨关节炎(OA)发展的主要风险因素。半月板的中部和内部区域缺乏血液供应，因此治愈的可能性最小。
在与撕裂相邻的半月板中以及在滑膜和关节囊中存在能够促进半月板修复和再生的细胞。因此，将趋化因子应用于撕裂部位能够潜在地募集介导修复的细胞。生长因子具有促进半月板愈合的潜力，并且已寻求各种方法，包括将基因转移到半月板细胞中或应用基因转导的细胞。PDGF是半月板修复的候选因子，因为它对软骨细胞和间充质干细胞具有强大的趋化活性。PDGF增强半月板细胞活性，其在无血管区域病灶处的表达降低。具体而言，PDGF-BB被称为最强的促***原，它会使PDGFRβ自动磷酸化。该受体参与细胞-基质相互作用，用于细胞生长的靶向操纵。
在本公开的一个实施方案中，通过共价键或静电相互作用进行肝素的表面固定，以克服生长因子最初从支架中突然释放。肝素对多种生长因子具有强结合亲和力，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)。在一个实施方案中，将通过肝素固定的PDGF缀合的支架***到半月板撕裂区域中来募集介导半月板撕裂修复的细胞。在一个实施方案中，本公开使用脱细胞半月板作为固定PDGF的临床适用支架，并测试了其募集内源细胞以介导半月板撕裂修复的能力。
在另一个实施方案中，PDGF和其他生长因子可以通过与肝素的共价结合或静电相互作用而被固定在支架上，这转而导致生长因子的缓释。在本公开的一个实施方案中，发明人将肝素缀合的脱细胞半月板用作固定PDGF-BB的容易获得且临床上适用的支架，并显示了该支架募集内源细胞以介导半月板撕裂修复的能力。
实施例2
脱细胞半月板移植物
如本领域技术人员所知，半月板撕裂是最常见的膝损伤；尽管目前存在针对半月板损伤的一些治疗方法，但这些治疗方法不会导致半月板的修复或再生。在一些情况下，进行半月板部分切除术或半月板全切除术以治疗患者。这些治疗常常导致患者的骨关节炎和/或疤痕组织。
在各种实施方案中，发明人通过开发用于整合性半月板愈合的趋化性脱细胞半月板移植物解决了该问题。在一个实施方案中，发明人表征了用于宿主细胞浸润的脱细胞半月板支架(DMS)。脱细胞的天然半月板组织是修复损伤的人半月板的有前途的生物支架。它具有与天然半月板相似的生物学和机械特性。此外，理想的支架还包含趋化因子，以募集新的细胞群以引发无血管区域中的修复。对DMS结构进行修饰，以实现从宿主细胞到DMS的有效的细胞浸润和细胞迁移。
在一个实施方案中，在体外检查了DMS的PDGF涂覆对细胞募集和半月板修复的影响。众所周知，PDGF-BB(血小板衍生生长因子-BB)是间充质细胞的强效的趋化生长因子。在体外损伤模型中使用半月板外植体，使用特定的细胞表面标志物识别由生长因子募集到DMS的细胞。分析了迁移的细胞和新合成的细胞外基质(ECM)的数量。测试生物力学特性以确定PDGF-BB涂覆改善DMS在损伤半月板上的应用的程度。
在一个实施方案中，使用动物模型测试了经PDGF涂覆的DMS在半月板整合性愈合中的功效。在兔半月板缺陷模型中测试复合材料。结果测量值可包括组织学和生物力学参数。
如本文在整个公开中所描述的，发明人试图通过使用经趋化生长因子涂覆的脱细胞支架来开发用于整合性半月板愈合的新型治疗方法。通过使用相关的结果测量值而在体外和体内检查支架。生长因子增强的天然支架易于制造，同时没有使用外源细胞所带来的挑战，并且可以快速进行临床转化，从而解决了增强半月板撕裂修复和预防由于OA发展引起的慢性疼痛和残疾的巨大未满足需求。
实施例3
意义
半月板的主体是纤维软骨半月形结构，其位于胫骨和股骨之间的关节的周边。两个前角和后角与胫骨平台相连。半月板通过转换压缩和拉伸环向应力来提供缓冲，该应力通过纤维软骨肌腱末端在胫骨平台处削弱。
半月板撕裂是最常见的膝关节损伤。正常半月板和非正常发育的半月板，尤其是盘状半月板发生撕裂的风险增加。甚至稳定的盘状半月板也会出现半月板撕裂的机械症状。许多情况与前交叉韧带(ACL)损伤，例如慢性ACL功能不全和急性ACL破裂相关。不同的损伤模式可能与不同的风险因素例如性别、年龄、体重和损伤机制相关。尽管半月板的外部三分之一处由于其血管分布和从血液中募集祖细胞而具有潜在的治愈能力，但中部和内部区域是无血管的，因此具有最小的治愈潜力。无血管区域的修复似乎需要驻留细胞的增殖，并且纤维软骨细胞分化对于恢复适当的半月板生物力学功能是必不可少的(图1)。半月板撕裂，尤其是发生在内侧三分之一处的最普遍形式，通常不会自发愈合，并且是发生膝骨关节炎(OA)的主要风险因素。因此，半月板修复策略对于预防与OA相关的残疾和疼痛至关重要。分化的半月板细胞和半月板祖细胞的总体低细胞性、密集的ECM、不良的血管分布以及半月板损伤部位处的炎性环境，均导致半月板愈合和再生的失败。
由于半月板的复杂结构，许多有关使用外源细胞进行半月板样分化的研究遇到了挑战(图1)。在一个实施方案中，研究了将分化的细胞例如人半月板细胞应用于静电纺丝支架上。具体生长因子的选择随所使用的具体细胞类型而变化。源自骨髓、滑膜、滑液、脂肪组织、半月板和其他来源的不同类型的间充质干细胞可与生长因子组合使用，以诱导纤维软骨形成分化。用于半月板愈合的祖细胞需要进化为异质群并同时合成前胶原I和IIa。此外，半月板具有明显的区域特征，最重要的是有和没有血管形成。
支架的选择对于适合半月板修复也很关键。根据撕裂的类型以及是否用于部分或全部替换，可以考虑使用各种类型的支架。即使使用相同的原料，支架也可以制成不同的形状、具有机械性能和尺寸。因此，在支架设计中应考虑许多因素。理想地，用于半月板修复的支架应具有与天然半月板相似的纤维软骨结构，以实现稳定的负荷转移功能。
基于这些考虑，细胞向损伤区域的迁移和适当的分化以产生纤维软骨***似乎是成功的半月板愈合所需的关键过程(图2)。该研究的动机在于只有趋化生长因子可以被施加到支架上而没有任何外源细胞，并且预期迁移到损伤区域的内源细胞进行愈合过程。PDGF对祖细胞具有很强的趋化作用。因此，发明人研究了以脱细胞半月板为支架的PDGF的施加，以确定该方法通过内源细胞迁移来治愈半月板损伤的可行性。
实施例4
治疗半月板撕裂的支架
如组织工程领域中已知的那样，通过天然组织的脱细胞来制备支架。将大多数材料重新制成水凝胶，并在交联后以空隙填充物或海绵状支架的形式施用。但是，半月板由致密且复杂的胶原蛋白基质构成。此外，多种机械应力例如压缩和拉伸环影响膝盖半月板。在一个实施方案中，发现半月板衍生的移植物是促进损伤的半月板愈合的高度可行原料。从牛半月板开发出一种脱细胞片以专门用于半月板撕裂(图3)，其中天然组织结构通过有效的脱细胞作用得以维持。
实施例5
DMS与趋化生长因子的缀合
肝素是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，对多种生长因子具有强效的结合亲和力，包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)。肝素的羧基可以与DMS的胺基结合(图4)。该复合物能够保留生长因子并允许受控释放，这将以梯度方式将驻留细胞从相邻的天然半月板募集到损伤区域。使用该固定系统，优化了生长因子的剂量和释放动力学，表征了由趋化生长因子募集的细胞的表型，并了解了将该复合物***损伤的半月板后的愈合过程。
实施例6
半月板修复和再生
组织工程移植物通常由支架、外源细胞和生长因子构成。但是，外源细胞的使用受到手术前收获足够数量细胞的挑战以及准备和使用包含活细胞的构建体的复杂后勤工作的限制。本公开内容提供了通过使用源自天然半月板的趋化性脱细胞支架的新型治疗方法，其可用于半月板的修复和再生。在一个实施方案中，本公开的创新在于使用了天然生物材料，其被专门成形以***半月板撕裂处并且与趋化生长因子缀合以通过募集内源细胞来诱导愈合。这种方法还具有很高的转化潜力，因为它避免了与使用外源细胞相关的挑战，并使用了已知是安全的材料和方法。
实施例7
PDGF-BB的缀合和释放
应用脱细胞方法后，与天然牛半月板组织相比，DNA含量明显降低(图5A，图5B)。为了评估肝素缀合的功效，应用甲苯胺蓝测定法检测肝素(图5C)。肝素缀合导致甲苯胺蓝结合的大量增加(图5D)。
图6公开了PDGF-BB缀合和释放的实验数据。与经肝素涂覆的DMS结合的PDGF-BB的量为200ng PDGF-BB总量的86.72％，在未经肝素涂覆的DMS中该量为76.82％。在最初的24小时内，经肝素涂覆的DMS初始释放6.22％，而未经肝素涂覆的DMS初始释放13.76％，随后在接下来的16天期间内，每24h持续释放约0.61ng(图6)。到第16天，从经肝素涂覆的DMS释放出PDGF总量的11.22％，而从未经肝素涂覆的DMS中释放出26.11％。同样，有肝素和没有肝素的DMS之间，在第2天、4天、8天、12天和16天释放的量也存在显著差异。在一个实施方案中，发明人发现，PDGF从经肝素涂覆的DMS中的持续释放持续到第30天。
发现PDGFRβ阳性细胞在人的半月板的血管区域中含量丰富，但是在无血管区域中非常少(图7A、图7B)。然而，用经PDGF涂覆的支架处理牛半月板外植体的实验性撕裂后，PDGFRβ阳性细胞在无血管区域中增加。此外，半月板中的内源细胞显示出细胞定向迁移至经PDGF涂覆的支架(图7C，图7D)。
基于DAPI比较图像，与仅将DMS***外植体相比，***PDGF-DMS募集了靠近缺陷区域边界的驻留细胞(图8B、图8C)。番红O和天狼猩红染色的图像显示了由迁移细胞新产生的ECM(图8E、图8F)。由PDGF募集的细胞沿半月板组织和DMS之间的边界排列(图8C)。***未经PDGF涂覆的DMS不会导致细胞募集。天狼猩红染色表明，迁移细胞新合成了连接DMS和天然半月板的ECM(图8F)。这些初步数据表明，PDGF能够将内源细胞募集到缺陷区域，并且细胞产生了新的ECM。这些结果说明，PDGF缀合的DMS具有提供趋化性移植物的潜力，该移植物可以募集自体细胞，而无需接种任何工程化的外源细胞。
与未缀合的DMS相比，经50ng/ml PDGF涂覆或缀合的DMS显示出募集到缺陷边界的显著增加的细胞数量。200ng/ml PDGF募集了更大的细胞数(图9A)。新产生的ECM填充DMS的内部空间(图9B)。即使DMS的胶原纤维是水平排列的，200ng/ml组仍显示出细胞浸润的DMS层中的胶原纤维朝向宿主组织的方向(图9C)。拉伸试验显示，PDGF组在2周和4周后，杨氏模量显著增加(图10)。
实施例8
DMS整合行愈合方案
用于宿主细胞浸润的脱细胞半月板支架(DMS)的优化：通过表面修饰实现从宿主组织到DMS的有效细胞浸润，并通过将趋化生长因子固定在DMS上来优化DMS。
由于通过脱细胞过程去除了细胞、蛋白聚糖和GAG，DMS具有支架内的微空间，这可以允许附着募集的细胞。
通过肝素缀合优化了PDGF-BB在DMS上的固定(图11)。肝素具有PDGF结合位点。DMS上缀合的肝素会结合PDGF-BB，从而导致持续释放。在不同的肝素和PDGF浓度下，使用ELISA试剂盒(PeproTech，Inc.)对释放的PDGF进行最长达4周的定量分析。优化的结果包括来自最初处理的PDGF-BB的90％以上的结合功效，并持续释放4周至6周。
定量并表征迁移到经PDGF涂覆的DMS中的细胞：在一个实施方案中，这些研究的目的是定量并表征迁移的细胞。采购新鲜的牛膝关节，去除完整的半月板后，准备来自无血管区域的外植体。将外植体用DMEM基础培养基培养3天。到时，使用#11尺寸(40mm)的手术刀产生类似撕裂的缺陷，使用3mm打孔机产生圆柱形的缺陷(图12)。将具有或不具有PDGF的PDGF缀合的DMS***缺陷区域中。为了缩小缺陷间隙，用6-0尺寸的不可吸收尼龙缝线进行缝合。将外植体在DMEM基础培养基中孵育2周和4周，并包埋在石蜡中。定量DAPI染色切片上迁移到天然组织与DMS之间的界面的细胞数量以及支架内的细胞数量。
离体培养后，应用ECM染色剂如三色染色(Trichrome)和天狼猩红以评估在天然半月板与支架之间的界面处甚至在支架内的ECM形成和组织化。定向的胶原纤维也可以通过天狼猩红染色来检测。使用图像分析程序(ImageJ，1.50c4版)，可以通过Mann-Whitney、T检验(95％或99％，置信区间)对迁移的细胞数量和新合成的ECM面积进行定量和统计分析。在一个实施方案中，PDGF增加了细胞性、修复组织的组织化以及番红O染色的强度。
在一个实施方案中，在长期(4周)培养后，根据成纤维细胞和软骨细胞标志物确定细胞的表型。用SCX、生腱蛋白-C、1型胶原蛋白作为纤维生成标志物，用Sox9、COMP、2型胶原蛋白作为软骨生成标志物进行免疫组织化学分析。该分析可以确定PDGF是否不仅作为趋化因子还促进适当的细胞分化。如果软骨细胞分化程度不足，则可以应用DMS与PDGF和TGF-β3的杂合型缀合。
在一个实施方案中，检查了生物力学性能。在直径为12mm的牛半月板外植体中间形成8mm的撕裂后，***有或没有PDGF的直径为6mm的DMS并进行缝合。离体培养2周和4周后，进行拉伸试验。使用超强胶将样品固定在1000N称重传感器(Instron UniversalTesting Machine)的上部和下部之间(图13)。在施加拉力之前，将缝合线从固定的外植体上切除。以1mm/min的拉伸速度测量拉力。通过Mann-Whitney、T检验(95％或99％，置信区间)对每组(n＝8至12)的值进行统计学比较。迁移的细胞可能会产生新的ECM，从而增强半月板外植体和***的DMS之间的互连性。
检查用于动物模型中半月板整合性愈合的体外优化的PDGF缀合的DMS：按照常用的前外侧入路，在骨骼成熟(2.8kg至3.3kg；4个月至4.5个月)的雌性新西兰白兔(n＝8)中建立半月板缺陷模型。将PDGF缀合的DMS(直径1mm)***1mm穿刺的缺陷处。为了闭合间隙，使用6-0尺寸的不可吸收尼龙缝合线进行缝合。
在第4周和第8周，对动物实施安乐死，并收集半月板样品进行H&E组织学检查。分析了细胞向DMS中的浸润和迁移细胞的ECM合成。通过三色染色研究了新产生的胶原蛋白。对于生物力学性能，进行微压痕测试。直径为0.8mm的球形压头(用于压痕的SMAC)在***的DMS与宿主组织之间的区域加载小于1N的力。通过这种微加载，比较DMS***的样品和PDGF缀合的DMS***的样品之间的变形模式。这些研究的成功完成进一步验证了本发明的方法，并为进一步优化和标准化用于大型动物模型中的测试以及准备用于临床测试的支架奠定了基础。
实施例9
方法和结果
在一个实施方案中，发明人检查了经PDGF涂覆的脱细胞半月板支架通过诱导内源细胞迁移来介导半月板撕裂的整合性愈合的潜力。
半月板外植体：从18个月至30个月龄的动物(德克萨斯州泰勒市的AnimalTechnologies Inc.)的正常膝获得新鲜的牛半月板(内侧和外侧)。在屠宰动物的同一天收集膝，并在冰上运输以在第二天到达实验室。为了制备半月板外植体，用手术刀切下无血管部位(内侧三分之二)并将其切成约20mm宽的块。将组织块在含有1％PSF的DMEM中洗涤3次，在含有10％小牛血清(CS)(Omega Scientific Inc.，塔尔扎纳，加利福尼亚州)和1％青霉素-链霉素-庆大霉素(PSG)的DMEM中孵育(Life Technologies)3天。
脱细胞半月板支架的制备和生长因子缀合：使用标本针从水平穿刺的牛半月板块获得直径为6mm、厚度为1mm的圆盘状外植体。为了脱细胞，将外植体依次在摇动培养箱中(37℃下300rpm)与无DNA酶/RNA酶的水孵育12小时，与0.05％胰蛋白酶-EDTA一起孵育12小时，用盐水洗涤三次持续1小时，加入2％的Triton X-100水溶液和1.5％的过乙酸孵育24小时，以及加入2％的胶原酶孵育4小时。完成此顺序的化学处理后，将脱细胞的半月板支架(DMS)用无DNA酶/RNA酶的蒸馏水洗涤72小时，并每天更换培养基，于4℃储存于含0.1％PSG的PBS中直至使用。DNA含量分析表明，天然半月板的组织干重为7.75ng/mg，脱细胞DMS的组织干重为1.71ng/mg(p＝0.0014)。
为了将PDGF-BB固定在DMS上，将肝素缀合到DMS上。将0.1重量/体积％的肝素钠盐(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)溶解在含有25mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(Thermo Scientific)和10mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(Sigma-Aldrich)的0.05M 2-吗啉代乙烷硫酸(MES)(Sigma-Aldrich)缓冲液(pH5.5)中，以激活肝素的羧基。将肝素溶液的1ml等分样品加入每个DMS中，并在室温下缓慢摇动孵育4小时。将肝素缀合的DMS用0.1MNa2HPO4和蒸馏水漂洗3次。甲苯胺蓝测定表明，通过EDC交联缀合肝素的DMS是仅浸入肝素溶液的DMS的33.77倍(p<0.0001)。
将肝素缀合的DMS与浓度为200ng/ml的重组人PDGF-BB(Peprotech Inc.，RockyHill，NJ)在4℃孵育12小时。PDGF-BB固定后，将DMS用PBS洗涤3次并在4℃下保存。
PDGF-BB从肝素缀合的DMS的释放动力学：将肝素缀合的DMS(直径为10mm)与总量为200ng的PDGF-BB在1ml添加有0.1％NaN3的PBS中于4℃孵育12小时。为了除去未结合的PDGF-BB，用500μl释放培养基洗涤支架，该释放培养基由含0.1％BSA和0.1％NaN3的PBS组成。洗涤后，收集上清液，将测得的PDGF-BB的量视为未吸收的PDGF-BB，并用于计算与支架结合的PDGF-BB的量(结合的PDGF-BB的总量＝200ng－剩余上清液中未吸收的PDGF-BB的量)。为了测量PDGF-BB的释放，重复将PDGF-BB缀合的DMS置于无菌1.5ml试管中的1ml释放培养基中，在37℃下以150rpm缓慢摇动直到16天。在每个时间点，用新释放的培养基替换所有培养基。将收集的上清液离心并保存在-80℃。使用人PDGF-BB ELISA(Peprotech Inc)分析每个样品的释放培养基中PDGF-BB的累积量。
接种于DMS上的无血管细胞的体外培养：将一百万个人无血管半月板细胞(从组织库中获得的33岁男性和39岁女性的正常膝关节分离)接种在迁移/侵袭(trans-well)板(12孔板)中的各个DMS(直径3mm，高度6mm)中。将50μl细胞悬液连续两次施加于DMS表面后，将迁移/侵袭板在37℃、5％CO2下孵育3小时，然后加入基础培养基或PDGF-BB(50ng/ml)培养基。将细胞接种的DMS培养2周，每3天更换培养基。
对DMS进行DAPI和番红O染色处理，以确定细胞是否渗透到DMS中并产生新的糖胺聚糖(GAG)。为了证实PDGF-BB的生物学活性，应用抗PDGFRβ(Ab107169，1:200稀释，Abcam)抗体，并通过抗兔IgG(A-11008，1:500稀释，Life Technologies)检测。
离体半月板外植体培养：用无菌刀片在半月板外植体的中间部分形成全厚度的径向撕裂。将直径为6mm的DMS***缺陷处。在***过程中，使DMS的纤维方向与半月板中部的纤维方向保持相同。将外植体培养2周和4周，每3天更换培养基。
组织学和免疫组织化学分析：将外植体(每组n＝5)固定在Z-fix(Anatech，BattleCreek MI)中。用DAPI(H-1500Vector Laboratories，Inc.)对石蜡包埋的切片(5μm至7μm)进行染色以进行细胞计数。用外植体中的总细胞数计算边界处的细胞百分比，并与对照外植体进行统计学比较。将切片用番红O染色以检测蛋白聚糖，并用天狼猩红染色以检测胶原纤维的排列以及***的DMS与损伤的外植体之间的互连性。计数PDGFRβ阳性细胞，以证实来自缀合的DMS的PDGF-BB活性。为了确认PDGF-BB的生物活性，施用抗PDGF受体β(Ab107169，1:200稀释，Abcam)、1a1型胶原蛋白(Ab34710，1:500稀释，Abcam)、2a1型胶原蛋白(II-II6B3，1:50稀释，DSHB)和聚集蛋白聚糖(L0101，1:50稀释，OWL)抗体，并通过抗兔IgG(A-11008，1:500稀释，Life Technologies)或抗小鼠DAB(MP-7420，1:20稀释，Vector实验室)检测。
生物力学测试：通过拉伸试验对具有各种DMS的损伤的半月板外植体的杨氏模量进行定量，各种DMS包括DMS、肝素缀合的(HEP)DMS、50ng/ml经PDGF-BB涂覆的HEP-DMS、100ng/ml经PDGF涂覆的HEP-DMS和200ng/ml经PDGF涂覆的HEP-DMS(每组n＝8至12)。将每个外植体安装并固定在具有500N称重传感器的万能试验机(马萨诸塞州诺伍德的
统计分析：数据代表至少3个至4个重复实验的平均值和平均值的标准误差(SEM)，每个重复三次。PDGF释放定量差异的统计学显著性使用2-WAYANOVA进行多次比较确定。在拉伸试验中，使用了Mann-Whitney检验。组织学评分和值、DNA含量和甲苯胺蓝定量的差异通过未配对的t检验进行分析。认为结果*＝p<0.05(95％CI，置信区间)、**＝p<0.01(99％CI)、***＝p<0.001(99.9％CI)、****＝p<(99.99％CI)具有统计学显著性。
PDGF活性和细胞迁移：正常半月板组织中的PDGFRβ阳性细胞主要在血管区域(图14A)。PDGF缀合增加了缺陷区域中迁移细胞中PDGFRβ阳性细胞的数量(图14)。PDGF缀合的DMS的抗PDGFRβ阳性细胞(92.32±2.536％)显著高于仅DMS***组(49.61±5.967％)和仅半月板缺陷组(21.53±7.267％)。将经PDGF涂覆的DMS***半月板撕裂处导致牛半月板细胞迁移到缺陷区域(图15)。DAPI阳性计数显示，与未缀合PDGF的DMS(32.25±2.754％)相比，经PDGF涂覆的DMS(58.90±3.051％)诱导的缺损区域细胞密度明显更高。
损伤的半月板外植体中的ECM形成：在番红O(n＝3至9)和天狼猩红(n＝4至8)染色的组织形态分析中，PDGF缀合的DMS诱导GAG扩散到DMS中，并诱导DMS与损伤外植体之间的组织整合(图20)。此外，PDGF缀合促进了细胞整合到DMS中。PDGF-HEP缀合的DMS组中的番红O阳性区域(2周后为36.49±1.55％、4周后为46.88±1.673％)显著高于仅DMS***的半月板外植体(2周后为2.69±0.75％、4周后为0.33±0.30％)。***PDGF缀合的DMS的外植体的整合百分比(2周后为68.05±5.779％、4周后为68.45±3.709％)显著高于***仅DMS的外植体(2周后为2.313±2.313％、4周后为38.70±6.981％)。
DMS***后损伤的半月板外植体的机械性能：如图17所示，在培养2周和4周后，比较了***仅DMS的外植体或***200ng/ml PDGF-BB缀合的DMS的外植体的拉伸性能。***PDGF-BB缀合的DMS的外植体的杨氏模量(2周后0.73MPa，4周后0.89MPa)比***仅DMS的外植体(2周后0.25Mpa、4周后0.17MPa)明显更高(图17)。
因此，经PDGF涂覆的DMS增加了PDGFRβ表达，并促进了内源性半月板细胞迁移至缺陷区域和支架中。形成了新的基质，该基质桥接了天然半月板和支架之间的空间，这与改善的生物力学性能有关。经PDGF涂覆的支架将有望用于半月板撕裂愈合的转化方法
实施例10
半月板撕裂的整合性愈合
在一个实施方案中，发明人先前已经公开了PDGF对人关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞(MSC)显示出强的趋化活性。Y Mishima和M Lotz,J OrthopRes.2008年10月；26(10):1407-12，其全部公开内容通过引用并入本文。即使PDGF作为半月板细胞活性的增强剂而广为人知，但并不知道将其掺入支架对于募集细胞以引发受损半月板的修复至关重要。本公开涉及用于半月板撕裂的治疗方法的脱细胞半月板片。在一个实施方案中，发明人检查了经PDGF涂覆的脱细胞半月板支架通过内源性细胞迁移来介导整合性愈合的潜力。
将新鲜的牛半月板化学脱细胞。将脱细胞的组织制成圆形片。将肝素与脱细胞半月板支架(DMS)共价缀合。PDGF-BB通过与肝素缀合的DMS结合而固定。通过ELISA分析体外PDGF释放动力学。将DMS移植到损伤的半月板外植体中并培养2周和4周。在DAPI染色的切片上对DMS和损伤外植体之间的边界处的迁移细胞的数目进行计数，并且在免疫组织化学染色后对表达PDGFRβ的细胞进行计数。通过番红O和天狼猩红染色切片的组织学来确定新产生的ECM和胶原纤维的排列。还测试了外植体的拉伸性能。
PDGF的释放动力学显示，在肝素缀合的DMS中持续缓慢释放，第16天释放11.2％，而没有肝素的DMS释放26.1％。将经PDGF处理的DMS***半月板撕裂处导致牛半月板细胞迁移到缺陷区域(图18A至图18D)。迁移的细胞在缺陷区域产生了新的ECM。番红O和天狼猩红染色显示出DMS和损伤外植体之间的组织整合。而且，较高浓度的PDGF促进了细胞整合到DMS中(图18E)。用经PDGF涂覆的DMS处理的损伤外植体的拉伸特性显著高于没有PDGF的DMS(图18F)。
肝素缀合的DMS表现出PDGF的强效固定，从而导致PDGF的缓慢释放。经PDGF涂覆的DMS促进内源性半月板细胞迁移至缺陷区域和支架中。形成了新的基质，该基质桥接了天然半月板和支架之间的空间，这与改善的生物力学性能有关。经PDGF涂覆的DMS是半月板撕裂愈合的一种有前途的方法。总之，这些结果为半月板撕裂的治疗提供了一种新颖、可行和有效的方法。
实施例11
细胞迁移和ECM形成
其中缝合缺陷区域但未***DMS的损伤半月板外植体的长达4周的培养未显示出在缺陷区域的任何细胞迁移或纤维连接(图16)。***未与肝素或PDGF缀合的DMS也未显示出细胞迁移至缺陷区域，尽管DMS充满了缺陷区域。将经PDGF处理的DMS***半月板撕裂处导致牛半月板细胞迁移到缺陷区域(图16)。在半月板组织和***的DMS之间的边界处存在细胞。大多数募集的细胞都在缺陷空间中，但有些细胞迁移到了DMS的外表面。DAPI染色切片的细胞计数显示，与未缀合PDGF的DMS(32.25±2.754％)相比，PDGF缀合的DMS(58.90±3.051％)诱导显著更高的缺损区域细胞密度。
来自相同半月板外植体的切片还用PDGFRβ抗体染色。结果表明，经PDGF涂覆的DMS在整个外植体中诱导PDGFRβ阳性细胞数量的显著增加(图8)。对于缺陷区域的迁移细胞中的抗PDGFRβ阳性细胞而言，200ng/ml的PDGF缀合的DMS组(92.32±2.536％)显著高于仅DMS***组(49.61±5.967％)和仅缺陷半月板组(21.53±7.267％)。通过对从培养的外植体中分离的RNA进行PCR证实了经PDGF涂覆的DMS的这种生物活性。
通过番红O和天狼猩红染色研究了损伤半月板外植体中ECM的形成。番红O和天狼猩红染色显示出DMS和损伤的外植体之间的组织整合。而且，较高浓度的PDGF促进了细胞整合到DMS中。
还研究了损伤的半月板外植体的机械性能。在2周和4周后，比较了***仅DMS的外植体和***200ng/ml PDGF缀合的DMS的外植体之间的拉伸性能。在每个时间点，***PDGF缀合的DMS的外植体的拉伸性能(2周后为0.73Mpa、4周后为0.89MPa)显著高于***仅DMS的外植体(2周后为0.25Mpa、4周后为0.17MPa)。
在一个实施方案中，与肝素缀合的DMS结合的PDGF-BB增加了无血管区域中的PRGFRβ表达。这种增加使得细胞迁移到半月板缺陷处与PDGF-BB结合的DMS附近。PDGF/PDGFR信号转导研究显示了内皮祖细胞或间充质干细胞之间的相互作用。响应于PDGF-BB的区域变化也存在局限性，这在体外无血管区域中至关重要。首次研究了PDGF-BB固定的DMS可以诱导PDGFRβ表达增加，并导致细胞迁移到天然组织中的半月板缺陷区域附近并增殖。在一个实施方案中，在PDGF-BB处理后的早期，VEGFA表达增加。
在一个实施方案中，本文公开了肝素缀合的DMS显示出PDGF的强效固定，从而导致PDGF的缓慢释放。经PDGF涂覆的DMS促进了内源性半月板细胞向缺陷区域和支架中的迁移。形成了新的基质，该基质桥接了天然半月板和支架之间的空间，这与改善的生物力学性能有关。经PDGF涂覆的DMS是半月板撕裂愈合的一种新的有前途的方法。
实施例12
***DMS的半月板撕裂处的细胞迁移和ECM形成
其中缝合缺陷区域但未***DMS的损伤半月板外植体的长达2周的培养未显示出在缺陷区域的任何细胞迁移或纤维连接(图15b)。***未与肝素或PDGF缀合的DMS也未显示细胞迁移至缺陷区域，尽管DMS充满了缺陷区域(图15c)。
将PDGF-BB缀合的DMS***半月板撕裂处导致半月板细胞迁移到缺陷区域(图15d)。在半月板组织和***的DMS之间的边界处存在细胞。大多数募集的细胞都在缺陷空间中，但有些细胞迁移到了DMS的外表面。
DAPI染色切片的细胞计数显示，与未缀合PDGF的DMS(32.25±2.754％)相比，PDGF-BB缀合的DMS(58.90±3.051％)诱导显著更高的缺损区域细胞密度。
来自相同半月板外植体的切片还用PDGFRβ抗体染色。在人半月板的血管区域的大多数细胞中可以看到PDGFRβ的表达。然而，外源的PDGF-BB诱导了无血管区域中PDGFRβ的表达。此外，PDGF-BB处理导致在无血管区域内源性PDGFRβ基因的表达增加。在培养的牛半月板中，经PDGF-BB涂覆的DMS在整个外植体中诱导PDGFRβ阳性细胞的数量显著增加(图15d)。对于缺陷区域的迁移细胞中PDGFR阳性细胞的数量而言，PDGF-BB缀合的DMS(92.32±2.536％)明显高于DMS***组(49.61±5.967％)和无DMS的缝合半月板组(21.53±7.267％)(图15e)诱导。
实施例13
损伤的半月板外植体中的ECM形成
番红O和天狼猩红染色显示出DMS和损伤的外植体之间的组织整合(图24a至图24l)。PDGF-BB缀合的DMS组在培养2周后(34.491±1.55％)和培养4周后(46.88±1.673％)的通过图像分析评估的番红O阳性面积显著大于培养2周后(2.69±0.75％)和培养4周后(0.33±0.31％)的DMS组(图24m)。在培养2周后(68.1±5.78％)和培养4周后(68.45±3.71％)的PDGF-BB缀合的DMS组在***的DMS与损伤的牛半月板外植体之间的互连性显著高于培养2周后(2.31±2.31％)和培养4周后(38.7±6.98％)后的DMS组(图24n)。
实施例14
生长因子缀合的支架
在本文公开的各种实施方案中，本公开提供了生长因子缀合的支架，其可以容易地应用于临床中以募集促进半月板撕裂修复的内源细胞。在一个实施方案中，选择DMS作为支架，因为它是生物相容性材料并且可以容易地用于临床制造。
关于生长因子缀合的支架的先前研究包括天然聚合物，例如胶原蛋白、明胶、去矿质的骨基质和合成聚合物，这些研究已经表明生长因子的固定在细胞募集和组织修复中的可行性。临床应用中用于半月板修复的支架不仅需要促进内源细胞募集，还需要具有抵抗膝关节剪切和压缩应力的机械性能。
已将具有与人类半月板相似的机械性能的DMS用作支架，但是还没有关于固定了生长因子的DMS用于半月板内源细胞募集的研究。在脱细胞过程中，通过蛋白水解酶处理修饰了致密的牛半月板，以促进随后的细胞浸润。
通过无血管区域细胞PRGFRβ表达的增加证明了PDGF缀合的DMS在***半月板外植体后具有生物活性。这与在半月板缺陷中细胞迁移至PDGF-BB缀合的DMS有关。先前的研究表明，PDGF/PDGFR信号传导参与决定内皮祖细胞或间充质干细胞的表型和调节功能。已经报道PDGFβ受体阳性细胞包括或代表干细胞/祖细胞群，并且目前的结果表明，PDGF募集和/或激活了半月板中的这些细胞群。与健康的半月板相比，多能半月板祖细胞在OA或患病的半月板中更易迁移。
据信，本公开首次提出了通过PDGF-BB固定的DMS刺激细胞迁移到半月板缺陷中的方法。募集的细胞还产生了新的细胞外基质，并通过新释放的ECM增加了经PDGF涂覆的DMS与缺陷区域之间的互连性。PDGF不仅具有趋化作用，还可以增强纤维软骨基质组分例如GAG和胶原蛋白的合成。新的ECM增强了互连性，从而提高了生物力学性能，例如初始拉伸杨氏模量。
在PDGF-BB处理后的早期，无血管半月板组织和细胞中的PDGFRβ和VEGFA基因表达增加(图S6和7)。VEGF介导的新血管形成对于损伤组织的愈合至关重要。在培养的半月板细胞中，血管半月板细胞中的VEGF高于无血管半月板细胞中的VEGF。另外，主要在半月板的损伤区域附近检测到VEGF。通过PDGF-BB处理，VEGF在无血管细胞中的表达可调节无血管区域中的半月板愈合过程。
已报道了关于将膜***实验性半月板撕裂处的研究。释放胶原酶的纳米纤维支架的***显示出通过使致密的半月板外植体变得松散而增强细胞浸润。然而，在早期时间点，支架所占据的边缘没有整合。多层层状胶原性生物材料有利于具有宿主半月板要素的细胞再增殖，但必须进行研究以显示足够的机械性能。
实施例15
通过取向优化DMS
如图25中所示，在一个实施方案中，进行了DMS优化以使DMS的胶原纤维取向与半月板缺陷中的胶原取向对齐。将牛半月板的血管区域(图25c，图25d)和无血管区域(图25a，图25b)分开。使用6mm样品针，沿垂直方向(图25a、图25c)或水平方向(图25b、图25d)收集圆柱形组织片。然后，将每块切成1mm厚的盘状支架并进行脱细胞。DMS制备后，垂直和水平切片之间的微观结构显示出明显不同的形态。水平穿刺的组织块显示出内部纤维网络，以使细胞更好地迁移和浸润。
实施例16
通过产生额外的孔来优化DMS
如图26所示，对DMS进行了进一步优化，以在脱细胞半月板支架的致密胶原蛋白基质中形成孔，以促进细胞迁移和浸润。DMS支架包含致密的胶原纤维网络。为了促进细胞迁移和浸润，通过使用胶原酶消化、机械穿刺或施加激光来产生孔。图26说明了DMS的胶原酶消化对细胞浸润的影响。选择用胶原酶进行短期处理(2重量/体积％，持续3小时至4小时)。在每个DMS的6mm直径的圆盘上培养2M滑液间充质干细胞，然后进行DAPI染色(10x)。结果显示，在短时间内用胶原酶处理后，细胞浸润增加(图26)。
实施例17
PDGF缀合的DMS诱导细胞迁移和增殖
如图27和图28所示，PDGF缀合的DMS诱导细胞迁移和增殖。将PDGF缀合的DMS***牛半月板外植体的实验性缺陷中。离体培养2周后，进行细胞迁移和增殖的免疫荧光分析。肌动蛋白阳性染色(红色)表示板状伪足，并指示细胞迁移的方向。KI67(绿色，图27)阳性染色指示增殖的细胞。这些结果表明，PDGF缀合的DMS诱导更多的细胞迁移和增殖(100x共聚焦图像)。
上述各种方法和技术提供了许多实现本发明的方法。当然，应该理解的是，无需根据本文描述的任何特定实施方案，实现所描述的所有目标或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，可以以实现或优化本文所教导的一个优点或一组优点的方式执行所述方法，而不必实现本文可能教导或建议的其他目的或优点。本文提到了各种有利和不利的替代方案。应当理解的是，一些优选实施方案具体包括一个、另一个或几个有利特征，而其他优选实施方案具体地排除一个、另一个或几个不利特征，而另一些优选实施方案通过包含一个、另一个或几个有利的特征明确地减轻当前的不利特征。
此外，技术人员将认识到来自不同实施方案的各种特征的适用性。类似地，本领域普通技术人员可以混合和匹配上面讨论的各种元素、特征和步骤，以及每个这样的元素、特征或步骤的其他已知等同物，以执行根据本文描述的原理的方法。在各种元素、特征和步骤中，在不同的实施方案中将特别包括一些，并且特别排除其他元素、特征和步骤。
尽管已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本发明，但是本领域技术人员将理解，本发明的实施方案超出了具体公开的实施方案，延伸到其他替换实施方案和/或其用途和修改及其等同物。
在本发明的实施方案中已经公开了许多变型和替代元素。更进一步的变型和替代元素对于本领域技术人员来说是显而易见的。在这些变化中，但不限于这些变化，选择本发明组合物的组成模块，以及可以用本发明组合物进行诊断、预后或治疗的疾病和其他临床病症。本发明的各种实施方案可以具体包括或排除这些变型或元素中的任何一个。
在一些实施方案中，用于描述和要求保护本发明一些实施方案的表示成分、性质的量如浓度、反应条件等的数字应理解为在一些情况下被术语“约”修饰。因此，在一些实施方案中，书面描述和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据特定实施方案旨在获得的所需性质而变化。在一些实施方案中，数值参数应根据报告的有效数字的数和通过应用普通的舍入技术来解释。尽管本发明的一些实施方案阐述的宽范围的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报告了具体实施例中列出的数值。在本发明的一些实施方案中呈现的数值可能包含必然由于在其各自的测试测量中发现的标准差引起的某些误差。
在一些实施方案中，在描述本发明的特定实施方案的背景以及类似的参考文献中(特别是在以下一些权利要求的上下文中)使用的术语“一种”和“该”或不使用数量词可以解释为涵盖单数和复数两者。本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则将各个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。关于本文的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
本文公开的本发明的替代元素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独地或与该组中的其他成员或本文中找到的其他元素任意组合地提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，可以将一个或多于一个组成员包括在组中或从组中删除。当发生任何这样的包含或删除时，本说明书在此被认为包含经修改的组，从而实现所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读前面的描述后，那些优选实施方案的变化对于本领域普通技术人员来说将变得显而易见。预期技术人员可以适当地采用这些变化，并且本发明可以以不同于本文具体描述的方式实施。因此，本发明的许多实施方案包括适用法律所允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素的所有可能变体的任何组合。
此外，在整个说明书中已经参考了许多专利和印刷出版物。上文引用的每篇参考文献和印刷出版物均通过引用整体并入本文。
最后，应该理解这里公开的本发明的实施方案是对本发明原理的说明。可以进行在本发明的范围内可以采用的其他修改。因此，作为实施例而非限制，可以根据本文的教导利用本发明的替代配置。因此，本发明的实施例不限于精确地如所示和所述的那些。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：武装复制型溶瘤腺病毒