阅读说明：本技术 用于提取膜蛋白和稳定膜蛋白溶液的表面活性化合物夹 (Surface active compound clamp for extracting membrane protein and stabilizing membrane protein solution ) 是由 皮埃尔·菲尔森 朱利安·道维格尼 阿赫桑·博蒙德耶 马里纳·珀什莫尔 基姆·安赫·恩古耶 于 2017-12-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及式(I)化合物,式(I)如说明书中所述。本发明还涉及一种用于提取与生物膜结合的膜蛋白的方法,所述方法包括使与所述生物膜结合的膜蛋白的水性溶液与至少一种本发明的化合物发生接触的步骤。本发明还涉及一种使在水性溶液中的膜蛋白溶液稳定的方法,所述方法包括使溶液中的膜蛋白的水性溶液与至少一种本发明的化合物发生接触的步骤。<Image he="316" wi="542" file="DDA0002193762040000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to compounds of formula (I), wherein formula (I) is as described in the specification. The invention also relates to a method for extracting membrane proteins bound to a biological membrane, comprising the step of contacting an aqueous solution of membrane proteins bound to said biological membrane with at least one compound of the invention. The invention also relates to a method for stabilizing a solution of a membrane protein in an aqueous solution, said method comprising the step of contacting an aqueous solution of a membrane protein in solution with at least one compound of the invention.)

用于提取膜蛋白和稳定膜蛋白溶液的表面活性化合物夹

技术领域

本发明涉及表面活性化合物及其用于提取膜蛋白和稳定被提取在水性溶液中的膜蛋白溶液的用途。

本发明在生物化学领域，并且也适用于医学领域，特别是基于结构的药物设计领域具有工业实用性。

在下面的描述中，方括号([])之间的参考文献是指在本文结尾处提呈的参考文献表。

背景技术

膜蛋白(MP)的结构在围绕它们的脂质膜之外不稳定。当使用去污剂从膜提取它们以便随后将它们纯化并结晶、或将它们用作抗原时，发生这种情况。然而，至关重要的是，这种结构确实是所述MP在其原始膜中采取的结构，并且它不会或多或少地被使用去污剂进行的提取过程所改变。

已有超过100种在售的去污剂被提议用于提取MP。它们是MP被包埋在其中的脂质的出色竞争者，并以高水平的有效性提取所述MP。这在一定程度上是由于所述去污剂与介质的交换速度非常快速这一事实，这与脂质不同(Israelachvili,J.N.,Mitchell,D.J.&Ninham,B.W.，脂质双层和囊泡的自组装理论(Theoryofself-assemblyoflipidbilayersandvesicles)，BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Biomembranes 470,185-201(1977)([1])。然而，这种高交换能力导致MP的膜结构域失稳，与脂质相比，所述膜结构域维持得不好，倾向于随时间往往发生结构破坏。因此，观察到所述MP的聚集，这是由于所述MP的疏水区暂时暴露在外，这些疏水区簇集在一起以保护彼此不受水性介质的影响。

就药物设计而言，这对采用基于结构的药物设计方法的行业来说是一个主要挑战。事实上，在迄今为止确定的324个药理学靶点中，超过60％是MP，并且据估计，靶点的数目最终将超过3000个，其中80％将是基于膜的(Overington,J.P.,Al-Lazikani,B.&Hopkins,A.L.，存在多少药物靶点？(How many drug targets are there？)，Nat Rev DrugDiscov 5,993-996(2006)([2]))。这种策略包括了解不论是脱辅基还是与其配体结合的靶的3D结构，以便开发在结构的基础上优化的一代调节剂(Mason,J.S.,Bortolato,A.,Congreve,M.&Marshall,F.H.，G蛋白偶联受体的成药性的来自于结构生物学的新见解(Newinsights from structural biology into the druggability of G protein-coupledreceptors)，Trends in Pharmacological Sciences 33,249-260(2012)([3])；Schaffhausen,J.，基于结构的药物设计的进展(Advances in structure-based drugdesign)，Trends in Pharmacological Sciences 33,223(2012)([4])；Shoichet,B.K.&Kobilka,B.K.，G蛋白偶联受体的基于结构的药物筛选(Structure-based drug screeningfor G-protein-coupled receptors)，Trends in Pharmacological Sciences 33,268-272(2012)([5]))。因此，有必要获得实际上代表所述蛋白质的本源状态的结构数据。这在所述靶基于膜时非常有限，并且在这种形势下，消除这种限制的新工具对这种类型的方法具有重要影响。

就疫苗接种而言，靶点主要位于病原体的表面，因此被锚定或包埋在质膜中。提取靶MP(有时是均低聚物和/或异低聚物形式)并在它们被免疫系统处理时将其维持在本源状态下，可能能够提高抗体的质量，因为它们的有效性与被注射蛋白质的结构完整性直接相关。抗原在正确构象下可以以较低剂量注射，这对于抗原的生产来说也是重要的，能够实现规模经济。

更加稳定的去污剂的设计是非常活跃的研究领域。因此，在稳定化作用最好的去污剂中，最近已开发了包含2个模拟脂质的短脂肪链的月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)(Chae,P.S.等，用于膜蛋白的溶解、稳定化和结晶的麦芽糖新戊二醇(MNG)两亲物(Maltose-neopentyl glycol(MNG)amphiphiles for solubilization,stabilizationand crystallization of membrane proteins)，Nat Meth 7,1003-1008,(2010)([6]))。也已开发了基于胆汁酸的去污剂(Chae,P.S.等，用于膜蛋白稳定化的串联面部两亲物(Tandem Facial Amphiphiles for Membrane Protein Stabilization)，Journal of theAmerican Chemical Society 132,16750-16752(2010)([7])；Zhang,Q.等，设计用于整合膜蛋白的稳定化的面部两亲物(Designing Facial Amphiphiles for the Stabilizationof Integral Membrane Proteins)，Angewandte Chemie International Edition46,7023-7025(2007)([8])；Lee,S.C.等，用于膜蛋白的稳定化和结晶的基于甾类的面部两亲物(Steroid-based facial amphiphiles for stabilization and crystallization ofmembrane proteins)，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 110,E1203-1211(2013)([9]))。这些分子的设计是基于经典的概念例如亲水-疏水平衡，这限制了它们的潜力。合并有弱酸功能团的基于杯[4]芳烃骨架的另外一代去污剂能够提高稳定性(Suwinska,K.等，三阴离子杯[4]芳烃单烷基衍生物：合成、固态结构和自组装性质(Tri-Anionic Calix[4]arene Monoalkyl Derivatives:Synthesis,Solid-State Structures and Self-Assembly Properties)，New Journal ofChemistry 32,1988-1998,(2008)([10])；Matar-Merheb,R.等，构建用于提取和稳定化功能性膜蛋白的去污剂(Structuring detergents for extracting and stabilizingfunctional membrane proteins)，PLoS One 6,e18036,(2011)([11]))。这些酸功能团促进与位于膜-胞质界面处的氨基酸以比所述蛋白质上别处更大的数量形成多个盐桥(vonHeijne,G.，细菌内膜蛋白中带正电荷残基的分布与跨膜拓扑结构相关(The distributionof positively charged residues in bacterial inner membrane proteinscorrelates with the trans-membrane topology)，Embo J 5,3021-3027(1986)([12])；Nilsson,J.,Persson,B.&von Heijne,G.，来自于107个基因组的整合膜蛋白中氨基酸分布的比较性分析(Comparative analysis of amino acid distributions in integralmembrane proteins from 107genomes)，Proteins:Structure,Function,andBioinformatics 60,606-616,(2005)([13])；von Heijne,G.，膜-蛋白质拓扑结构(Membrane-protein topology)，Nat Rev Mol Cell Biol 7,909-918(2006)([14]))。这些杯[4]芳烃去污剂在UV范围内、特别是最通常用于检测蛋白质的280nm处具有强烈吸收，并且螯合二价金属，这可能是不理想的。

因此，对于克服现有技术的这些缺点、劣势和障碍的新工具，特别是能够提取膜蛋白并提高其在水性溶液中的稳定性的新工具，存在着真正的需求。

发明内容

在大量研究后，本申请人设计了能够解决这个技术难题的新的化合物。

本发明的化合物由能够提取膜蛋白(MP)并同时对所述MP的本源和功能状态影响小的一系列两亲性表面活性剂构成。

有利的是，本发明的化合物显著提高被提取在水性溶液中的MP的稳定性。

这些分子具有通过三重相互作用能力将MP的疏水区像夹一样环绕的独特性质：1/所述蛋白质的膜结合区与所述去污剂的脂肪链之间的疏水相互作用，2/氢键合类型的相互作用，特别是被糖类或聚醚链的存在所加强，和3/所述去污剂的极性头部的弱酸类型的官能团与在所述MP的膜-胞质界面处丰度特别高的碱性残基之间的离子相互作用。

本发明的分子还可以提取所述MP并使其在4℃下在短期和长期(几十天)内稳定。

这些分子还具有在UV范围内无吸收和不螯合二价阳离子的性质。

因此，本发明的第一主题涉及式(I)的化合物或其可药用盐：

其中：

■X表示–OH、

–S(CH₂)_nCH₃、–CO₂R²或

■Y表示–(CH₂)_nCH₃、

–(CH₂)₂OR¹

■Z表示–NHCO(CH₂)_nCH₃、

并且其中：

■R¹表示单糖、二糖或聚乙二醇；

■R²表示H、Na或K；

■m是4至21范围内的整数；

■n是4至21范围内的整数；

■p是1至3范围内的整数；

■q是1至5范围内的整数；

■r是1至10范围内的整数；

■Cy表示环己基。

出于本发明的目的，“单糖”意指包含3至14个碳原子的糖类单体。这可以例如是选自甘油醛、二羟丙酮、赤藓糖、苏阿糖、赤藓酮糖、脱氧核糖、核糖、***糖、木糖、来苏糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、岩藻糖、鼠李糖、景天庚酮糖、甘露庚酮糖、七羟基辛醛、神经氨酸和唾液酸及其衍生物的单糖。优选地，它可以是葡萄糖。它可以是环状或非环状单糖。在环状单糖中，它可以是吡喃型或呋喃型的单糖，例如β-D-吡喃葡萄糖。

出于本发明的目的，“二糖”意指由两个糖类单体通过糖苷连键形成的二糖。它可以是同二糖(homodisaccharide)或异二糖(heterodisaccharide)。如果它是同二糖，它可以是果糖的同二糖例如菊粉二糖，或甘露糖的同二糖例如2α-甘露二糖或3α-甘露二糖，或葡萄糖的同二糖例如海藻糖、曲二糖、黑曲霉糖、麦芽糖、异麦芽糖、槐二糖、昆布二糖、纤维二糖或龙胆二糖，或其衍生物。它可以例如是乙基麦芽糖苷。或者，如果它是异二糖，它可以是葡萄糖-果糖的异二糖例如选自海藻酮糖、蔗糖、松二糖、麦芽酮糖、白菌二糖、异麦芽酮糖和龙胆二酮糖及其衍生物，或者选自蜜二糖、乳果糖、乳糖和芸香二糖及其衍生物的别的异二糖。

在本发明的情形中，m可以选自整数4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21。

在本发明的情形中，n可以选自整数4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21。它可以例如是数字10、12或14。

在本发明的情形中，p可以选自整数1、2和3。

在本发明的情形中，q可以选自整数1、2、3、4和5。

在本发明的情形中，r可以选自整数1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。

所述整数m、n、p、q和r是彼此独立的，并且这些整数的所有组合都属于本发明。

在本发明的情形中，术语“可药用盐”包含根据所述化合物上存在的取代基而使用酸或碱制备的无毒性盐。当本发明的化合物包含酸官能团时，相应的盐可以通过任选地在优选惰性的溶剂存在下向处于中和形式的所述化合物添加有机或无机碱来获得。碱加成盐的实例可以是钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、(有机)胺盐或镁盐。

因此，本发明是例如一种式(I)的化合物或其可药用盐，其中：

■X表示

■Y表示

■Z表示–NHCO(CH₂)_nCH₃或

■R¹表示单糖例如葡萄糖、二糖例如麦芽糖、或聚乙二醇；

■R²表示H、Na或K；

■m是4至21范围内的整数，例如等于11；

■n是4至21范围内的整数，例如等于8、10、11、12、14或17；

■p是1至3的整数，例如等于2。

在这种情况下，其可例如为如下文“示例”部分所述的组3.7的化合物，例如组3.7b、3.7c、3.7e、3.7g、3.7j、3.7l的化合物，或为组4.6的化合物例如组4.6b或4.6d的化合物。

或者，本发明是例如式(I)化合物或其可药用盐，其中：

■X表示–S(CH₂)_nCH₃；

■Y表示–(CH₂)₂OR¹；

■Z表示

■R¹表示单糖、二糖例如麦芽糖、或聚乙二醇；

■R²表示H、Na或K；

■n是4至21范围内的整数，例如等于11、13、15或17；

■p是1至3范围内的整数，例如等于2。

在这种情况下，它可以例如是下文“实施例”部分中所描述的组5.3的化合物，例如5.3a、5.3b、5.3c或5.3d的化合物，特别是化合物5.3a。

一般来说，对应于式(I)并且在“实施例”部分中、特别是在“实施例”部分的表1和2中描述的每种化合物，都构成本发明的主题的分子。

有利的是，本发明的分子在220nm至500nm(和以外)处不吸收或仅仅可忽略地吸收，并因此不阻止蛋白质在280nm处的检测。

有利的是，本发明的分子不与二价金属形成不溶性络合物。例如与本发明的分子不同，这种与金属无相互作用的情况在使用镍或钴的金属亲和类型的层析步骤期间是非常有用的，并且不能使用高浓度的的常规去污剂来实现。它对于在钙和镁存在下避免络合物的沉淀来说，也是非常有用的，所述钙和镁是在活生物体中常常遇到的蛋白质辅因子。

本发明人已通过实验证实，取决于预期使用目的，例如通过透析或超滤容易地消除具有高CMC(临界胶束浓度)的去污剂或者通过使用具有较低CMC的化合物保留所述去污剂，可以通过改变本发明的化合物的取代基例如通过改变脂族链的长度和/或极性头部的大小，来改变所述化合物的CMC。

本发明人已通过实验证实，取决于待提取的膜蛋白，使用本发明的分子，通过改变其技术特征、特别是它们的取代基，可以执行选择性提取，特别是当使用常规技术的情况下感兴趣的膜蛋白通常与污染物共纯化时。

有利的是，利用本发明的分子进行的膜蛋白的提取不导致所述MP的功能活性在被提取后降低。任选地，取决于待提取的MP的本质，利用本发明的分子进行的提取可能能够提高所述被提取MP的功能活性。

本发明人还已通过实验证实，本发明的分子与常规去污剂相比，使膜蛋白在溶液中稳定至少2倍长的时间，例如2倍、3倍、4倍、5倍或甚至更多倍长的时间。

本发明的化合物可以利用本领域技术人员已知的任何适合的方法来制备，包括下述方法中的至少一者：肽偶联，Fmoc(芴甲氧羰基)基团的去保护，酰胺形成，催化加氢，tBu(叔丁基)基团的去保护，甲基酯或乙基酯的去保护，Boc基团的去保护，Huisgen环加成，脱乙酰化反应，(Na、K)羧酸盐的形成，三苯甲基去保护和硫醇-烯偶联。用于本发明的每种化合物的合成的流程描述在例如下文“实施例”部分中。

本发明的第二个主题涉及一种用于提取与生物膜结合的膜蛋白的方法，所述方法包括使与所述生物膜结合的膜蛋白的水性溶液与如上所定义的至少一种式(I)的化合物发生接触的步骤。

出于本发明的目的，“生物膜”意指亲脂性分子的任何组装体，其组装成将细胞与其环境分隔开的双层小叶，由两亲性脂质、特别是磷脂构成，每个膜脂质由朝向膜外部的亲水性极性头部和朝向内部的疏水性尾部形成。这可以是原核细胞或真核动物细胞(除了人类胚胎干细胞之外)或植物细胞或病毒的膜。如果它是真核细胞，它可以例如是质膜、细胞内膜例如核膜、溶酶体、外来体、蛋白脂质体、光滑或粗糙型内质网膜或高尔基体膜，此罗列是非限制性的。它也可以是分离的转基因宿主细胞，其源自于例如通过重组RNA或DNA的遗传工程技术或通过用表达一种或多种感兴趣的疫苗抗原的病毒载体感染细胞而在其中表达一种或多种感兴趣的抗原的细胞系。可以使用本领域技术人员已知的能够在细胞中表达转基因的任何遗传工程技术。它可以是涉及通过转导，例如通过电穿孔、微注射、超声、感染或转染引入到细胞中的DNA或RNA、例如合成的编码mRNA的表达的技术。所述表达可以例如是至少一种感兴趣的抗原的瞬时和/或可诱导和/或组成性的表达，正如在例如文献WO02090533([29])中所描述的。所述细胞也可以是任何分离的细胞，特别是除了人类胚胎干细胞之外，例如分离的人类细胞(例如人类胚胎干细胞除外)或分离的非人类动物细胞或植物细胞。所述分离的细胞可以源自于选自Vero(ATCC No.CCL-81)例如Vero 76(ATCCNo.CRL-1587)、CHO例如CHO-Kl(CCL 61,ATCC)、BHK例如BHK-21[C-13](

CCL-10^TM)、HELA、(Crucell)、HEK293(

CRL-1573^TM)、Sf9(ATCC,CRL-1711)、MDCK例如MDCK(NBL-2)(CCL-34^TM)的细胞系，此罗列不受限制。

所述生物膜可能是整个的、也就是说完整的，或者可能是生物膜级分，也就是说生物膜的一部分。

出于本发明的目的，“膜蛋白”意指与生物膜结合的，也就是说锚定的或整合的，并且不在水性介质中自由扩散的蛋白质。在膜蛋白中，可以提到的是例如质膜蛋白和细胞内膜蛋白例如线粒体、核或溶酶体膜蛋白。它可以例如是转运蛋白例如ABC转运蛋白，任选地选自P-糖蛋白(Pgp/ABCB1)、MRP1/ABCC1、MRP2/ABCC2、BCRP/ABCG2和BmrA。可选地，它可以是在生物膜中转基因表达的感兴趣的蛋白质，例如上面提到的并在真核细胞中表达的蛋白质，如Baiceanu等人(Baiceanu E等，作为ABCC2的第一种有效抑制剂的2-吲哚基亚甲基苯并呋喃酮(2-Indolylmethylenebenzofuranones as first effective inhibitors ofABCC2)，Eur J Med Chem.2016℃t 21；122:408-18([30]))为ABCB1、C1,C2和G2所描述的，或在细菌中表达的BmrA(Matar-Merheb,R.等，([11]))。

可以使所述生物膜与如上所定义的至少一种式(I)的化合物或这些化合物中的至少两者或至少三者或甚至更多者发生接触。有利的是，选择一种或多种本发明的化合物可能能够选择性提取膜蛋白，以便例如除去污染物。

在本发明的情形中，可以将所述生物膜事先放置在水性溶液中，例如缓冲溶液中。

使包含所述待提取的膜蛋白的水性溶液与至少一种式(I)的化合物发生接触的步骤，可以在本发明的分子的羧酸基团发生离子化的pH下进行，以便最大化所述分子的夹持效应。有利情况下，所述pH是5.0至12之间的pH，例如5.0或6.0或7.0或8.0或9.0或10.0或11.0或12.0的pH。

本发明的提取方法还可以包括将所述膜蛋白与本发明的化合物温育的步骤。可以改变所述温育时间以使全部或一部分所述待提取的膜蛋白进入溶液。所述温育时间可以由熟知如何根据待溶解的膜和/或待提取的蛋白质和/或所需的提取得率来改变它的本领域技术人员确定。所述温育时间可以例如是15分钟或30分钟或1小时或2小时或3小时或甚至超过3小时。

所述温育步骤可以在适合于待提取的蛋白质的温度下进行，以便特别是避免其变性，特别是由热造成的变性。因此，所述温度可以由本领域技术人员改变；通常，对于不是热稳定的蛋白质来说它可以在4至40℃之间，并且对于热稳定蛋白质来说在40-90℃之间。

本发明的提取方法还可以包括分离步骤，以便获得含有所需蛋白质的级分。这可以是本领域技术人员已知的任何方法，例如离心。在所述分离步骤结束时，获得含有从所述膜提取的蛋白质的级分。

有利的是，在所述提取结束时，所述蛋白质可以保留在包含至少一种本发明的化合物的溶液中。

有利的是，本发明的化合物能够使所述蛋白质功能稳定，特别是在所述蛋白质已从它们的膜中被提取之后。

因此，本发明的另一个主题涉及一种用于使处于溶液中的蛋白质、也就是说从而在它们最初所在的生物膜之外的膜蛋白在水性溶液中稳定的方法，所述方法包括使处于溶液中的膜蛋白的水性溶液与至少一种本发明的式(I)的化合物发生接触的步骤。

所述蛋白质的稳定化可以与其本源状态相比，保留其全部或一些功能特性。这可以是与其本源状态相比保留所述蛋白质的至少50％的活性，或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或100％的这种活性。

有利的是，所述蛋白质因此在0℃至10℃的温度下的稳定时长大于1天，例如大约5天或大于10天或大于20天或大于30天或大于40天。

所述膜蛋白可以通过利用如前所定义的本发明的化合物的提取步骤，或利用通过另一种去污剂、也就是说商用去污剂例如DDM(正十二烷基β-d-麦芽糖苷)、LMNG(月桂基麦芽糖新戊二醇)、Triton X100或FA3(面部两亲物3)的提取步骤，从而位于溶液中。

对于本领域技术人员来说，在读过下文作为示例提供的用附图说明的实施例后，其他优点可能也将变得显而易见。

附图说明

图1描绘了ABC转运蛋白BmrA的拓扑结构和底物通过质膜的转运循环。S＝底物；NBD＝核苷酸结合结构域；ATP＝腺苷三磷酸。

图2描绘了杯[4]芳烃去污剂(以C4C7为例)与本发明的分子夹相比的吸收光谱。波长以nm为单位表示。图A：DDM(1mM)的吸收光谱用实线表示；C4C7(1mM)的吸收光谱用虚线表示。图B：化合物2.3b(1mM)的吸收光谱用

表示；化合物2.3c(1mM)的吸收光谱用实线表示；化合物2.3d(1mM)的吸收光谱用

表示。图C：化合物3.7e(1mM)的吸收光谱用

表示；化合物3.7f(1mM)的吸收光谱用

表示；化合物3.7g(1mM)的吸收光谱用

表示；化合物3.7h(1mM)的吸收光谱用表示；化合物3.7j(1mM)的吸收光谱用实线表示。图D：化合物4.6b(1mM)的吸收光谱用

表示；化合物4.6c(1mM)的吸收光谱用实线表示；化合物4.6d(1mM)的吸收光谱用

表示。图F：化合物3.9a(1mM)的吸收光谱用实线表示。图G：化合物3.7a(1mM)的吸收光谱用表示；化合物3.7b(1mM)的吸收光谱用

表示；化合物3.7k(1mM)的吸收光谱用表示；化合物3.7l(1mM)的吸收光谱用实线表示；化合物3.7c(1mM)的吸收光谱用

表示；化合物3.7d(1mM)的吸收光谱用

表示。

图3(A和B)表示二价阳离子与本发明的分子的相互作用，其与这里以C4C12为例的杯[4]芳烃去污剂截然相反，并且显示了与所述杯[4]芳烃去污剂相反，不存在二价阳离子与本发明的分子的相互作用。对不同浓度的MgCl₂(mM)来说，在600nm处测量吸光值。图A：化合物3.7b在0.45mM(圆圈)、1.5mM(正方形)和4.5mM(三角形)浓度下的吸光值。图B：化合物3.7c在0.2mM(十字形)、0.5mM(圆圈)、2mM(正方形)和6mM(三角形)浓度下的吸光值。图C：化合物3.7d在0.0045mM(圆圈)、0.0015mM(正方形)和0.045mM(三角形)浓度下的吸光值。图D：化合物3.7e在0.2mM(十字形)、0.5mM(圆圈)、2mM(正方形)和6mM(三角形)浓度下的吸光值。图E：化合物3.7f在0.006mM(圆圈)、0.02mM(正方形)和0.06mM(三角形)浓度下的吸光值。图F：化合物3.7g在0.003mM(圆圈)、0.01mM(正方形)和0.03mM(三角形)浓度下的吸光值。图G：化合物3.7h在0.003mM(圆圈)、0.01mM(正方形)和0.05mM(三角形)浓度下的吸光值。图H：化合物3.7i在0.3mM(圆圈)、1mM(正方形)和3mM(三角形)浓度下的吸光值。图I：化合物3.7j在0.006mM(圆圈)、0.02mM(正方形)和0.06mM(三角形)浓度下的吸光值。图J：化合物3.7k在0.3mM(圆圈)、1mM(正方形)和3mM(三角形)浓度下的吸光值。图K：化合物3.7l在0.3mM(圆圈)、1mM(正方形)和3mM(三角形)浓度下的吸光值。图L：化合物2.3f在0.24mM(圆圈)、0.8mM(正方形)和2.4mM(三角形)浓度下的吸光值。图M：化合物2.3g在0.03mM(圆圈)、0.1mM(正方形)和0.3mM(三角形)浓度下的吸光值。图N：化合物2.3h在0.15mM(圆圈)、0.5mM(正方形)和1.5mM(三角形)浓度下的吸光值。图O：化合物4.5c在0.3mM(圆圈)、1mM(正方形)和3mM(三角形)浓度下的吸光值。图P：化合物4.5d在0.15mM(圆圈)、0.5mM(正方形)和1.5mM(三角形)浓度下的吸光值。图Q：化合物4.6c在1.5mM(圆圈)、5mM(正方形)和15mM(三角形)浓度下的吸光值。图R：化合物4.6d在1mM(圆圈)、3mM(正方形)和9mM(三角形)浓度下的吸光值。图S：化合物3.9a在0.01mM(圆圈)、0.1mM(正方形)和1mM(三角形)浓度下的吸光值。图T：化合物C4C12在0.03mM(圆圈)、0.1mM(正方形)和0.3mM(三角形)浓度下的吸光值。

图4表示在浓度不断提高(0.0001mM、0.001mM、0.01mM、0.1mM、1mM和10mM)的夹(本发明的化合物)存在下DPH(1,6-二苯基-1,3,5-己三烯)的荧光(％)，本发明的化合物以化合物#3.7e(C13，用正方形表示的点)和3.7f(C18，用圆圈表示的点)为例。所述实验一式三份进行。根据Chattopadhyay,A.&London,E([22])，CMC对应于在斜率中观察到断裂时的浓度，在这里对于3.7f来说为20μM，对于3.7e来说为2mM(黑色符号)。

图5描绘了夹的动态光散射(DLS)随波长(nm)的变化，坐标为强度(％，左侧A列)和数目(％，左侧B列)。在每张图上注明了估算的直径(A列)。A列和B列从上至下：化合物3.7c(10mM，5xCMC)，化合物3.7d(10mM，5xCMC)，化合物3.7e(2mM，5xCMC)，化合物3.7f(10mM，500xCMC)，化合物3.7h(1mM，100xCMC)，化合物3.7j(2mM，100xCMC)，化合物3.9a(1mM，50xCMC)。

图6描绘了膜蛋白BmrA(图A和C)和AcrB(图B和D)的使用商品化去污剂和本发明的分子的提取。(图A和B，从左至右)：SDS，DDM，FC12，TX100，本发明的化合物1.4，1.5，2.3a，2.3b，2.3c，2.3d，2.3e，2.3f，2.3g，2.3h，2.3i，3.7a，3.7b；；图C：本发明的化合物3.7c0.8％，3.7d 0.16％，3.7e 0.8％，3.7f 0.3％，3.7g 0.4％，3.7h 0.2％，3.7i 0.07％，3.7j 0.09％，3.7k，3.7l 0.25％，3.9a，4.5a，4.5b，4.5c，4.5d 0.34％，4.6a，4.6b，4.6c，4.6d，5.3a，5.3b，5.3c 0.3％，5.3d 0.3％；图D：3.7c，3.7d，3.7e，3.7f，3.7h，3.7i 0.1％，3.7j，3.7k，3.7l，3.9a，4.5a，4.5b，4.5c，4.5d，4.6a，4.6b，4.6c，4.6d。除非另有指明，否则去污剂以10g/l(1％)添加。将相当于在100 000xg离心30min后20μg的提取级分沉积在10％SDS-PAGE上，在迁移后用考马斯蓝染色。BmrA以单体形式迁移到55kDa条带的水平；AcrB以单体形式迁移到100kDa条带的水平。SDS＝十二烷基硫酸钠；DDM＝β-D-十二烷基麦芽糖苷；FC12＝foscholine-12；TX100＝triton X-100。

图7描绘了本发明的去污剂对BmrA的功能性的影响(ATP酶活性，％)。向稀释到2g/l的富含BmrA(～25％)的膜级分添加所指示浓度(mM)的所述化合物(图A，从上至下：3.7e10.7mM，3.7e 8.6mM，3.7e 6.4mM，3.7e 4.3mM，3.7e 2.2mM，3.7e 1.1mM，3.7d 4mM，3.7d3mM，3.7d 2mM，3.7d 1mM，3.7d 0.8mM，3.7d 0.6mM，3.7d 0.05mM，3.7d 0.03mM，3.7d0.02mM，3.7c 13mM，3.7c 10.4mM，3.7c 10mM，3.7b 1.5mM，3.7b 0.7mM，3.7b 0.5mM，2.3gNa2 20.5mM，2.3gK219.3mM，2.3f 21.1mM，2.3e 22mM，2.3d 23.2mM，2.3a 3.2mM，1.5a22mM，DDM 20mM，DDM 2mM，DDM 10mM，DDM 2mM，DDM 1mM，LMNG 10mM，LMNG 1mM，LMNG0.1mM，LMNG 0.01mM，FA3 27mM，FA3 9mM，FA3 2mM，FA3 1mM，TX100 16mM；图B从上至下：本发明的化合物5.3d 3.2mM，5.3c 3.3mM，5.3b 11.7mM，5.3b 2.9mM，5.3a 3mM，4.6c14.6mM，4.6b 15.2mM，4.5c 18.6mM，4.5b 19.6mM，3.9a 8mM，3.9a 0.51mM，3.9a 0.31mM，3.9a 0.11mM，3.7l 12.01mM，3.7l 6.01mM，3.7l 3mM，3.7l 1mM，3.7k 10mM，3.7k3mM，3.7j3mM，3.7j 2mM，3.7j 1mM，3.7j 0.6mM，3.7j 0.03mM，3.7j 0.02mM，3.7j 1mM，3.7i 0.3mM，3.7h 3mM，3.7h 2mM，3.7h 1mM，3.7h 0.6mM，3.7h 0.58mM，3.7h 0.5mM，3.7h 0.35mM，3.7h0.1mM，3.7h 0.5mM，3.7h 0.35mM，3.7h 0.1mM，3.7h 0.05mM，3.7h 0.03mM，3.7h 0.02mM，3.7g 12.5mM，3.7g 9mM，3.7g 7.5mM，3.7g 5mM，3.7g 3mM，3.7g 1mM，3.7f 3.2mM，3.7f2mM，3.7f 1mM，3.7f 0.061mM，3.7f 0.031mM，3.7f 0.015mM)。在4℃温育2h后，测量ATP酶活性。然后将所述溶液在4℃、100 000xg下离心1h，并将上清液沉积在10％SDS-PAGE上(参见图8)。灰色和黑色柱状图对应于根据这些SDS-PAGE，BmrA被部分(灰色)或完全(黑色)提取时的浓度。ATP酶活性以相对于不含化合物的蛋白质的活性(即0.7μmol被水解的ATP/min/mg蛋白质)的％为单位。

图8描绘了在如图7中所指示的不同浓度(以mM和xCMC为单位表示)的不同去污剂(DDM、LMNG和FA3)和本发明的分子(3.7b、3.7c、3.7d、3.7e、3.7f、3.7h、3.7g、3.7j、3.7l、3.9a、4.3d、5.3b)下试验的BmrA的提取。将在图7中制备的溶液的总(T)和可溶性(S)级分，在4℃和100 000xg下离心30min后沉积在10％SDS-PAGE上。DDM＝β-D-十二烷基麦芽糖苷；LMNG：月桂基麦芽糖新戊二醇(Chae,P.S.等，([6]))。FA3＝面部两亲物#3(Lee,S.C.等，([9]))。

图9描绘了在DDM中(由圆圈表示的点)和向其添加有本发明的化合物(3.7c，由正方形表示的点，3.7g，由菱形表示的点)或向其添加有FA3(由三角形表示的点)的纯化的BmrA随时间的稳定性。如实施例13中所示例的，测量了ATP酶活性(％)随纯化后温育的天数的变化。

图10示出了在DDM(虚线)或本发明的化合物3.7c(实线)存在下ABC膜蛋白BmrA在Superdex S200 5/150柱上通过排阻层析的分离。将所述膜级分在DDM中提取并通过Ni-NTA金属亲和和Superdex200孔径排阻纯化，然后重新装载到Ni-NTA上，以便使所述DDM与其自身或化合物3.7c交换。然后如所指示的将每种合并物装载到3ml Superdex S200 5/150孔径排阻柱上，并在2CMC相同去污剂存在下洗脱。蛋白质通过280nm处的吸收值来检测。

图11表示膜蛋白BmrA在本发明的化合物存在下的热稳定性。A.去污剂和本发明的化合物对BmrA的热稳定作用(从左至右：DDM，LMNG，3.7d，3.7c，3.7b，3.7a，3.7i，3.7j，3.7k，3.7f和3.7e)。将膜级分用含有或不含1mM去污剂和本发明的化合物的10mM DDM提取，澄清，并在所示温度静置30min，然后离心，对上清液进行SDS-PAGE和Western Blot检测，以定量表示剩余的膜蛋白(2-4个实验)。B：使用DDM和3.7c的实施例。

具体实施方式

实施例

实施例1：制备本发明的化合物的方法

按照下述流程制备了属于式(I)的去污剂的不同实施例：

通用流程A：肽偶联

按照Corzana等，2006(Corzana,F.等，α-GalNAc-Ser基序的新见解：氢键形成与溶剂相互作用相比对优选构象的影响(New Insights intoα-GalNAc-Ser Motif:Influenceof Hydrogen Bonding versus Solvent Interactions on the PreferredConformation)，Journal of the American Chemical Society 128,14640-14648(2006)([15]))。向具有游离羧酸官能团的氨基酸衍生物(1equiv.)在无水DMF(15ml/mmol)中的溶液添加具有游离胺官能团或采取甲磺酸盐形式的氨基酸(2equiv.)、DIEA(5equiv.)和TBTU(1.2equiv.)。将反应混合物在惰性气氛下，在室温(RT)下搅拌3h。在添加水(15ml/mmol)后，将反应介质用***萃取。将有机相合并，用蒸馏水和饱和NaCl水溶液洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，然后在真空下浓缩。将粗产物通过硅胶柱层析进行纯化。

通用流程B1：Fmoc基团的去保护

向以Fmoc形式保护的胺(1equiv.)在无水CH₂Cl₂(20ml/mmol)中的溶液添加二乙胺(20equiv.)。在RT和N₂下搅拌过夜后，将反应介质在真空下浓缩。将残留物转移到CH₂Cl₂中。将该溶液用NaHCO₃饱和溶液洗涤，经K₂CO₃干燥，然后在真空下浓缩。

通用流程B2：Fmoc基团的去保护

与B1一致的流程，区别在于将二乙胺用哌啶代替。

通用流程C：酰胺形成

向去保护的胺(1equiv.)在无水CH₂Cl₂(30ml/mmol)中的溶液添加酰基氯(2equiv.)、DMAP(0.5equiv.)和吡啶(34equiv.)。在RT和N₂下搅拌过夜后，通过添加10％HCl的水性溶液将反应介质酸化(pH＝3)。将所述反应介质用CH₂Cl₂萃取。将有机相合并，用饱和NaCl水溶液洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，然后在真空下浓缩。将粗产物通过硅胶柱层析进行纯化。

通用流程D1：催化加氢

向苯甲基酯(1equiv.)在MeOH(100ml/mmol)中的溶液添加10％Pd/C(200mg/mmol)。在H₂和RT下搅拌4小时至一夜后，将所述反应介质在

上过滤，然后在真空下浓缩。将获得的粗产物不需纯化直接用于下一步骤中。在PEG化的去污剂的情况下，将残留物用环己烷和/或CH₂Cl₂洗涤。

通用流程D2：催化加氢

向苯甲基酯(1equiv.)在THF(30ml/mmol)中的溶液添加5％Pd/C(120mg/mmol)。在H₂和RT下搅拌过夜后，将反应介质在上过滤，然后在真空下浓缩。将获得的粗产物不需纯化直接用于下一步骤中。

通用流程E：叔丁基(tBu)基团的去保护

按照Christensen等，2005(Christensen,C.A.&Meldal,M.，基于肽的膦配体的高效固相合成：通往选择性过渡金属催化剂的组合文库(Efficient solid-phase synthesisof peptide-based phosphine ligands:towards combinatorial libraries ofselective transition metal catalysts)，Chemistry 11,4121-4131,doi:10.1002/chem.200500105(2005)([16]))。在0℃下向以叔丁基醚形式保护的醇(1equiv.)在CH₂Cl₂(12ml/mmol)中的溶液添加三氟乙酸TFA(4ml/mmol)。在RT和N₂下搅拌过夜后，将反应介质在真空下干燥。将残留物转移到CH₂Cl₂中，然后添加2M NaOH水溶液(pH＝11-12)。将水性相用EtOAc洗涤，然后用浓HCl溶液酸化(pH＝1-2)，然后用EtOAc萃取。将有机相合并，经MgSO₄干燥，过滤，并在真空下浓缩。将残留物用CH₂Cl₂洗涤，以消除残留的脂肪酸。

通用流程F：甲基或乙基酯的去保护

向以甲基酯或乙基酯形式保护的酸(1equiv.)在THF(10.4ml/mmol)中的溶液添加LiOH(5equiv.)在水(10.4ml/mmol)中的溶液。将反应介质在RT搅拌4h。在添加5％H₃PO₄水溶液后(pH＝1-2)，将反应介质用EtOAc萃取(除非所需化合物沉淀；在这种情况下，将它用事先冷却的蒸馏水洗涤)。将有机相合并，用饱和N_aCl水溶液洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，然后在真空下浓缩。随后将粗产物通过C18反相柱层析(洗脱剂：H₂O，然后是MeOH)进行纯化。

通用流程G：Boc基团的去保护

在0℃下向通过Boc基团保护的胺(1equiv.)在无水CH₂Cl₂(5ml/g)中的溶液添加TFA(2.5ml/g)。在RT和N₂下搅拌4-5h后，将反应介质在真空下浓缩。将残留物转移到CH₂Cl₂中，并添加NaOH水性溶液(2M)(pH＝11-12)。将水性相用EtOAc洗涤，用浓HCl溶液酸化(pH＝1-2)，用CH₂Cl₂洗涤，然后用EtOAc萃取。将有机相合并，经MgSO₄干燥，过滤，然后在真空下浓缩。将获得的粗产物不需纯化直接用于下一步骤中。

通用流程I：Huisgen环加成

按照Munteanu等，2008(Munteanu,M.,Choi,S.&Ritter,H.，通过微波辅助的点击反应合成环糊精甲基丙烯酸酯(Cyclodextrin Methacrylate via Microwave-AssistedClick Reaction)，Macromolecules41,9619-9623(2008)([18]))。向炔烃(1equiv.)、以乙酸酯或叠氮基-PEG形式保护的叠氮基糖(1-1.5equiv.)、CuSO₄.5H₂O(0.1equiv.)和抗坏血酸钠(0.2equiv.)在DMF(6ml/mmol)中的溶液添加几滴水。将反应混合物在微波辐射下在140℃搅拌1h。在添加水后，将反应介质用EtOAc萃取。将有机相合并，经MgSO₄干燥，过滤，然后在真空下浓缩。将粗产物通过硅胶柱层析进行纯化。

通用流程J：脱乙酰化反应

按照Chae,P.S.等，2010([6])。向以乙酸酯形式保护的糖衍生物(1equiv.)在MeOH(16.7ml/mmol)中的溶液添加MeONa(0.2equiv.)。在RT下搅拌过夜后，添加质子交换树脂(Dowex-H⁺)，将反应介质搅拌30min，然后过滤。将滤液在真空下浓缩，并将获得的粗产物不需纯化直接用于下一步骤中。

通用流程K：(Na,K)羧酸盐的形成

向羧酸(1equiv.)在极少量MeOH中的溶液添加MeONa或MeOK(每个待成盐的羧酸官能团1equiv.)。在搅拌5min后，蒸发掉溶剂，以固体形式回收最终产物。

通用流程L：三苯甲基去保护和硫醇-烯偶联

在0℃和Et₃SiH(1.5equiv.)存在下向L-Fmoc-Cys(Trt)-OH(1equiv.)在CH₂Cl₂(10ml/g)中的悬液添加TFA(5ml/g)。在搅拌3h后，将反应介质在真空下浓缩，得到灰色固体。将该残留物、烯烃(1.2equiv.)和DMPA光引发剂(0.5equiv.)溶解在THF(7.5ml/g)中。将所述介质在RT和UV下搅拌3h。在真空下浓缩后，将粗产物通过硅胶柱层析进行纯化。

实施例2：化合物实施例1.1至1.5

i.CH₃(CH₂)₁₁NH₂，TBTU，DIEA，DMF；ii.哌啶/DMF 20:80；iii.丙烯酸乙酯，MeOH；iv.丙烯酸苯甲基酯，70℃；v.LiOH，THF，H₂O，RT；vi.TFA，CH₂Cl₂，RT；vii.H₂，Pd/C 10％，MeOH。

化合物1.1

向Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0g，7.82mmol，1equiv.)在DMF(300ml)中的溶液添加十二胺(2.9g，15.64mmol，2equiv.)，然后添加DIEA(6.8ml,39.11mmol，5equiv.)和TBTU(3.01g，9.38mmol，1.2equiv.)。在RT下搅拌4h后，将反应介质在真空下浓缩并用***稀释。将有机相用NaCl饱和溶液、HCl(0.1N)溶液、然后用NaHCO₃溶液(5％)相继洗涤，然后经Na₂SO₄干燥，过滤，并在真空下浓缩。将获得的残留物转移到哌啶/DMF混合物(20:80，300ml)中。在RT下搅拌1h后，将反应介质随后在真空下浓缩。将得到的粗产物通过硅胶柱层析(CH₂Cl₂/MeOH98:2)进行纯化，给出黄色油状物形式的预期化合物(2.44g，7.43mmol，95％)。Rf＝0.45(CH₂Cl₂/MeOH 95:5)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.89(t,J＝7.2Hz,3H),1.20(s,9H),1.26-1.35(m,22H),3.25(q,J＝4.4Hz,2H),3.42-3.51(m,2H),3.62(dd,J＝4.0,4.0Hz,1H),7.39(m,1H)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm14.4(CH₃),23.0(CH₂),27.3(CH₂),27.8(3xCH₃),29.6(2xCH₂),29.9(3xCH₂),30.0(CH₂),32.0(CH₂),36.8(CH₂),39.4(CH₂),55.7(CH),64.3(CH₂),73.7(C),173.2(C)；质量(ESI+)：m/z(％)329[M+H]⁺(100)。

化合物1.2

向中间体1.1(1.06g，3.22mmol，1equiv.)在甲醇(3.5ml)中的溶液添加丙烯酸乙酯(1.37ml，12.9mmol，2.5equiv.)。将混合物用氮气冲刷，用铝箔覆盖并在RT下搅拌5天。将得到的粗产物通过硅胶柱层析(CH₂Cl₂/MeOH 95:5)进行纯化，给出黄色油状物形式的预期化合物(1.24g，2.90mmol，83％)。Rf＝0.56(CH₂Cl₂/MeOH 98:2)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.89(t,J＝6.8Hz,3H),1.13(s,9H),1.22-1.25(m,25H),1.46-1.49(m,2H),2.04(m,1H),2.44(t,J＝6.0Hz,2H),2.79-2.83(m,2H),3.16(dd,J＝4.0,4.0Hz,1H),3.20(q,J＝6.8Hz,2H),3.29(t,J＝4.8Hz,1H),3.62(dd,J＝4.0,4.0Hz,1H),4.12(q,J＝7.2Hz,2H),7.46(t,J＝4.8Hz,1H)；¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δppm14.3(CH₃),14.4(CH₃),22.8(CH₂),27.1(CH₂),27.7(3xCH₃),29.5-29.8(7xCH₂),32.1(CH₂),35.0(CH₂),39.2(CH₂),44.0(CH₂),60.7(CH₂),62.6(CH),63.5(CH₂),73.5(C),172.0(C),172.7(C)；质量(ESI+)：m/z(％)429[M+H]⁺(100)；HRMS(ESI+)m/z为C₂₄H₄₉N₂O₄的计算值为429.3692，实测值为429.3696。

化合物1.3

将中间体1.2(1.40g，3.26mmol，1equiv)和丙烯酸苯甲基酯(1.32g，8.16mmol，2.5equiv.)的溶液在70℃搅拌7天，然后将反应介质在真空下浓缩。将得到的粗产物通过硅胶柱层析(CH₂Cl₂ 100％)进行纯化，给出黄色油状物形式的预期化合物(640mg，1.07mmol，33％)。Rf＝0.47(CH₂Cl₂/MeOH 98:2)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.80(t,J＝6.8Hz,3H),1.10(s,9H),1.13-1.25(m,22H),1.40(m,2H),2.30-2.52(m,4H),2.87-3.04(m,4H),3.09(q,J＝6.4Hz,2H),3.38(dd,J＝8.8,4.4Hz,1H),3.57(ddd,J＝19.2,12.8,3.2Hz,1H),3.89(dd,J＝6.0,2.4Hz,1H),4.04(q,J＝7.2Hz,2H),5.04(s,2H),7.23-7.33(m,5H),7.51(t,J＝6.0Hz,1H)；¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 14.1(CH₃),14.2(CH₃),22.7(CH₂),27.0(CH₂),27.5(3xCH₃),29.4-29.7(7xCH₂),31.9(2xCH₂),33.5(CH₂),39.2(CH₂),47.0(2xCH₂),60.0(CH₂),60.4(CH₂),65.1(CH),66.3(CH₂),73.3(C),128.3-128.6(5xCH),136.3(C),171.6(C),172.4(C),172.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)613(46)[M+Na]⁺,591(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₄H₅₉N₂O₆的计算值为591.4373，实测值为591.4384。

化合物1.4

遵照通用流程F然后是K(然而不进行酸-碱洗涤)，从化合物1.2(59mg，0.13mmol)得到化合物1.4(黄色油状物，17mg，0.05mmol，38％)；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.64(t,J＝8.0Hz,3H),1.06-1.07(m,18H),1.27-1.31(m,2H),2.55(t,J＝8.0Hz,2H),3.00(t,J＝8.0Hz,2H),3.04-3.05(m,2H),3.60(dd,J＝8.0,8.0Hz,1H),3.69-3.77(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm 14.3(CH₃),23.6(CH₂),27.4(CH₂),27.8(CH₂),30.1(CH₂),30.2(CH₂),30.3(CH₂),30.5(CH₂),30.6(3xCH₂),32.9(CH₂),40.8(CH₂),43.5(CH₂),60.4(CH),60.9(CH₂),167.0(2xC)；质量(ESI+)m/z(％)345(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₁₈H₃₇N₂O₄的计算值为345.2747，实测值为345.2746。

化合物1.5

遵照通用流程D1、F然后是K(然而不进行酸-碱洗涤)，从化合物1.3(300mg，0.50mmol)得到化合物1.5(黄色油状物，147mg，0.35mmol，72％)；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.90(t,3H,J＝8.0Hz),1.22-1.37(m,22H),1.53-1.57(m,2H),2.90(t,J＝8.0Hz,4H),3.18-3.29(m,3H),3.64(m,J＝8.0Hz,4H),4.08(t,J＝4.0Hz,1H),4.16-4.18(m,1H),8.42(t,J＝4.0Hz,NH)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm 14.5(CH₃),17.9(CH₂),23.8(CH₂),24.3(CH₂),28.1(CH₂),29.8(CH₂),30.2(CH₂),30.5(CH₂),30.6(CH₂),30.8(2xCH₂),33.2(2xCH₂),41.0(CH₂),54.9(2xCH₂),59.4(CH),69.2(CH₂),173.8(3xC)；质量(ESI+)m/z(％)417(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₂₁H₄₁N₂O₆的计算值为417.2959，实测值为417.2956。

实施例3:化合物2.1至2.3

i.TBTU，DIEA，DMF；ii.Et₂NH，CH₂Cl₂；iii.RCOCl，DMAP，吡啶，CH₂Cl₂；iv.RCOOH，TBTU，DIEA，DMF；v.H₂，Pd/C，MeOH；vi.TFA，CH₂Cl₂。

实施例2.1a

遵照通用流程A(纯化：硅胶柱层析，洗脱剂：环己烷/EtOAc 9:1至7:3)，从商品化合物Fmoc-L-Ser(t-Bu)-OH(2.00g，5.22mmol)和H-D-Asp(OBn)-OBn对甲苯磺酸盐(5.07g，10.43mmol)得到化合物2.1a(白色固体，2.95g，4.34mmol，83％)。

Rf＝0.32(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝115-117℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 1.15(s,9H),2.82-2.96(m,1H),3.06(dd,J＝17.1,4.6Hz,1H),3.38(dd,J＝8.3,8.3Hz,1H),3.74-3.77(m,1H),4.19-4.26(m,2H),4.35-4.37(m,2H),4.88-4.93(m,1H),5.01(s,2H),5.12(s,2H),5.74(d,J＝3.6Hz,1H),7.25-7.34(m,12H,H3”),7.38(dd,J＝7.5,7.5Hz,2H),7.59-7.61(m,2H),7.65(d,J＝6.3Hz,1H),7.74(d,J＝7.5Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 27.5(3xCH₃),36.6(CH₂),47.3(CH),49.0(CH),54.8(CH),61.7(CH₂),66.9(CH₂),67.3(CH₂),67.7(CH₂),74.4(C),120.1(2xCH),125.3(2xCH),127.3(2xCH),127.9(2xCH),128.4(CH),128.5(CH),128.6(CH),128.6(CH),128.7(CH),135.3(C),135.5(C),141.5(2xC),143.9(2xC),156.2(C),170.3(2xC),170.6(C)；质量(ESI+)m/z(％)426(100),701(60)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₄₀H₄₃N₂O₈的计算值为679.3019，实测值为679.3013。

实施例2.1b

遵照通用流程A(修改：在添加水后，所需化合物沉淀，并通过在CH₂Cl₂/Et₂O混合物中重结晶进行纯化)，从商品化合物Fmoc-L-Ser(t-Bu)-OH(3.5g，9.12mmol)和H-D-Glu(OBn)-OBn对甲苯磺酸盐(9g，18.24mmol)得到化合物2.1b(白色固体，5.14g，7.42mmol，81％)。

Rf＝0.50(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝126-128℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 1.19(s,9H),1.99-2.11(m,1H),2.22-2.35(m,1H),2.32-2.55(m,2H),3.41(dd,J＝8.3,8.3Hz,1H),3.75-3.87(m,1H),4.23(t,J＝7.1Hz,1H),4.24-4.33(m,1H),4.40(d,J＝6.8Hz,2H),4.68-4.76(m,1H),5.09(s,2H),5.17(s,2H),5.78(bs,1H),7.21-7.46(m,15H),7.61(d,J＝7.0Hz,2H),7.76(d,J＝7.5Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 27.4(3xCH₃),27.5(CH₂),30.0(CH₂),47.1(CH),51.8(CH),54.6(CH),61.7(CH₂),66.5(CH₂),67.2(CH₂),67.4(CH₂),74.3(C),120.0(2xCH),125.1(2xCH),127.1(2xCH),127.7(2xCH),128.2-128.7(10xCH),135.1(C),135.7(C),141.3(2xC),143.7(2xC),156.1(C),170.1(C),171.2(C),172.3(C)；质量(ESI+)m/z(％)426(100),570(3),715(1)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₄₁H₄₅N₂O₈的计算值为693.3176，实测值为693.3156。

实施例2.2a

遵照通用流程B然后是C，从化合物2.1a得到化合物2.2a(白色固体，105mg，0.16mmol，27％)。

Rf＝0.30(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝59-61℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.9Hz,3H),1.16(s,9H),1.18-1.36(m,20H),1.56-1.67(m,2H),2.20(t,J＝7.2Hz,2H),2.89(dd,J＝17.1,4.7Hz,1H),3.07(dd,J＝17.1,4.7Hz,1H),3.27(dd,J＝8.6,8.6Hz,1H),3.79(dd,J＝8.6,4.1Hz,1H),4.43-4.50(m,1H),4.87-4.93(m,1H),5.06(s,2H),5.13(s,2H),6.36(d,J＝6.3Hz,1H,NH),7.26-7.38(m,10H),7.60(d,J＝8.1Hz,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.2(CH₃),22.8(CH₂),25.6(CH₂),27.4(3xCH₃),29.4-29.8(8xCH₂),32.0(CH₂),36.5(CH₂),36.7(CH₂),48.9(CH),53.1(CH),61.3(CH₂),66.9(CH₂),67.6(CH₂),74.3(C),128.5-128.8(10xCH),135.3(C),135.5(C),170.3(C),170.6(C),170.6(C),173.4(C)；质量(ESI+)m/z(％)690(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₉H₅₉N₂O₇的计算值为667.4322，实测值为667.4318。

实施例2.2b

遵照通用流程B然后是C，从化合物2.1b得到化合物2.2b(白色固体，67mg，0.11mmol，39％)。

Rf＝0.35(7:3环己烷/EtOAc)；Tm＝86℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.87(t,3H,J＝7.0Hz),1.17(s,9H),1.23-1.38(m,8H),1.57-1.72(m,2H),1.98-2.11(m,1H),2.19-2.35(m,3H),2.35-2.53(m,2H),3.38(t,J＝8.5Hz,1H),3.78(dd,J＝8.8,4.2Hz,1H),4.53-4.60(m,1H),4.67-4.75(m,1H),5.10(s,2H),5.15(s,2H),6.66(d,J＝6.9Hz,1H,NH),7.27-7.38(m,10H),7.45(d,J＝7.9Hz,1H,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.1(CH₃),22.6(2xCH₂),27.4(3xCH₃),27.5(CH₂),29.0-30.0(3xCH₂),31.7(CH₂),36.6(CH₂),51.8(CH),53.0(CH),61.3(CH₂),66.5(CH₂),67.41(CH₂),74.4(3xCH₃),128.3-128.7(10xCH),135.1(C),135.8(C),170.36(C),171.23(C),172.34(C),173.34(C)；质量(ESI+)m/z(％)597(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₄H₄₉N₂O₇的计算值为597.3540，实测值为597.3538。

实施例2.2c

遵照通用流程B然后是C，从化合物2.1b得到化合物2.2c(白色固体，69mg，0.11mmol，39％)。

Rf＝0.38(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝91℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.87(t,J＝7.0Hz,3H),1.17(s,9H),1.22-1.38(m,10H),1.56-1.70(m,2H),1.98-2.10(m,1H),2.18-2.34(m,3H),2.36-2.53(m,2H),3.41(t,J＝8.5Hz,1H),3.76(dd,J＝8.9,4.1Hz,1H),4.57-4.64(m,1H),4.68-4.76(m,1H),5.09(s,2H),5.14(s,2H),6.75(d,J＝6.9Hz,1H,NH),7.26-7.38(m,10H),7.53(d,J＝7.9Hz,1H,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.2(CH₃),22.8(2xCH₂),27.5(3xCH₃),27.7(CH₂),29.3-30.1(4xCH₂),32.0(CH₂),36.7(CH₂),51.9(CH),53.1(CH),61.4(CH₂),66.7(CH₂),67.5(CH₂),74.5(C),128.4-128.8(10xCH),135.2(C),135.9(C),170.5(C),171.3(C),172.5(C),173.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)633(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₅H₅₁N₂O₇的计算值为611.3696，实测值为611.3681。

实施例2.2d

遵照通用流程B然后是C，从化合物2.1b得到化合物2.2d(白色固体，195mg，0.31mmol，45％)。

Rf＝0.18(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝82-85℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.87(t,J＝6.9Hz,3H),1.16(s,9H),1.19-1.35(m,12H),1.55-1.66(m,2H),1.96-2.07(m,1H),2.21(t,J＝7.8Hz,2H),2.21-2.30(m,1H),2.32-2.50(m,2H),3.31(dd,J＝8.7,8.7Hz,1H),3.80(dd,J＝8.7,4.2Hz,1H),4.44-4.50(m,1H),4.65-4.72(m,1H),5.08(s,2H),5.15(s,2H),6.40(d,J＝6.4Hz,1H,NH),7.27-7.36(m,11H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.1(CH₃),22.7(2xCH₂),25.6(CH₂),27.4(3xCH₃),27.5(CH₂),29.3-29.44(4xCH₂),30.0(CH₂),31.9(CH₂),36.6(CH₂),51.8(CH),53.0(CH),61.3(CH₂),66.5(CH₂),67.3(CH₂),74.3(C),128.3-128.7(10xCH),135.2(C),135.8(C),170.4(C),171.2(C),172.3(C),173.3(C)；质量(ESI+)m/z(％)626(30)[M+H]⁺,648(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₆H₅₃N₂O₇的计算值为625.3853，实测值为625.3846。

实施例2.2e

遵照通用流程B然后是C，从化合物2.1b得到化合物2.2e(白色固体，182mg，0.28mmol，48％)。

Rf＝0.12(环己烷/EtOAc 8:2)；Tm＝67-69℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.9Hz,3H),1.17(s,9H),1.19-1.35(m,16H),1.56-1.67(m,2H),1.96-2.08(m,1H),2.21(t,J＝7.6Hz,2H),2.21-2.32(m,1H),2.32-2.50(m,2H),3.30(dd,J＝8.7,8.7Hz,1H),3.81(dd,J＝8.7,4.2Hz,1H),4.42-4.49(m,1H),4.64-4.72(m,1H),5.09(s,2H),5.16(s,2H),6.38(d,J＝6.3Hz,1H,NH),7.23-7.39(m,11H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.2(CH₃),22.8(CH₂),25.6(CH₂),27.5(3xCH₃),27.6(CH₂),29.4-29.7(6xCH₂),30.0(CH₂),32.0(CH₂),36.7(CH₂),51.9(CH),53.1(CH),61.4(CH₂),66.6(CH₂),67.5(CH₂),74.4(C),128.4-128.8(10xCH),135.2(C),135.9(C),170.4(C),171.3(C),172.4(C),173.4(C)；质量(ESI+)m/z(％)131(30),199(40),654(50)[M+H]⁺,677(100),699(20)；HRMS(ESI+)m/z为C₃₈H₅₇N₂O₇的计算值为653.4166，实测值为653.4158。

实施例2.2f

遵照通用流程B然后是C，从化合物2.1b得到化合物2.2f(白色固体，233mg，0.35mmol，50％)。

Rf＝0.24(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝68-71℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.9Hz,3H),1.17(s,9H),1.20-1.36(m,18H),1.55-1.67(m,2H),1.96-2.08(m,1H),2.21(t,J＝7.6Hz,2H),2.21-2.32(m,1H),2.32-2.50(m,2H),3.31(dd,J＝8.7,8.7Hz,1H),3.80(dd,J＝8.7,4.2Hz,1H),4.44-4.50(m,1H),4.63-4.73(m,1H),5.08(s,2H),5.15(s,2H),6.41(d,J＝6.4Hz,1H,NH),7.25-7.37(m,11H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.1(CH₃),22.7(CH₂),25.5(CH₂),27.4(3xCH₃),27.5(CH₂),29.3-29.7(7xCH₂),29.9(CH₂),31.9(CH₂),36.5(CH₂),51.8(CH),53.0(CH),61.3(CH₂),66.5(CH₂),67.3(CH₂),74.2(C),128.3-128.6(10xCH),135.2(C),135.8(C),170.4(C),171.2(C),172.3(C),173.3(C)；质量(ESI+)m/z(％)668(20)[M+H]⁺,690(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₉H₅₉N₂O₇的计算值为667.4322，实测值为667.4334。

实施例2.2g

遵照通用流程B然后是C，从化合物2.1b得到化合物2.2g(白色固体，187mg，0.27mmol，48％)。

Rf＝0.07(环己烷/EtOAc 8:2)；Tm＝71-73℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.9Hz,3H),1.17(s,9H),1.20-1.36(m,20H),1.56-1.67(m,2H),1.97-2.08(m,1H),2.21(t,J＝7.6Hz,2H),2.23-2.50(m,3H),3.29(dd,J＝8.7,8.7Hz,1H),3.80(dd,J＝8.7,4.2Hz,1H),4.41-4.49(m,1H),4.63-4.72(m,1H),5.09(s,2H),5.14(d,J＝12.3Hz,1H),5.18(d,J＝12.3Hz,1H),7.25-7.39(m,11H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.2(CH₃),22.8(CH₂),25.6(CH₂),27.5(3xCH₃),27.6(CH₂),29.4-29.8(8xCH₂),30.0(CH₂),32.0(CH₂),36.7(CH₂),51.9(CH),53.1(CH),61.4(CH₂),66.6(CH₂),67.5(CH₂),74.4(C),128.4-128.8(10xCH),135.2(C),135.8(C),170.5(C),171.3(C),172.4(C),173.4(C)；质量(ESI+)m/z(％)131(65),199(100),682(60)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₄₀H₆₁N₂O₇的计算值为681.4479，实测值为681.4447。

实施例2.2h

遵照通用流程B然后是C，从化合物2.1b得到化合物2.2h(白色固体，93mg，0.13mmol，30％)。Rf＝0.11(环己烷/EtOAc 8:2)；Tm＝69-71℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm0.86(t,J＝6.8Hz,3H),1.15(s,9H),1.19-1.31(m,24H),1.56-1.63(m,2H),1.96-2.05(m,1H),2.19(t,J＝7.6Hz,2H),2.23-2.47(m,3H),3.27(dd,J＝8.7,8.7Hz,1H),3.79(dd,J＝8.7,4.2Hz,1H),4.41-4.45(m,1H),4.63-4.68(m,1H),5.07(s,2H),5.14(s,2H),7.22-7.37(m,10H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.3(CH₃),22.9(CH₂),25.7(CH₂),27.6(3xCH₃),27.7(CH₂),29.5-30.2(11xCH₂),32.1(CH₂),36.8(CH₂),52.0(CH),53.2(CH),61.5(CH₂),66.7(CH₂),67.6(CH₂),74.6(C),128.5-128.9(10xCH),135.3(C),136.0(C),170.5(C),171.4(C),172.5(C),173.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)199(15),710(100)[M+H]⁺,732(15)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₄₂H₆₅N₂O₇的计算值为709.4792，实测值为709.4805。

实施例2.2i

遵照通用流程A(纯化：硅胶柱层析，洗脱剂：环己烷/EtOAc 9:1至7:3)，从化合物2.1b得到化合物2.2i(白色固体，162mg，0.24mmol，83％)。

Rf＝0.28(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝70-72℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 1.15(s,9H),1.94-2.06(m,1H),2.17-2.29(m,1H),2.29-2.48(m,2H),3.29(dd,J＝8.6,8.6Hz,1H),3.78(dd,J＝8.6,4.1Hz,1H),4.39-4.48(m,1H),4.60-4.71(m,1H),5.06(s,2H),5.13(s,2H),6.36(d,J＝6.4Hz,1H,NH),7.22-7.35(m,11H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 13.1(st,J_C,D＝18.6Hz,CD₃),21.4(qt,J_C,D＝18.4Hz,CD₂),24.5(qt,J_C,D＝19.2Hz,CD₂),27.4(3xCH₃),27.5(CH₂),27.2-28.8(6xCD₂),30.0(CH₂),30.5(qt,J＝18.7Hz,CD₂),35.7(qt,J＝19.5Hz,CD₂),51.8(CH),53.0(CH),61.4(CH₂),66.5(CH₂),67.4(CH₂),74.3(C),128.3-128.7(10xCH),135.2(C),135.8(C),170.4(C),171.2(C),172.3(C),173.4(C)；质量(ESI+)m/z(％)199(40),265(100),677(80)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₈H₃₄D₂₃N₂O₇的计算值为676.5610，实测值为676.5610。

实施例2.3a

遵照通用流程D1然后是K，从化合物2.2a得到化合物2.3a(白色固体，55mg，0.13mmol，98％)。

Tm＝125-135℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.2Hz,3H),1.19-1.42(m,20H),1.54-1.71(m,2H),2.23-2.33(m,2H),2.76-2.93(m,2H),3.71-3.83(m,2H),4.47(dd,J＝5.4,5.4Hz,1H),4.74(dd,J＝5.4,5.4Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),30.4-30.9(8xCH₂),33.1(CH₂),36.9(CH₂),37.0(CH₂),50.3(CH),56.7(CH),63.0(CH₂),172.2(C),174.3(C),176.5(C),176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)429(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₂₁H₃₇N₂O₇的计算值为429.2601，实测值为429.2591。

实施例2.3b

遵照通用流程D1然后是K，从化合物2.2b得到化合物2.3b(吸湿的无色固体，27mg，0.07mmol，定量)。

Tm＝39-40℃；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.89(t,J＝7.0Hz,3H),1.23-1.39(m,8H),1.57-1.67(m,2H),1.90-2.02(m,1H),2.16-2.32(m,3H),2.40(t,J＝7.5Hz,2H),3.72-3.84(m,2H),4.42-4.50(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm 14.4(CH₃),23.6(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),30.1-31.1(3xCH₂),32.8(CH₂),36.9(CH₂),53.3(CH),56.7(CH),63.0(CH₂),172.6(C),175.0(C),176.5(C),176.6(C)；质量(ESI-)m/z(％)360(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₁₆H₂₇N₂O₇的计算值为359.1818，实测值为359.1803。

实施例2.3c

遵照通用流程D1然后是K，从化合物2.2c得到化合物2.3c(吸湿的无色固体，31mg，0.08mmol，定量)。

Tm＝46℃；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.89(t,J＝7.0Hz,3H),1.22-1.40(m,10H),1.56-1.68(m,2H),1.90-2.02(m,1H),2.15-2.32(m,3H),2.40(t,J＝7.7Hz,2H),3.73-3.83(m,2H),4.43-4.50(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),30.2-31.1(4xCH₂),33.0(CH₂),36.9(CH₂),53.3(CH),56.7(CH),63.0(CH₂),172.6(C),175.1(C),176.5(C),176.6(C)；质量(ESI-)m/z(％)373(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₁₇H₂₉N₂O₇的计算值为373.1975，实测值为373.1992。

实施例2.3d

遵照通用流程D1然后是K，从化合物2.2d得到化合物2.3d(白色固体，182mg，0.47mmol，94％)。

Tm＝53-57℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.89(t,J＝6.8Hz,3H),1.22-1.38(m,12H),1.56-1.69(m,2H),1.90-2.03(m,1H),2.14-2.26(m,1H),2.29(t,J＝7.3Hz,2H),2.36-2.43(m,2H),3.73-3.84(m,2H),4.42-4.52(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),30.3-30.5(4xCH₂),31.1(CH₂),33.0(CH₂),36.9(CH₂),53.3(CH),56.6(CH),63.1(CH₂),172.5(C),174.9(C),176.5(C),176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)387(100)[M-H]^-,404(20)；HRMS(ESI-)m/z为C₁₈H₃₁N₂O₇的计算值为387.2131，实测值为387.2140。

实施例2.3e

遵照通用流程D1然后是K，从化合物2.2e得到化合物2.3e(白色固体，1.683g，4.04mmol，70％)。

Tm＝100-102℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.9Hz,3H),1.22-1.38(m,16H),1.57-1.67(m,2H),1.91-2.01(m,1H),2.15-2.26(m,1H),2.29(t,J＝7.2Hz,2H),2.37-2.44(m,2H),3.72-3.81(m,2H),4.43-4.51(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),30.4-30.7(6xCH₂),31.0(CH₂),33.1(CH₂),36.9(CH₂),53.1(CH),56.6(CH),63.1(CH₂),172.6(C),174.6(C),176.4(C),176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)157(40),199(30),387(80),415(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₂₀H₃₅N₂O₇的计算值为415.2444，实测值为415.2447。

实施例2.3f

遵照通用流程D1然后是K，从化合物2.2f得到化合物2.3f(白色固体，115mg，0.27mmol，89％)。

Tm＝58-63℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.89(t,J＝6.9Hz,3H),1.21-1.41(m,16H),1.54-1.68(m,2H),1.90-2.04(m,1H),2.14-2.27(m,1H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.36-2.48(m,2H),3.71-3.83(m,2H),4.43-4.53(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.8(CH₂),30.3-30.9(7xCH₂),31.0(CH₂),33.0(CH₂),36.9(CH₂),53.1(CH),56.6(CH),63.1(CH₂),172.6(C),174.6(C),176.4(C),176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)429(100)[M-H]^-,446；HRMS(ESI-)m/z为C₂₁H₃₇N₂O₇的计算值为429.2601，实测值为429.2599。

实施例2.3g

遵照通用流程D1然后是K，从化合物2.2g得到化合物2.3g(白色固体，57mg，0.13mmol，定量)。

Tm＝109-112℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.19-1.39(m,20H),1.57-1.67(m,2H),1.90-2.02(m,1H),2.16-2.26(m,3H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.36-2.45(m,2H),3.71-3.84(m,2H),4.43-4.52(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),30.4-30.9(8xCH₂),31.1(CH₂),33.0(CH₂),36.9(CH₂),53.3(CH),56.6(CH),63.1(CH₂),172.6(C),174.9(C),176.5(C),176.5(C).Mass(ESI-)m/z(％)443(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₂₂H₃₉N₂O₇的计算值为443.2757，实测值为443.2754。

实施例2.3h

遵照通用流程D1然后是K，从化合物2.2h得到化合物2.3h(白色固体，36mg，0.08mmol，65％)。

Tm＝111-113℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.19-1.37(m,24H),1.55-1.68(m,2H),1.90-2.03(m,1H),2.15-2.26(m,1H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.36-2.44(m,2H),3.72-3.82(m,2H),4.43-4.52(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),30.4-30.8(10xCH₂),31.1(CH₂),33.1(CH₂),36.9(CH₂),53.2(CH),56.6(CH),63.1(CH₂),172.6(C),174.7(C),176.5(C),176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)471(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₂₄H₄₃N₂O₇的计算值为471.3070，实测值为471.3057。

实施例2.3i

遵照通用流程D1然后是K，从化合物2.2i得到化合物2.3i(白色固体，33mg，0.08mmol，75％)。

Tm>80℃(分解)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 1.90-2.03(m,1H),2.14-2.27(m,1H),2.33-2.48(m,2H),3.72-3.84(m,2H),4.41-4.54(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm13.3(st,J_C,D＝19.8Hz,CD₃),22.4(qt,J_C,D＝19.6,Hz,CD₂),25.7(qt,J_C,D＝20.2Hz,CD₂),27.9(CH₂),28.6-29.9(6xCD₂),31.1(CH₂),31.7(qt,J_C,D＝16.9Hz,CD₂),36.1(qt,J_C,D＝21.1Hz,CD₂),53.2(CH),56.6(CH),63.1(CH₂),172.6(C),174.8(C),176.5(C),176.6(C)；质量(ESI-)m/z(％)438(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₂₀H₁₂D₂₃N₂O₇的计算值为438.3888，实测值为438.3889。

实施例4：化合物3.1至3.9

i.烯丙基溴或炔丙基溴，NaH，DMF；ii.H-D-Glu(OBn)-OBn对甲苯磺酸盐或H-L-Glu(OBn)-Gly-OBn，TBTU，DIEA，DMF；iii.TFA，CH₂Cl₂；iv.R³COCl，DMAP，吡啶，CH₂Cl₂；vi.叠氮基糖(乙酸酯)或PEG-N₃或N₃-PEG-N₃，CuSO₄.5H₂O，抗坏血酸钠，DMF，H₂O；vii.MeONa，MeOH，然后是Dowex；viii.LiOH，THF/H₂O；ix.H₂，Pd/C，MeOH。其中R¹＝Ac-糖或PEG；R^1a＝糖或PEG；R²＝–OBn或–NHCH₂COOBn；R^2a＝–OH或–NHCH₂COOH；R³＝–(CH₂)_nCH₃、–CH[(CH₂)_nCH₃]₂或–(CH₂)_n环己基。

化合物3.1b

按照上述流程(实施例3.1a)，使用炔丙基溴得到产物3.1b(微黄色油状物，915mg，3.76mmol，77％)。得到的粗产物(无色油状物)被直接用于下一步骤。

化合物3.2b

遵照通用流程A(纯化：硅胶柱层析，洗脱剂：环己烷/EtOAc 9:1至7:3)，从化合物3.1a得到化合物3.2b(微黄色油状物，1.91g，3.45mmol，77％)。

Rf＝0.33(环己烷/EtOAc 7:3)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm1.44(s,9H),1.95-2.08(m,1H),2.22-2.32(m,1H),2.32-2.53(m,3H),3.66(dd,J＝9.3,6.1Hz,1H),3.87(dd,J＝9.3,4.0Hz,1H),4.08(dd,J＝15.9,2.4Hz,1H),4.15(dd,J＝15.9,2.4Hz,1H),4.25-4.38(m,1H),4.66-4.74(m,1H),5.08(s,2H),5.15(s,2H),5.38(s,1H,NH),6.98(d,J＝7.9Hz,1H,NH),7.26-7.39(m,10H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 27.4(CH₂),28.3(3xCH₃),30.0(CH₂),51.7(CH),54.0(CH),58.6(CH₂),66.5(CH₂),67.4(CH₂),69.3(CH₂),75.4(CH),79.0(C),80.4(C),128.3-128.7(10xCH),135.2(C),135.8(C),155.6(C),170.0(C),171.4(C),172.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)453(40),497(35),553(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₀H₃₇N₂O₈的计算值为553.2550，实测值为553.2528。

化合物3.2c

遵照通用流程A(纯化：硅胶柱层析，洗脱剂：环己烷/EtOAc 9:1至7:3)，从化合物3.1b和H-L-Glu(OBn)-Gly-OBn(未描述)得到化合物3.2c(微黄色油状物，886mg，1.45mmol，65％)。

Rf＝0.28(环己烷/EtOAc 5:5)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm1.43(s,9H),1.99-2.13(m,1H),2.15-2.27(m,1H),2.39(t,J＝2.4Hz,1H),2.42-2.54(m,1H),2.54-2.66(m,1H),3.69(dd,J＝9.2,5.6Hz,1H),3.86(dd,J＝9.3,4.4Hz,1H),3.95(dd,J＝17.9,5.1Hz,1H),4.12(dd,J＝17.9,6.0Hz,1H),4.09(dd,J＝15.8,2.4Hz,1H),4.14(dd,J＝15.8,2.4Hz,1H),4.22-4.32(m,1H),4.52-4.61(m,1H),5.11(d,J＝12.4Hz,1H),5.12(d,J＝12.2Hz,1H),5.14(d,J＝12.4Hz,1H),5.17(d,J＝12.2Hz,1H),5.41(d,J＝5.3Hz,1H,NH),7.15(bs,1H,NH),7.28-7.43(m,10H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 26.9(CH₂),28.4(3xCH₃),30.5(CH₂),52.9(CH),54.7(CH),58.8(CH₂),66.8(CH₂),67.2(CH₂),69.5(CH₂),75.6(CH),78.9(C),80.8(C),128.4-128.7(10xCH),135.4(C),135.8(C),155.9(C),169.5(C),170.3(C),171.2(C),174.0(C)；质量(ESI+)m/z(％)610(15)[M+H]⁺,632(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₂H₄₀N₃O₉的计算值为610.2765，实测值为610.2764。

化合物3.3d

遵照通用流程G然后是C，从化合物3.2b得到化合物3.3d(白色固体，813mg，1.34mmol，67％)。

Rf＝0.13(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝93-94℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.87(t,J＝6.9Hz,3H),1.19-1.35(m,12H),1.56-1.67(m,2H),1.97-2.10(m,1H),2.16-2.32(m,3H),2.32-2.51(m,3H),3.62(dd,J＝9.2,6.6Hz,1H),3.88(dd,J＝9.2,4.0Hz,1H),4.10(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.18(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.58-4.72(m,2H),5.09(s,2H),5.15(s,2H),6.32(d,J＝7.0Hz,1H,NH),7.02(d,J＝7.8Hz,1H,NH),7.28-7.40(m,10H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.2(CH₃),22.8(CH₂),25.6(CH₂),27.3(CH₂),29.4-29.5(4xCH₂),30.1(CH₂),32.0(CH₂),36.7(CH₂),52.0(CH),52.4(CH),58.7(CH₂),66.7(CH₂),67.5(CH₂),69.0(CH₂),75.5(CH),79.0(C),128.4-128.8(10xCH),135.2(C),135.9(C),169.8(C),171.3(C),172.6(C),173.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)491(100),608(20)[M+H]⁺,630(95)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₅H₄₇N₂O₇的计算值为607.3383，实测值为607.3373。

化合物3.3e

遵照通用流程G然后是C，从化合物3.2b得到化合物3.3e(白色固体，651mg，1.03mmol，77％)。

Rf＝0.16(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝99-100℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.9Hz,3H),1.19-1.35(m,16H),1.56-1.67(m,2H),1.96-2.09(m,1H),2.16-2.31(m,3H),2.32-2.50(m,3H),3.62(dd,J＝9.2,6.6Hz,1H),3.89(dd,J＝9.2,4.0Hz,1H),4.10(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.18(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.59-4.72(m,2H),5.09(s,2H),5.15(s,2H),6.32(d,J＝7.0Hz,1H,NH),7.02(d,J＝7.8Hz,1H,NH),7.27-7.39(m,10H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.2(CH₃),22.8(CH₂),25.6(CH₂),27.3(CH₂),29.4-29.7(6xCH₂),30.1(CH₂),32.0(CH₂),36.7(CH₂),52.0(CH),52.4(CH),58.7(CH₂),66.7(CH₂),67.5(CH₂),69.0(CH₂),75.5(CH),79.0(C),128.4-128.8(10xCH),135.2(C),135.9(C),169.8(C),171.3(C),172.6(C),173.5(C1')；质量(ESI+)m/z(％)636(25)[M+H]⁺,658(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₇H₅₁N₂O₇的计算值为635.3696，实测值为635.3697。

化合物3.3f

遵照通用流程G然后是C，从化合物3.2b得到化合物3.3f(白色固体，1.085g，1.64mmol，84％)。

Rf＝0.21(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝101-103℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.8Hz,3H),1.17-1.37(m,20H),1.56-1.66(m,2H),1.97-2.08(m,1H),2.14-2.32(m,3H),2.32-2.50(m,3H),3.62(dd,J＝9.2,6.6Hz,1H),3.89(dd,J＝9.2,4.1Hz,1H),4.10(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.17(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.62-4.72(m,2H),5.09(s,2H),5.15(s,2H),6.39(d,J＝7.1Hz,1H,NH),7.10(d,J＝7.9Hz,1H,NH),7.28-7.39(m,10H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.2(CH₃),22.8(CH₂),25.6(CH₂),27.2(CH₂),29.4-29.8(8xCH₂),30.1(CH₂),32.0(CH₂),36.6(CH₂),51.9(CH),52.4(CH),58.7(CH₂),66.6(CH₂),67.5(CH₂),69.0(CH₂),75.5(CH),79.0(C),128.4-128.8(10xCH),135.2(C),135.8(C),169.8(C),171.3(C),172.6(C),173.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)199(15),664(100)[M+H]⁺,686(20)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₉H₅₅N₂O₇的计算值为663.4009，实测值为663.4006。

化合物3.3g

遵照通用流程G然后是C，从化合物3.2b得到化合物3.3g(白色固体，467mg，0.64mmol，47％)。

Rf＝0.18(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝105-108℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.9Hz,3H),1.18-1.36(m,30H),1.56-1.68(m,2H),1.96-2.09(m,1H),2.15-2.32(m,3H),2.33-2.50(m,3H),3.62(dd,J＝9.2,6.6Hz,1H),3.89(dd,J＝9.2,4.0Hz,1H),4.10(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.17(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.60-4.72(m,2H),5.09(s,2H),5.15(s,2H),6.35(d,J＝7.0Hz,1H,NH),7.05(d,J＝7.9Hz,1H,NH),7.29-7.39(m,10H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.2(CH₃),22.8(CH₂),25.6(CH₂),27.2(CH₂),29.4-29.8(13xCH₂),30.1(CH₂),32.0(CH₂),36.6(CH₂),52.0(CH),52.4(CH),58.7(CH₂),66.6(CH₂),67.5(CH₂),69.0(CH₂),75.5(CH),79.0(C)；128.4-128.8(10xCH),135.2(C),135.8(C),169.8(C),171.3(C),172.6(C),173.6(C)；质量(ESI+)m/z(％)734(55)[M+H]⁺,756(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₄₄H₆₄N₂O₇Na的计算值为755.4611，实测值为755.4612。

化合物3.3h

遵照通用流程G然后是C，从化合物3.2b得到化合物3.3h(白色固体，206mg，0.32mmol，65％)。

Rf＝0.38(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝87-90℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.84(t,J＝6.7Hz,3H),0.86(t,J＝7.0Hz,3H),1.15-1.32(m,12H),1.32-1.46(m,2H),1.51-1.67(m,2H),1.94-2.14(m,2H),2.37(dd,J＝2.4,2.4Hz,1H),2.21-2.50(m,3H),3.63(dd,J＝9.2,6.3Hz,1H),3.89(dd,J＝9.2,4.7Hz,1H),4.09(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.14(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.65-4.77(m,2H),5.08(s,2H),5.11(d,J＝12.2Hz,1H),5.15(d,J＝12.2Hz,1H),6.44(d,J＝7.1Hz,1H,NH),7.16(d,J＝8.0Hz,1H,NH),7.24-7.37(m,10H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.0(2xCH₃),22.4(CH₂),22.5(CH₂),27.2,27.2(2xCH₂),27.4(CH₂),29.9(CH₂),31.8(CH₂),31.9(CH₂),32.8(CH₂),32.9(CH₂),47.7(CH),51.6(CH),52.2(CH),58.5(CH₂),66.4(CH₂),67.3(CH₂),69.1(CH₂),75.4(CH),78.9(C),128.2-128.6(10xCH),135.1(C),135.8(C),169.6(C),171.1(C),172.3(C),176.3(C).Mass(ESI+)m/z(％)413(30),635(40)[M+H]⁺,657(100)[M+Na]^+；HRMS(ESI+)m/z为C₃₇H₅₀N₂O₇Na的计算值为657.3516，实测值为657.3532。

化合物3.3i

遵照通用流程G然后是C，从化合物3.2b得到化合物3.3i(白色固体，361mg，0.43mmol，40％)。

Rf＝0.52(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝91-93℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.87(t,J＝6.9Hz,3H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H),1.11-1.33(m,40H),1.35-1.47(m,2H),1.50-1.65(m,2H),1.94-2.14(m,2H),2.37(dd,J＝2.4,2.4Hz,1H),2.21-2.50(m,3H),3.62(dd,J＝9.2,6.6Hz,1H),3.90(dd,J＝9.2,4.0Hz,1H),4.10(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.18(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.62-4.75(m,2H),5.09(s,2H),5.15(s,2H),6.34(d,J＝7.0Hz,1H,NH),7.01(d,J＝7.9Hz,1H,NH),7.26-7.38(m,10H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.2(2xCH₃),22.8(2xCH₂),27.5(CH₂),27.7(2xCH₂),29.5-30.0(16xCH₂),32.0(CH₂),32.9(CH₂),33.1(CH₂),47.9(CH),51.8(CH),52.2(CH),58.6(CH₂),66.6(CH₂),67.5(CH₂),69.0(CH₂),75.5(CH),79.0(C),128.4-128.7(10xCH),135.2(C),135.8(C),169.6(C),171.2(C),172.4(C),176.5(C).Mass(ESI+)m/z(％)853(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₁H₇₈N₂O₇Na的计算值为853.5707，实测值为853.5693。

化合物3.3j

遵照通用流程G然后是C，从化合物3.2b得到化合物3.3j(白色固体，337mg，0.54mmol，66％)。

Rf＝0.13(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝100-102℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm0.76-0.91(m,2H),1.05-1.24(m,6H),1.23-1.35(m,2H),1.53-1.73(m,7H),1.94-2.08(m,1H),2.13-2.31(m,3H),2.31-2.52(m,3H),3.62(dd,J＝9.2,6.5Hz,1H),3.89(dd,J＝9.2,4.1Hz,1H),4.09(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.16(dd,J＝16.0,2.4Hz,1H),4.61-4.72(m,2H),5.09(s,2H),5.13(s,2H),6.38(d,J＝7.1Hz,1H,NH),7.11(d,J＝7.9Hz,1H,NH),7.28-7.39(m,10H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm25.9(CH₂),26.5(2xCH₂),26.6(CH₂),26.8(CH₂),27.2(CH₂),30.1(CH₂),33.4(2xCH₂),36.6(CH₂),37.2(CH₂),37.5(CH),51.9(CH),52.3(CH),58.6(CH₂),66.6(CH₂),67.4(CH₂),69.0(CH₂),75.4(CH),79.0(C),128.3-128.7(10xCH),135.2(C),135.8(C),169.8(C),171.2(C),172.6(C),173.5(C).Mass(ESI+)m/z(％)619(60)[M+H]⁺,641(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₆H₄₆N₂O₇Na的计算值为641.3203，实测值为641.3199。

化合物3.3k

遵照通用流程G然后是C，从化合物3.2c得到化合物3.3k(白色固体，506mg，0.70mmol，72％)。

Rf＝0.19(环己烷/EtOAc 5:5)；Tm＝122-123℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.87(t,J＝6.9Hz,3H),1.15-1.35(m,20H),1.54-1.69(m,2H),2.01-2.29(m,4H),2.39(dd,J＝2.4,2.4Hz,1H),2.43-2.66(m,2H),3.67(dd,J＝9.3,6.0Hz,1H),3.89(dd,J＝9.3,4.3Hz,1H),3.96(dd,J＝17.9,5.4Hz,1H),4.10(dd,J＝15.8,2.4Hz,1H),4.14(dd,J＝17.9,6.2Hz,1H),4.15(dd,J＝15.8,2.4Hz,1H),4.54-4.63(m,2H),5.11(s,2H),5.12(d,J＝12.2Hz,1H),5.16(d,J＝12.2Hz,1H),6.45(d,J＝6.8Hz,1H,NH),7.21(dd,J＝6.2,5.4Hz,1H,NH),7.28-7.38(m,10H),7.57(d,J＝7.7Hz,1H,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.2(CH₃),22.8(CH₂),25.6(CH₂),26.7(CH₂),29.4-29.8(8xCH₂),30.5(CH₂),32.0(CH₂),36.5(CH₂),41.4(CH₂),53.0(CH),53.1(CH),58.8(CH₂),66.8(CH₂),67.2(CH₂),69.4(CH₂),75.6(CH),78.9(C),128.3-128.7(10xCH),135.4(C),135.7(C),169.6(C),170.0(C),171.1(C),173.9(C),174.2(C)；质量(ESI+)m/z(％)720(20)[M+H]⁺,742(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₄₁H₅₇N₃O₈Na的计算值为742.4043，实测值为742.4042。

化合物3.5a

遵照通用流程I，从化合物3.3d得到化合物3.5a(微黄色油状物，541mg，0.53mmol，71％)。

Rf＝0.07(CH₂Cl₂/EtOAc 1:1)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm0.88(t,J＝6.7Hz,3H),1.20-1.36(m,12H),1.54-1.65(m,2H),1.91(s,3H),1.93(s,3H),1.99(s,3H),2.02(s,3H),1.96-2.09(m,1H),2.15-2.30(m,3H),2.34-2.48(m,2H),3.68(dd,J＝9.5,5.4Hz,1H),3.77(dd,J＝9.5,5.1Hz,1H),3.85(ddd,J＝9.6,4.7,1.8Hz,1H),3.90-3.99(m,1H),4.12(dd,J＝12.5,1.8Hz,1H),4.12-4.20(m,1H),4.26(dd,J＝12.5,4.7Hz,1H),4.45-4.69(m,6H),4.66(d,J＝8.0Hz,1H),4.90(dd,J＝9.5,8.0Hz,1H),5.01(dd,J＝9.6,9.6Hz,1H),5.09(s,2H),5.12(d,J＝12.5Hz,1H),5.17(d,J＝12.5Hz,1H),5.23(dd,J＝9.6,9.6Hz,1H),7.24-7.40(m,10H),7.83(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.5(CH₃),20.6(2xCH₃),20.7(2xCH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.6(CH₂),30.3,30.4,30.5,30.6(4xCH₂),31.0(CH₂),33.0(CH₂),36.8(CH₂),51.3(CH₂),53.1(CH),54.5(CH),63.0(CH₂),65.2(CH₂),67.4(CH₂),68.0(CH₂),69.0(CH₂),69.7(CH),70.9(CH₂),72.5(CH),72.9(CH),74.0(CH),101.6(CH),125.8(CH),129.2-129.6(10xCH),137.1(C),137.5(C),145.4(C),171.1(2xC),171.5(C),172.2(2xC),172.6(C),174.0(C),176.2(C)；质量(ESI+)m/z(％)1047(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₁H₇₀N₅O₁₇的计算值为1024.4767，实测值为1024.4784。

化合物3.5b

遵照通用流程I，从化合物3.3e得到化合物3.5b(微黄色油状物，181mg，0.17mmol，72％)。

Rf＝0.11(CH₂Cl₂/EtOAc 1:1)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm0.89(t,J＝6.9Hz,3H),1.20-1.36(m,12H),1.54-1.65(m,2H),1.91(s,3H),1.93(s,3H),1.99(s,3H),2.02(s,3H),1.94-2.06(m,1H),2.15-2.31(m,3H),2.36-2.44(m,2H),3.65-3.73(m,1H),3.73-3.81(m,1H),3.85(ddd,J＝10.0,4.7,2.4Hz,1H),3.91-3.99(m,1H),4.12(dd,J＝12.4,2.4Hz,1H),4.14-4.20(m,1H),4.26(dd,J＝12.4,4.7Hz,1H),4.48-4.64(m,6H),4.66(d,J＝8.0Hz,1H),4.89(dd,J＝9.7,8.0Hz,1H),5.01(dd,J＝10.1,9.7Hz,1H),5.09(s,2H),5.12(d,J＝12.4Hz,1H),5.17(d,J＝12.4Hz,1H),5.23(dd,J＝9.7,9.7Hz,1H),7.26-7.37(m,10H),7.83(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.5(CH₃),20.6(2xCH₃),20.7(2xCH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.6(CH₂),30.3-30.7(6xCH₂),31.0(CH₂),33.0(CH₂),36.8(CH₂),51.2(CH₂),53.2(CH),54.5(CH),63.0(CH₂),65.2(CH₂),67.4(CH₂),68.0(CH₂),69.0(CH₂),69.7(CH),70.9(CH₂),72.5(CH),72.9(CH),74.0(CH),101.6(CH),125.8(CH),129.2-129.6(10xCH),137.1(C),137.5(C),145.3(C),171.1(C),171.2(C),171.5(C),172.2(C),172.6(C),174.0(C),176.2(C)；质量(ESI+)m/z(％)1075(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₃H₇₄N₅O₁₇的计算值为1052.5080，实测值为1052.5117。

化合物3.5c

遵照通用流程I，从化合物3.3f得到化合物3.5c(微黄色油状物，568mg，0.53mmol，77％)。

Rf＝0.08(CH₂Cl₂/EtOAc 1:1)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm0.89(t,J＝6.9Hz,3H),1.21-1.34(m,20H),1.53-1.65(m,2H)；1.91,1.93,1.99,2.02(s,12H),1.86-1.99(m,1H),2.15-2.31(m,3H),2.34-2.48(m,2H),3.69(dd,J＝9.6,5.4Hz,1H),3.77(dd,J＝9.6,5.1Hz,1H),3.85(ddd,J＝10.1,4.7,2.4Hz,1H),3.92-3.99(m,1H),4.12(dd,J＝12.3,2.4Hz,1H),4.13-4.20(m,1H),4.26(dd,J＝12.3,4.7Hz,1H),4.47-4.64(m,6H),4.66(d,J＝7.9Hz,1H),4.88(dd,J＝9.5,7.9Hz,1H),5.01(dd,J＝10.1,9.5Hz,1H),5.10(s,2H),5.11-5.20(m,2H),5.23(dd,J＝9.5,9.5Hz,1H),7.27-7.37(m,10H),7.84(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.5(CH₃),20.6(CH₃),20.7(2xCH₃),20.9(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.6(CH₂),30.4-30.8(8xCH₂),33.1(CH₂),31.0(CH₂),36.8(CH₂),51.3(CH₂),53.2(CH),54.6(CH),61.5(CH₂),65.2(CH₂),67.4(CH₂),68.0(CH₂),69.0(CH₂),69.7(CH),70.9(CH₂),72.6(CH),72.9(CH),74.0(CH),101.6(CH),125.8(CH),129.2-129.6(10xCH),137.2(C),137.5(C),145.4(C),171.1(C),171.2(C),171.5(C),172.3(C),172.6(C),173.0(C),174.1(C),176.3(C)；质量(ESI+)m/z(％)130(35),199(40),1081(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₅H₇₈N₅O₁₇的计算值为1080.5393，实测值为1080.5375。

化合物3.5d

遵照通用流程I，从化合物3.3f得到化合物3.5d(白色固体，160mg，0.14mmol，87％)。

Rf＝0.09(CH₂Cl₂/EtOAc 1:1)；Tm＝58-60℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.83(t,J＝6.8Hz,3H),1.08-1.30(m,30H),1.49-1.64(m,2H),1.87,1.93,1.96,2.02(s,12H),1.86-1.99(m,1H),2.11-2.85(m,3H),2.26-2.45(m,2H),3.51-3.60(m,1H),3.66(ddd,J＝10.1,4.7,1.9Hz,1H),3.78-3.97(m,2H),4.08(dd,J＝12.4,1.9Hz,1H),4.11-4.18(m,1H),4.21(dd,J＝12.4,4.7Hz,1H),4.33-4.69(m,6H),4.43(d,J＝7.9Hz,1H),4.95(dd,J＝9.5,8.0Hz,1H),5.03(dd,J＝10.1,9.5Hz,1H),5.03(s,2H),5.10(s,2H),5.13(dd,J＝9.5,9.5Hz,1H),6.80(bs,1H),7.18-7.35(m,10H),7.39(d,J＝6.8Hz,1H),7.58(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.1(CH₃),20.5,20.5,20.5(3xCH₃),20.6(CH₃),22.6(CH₂),25.5(CH₂),26.9(CH₂),29.3-29.6(13xCH₂),30.0(CH₂),31.8(CH₂),36.3(CH₂),49.9(CH₂),51.8(CH),52.5(CH),61.7(CH₂),64.6(CH₂),66.4(CH₂),67.1(CH₂),67.7(CH₂),68.1(CH),69.7(CH₂),70.9(CH),71.9(CH),72.4(CH),100.4(CH),124.0(CH),128.1-128.5(10xCH),135.2(C),135.8(C),144.1(C),169.3(C),169.5(C),170.0(C),170.0(C),170.5(C),171.2(C),172.4(C),173.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)1151(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₆₀H₈₈N₅O₁₇的计算值为1150.6175，实测值为1150.6163。

化合物3.5e

遵照通用流程I，从化合物3.3f得到化合物3.5e(白色固体，302mg，0.22mmol，74％)。

Rf＝0.06(CH₂Cl₂/EtOAc 1:1)；Tm＝78-80℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.89(t,J＝6.9Hz,3H),1.22-1.37(m,20H),1.54-1.65(m,2H),1.89,1.96,1.98,2.00,2.01,2.05,2.09(s,21H),1.91-2.03(m,1H),2.15-2.29(m,3H),2.39-2.42(m,2H),3.68(dd,J＝9.6,5.5Hz,1H),3.76(dd,J＝9.6,5.1Hz,1H),3.79-3.83(m,1H),3.92-4.00(m,2H),4.03-4.07(m,1H),4.12(dd,J＝6.3,2.5Hz,1H),4.14-4.17(m,1H),4.20-4.28(m,2H),4.48-4.63(m,7H),4.66(d,J＝7.9Hz,1H),4.76(dd,J＝9.1,7.9Hz,1H)；4.81-4.85(m,1H),5.04(dd,J＝10.0,10.0Hz,1H),5.10(s,2H),5.11-5.20(m,2H),5.27(dd,J＝9.1,9.1Hz,1H),5.33-5.38(m,2H),7.26-7.39(m,10H),7.83(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm14.5(CH₃),20.5-21.2(7xCH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.6(CH₂),30.3-30.8(8xCH₂),31.0(CH₂),33.1(CH₂),36.8(CH₂),51.3(CH₂),53.1(CH),54.5(CH),63.0(CH₂),64.1(CH₂),65.2(CH₂),67.4(CH₂),68.0(CH₂),69.0(CH₂)；69.6(CH),69.8(CH),70.7(CH),70.9(CH₂),71.6(CH),73.3(CH),73.5(CH),74.7(CH),76.3(CH),97.1(CH),101.4(CH),125.8(CH),129.2-129.6(10xCH),145.5(C),137.2(C),137.6(C),171.1-172.2(7xC),172.2(C),172.6(C),174.1(C),176.3(C)；质量(ESI+)m/z(％)1369(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₆₇H₉₄N₅O₂₅的计算值为1368.6238，实测值为1368.6237。

化合物3.5f

遵照通用流程I，从化合物3.3f得到化合物3.5f(白色固体，192mg，0.13mmol，83％)。

Rf＝0.10(CH₂Cl₂/EtOAc 4:6)；Tm＝90-94℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.84(t,J＝6.8Hz,3H),1.14-1.31(m,30H),1.52-1.62(m,2H),1.87,1.94,1.96,1.98,1.99,2.05,2.09(s,21H),1.91-2.03(m,1H),2.13-2.26(m,3H),2.26-2.43(m,2H),3.50-3.59(m,1H),3.60-3.66(m,1H),3.80-3.99(m,4H),4.02(dd,J＝12.4,2.2Hz,1H),4.09-4.25(m,3H),4.33-4.70(m,7H),4.46(d,J＝7.8Hz,1H),4.75-4.85(m,2H),5.02(dd,J＝9.8,9.8Hz,1H),5.04(s,2H),5.09(d,J＝12.4Hz,1H),5.13(d,J＝12.4Hz,1H),5.19(dd,J＝9.2,9.2Hz,1H),5.32(dd,J＝10.3,9.8Hz,1H),5.36(d,J＝4.0Hz,1H),6.70(d,J＝6.0Hz,1H,NH),7.23-7.37(m,11H),7.55(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.1(CH₃),20.5-20.8(7xCH₃),22.7(CH₂),25.5(CH₂),27.0(CH₂),29.3-29.7(13xCH₂),30.0(CH₂),31.9(CH₂),36.4(CH₂),49.9(CH₂),51.9(CH),52.5(CH),61.5(CH₂),62.5(CH₂),64.6(CH₂),66.4(CH₂),67.2(CH₂),67.8(CH₂),68.0(CH),68.5(CH),69.3(CH),69.6(CH₂),70.0(CH),71.8(CH),72.4(CH),72.5(CH),75.0(CH),95.6(CH),100.2(CH),123.9(CH),128.1-128.6(CH ofPh),135.3(C),135.8(C),144.3(C),169.4-170.5(7xC),170.0(C),171.2(C),172.5(C),173.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)1439(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₇₂H₁₀₄N₅O₂₅的计算值为1438.7020，实测值为1438.7031。

化合物3.5g

遵照通用流程I(纯化：硅胶柱层析，洗脱剂：CH₂Cl₂/MeOH 99:1至97:3)，从化合物3.3f得到化合物3.5g(白色蜡状物，207mg，0.21mmol，85％)。

Rf＝0.18(CH₂Cl₂/MeOH 97:3)；Tm＝50-52℃；¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δppm 0.89(t,J＝6.9Hz,3H),1.22-1.36(m,20H),1.53-1.65(m,2H),1.91-2.01(m,1H),2.15-2.29(m,3H),2.34-2.46(m,2H),3.33(s,3H),3.49-3.53(m,2H),3.54-3.64(m,18H),3.64-3.70(m,1H),3.71-3.77(m,1H),3.85(t,J＝4.8Hz,2H),4.49-4.63(m,6H),5.09(s,2H),5.12(d,J＝12.4Hz,1H),5.16(d,J＝12.4Hz,1H),7.25-7.37(m,10H),7.96(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)δppm 14.5(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.6(CH₂),30.3-30.8(8xCH₂),31.0(CH₂),33.1(CH₂),36.8(CH₂),51.5(CH₂),53.1(CH),54.5(CH),59.1(CH₃),65.1(CH₂),67.4(CH₂),68.0(CH₂),70.2(CH₂),70.8(CH₂),71.3-71.5(9xCH₂),73.0(CH₂),125.9(CH),129.2-129.6(10xCH),137.1(C),137.5(C),145.4(C),172.5(C),174.0(2xC),176.2(C)；质量(ESI+)m/z(％)985(20)[M+H]⁺,1007(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₂H₈₂N₅O₁₃的计算值为984.5909，实测值为984.5892。

化合物3.5h

遵照通用流程I(纯化：硅胶柱层析，洗脱剂：CH₂Cl₂/MeOH 99:1至97:3)，从化合物3.3g得到化合物3.5h(白色固体，91mg，0.09mmol，88％)。Rf＝0.20(CH₂Cl₂/MeOH 97:3)；Tm＝61-63℃；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δppm 0.85(t,J＝6.9Hz,3H),1.17-1.32(m,30H),1.53-1.64(m,2H),1.93-2.04(m,1H),2.14-2.26(m,3H),2.26-2.43(m,2H),3.33(s,3H),3.48-3.52(m,2H),3.52-3.66(m,19H),3.81(t,J＝5.0Hz,2H),3.88-3.95(m,1H),4.46(t,J＝5.0Hz,2H),4.53-4.69(m,4H),5.05(s,2H),5.10(d,J＝12.3Hz,1H),5.13(d,J＝12.3Hz,1H),6.65(d,J＝5.9Hz,1H,NH),7.24-7.35(m,10H),7.42(d,J＝7.7Hz,1H,NH),7.71(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δppm 14.1(CH₃),22.7(CH₂),25.5(CH₂),26.9(CH₂),29.3-29.7(13xCH₂),30.0(CH₂),31.9(CH₂),36.4(CH₂),50.3(CH₂),51.9(CH),52.5(CH),59.0(CH₃),65.1(CH₂),66.4(CH₂),67.2(CH₂),70.2(CH₂),70.8(CH₂),70.5-70.6(9xCH₂),71.9(CH₂),123.8(CH),128.2-128.6(10xCH),135.3(C),135.8(C),144.1(C),170.1(C),171.2(C),172.5(C),173.6(C)；质量(ESI+)m/z(％)892(100),1077(70)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₇H₉₂N₅O₁₃的计算值为1054.6692，实测值为1054.6696。

化合物3.5i

遵照通用流程I，从化合物3.3h得到化合物3.5i(微黄色蜡状物，115mg，0.11mmol，38％)。

Rf＝0.40(CH₂Cl₂/EtOAc 1:1)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm0.84,0.87(t,J＝6.9Hz,6H),1.15-1.39(m,12H),1.31-1.44(m,2H),1.47-1.63(m,2H),1.91,1.93,1.99,2.02(s,12H),1.89-2.05(m,1H),2.14-2.25(m,1H),2.26-2.35(m,1H),2.34-2.46(m,2H),3.68(dd,J＝9.6,5.7Hz,1H),3.76(dd,J＝9.6,5.3Hz,1H),3.85(ddd,J＝9.7,4.7,2.4Hz,1H),3.90-3.99(m,1H),4.12(dd,J＝12.4,2.4Hz,1H),4.13-4.20(m,1H),4.26(dd,J＝12.4,4.7Hz,1H),4.49-4.62(m,6H),4.66(d,J＝8.0Hz,1H),4.89(dd,J＝9.7,8.0Hz,1H),5.02(dd,J＝9.7,9.5Hz,1H),5.09(s,2H),5.13,5.17(d,J＝12.4Hz,2H),5.23(dd,J＝9.7,9.5Hz,1H),7.27-7.37(m,10H),7.83(s,1H),8.12(d,J＝7.5Hz,1H,NH),8.13(d,J＝7.8Hz,1H,NH)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),14.5(CH₃),20.6(CH₃),20.6(CH₃),20.7(CH₃),20.7(CH₃),23.5(CH₂),23.6(CH₂),27.9(CH₂),28.2(CH₂),28.3(CH₂),30.9(CH₂),32.9(CH₂),33.0(CH₂),34.0(CH₂),34.1(CH₂),47.9(CH),51.3(CH₂),53.0(CH),54.2(CH),63.0(CH₂),65.2(CH₂),67.4(CH₂),68.0(CH₂),69.0(CH₂),69.7(CH),71.0(CH₂),72.5(CH),72.9(CH),74.0(CH),101.6(CH),125.8(CH),129.2-129.6(10xCH),137.1(C),137.5(C),145.4(C),171.1(C),171.2(C),171.5(C),172.0(C),172.2(C),172.5(C),173.8(C),179.0(C)；质量(ESI+)m/z(％)1075(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₃H₇₃N₅O₁₇Na的计算值为1074.4899，实测值为1074.4904。

化合物3.5j

遵照通用流程I，从化合物3.3i得到化合物3.5j(白色固体，190mg，0.15mmol，90％)。

Rf＝0.40(CH₂Cl₂/EtOAc 1:1)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm0.84,0.85(t,J＝6.9Hz,6H),1.13-1.31(m,40H),1.33-1.44(m,2H),1.48-1.63(m,2H),1.90,1.95,1.99,2.04(s,12H),1.93-2.03(m,1H),2.06-2.15(m,1H),2.16-2.45(m,3H),3.50-3.60(m,1H),3.67(ddd,J＝9.7,4.7,2.2Hz,1H),3.81-3.90(m,1H),3.90-3.99(m,1H),4.10(dd,J＝12.3,2.2Hz,1H),4.14-4.20(m,1H),4.23(dd,J＝12.3,4.7Hz,1H),4.35-4.71(m,6H),4.44(d,J＝7.9Hz,1H),4.97(dd,J＝9.7,7.9Hz,1H),5.05(dd,J＝9.7,9.7Hz,1H),5.05(s,2H),5.13(s,2H),5.15(dd,J＝9.7,9.7Hz,1H),6.69(d,J＝6.0Hz,1H,NH),7.23-7.40(m,11H),7.57(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.1(2xCH₃),20.5(CH₃),20.6(2xCH₃),20.7(CH₃),22.7(2xCH₂),27.3(CH₂),27.7(2xCH₂),29.4-30.3(16xCH₂),31.9(CH₂),32.9(CH₂),33.0(CH₂),47.7(CH),50.0(CH₂),51.8(CH),52.4(CH),61.8(CH₂),64.6(CH₂),66.4(CH₂),67.2(CH₂),67.7(CH₂),68.3(CH),69.8(CH₂),71.0(CH),72.0(CH),72.5(CH),100.6(CH),124.0(CH),128.2-128.6(10xCH),135.3(C),135.9(C),144.4(C),169.4(C),169.5(C),170.0(2xC),170.6(C),171.2(C),172.3(C),176.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)1271(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₆₇H₁₀₁N₅O₁₇Na的计算值为1270.7090，实测值为1270.7128。

化合物3.5k

遵照通用流程I，从化合物3.3j得到化合物3.5k(微黄色胶质，200mg，0.19mmol，80％)。

Rf＝0.16(CH₂Cl₂/MeOH 97.5:2.5)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.77-0.92(m,2H),1.10-1.25(m,6H),1.25-1.37(m,2H),1.51-1.73(m,7H),1.91,1.93,1.98,2.02(s,12H),1.94-2.08(m,1H),2.14-2.30(m,3H),2.34-2.48(m,2H),3.69(dd,J＝9.6,5.5Hz,1H),3.78(dd,J＝9.6,5.2Hz,1H),3.85(ddd,J＝9.7,4.6,2.1Hz,1H),3.95(m,1H),4.12(dd,J＝12.4,2.1Hz,1H),4.12-4.20(m,1H),4.26(dd,J＝12.4,4.6Hz,1H),4.48-4.64(m,6H),4.66(d,J＝7.9Hz,1H),4.89(dd,J＝9.5,7.9Hz,1H),5.02(dd,J＝9.7,9.5Hz,1H),5.09(s,2H),5.12(d,J＝12.5Hz,1H),5.17(d,J＝12.5Hz,1H),5.23(dd,J＝9.5,9.5Hz,1H),7.25-7.38(m,10H),7.82(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 20.6(2xCH₃),20.7(2xCH₃),27.0(CH₂),27.4(2xCH₂),27.5(CH₂),27.6(CH₂),27.7(CH₂),31.0(CH₂),34.5(2xCH₂),36.8(CH₂),38.3(CH₂),38.7(CH),51.2(CH₂),53.1(CH),54.4(CH),63.0(CH₂),65.1(CH₂),67.4(CH₂),68.0(CH₂),68.9(CH₂),69.7(CH),70.9(CH₂),72.5(CH),72.8(CH),73.9(CH),101.6(CH),125.7(CH),129.1-129.6(10xCH),137.1(C),137.5(C),145.3(C),171.1(2xC),171.4(C),172.1(C),172.2(C),172.5(C),174.0(C),176.1(C)；质量(ESI+)m/z(％)1059(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₂H₇₀N₅O₁₇的计算值为1036.4767，实测值为1036.4760。

化合物3.5l

遵照通用流程I，从化合物3.3k得到化合物3.5l(微黄色固体，153mg，0.13mmol，61％)。

Rf＝0.21(CH₂Cl₂/MeOH 97.5:2.5)；Tm＝60-63℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm0.89(t,J＝6.9Hz,3H),1.21-1.34(m,20H),1.53-1.65(m,2H),1.92,1.94,1.99,2.02(s,12H),1.93-2.10(m,1H),2.15-2.31(m,3H),2.42-2.52(m,2H),3.71(dd,J＝9.6,5.2Hz,1H),3.79-3.88(m,2H),3.91-4.00(m,3H),4.09-4.20(m,2H),4.26(dd,J＝12.4,4.7Hz,1H),4.47-4.64(m,6H),4.66(d,J＝8.0Hz,1H),4.88(dd,J＝9.6,8.0Hz,1H),5.01(dd,J＝9.6,9.6Hz,1H),5.11(s,2H),5.15(s,2H),5.23(dd,J＝9.6,9.6Hz,1H),7.25-7.40(m,10H),7.84(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.6(CH₃),20.7(CH₃),20.7(CH₃),20.8(CH₃),20.8(CH₃),23.8(CH₂),26.8(CH₂),28.1(CH₂),30.5-30.9(8xCH₂),31.2(CH₂),33.1(CH₂),36.8(CH₂),42.2(CH₂),51.3(CH₂),53.7(CH),55.2(CH),63.1(CH₂),65.3(CH₂),67.4(CH₂),68.0(CH₂),69.0(CH₂),69.8(CH),70.9(CH₂),72.6(CH),73.0(CH),74.1(CH),101.7(CH),125.9(CH),129.3-129.7(10xCH),137.2(C),137.7(C),145.3(C),171.0(C),171.2(C),171.3(C),171.6(C),172.3(C),172.3(C),173.8(C),174.4(C),176.9(C)；质量(ESI+)m/z(％)1160(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₇H₈₁N₆O₁₈的计算值为1137.5607，实测值为1137.5610。

化合物3.7a

遵照通用流程J然后是F，从化合物3.5a得到化合物3.7a(白色固体，81mg，0.12mmol，70％)。

Tm＝72-75℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δppm 0.89(t,J＝6.2Hz,3H),1.20-1.38(m,12H),1.54-1.67(m,2H),1.86-1.99(m,1H),2.10-2.24(m,1H),2.24-2.40(m,4H),3.21(dd,J＝8.9,8.0Hz,1H),3.25-3.41(m,3H),3.62-3.75(m,2H),3.80(dd,J＝9.6,5.2Hz,1H),3.87(dd,J＝11.8,1.3Hz,1H),3.94-4.06(m,1H),4.20-4.29(m,1H),4.32(d,J＝8.0Hz,1H),4.45(dd,J＝8.7,4.6Hz,1H),4.57-4.71(m,5H),8.14(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD):δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.8(CH₂),30.3,30.4,30.4,30.5(4xCH₂),30.9(CH₂),33.0(CH₂),36.8(CH₂),51.6(CH₂),53.0(CH),54.5(CH),62.6(CH₂),65.0(CH₂),69.0(CH₂),70.8(CH₂),71.5(CH),74.9(CH),77.9(2xCH),104.4(CH),126.2(CH),145.2(C),172.1(C),174.5(C),176.4(2xC)；质量(ESI-)m/z(％)674(100)[M-H]^-；HRMS(ESI+)m/z为C₂₉H₅₀N₅O₁₃的计算值为676.3405，实测值为676.3409。

化合物3.7b

遵照通用流程J然后是F，从化合物3.5b得到化合物3.7b(白色固体，108mg，0.15mmol，93％)。

Tm＝118-120℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δppm 0.89(t,J＝5.9Hz,3H),1.16-1.38(m,16H),1.52-1.67(m,2H),1.85-2.00(m,1H),2.10-2.25(m,1H),2.22-2.42(m,4H),3.21(dd,J＝8.4,7.8Hz,1H),3.23-3.42(m,3H),3.63-3.74(m,2H),3.79(dd,J＝9.6,5.2Hz,1H),3.87(dd,J＝11.8,1.3Hz,1H),3.94-4.06(m,1H),4.17-4.28(m,1H),4.32(d,J＝7.8Hz,1H),4.46(dd,J＝8.8,4.6Hz,1H),4.55-4.70(m,5H),8.10(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD):δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),30.3-30.7(6xCH₂),31.0(CH₂),33.0(CH₂),36.8(CH₂),51.6(CH₂),53.2(CH),54.5(CH),62.6(CH₂),65.0(CH₂),69.0(CH₂),70.8(CH₂),71.4(CH),74.9(CH),77.8(CH),77.9(CH),104.4(CH),126.2(CH),145.2(C),172.0(C),174.8(C),176.4(C),176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)702(100)[M-H]^-；HRMS(ESI+)m/z为C₃₁H₅₄N₅O₁₃的计算值为704.3718，实测值为704.3703。

化合物3.7c

遵照通用流程J然后是F，从化合物3.5c得到化合物3.7c(白色固体，358mg，0.49mmol，75％)。

Tm＝154-156℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.9Hz,3H),1.21-1.37(m,20H),1.54-1.67(m,2H),1.86-1.99(m,1H),2.13-2.25(m,1H),2.25-2.31(m,2H),2.31-2.38(m,2H),3.19(dd,J＝9.7,8.0Hz,1H),3.24-3.38(m,3H),3.62-3.68(m,1H),3.71(dd,J＝9.5,5.4Hz,1H),3.78(dd,J＝9.5,5.4Hz,1H),3.87(dd,J＝11.8,1.5Hz,1H),3.96-4.03(m,1H),4.21-4.28(m,1H),4.30(d,J＝7.8Hz,1H),4.47(dd,J＝9.1,4.7Hz,1H),4.58-4.67(m,5H),8.09(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.9(CH₂),27.9(CH₂),30.4-30.8(8xCH₂),31.0(CH2),33.1(CH₂),36.8(CH₂),51.6(CH₂),53.1(CH),54.5(CH),62.7(CH₂),65.1(CH₂),69.1(CH₂),70.8(CH₂),71.5(CH),74.9(CH),77.9(CH),78.1(CH),104.5(CH),126.2(CH),145.3(C),172.1(2xC),176.4(C),176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)365(30)[M-2H]^2-,550(20),730(100)[M-H]^-,752(20)；HRMS(ESI-)m/z为C₃₃H₅₆N₅O₁₃的计算值为730.3875，实测值为730.3886。

化合物3.7d

遵照通用流程J然后是F(LiOH/二噁烷-H₂O)，从化合物3.5d得到化合物3.7d(白色固体，74mg，0.09mmol，77％)。

Tm＝175-185℃；¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δppm 0.85(t,J＝6.6Hz,3H),1.11-1.32(m,30H),1.39-1.51(m,2H),1.68-1.83(m,1H),1.90-2.04(m,1H),2.07-2.16(m,2H),2.18-2.29(m,2H),2.96(dd,J＝8.3,8.3Hz,1H),3.03(dd,J＝8.8,8.8Hz,1H),3.08-3.17(m,2H),3.34-3.46(m,1H),3.51-3.60(m,2H),3.64-3.70(m,1H),3.85-3.93(m,1H),4.03-4.12(m,1H),4.17-4.28(m,2H),4.44-4.63(m,5H),7.93(d,J＝8.1Hz,1H,NH),8.09(s,1H),8.20(d,J＝7.8Hz,1H,NH)；¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δppm 14.0(CH₃),22.1(CH₂),25.2(CH₂),26.5(CH₂),28.7-29.1(13xCH₂),29.8(CH₂),31.3(CH₂),35.1(CH₂),49.6(CH₂),51.1(CH),52.2(CH),61.1(CH₂),63.6(CH₂),67.3(CH₂),69.9(CH₂),70.0(CH),73.3(CH),76.6(CH),77.0(CH),102.9(CH),124.7(CH),143.5(C),169.6(C),172.3(C),173.0(C),173.8(C)；质量(ESI-)m/z(％)399(95)[M-2H]^2-,620(70),638(30),800(100)[M-H]^-,822(85)[M+Na-2H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₃₈H₆₆N₅O₁₃的计算值为800.4657，实测值为800.4636。

化合物3.7e

遵照通用流程J然后是F，从化合物3.5d得到化合物3.7e(白色固体，163mg，0.18mmol，79％)。

Tm＝167-169℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.22-1.39(m,20H),1.57-1.67(m,2H),1.86-1.98(m,1H),2.13-2.24(m,1H),2.28(t,J＝7.1Hz,2H),2.31-2.40(m,2H),3.22-3.33(m,2H),3.39(ddd,J＝9.2,4.7,1.9Hz,1H),3.44(dd,J＝9.7,3.8Hz,1H),3.53(dd,J＝9.2,9.2Hz,1H),3.56-3.73(m,5H),3.74-3.92(m,4H),3.95-4.03(m,1H),4.19-4.29(m,1H),4.33(d,J＝7.8Hz,1H),4.46(dd,J＝9.0,4.6Hz,1H),4.56-4.68(m,5H),5.16(d,J＝3.8Hz,1H),8.09(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),28.0(CH₂),30.3-30.8(8xCH₂),31.0(CH₂),33.1(CH₂),36.8(CH₂),51.6(CH₂),53.2(CH),54.6(CH),62.1(CH₂),62.8(CH₂),65.1(CH₂),69.1(CH₂),70.8(CH₂),71.5(CH),74.1(CH),74.5(CH),74.8(CH),75.0(CH),76.7(CH),77.7(CH),81.1(CH),102.9(CH),104.5(CH),126.2(CH),145.3(C),172.1(C),174.7(C),176.4(C),176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)446(100)[M-H]^2-,892(100)[M-H]^-；HRMS(ESI+)m/z为C₃₉H₆₆N₅O₁₈的计算值为892.4403，实测值为892.4398。

化合物3.7f

遵照通用流程J然后是F(LiOH/二噁烷-H₂O)，从化合物3.5e得到化合物3.7f(白色固体，101mg，0.10mmol，92％)。

Tm＝214-216℃；¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝7.0Hz,3H),1.23-1.39(m,30H),1.56-1.66(m,2H),1.88-1.97(m,1H),2.15-2.24(m,1H),2.25-2.31(m,2H),2.31-2.39(m,2H),3.22-3.29(m,2H),3.39(ddd,J＝9.4,4.7,1.9Hz,1H),3.44(dd,J＝9.7,3.8Hz,1H),3.53(dd,J＝9.4,9.2Hz,1H),3.57-3.74(m,5H),3.75-3.85(m,3H),3.89(dd,J＝12.1,1.9Hz,1H),3.96-4.03(m,1H),4.21-4.27(m,1H),4.33(d,J＝7.8Hz,1H),4.47(dd,J＝9.1,4.7Hz,1H),4.57-4.69(m,5H),5.16(d,J＝3.8Hz,1H),8.09(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,CD₃OD):δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.9(CH₂),27.9(CH₂),30.4-30.8(13xCH₂),31.0(CH₂),33.1(CH₂),36.8(CH₂),51.6(CH₂),53.1(CH),54.5(CH),62.1(CH₂),62.8(CH₂),65.1(CH₂),69.2(CH₂),70.9(CH₂),71.5(CH),74.2(CH),74.5(CH),74.8(CH),75.1(CH),76.7(CH),77.7(CH),81.2(CH),102.9(CH),104.5(CH),126.2(CH),145.3(C),172.2(C),174.5(C),176.4(C),176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)481(55)[M-2H]^2-,963(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₄₄H₇₆N₅O₁₈的计算值为962.5185，实测值为962.5211。

化合物3.7g

遵照通用流程D1，从化合物3.5g得到化合物3.7g(白色蜡状物，41mg，0.05mmol，定量)。

Tm＝54-57℃；¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝7.0Hz,3H),1.23-1.37(m,20H),1.55-1.66(m,2H),1.88-1.98(m,1H),2.13-2.22(m,1H),2.23-2.39(m,4H),3.35(s,3H),3.51-3.55(m,2H),3.56-3.66(m,18H),3.71(dd,J＝9.7,5.2Hz,1H),3.79(dd,J＝9.7,5.4Hz,1H),3.90(t,J＝5.1Hz,2H),4.40(dd,J＝8.1,4.7Hz,1H),4.55-4.67(m,5H),8.03(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,CD₃OD):δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),28.4(CH₂),30.4-30.8(8xCH₂),31.2(CH₂),33.1(CH₂),36.8(CH₂),51.4(CH₂),53.9(CH),54.7(CH),59.1(CH₃),65.1(CH₂),70.3(CH₂),70.8(CH₂),71.1-71.3(9xCH₂),72.8(CH₂),125.9(CH),145.5(C),171.7(2xC),176.4(2xC)；质量(ESI+)m/z(％)827(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₈H₇₀N₅O₁₃的计算值为804.4970，实测值为804.4975。

化合物3.7h

遵照通用流程D1，从化合物3.5h得到化合物3.7h(白色固体，58mg，0.07mmol，89％)。

Tm＝76-79℃；¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.9Hz,3H),1.23-1.38(m,30H),1.56-1.66(m,2H),1.88-1.98(m,1H),2.13-2.22(m,1H),2.23-2.39(m,4H),3.35(s,3H),3.50-3.55(m,2H),3.56-3.67(m,18H),3.71(dd,J＝9.6,5.3Hz,1H),3.79(dd,J＝9.6,5.3Hz,1H),3.90(t,J＝5.1Hz,2H),4.42(dd,J＝8.5,4.8Hz,1H),4.55-4.67(m,5H),8.03(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,CD₃OD):δppm 14.5(CH₃),23.7(CH₂),26.9(CH₂),28.2(CH₂),30.4-30.9(13xCH₂),31.1(CH₂),33.1(CH₂),36.8(CH₂),51.4(CH₂),53.6(CH),54.6(CH),59.1(CH₃),65.1(CH₂),70.3(CH₂),70.9(CH₂),71.2-71.4(9xCH₂),72.9(CH₂),125.9(CH),145.4(C),171.8(C),175.1(C),176.4(C),176.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)231(50),897(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₄₃H₈₀N₅O₁₃的计算值为874.5753，实测值为874.5761。

化合物3.7i

遵照通用流程J然后是F，从化合物3.5i得到化合物3.7i(白色固体，31mg，0.04mmol，46％)。

Tm＝100-103℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.88(t,J＝6.5Hz,6H),1.18-1.36(m,12H),1.33-1.46(m,2H),1.47-1.68(m,2H),1.86-1.97(m,1H),2.13-2.24(m,1H),2.24-2.40(m,3H),3.20(dd,J＝9.0,7.9Hz,1H),3.31-3.39(m,3H),3.62-3.73(m,2H,),3.79(dd,J＝9.5,5.3Hz,1H),3.87(d,J＝11.5,1.3Hz,1H),3.96-4.04(m,1H),4.21-4.28(m,1H),4.32(d,J＝7.8Hz,1H),4.42(dd,J＝7.8,4.7Hz,1H),4.59-4.71(m,5H),8.10(s,1H)；¹³CNMR(100MHz,CD₃OD):δppm 14.4(2xCH₃),23.5(CH₂),23.6(CH₂),28.2(CH₂),28.3(CH₂),28.5(CH₂),31.1(CH₂),32.9(CH₂),33.1(CH₂),34.1(CH₂),48.0(CH),51.6(CH₂),53.5(CH),54.4(CH),62.7(CH₂),65.1(CH₂),69.0(CH₂),70.9(CH₂),71.5(CH),74.9(CH),77.9(CH),78.0(CH),104.5(CH),126.2(CH),145.3(C),171.7(C),175.1(C),176.5(C),179.2(C)；质量(ESI-)m/z(％)351(25)[M-2H]^2-,702(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₃₁H₅₂N₅O₁₃的计算值为702.3562，实测值为702.3550。

化合物3.7j

遵照通用流程J然后是F(LiOH/二噁烷-H₂O)，从化合物3.5j得到化合物3.7j(白色固体，40mg，0.04mmol，定量)。

Tm>160℃(伴有分解)；¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.9Hz,6H),1.20-1.36(m,40H),1.36-1.47(m,2H),1.49-1.65(m,2H),1.86-1.97(m,1H),2.14-2.23(m,1H),2.26-2.38(m,3H),3.20(dd,J＝9.1,7.8Hz,1H),3.26-3.39(m,3H),3.64-3.69(m,1H),3.70(dd,J＝9.7,5.7Hz,1H),3.78(dd,J＝9.7,5.3Hz,1H),3.87(dd,J＝11.5,1.3Hz,1H),3.97-4.03(m,1H),4.21-4.28(m,1H),4.32(d,J＝7.8Hz,1H),4.44(dd,J＝8.3,4.9Hz,1H),4.61-4.70(m,5H),8.10(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD):δppm 14.5(2xCH₃),23.7(2xCH₂),28.5(2xCH₂),28.6(CH₂),30.5-30.8(14xCH₂),31.1(CH₂),33.1(2x-CH₂),34.0(2xCH₂),47.9(CH),51.6(CH₂),53.5(CH),54.4(CH),62.7(CH₂),65.1(CH₂),69.0(CH₂),70.9(CH₂),71.5(CH),74.9(CH),77.9(CH),78.0(CH),104.5(CH),126.1(CH),145.3(C),171.7(C),175.0(C),176.5(C),179.2(C)；质量(ESI-)m/z(％)449(40)[M-2H]^2-,899(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₄₅H₈₀N₅O₁₃的计算值为898.5753，实测值为898.5754。

化合物3.7k

遵照通用流程J然后是F，从化合物3.5k得到化合物3.7k(白色固体，60mg，0.09mmol，82％)。

Tm＝114-116℃；¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δppm 0.81-0.94(m,2H)；1.12-1.28(m,6H)；1.27-1.38(m,2H)；1.53-1.76(m,7H)；1.86-1.98(m,1H)；2.13-2.23(m,1H)；2.28(t,J＝7.7Hz,2H)；2.31-2.39(m,2H)；3.20(dd,J＝9.1,7.8Hz,1H)；3.27-3.39(m,3H)；3.64-3.68(m,1H)；3.70(dd,J＝9.6,5.5Hz,1H)；3.79(dd,J＝9.6,5.3Hz,1H)；3.87(dd,J＝11.7,1.1Hz,1H)；3.96-4.04(m,1H)；4.21-4.28(m,1H)；4.32(d,J＝7.8Hz,1H)；4.47(dd,J＝9.1,4.7Hz)；4.61-4.69(m,5H)；8.09(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,CD₃OD):δppm 27.1(CH₂)；27.5(CH₂)；27.5(CH₂)；27.5(CH₂)；27.8(CH₂)；27.9(CH₂)；31.0(CH₂)；34.5(CH₂)；34.5(CH₂)；36.8(CH₂)；38.3(CH₂)；38.8(CH)；51.6(CH₂)；53.0(CH)；54.5(CH)；62.7(CH₂)；65.0(CH₂)；69.0(CH₂)；70.8(CH₂)；71.5(CH)；74.9(CH)；77.9(CH)；78.0(CH)；104.5(CH)；126.2(CH)；145.3(C)；172.1(C)；174.5(C)；176.4(C)；176.4(C)；质量(ESI-)m/z(％)343(30)[M-2H]^2-,506(25),686(100)[M-H]^-；HRMS(ESI+)m/z为C₃₀H₄₈N₅O₁₃的计算值为686.3249，实测值为686.3229。

化合物3.7l

遵照通用流程J然后是F，从化合物3.5l得到化合物3.7l(白色固体，70mg，0.09mmol，94％)。

Tm>170℃(伴有分解)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.23-1.38(m,20H),1.54-1.67(m,2H),1.86-2.03(m,1H),2.13-2.43(m,5H),3.19(dd,J＝8.9,7.9Hz,1H),3.25-3.38(m,3H),3.62-3.69(m,1H),3.72(dd,J＝9.7,4.8Hz,1H),3.82(dd,J＝9.7,5.3Hz,1H),3.84-3.94(m,3H),3.95-4.05(m,1H),4.20-4.28(m,1H),4.31(d,J＝7.9Hz,1H),4.40-4.70(m,6H),8.11(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),28.6(CH₂),30.4-30.8(8xCH₂),32.8(CH₂),33.1(CH₂),36.8(CH₂),41.9(CH₂),51.6(CH₂),53.2(CH),54.9(CH),62.7(CH₂),65.1(CH₂),69.0(CH₂),70.8(CH₂),71.5(CH),74.9(CH),78.0(CH),78.0(CH),104.5(CH),126.3(CH),145.3(C),172.2(C),173.1(C),174.5(C),175.4(C),176.6(C)；质量(ESI-)m/z(％)393(100)[M-H]^2-,787(80)[M-H]^-；HRMS(ESI+)m/z为C₃₅H₆₁N₆O₁₄的计算值为789.4246，实测值为789.4238。

化合物3.8a

遵照通用流程I，从化合物3.3f和1,17-二叠氮基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷(未描述)得到化合物3.8a(白色蜡状物，162mg，0.10mmol，43％)。

Rf＝0.15(CH₂Cl₂/MeOH 96:4)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δppm0.87(t,J＝6.9Hz,6H),1.18-1.34(m,40H),1.53-1.67(m,4H),1.94-2.08(m,2H),2.13-2.29(m,6H),2.29-2.51(m,4H),3.49-3.66(m,18H),3.79-3.89(m,4H),3.87-4.06(m,2H),4.39-4.53(m,4H),4.53-4.79(m,8H),5.07(s,4H),5.12(d,J＝12.5Hz,2H),5.15(d,J＝12.5Hz,2H),6.67(bs,2H,NH),7.24-7.39(m,20H),7.45(s,2H),7.73(bs,2H,NH)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δppm14.2(2xCH₃),22.8(2xCH₂),25.7(2xCH₂),27.1(2xCH₂),29.4-29.8(16xCH₂),30.1(2xCH₂),32.0(2xCH₂),36.6(2xCH₂),50.5(2xCH₂),52.0(2xCH),52.6(2xCH),64.5(2xCH₂),66.6(2xCH₂),67.3(2xCH₂),69.4(2xCH₂),69.6(2xCH₂),70.6(8xCH₂),123.9(2xCH),128.3-128.7(20xCH),135.4(2xC),135.9(2xC),144.2(2xC),170.2(2xC),171.3(2xC),172.6(2xC),173.7(2xC)；质量(ESI+)m/z(％)721(30),1072(100),1680(75)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₉₀H₁₃₃N₁₀O₁₉的计算值为1657.9748，实测值为1657.9785。

化合物3.9a

遵照通用流程D1，从化合物3.8a得到化合物3.9a(白色固体，107mg，0.08mmol，95％)。

Tm＝74-76℃；¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.9Hz,6H),1.22-1.37(m,40H),1.56-1.66(m,4H),1.85-2.00(m,2H),2.13-2.25(m,2H),2.24-2.32(m,4H),2.29-2.42(m,4H),3.53-3.66(m,16H),3.68-3.75(m,2H),3.75-3.83(m,2H),3.89(t,J＝4.9Hz,4H),4.37-4.51(m,2H),4.57(t,J＝4.9Hz,4H),4.59-4.69(m,6H),8.04(s,2H)；¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)δppm 14.5(2xCH₃),23.7(2xCH₂),26.8(2xCH₂),28.1(2xCH₂),29.3-29.7(16xCH₂),31.1(2xCH₂),33.1(2xCH₂),36.8(2xCH₂),51.4(2xCH₂),52.2(2xCH),54.6(2xCH),65.1(2xCH₂),70.3(2xCH₂),70.9(2xCH₂),71.4-71.5(8xCH₂),126.0(2xCH),145.4(2xC),171.9(2xC),174.9(2xC),176.4(2xC),176.4(2xC)；质量(ESI-)m/z(％)647(100)[M-2H]^2-；HRMS(ESI+)m/z为C₆₂H₁₀₉N₁₀O₁₉的计算值为1297.7870，实测值为1297.7860。

实施例5：化合物4.1至4.6

i.H-D-Glu(OBn)-OBn对甲苯磺酸盐(2equiv.)，TBTU(1.2equiv.)，DIEA(5equiv.)，DMF；ii.H-D-Glu(OBn)-OBn对甲苯磺酸盐(3equiv.)，TBTU(1.2equiv.)，DIEA(10equiv.)，DMF；iii.TFA，CH₂Cl₂；iv.CH₃(CH₂)_nCOCl，DMAP，吡啶，CH₂Cl₂；v.Pd/C 5％，THF。

化合物4.1

将所有试剂N-Boc-L-天冬氨酸4-苯甲基酯(2.00g，6.19mmol)、H-D-Glu(OBn)-OBn对甲苯磺酸盐(6.18g，12.37mmol，2equiv.)、TBTU(2.39g，7.43mmol，1.2equiv.)和DIEA(4.0g，30.9mmol，5equiv.)溶解在DMF(80ml)中。在RT下搅拌16h后，将反应介质用水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机相用NaHCO₃在水中的饱和溶液洗涤，用NaCl饱和水性溶液洗涤，然后经MgSO₄干燥，并在真空下浓缩。将残留物溶解在极少量CH₂Cl₂中，并在冷却条件下用***沉淀产物。将沉淀物使用滤纸在布氏漏斗上通过过滤进行回收，给出2.07g白色固体，得率为53％。

Rf＝0.44(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝102℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 1.44(s,9H),1.95-2.06(m,1H),2.18-2.47(m,3H),2.72(dd,J＝17.0,5.9Hz,1H),3.01(dd,J＝17.1,4.0Hz,1H),4.50-4.59(m,1H),4.59-4.66(m,1H),5.05-5.20(m,6H),5.63(d,J＝8.1Hz,NH),7.16(d,J＝7.3Hz,NH),7.28-7.41(m,15H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm27.2(CH₂),28.2(3xCH₃),30.0(CH₂),35.8(CH₂),50.6(CH),51.8(CH),66.5(CH₂),66.8(CH₂),67.3(CH₂),80.7(C),128.1-128.7(15xCH),135.1(C),135.4(C),135.7(C),155.6(C),170.7(C),171.1(C),171.5(C),172.4(C)；质量(ESI+)m/z(％)655(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₅H₄₀N₂O₉Na的计算值为655.2632[M+Na]⁺，实测值为655.2624。

化合物4.2

将所有试剂N-Boc-L-天冬氨酸(1.00g，4.28mmol)、H-D-Glu(OBn)-OBn对甲苯磺酸盐(6.22g，12.84mmol，3equiv.)、TBTU(3.3g，10.27mmol，1.2equiv.)和DIPEA(5.54g，42.8mmol，10equiv.)溶解在DMF(60ml)中。在RT下搅拌16h后，将反应介质用水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机相用NaHCO₃在水中的饱和溶液洗涤，用NaCl饱和水性溶液洗涤，然后经MgSO₄干燥，并在真空下浓缩。将残留物溶解在极少量CH₂Cl₂中，并在冷却条件下用***沉淀产物。将沉淀物使用滤纸在布氏漏斗上通过过滤进行回收，给出3.13g白色固体，得率为86％。

Rf＝0.56(CH₂Cl₂/EtOAc 8:2)；Tm＝89℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 1.43(s,9H),1.93-2.05(m,2H),2.15-2.28(m,2H),2.29-2.45(m,4H),2.47-2.56(m,1H),2.79-2.89(m,1H),4.47(m,1H),4.54-4.62(m,2H),5.07(s,4H),5.11(s,4H),5.96(d,J＝5.5Hz,NH),6.78(d,J＝7.4Hz,NH),7.38-7.27(m,20H),7.41(d,J＝7.0Hz,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 26.8(CH₂),27.0(CH₂),28.4(3xCH₃),30.2(CH₂),30.3(CH₂),37.5(CH₂),51.5(CH),52.0(CH),52.1(CH),66.6(CH₂),66.7(CH₂),67.4(CH₂),67.6(CH₂),80.6(C),128.3-128.8(20xCH),135.2(C),135.3(C),135.8(C),135.9(C),155.9(C),170.8(2xC),171.4(C),171.7(C),172.5(C),172.6(C)；质量(ESI-)m/z(％)850.4[M-H]^-,886.4(100)[M+Cl]^-；HRMS(ESI-)m/z为C47H₅₂N₃O₁₂的计算值为850.3551[M-H]^-，实测值为850.3510。

化合物4.3a

遵照通用流程G然后是C，从化合物4.1得到化合物4.3a(白色固体，431mg，0.63mmol，79％)。

Rf＝0.30(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝87℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.9Hz,3H),1.15-1.36(m,12H),1.50-1.64(m,2H),1.94-2.05(m,1H),2.14(t,J＝7.4Hz,2H),2.14-2.45(m,3H),2.76-2.92(m,2H,H3'),4.59-4.67(m,1H),4.96-5.02(m,1H),5.03-5.16(m,6H),7.13(d,J＝7.7Hz,NH),7.20-7.36(m,15H),7.60(d,J＝7.5Hz,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 13.9(CH₃),22.5(CH₂),25.3(CH₂),26.7(CH₂),29.8(CH₂),29.0-29.3(4xCH₂),31.7(CH₂),35.8(CH₂),36.0(CH₂),49.0(CH),51.7(CH),66.2(CH₂),66.4(CH₂),66.9(CH₂),127.9-128.4(15xCH),135.1(C),135.4(C),135.6(C),170.6(C),170.8(C),170.9(C),172.2(C),173.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)687[M+H]⁺,709(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₄₀H₅₁N₂O₈Na的计算值为709.3465[M+Na]⁺，实测值为709.3461。

化合物4.3b

遵照通用流程G然后是C，从化合物4.1得到化合物4.3b(白色固体，424mg，0.59mmol，75％)。

Rf＝0.31(环己烷/EtOAc7:3)；Tm＝75℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.8Hz,3H),1.15-1.36(m,16H),1.50-1.64(m,2H),1.93-2.04(m,1H),2.13(t,J＝7.6Hz,2H),2.14-2.45(m,3H),2.73-2.93(m,2H),4.57-4.66(m,1H),4.91-5.00(m,1H),5.01-5.16(m,6H),7.01(bs,NH),7.22-7.36(m,15H),7.50(bs,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.0(CH₃),22.5(CH₂),25.4(CH₂),26.8(CH₂),29.0-29.6(6xCH₂),29.9(CH₂),31.8(CH₂),35.7(CH₂),36.1(CH₂),49.1(CH),51.7(CH),66.3(CH₂),66.6(CH₂),67.0(CH₂),127.9-128.5(15xCH),135.2(C),135.4(C),135.7(C),170.5(C),171.0(2xC),172.3(C),173.6(C)；质量(ESI+)m/z(％)715[M+H]⁺,737(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₄₂H₅₄N₂O₈Na的计算值为737.3778[M+Na]⁺，实测值为737.3781。

化合物4.3c

遵照通用流程G然后是C，从化合物4.1得到化合物4.3c(白色固体，523mg，0.71mmol，86％)。

Rf＝0.34(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝75℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.9Hz,3H),1.16-1.36(m,20H),1.49-1.65(m,2H),1.93-2.04(m,1H),2.13(t,J＝7.7Hz,2H),2.16-2.45(m,3H),2.74-2.91(m,2H),4.57-4.65(m,1H),4.95-5.02(m,1H),5.02-5.14(m,6H),7.17(d,J＝8.4Hz,NH),7.20-7.34(m,15H),7.61(d,J＝8.0Hz,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.0(CH₃),22.6(CH₂),25.4(CH₂),26.7(CH₂),29.0-29.6(8xCH₂),29.9(CH₂),31.8(CH₂),35.8(CH₂),36.1(CH₂),49.1(CH),51.8(CH),66.3(CH₂),66.5(CH₂),67.0(CH₂),127.9-128.5(15xCH),135.2(C),135.4(C),135.7(C),170.7(C),170.9(2xC),172.3(C),173.7(C)；质量(ESI+)m/z(％)743[M+H]⁺,765(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₄₄H₅₈N₂O₈Na的计算值为765.4091[M+Na]⁺，实测值为765.4079。

化合物4.3d

遵照通用流程G然后是C，从化合物4.1得到化合物4.3d(白色固体，523mg，0.68mmol，89％)。

Rf＝0.37(环己烷/EtOAc 7:3)；Tm＝85-86℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.8Hz,3H),1.15-1.35(m,24H),1.49-1.63(m,2H),1.92-2.04(m,1H),2.12(t,J＝7.6Hz,2H),2.13-2.45(m,3H),2.73-2.93(m,2H),4.57-4.65(m,1H),4.92-5.01(m,1H),5.01-5.14(m,6H),7.17(bs,NH),7.19-7.36(m,15H),7.61(bs,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.0(CH₃),22.5(CH₂),25.4(CH₂),26.7(CH₂),29.0-29.6(11xCH₂),29.9(CH₂),31.8(CH₂),35.7(CH₂),36.1(CH₂),49.1(CH),51.7(CH),66.1(CH₂),66.5(CH₂),67.0(CH₂),127.9-128.5(15xCH),135.2(C),135.4(C),135.7(C),170.6(C),171.0(2xC),172.2(C),173.5(C)；质量(ESI+)m/z(％)793(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₄₆H₆₂N₂O₈Na的计算值为793.4404[M+Na]⁺，实测值为793.4420。

化合物4.4a

遵照通用流程G然后是C，从化合物4.2得到化合物4.4a(白色固体，437mg，0.48mmol，82％)。

Rf＝0.27(CH₂Cl₂/EtOAc 8:2)；Tm＝130-133℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.8Hz,3H),1.18-1.38(m,12H),1.56-1.67(m,2H),1.94-2.06(m,2H),2.16-2.28(m,4H),2.30-2.48(m,5H),2.88(dd,J＝14.9,3.2Hz,1H),4.52-4.63(m,2H),4.73-4.80(m,1H),5.04-5.17(m,8H),6.93(d,J＝7.5Hz,NH),7.13(d,J＝7.5Hz,NH),7.27-7.38(m,10H),7.51(d,J＝7.6Hz,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.1(CH₃),22.7(CH₂),25.5(CH₂),26.6(CH₂),26.8(CH₂),29.2-29.5(3xCH₂),30.1(CH₂),30.2(CH₂),31.9(2xCH₂),36.4(CH₂),37.1(CH₂),49.9(CH),51.9(CH),52.1(CH),66.5(2xCH₂),67.2(CH₂),67.4(CH₂),128.1-128.7(20xCH),135.2(C),135.3(C),135.8(2xC),170.0(C),171.1(C),171.3(C),171.8(C),172.3(C),172.5(C),174.1(C)；质量(ESI+)m/z(％)907[M+H]⁺,929(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₂H₆₃N₃O₁₁Na的计算值为928.4360[M+Na]⁺，实测值为928.4380。

化合物4.4b

遵照通用流程G然后是C，从化合物4.2得到化合物4.4b(白色固体，430mg，0.46mmol，78％)。

Rf＝0.33(CH₂Cl₂/EtOAc 8:2)；Tm＝112-114℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.87(t,J＝6.9Hz,3H),1.17-1.37(m,16H),1.56-1.67(m,2H),1.94-2.07(m,2H),2.16-2.28(m,4H),2.30-2.47(m,5H),2.87(dd,J＝14.9,3.3Hz,1H),4.52-4.63(m,2H),4.74-4.80(m,1H),5.04-5.17(m,8H),6.96(d,J＝7.5Hz,NH),7.14(d,J＝7.5Hz,NH),7.27-7.38(m,10H),7.52(d,J＝7.6Hz,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.1(CH₃),22.6(CH₂),25.5(CH₂),26.7(2xCH₂),29.2-29.7(5xCH₂),30.0(CH₂),30.2(CH₂),31.8(2xCH₂),36.3(CH₂),37.1(CH₂),49.9(CH),51.8(CH),52.0(CH),66.4(2xCH₂),67.1(CH₂),67.2(CH₂),128.0-128.6(20xCH),135.1(C),135.2(C),135.7(C),135.8(C),170.9(C),171.0(C),171.3(C),171.7(C),172.3(C),172.4(C),174.0(C)；质量(ESI+)m/z(％)935[M+H]⁺,957(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₄H₆₇N₃O₁₁Na的计算值为956.4673[M+Na]⁺，实测值为956.4682。

化合物4.4c

遵照通用流程G然后是C，从化合物4.2得到化合物4.4c(白色固体，437mg，0.45mmol，77％)。

Rf＝0.39(CH₂Cl₂/EtOAc 8:2)；Tm＝112-116℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝7.0Hz,3H),1.16-1.35(m,20H),1.56-1.65(m,2H),1.93-2.06(m,2H),2.15-2.28(m,4H),2.30-2.47(m,5H),2.87(dd,J＝14.9,3.0Hz,1H),4.51-4.63(m,2H),4.72-4.80(m,1H),5.05-5.14(m,8H),6.94(d,J＝7.4Hz,NH),7.11(d,J＝7.5Hz,NH),7.27-7.38(m,10H),7.50(d,J＝7.7Hz,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.3(CH₃),22.8(CH₂),25.6(CH₂),26.7(CH₂),26.9(CH₂),29.3-29.9(7xCH₂),30.3(CH₂),30.4(CH₂),32.1(2xCH₂),36.6(CH₂),37.2(CH₂),49.9(CH),52.2(CH),52.3(CH),66.7(2xCH₂),67.4(CH₂),67.6(CH₂),128.3-128.9(20xCH),135.2(C),135.3(C),135.9(2xC),171.2(2xC),171.3(C),171.9(C),172.5(C),172.6(C),174.1(C)；质量(ESI+)m/z(％)963(100)[M+H]⁺,985[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₆H₇₁N₃O₁₁Na的计算值为984.4986[M+Na]⁺，实测值为984.4996。

化合物4.4d

遵照通用流程G然后是C，从化合物4.2得到化合物4.4d(白色固体，436mg，0.44mmol，75％)。

Rf＝0.42(CH₂Cl₂/EtOAc 8:2)；Tm＝120-124℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝7.0Hz,3H),1.19-1.35(m,24H),1.55-1.66(m,2H),1.94-2.07(m,2H),2.16-2.28(m,4H),2.29-2.50(m,5H),2.88(dd,J＝14.9,3.3Hz,1H),4.52-4.64(m,2H),4.73-4.81(m,1H),5.04-5.17(m,8H),6.99(d,J＝7.5Hz,NH),7.16(d,J＝7.5Hz,NH),7.27-7.38(m,20H),7.53(d,J＝7.6Hz,NH)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.3(CH₃),22.8(CH₂),25.6(CH₂),26.7(CH₂),26.9(CH₂),29.3-29.9(11xCH₂),30.3(CH₂),30.4(CH₂),32.1(2xCH₂),36.6(CH₂),37.2(CH₂),49.9(CH),52.2(2xCH),66.6(CH₂),66.7(CH₂),67.4(CH₂),67.6(CH₂),128.3-128.8(20xCH),135.2(C),135.3(C),135.8(C),135.9(C),171.2(2xC),171.3(C),171.9(C),172.5(C),172.6(C),174.2(C)；质量(ESI+)m/z(％)991(100)[M+H]⁺,1013[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₈H₇₅N₃O₁₁Na的计算值为1012.5299[M+Na]⁺，实测值为1012.5296。

化合物4.5a

遵照通用流程D2，从化合物4.3a得到化合物4.5a(白色固体，175mg，0.42mmol，72％)。

Tm＝160-162℃；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.22-1.39(m,12H),1.55-1.68(m,2H),1.90-2.02(m,1H),2.14-2.24(m,1H),2.25(t,J＝7.5Hz,2H),2.36-2.42(m,2H),2.66(dd,J＝16.7,7.3Hz,1H),2.85(dd,J＝16.7,6.4Hz,1H),4.43(dd,J＝8.8,4.8Hz,1H),4.79(dd,J＝7.3,6.4Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),33.0(CH₂),30.2-31.1(4xCH₂),36.7(CH₂),36.9(CH₂),51.1(CH),53.2(CH),173.0(C),173.8(C),174.5(C),176.4(C),176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)397(100)[M-F]^-,415[M-H]^-,437[M+Na-2H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₁₉H₃₁N₂O₈的计算值为415.2080[M-H]^-，实测值为415.2093。

化合物4.5b

遵照通用流程D2，从化合物4.3b得到化合物4.5b(白色固体，190mg，0.43mmol，77％)。

Tm＝151℃；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.90(t,J＝6.7Hz,3H),1.20-1.41(m,16H),1.55-1.68(m,2H),1.90-2.02(m,1H),2.14-2.24(m,1H),2.25(t,J＝7.5Hz,2H),2.36-2.42(m,2H),2.66(dd,J＝16.7,7.2Hz,1H),2.85(dd,J＝16.7,6.5Hz,1H),4.43(dd,J＝8.7,4.8Hz,1H),4.79(dd,J＝7.2,6.5Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),30.2-31.1(6xCH₂),33.06(CH₂),36.7(CH₂),36.9(CH₂),51.1(CH),53.2(CH),173.0(C),173.8(C),174.5(C),176.5(2xC)；质量(ESI-)m/z(％)425[M-F]^-,443(100)[M-H]^-,465[M+Na-2H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₂₁H₃₅N₂O₈的计算值为443.2393[M-H]^-，实测值为443.2396。

化合物4.5c

遵照通用流程D2，从化合物4.3c得到化合物4.5c(白色固体，194mg，0.41mmol，76％)。

Tm＝145-148℃；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.20-1.40(m,20H),1.56-1.67(m,2H),1.91-2.02(m,1H),2.14-2.24(m,1H),2.25(t,J＝7.5Hz,2H),2.36-2.43(m,2H),2.66(dd,J＝16.7,7.2Hz,1H),2.85(dd,J＝16.7,6.4Hz,1H),4.43(dd,J＝8.8,4.8Hz,1H),4.79(dd,J＝7.2,6.4Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),30.2-31.1(10xCH₂),33.1(CH₂),36.7(CH₂),36.9(CH₂),51.1(CH),53.2(CH),173.0(C),173.8(C),174.5(C),176.5(2xC)；质量(ESI-)m/z(％)453[M-F]^-,471(100)[M-H]^-,493[M+Na-2H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₂₃H₃₉N₂O₈的计算值为471.2706[M-H]^-，实测值为471.2686。

化合物4.5d

遵照通用流程D2，从化合物4.3d得到化合物4.5d(白色固体，243mg，0.49mmol，93％)。

Tm＝138-141℃；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.90(t,J＝6.9Hz,3H),1.23-1.38(m,24H),1.56-1.67(m,2H),1.91-2.02(m,1H),2.15-2.24(m,1H),2.25(t,J＝7.5Hz,2H),2.36-2.43(m,2H),2.66(dd,J＝16.6,7.2Hz,1H),2.86(dd,J＝16.6,6.3,1H),4.43(dd,J＝8.8,4.8,Hz,1H),4.79(dd,J＝7.2,6.3Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),30.2-31.1(12xCH₂),33.1(CH₂),36.7(CH₂),36.9(CH₂),51.1(CH),53.2(CH),173.0(C),173.9(C),174.5(C),176.5(2xC)；质量(ESI-)m/z(％)481[M-F]^-,499(100)[M-H]^-,521[M+Na-2H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₂₅H₄₃N₂O₈的计算值为499.3019[M-H]^-，实测值为499.3027。

化合物4.6a

遵照通用流程D2，从化合物4.4a得到化合物4.6a(白色固体，221mg，0.40mmol，93％)。

Tm＝170-175℃；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.21-1.37(m,12H),1.54-1.66(m,2H),1.87-2.02(m,2H),2.13-2.28(m,4H),2.35-2.44(m,4H),2.63(dd,J＝15.1,8.0Hz,1H),2.80(dd,J＝15.1,6.1Hz,1H),4.40-4.48(m,2H),4.80(dd,J＝8.0 6.1 1H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),28.0(CH₂),30.4(2xCH₂),30.5(CH₂),30.6(CH₂),31.1(CH₂),31.2(CH₂),33.0(CH₂),36.9(CH₂),38.4(CH₂),51.6(CH),53.0(CH),53.2(CH),172.1(C),173.1(C),174.6(C),175.0(C),176.4(C),176.5(2xC)；质量(ESI-)m/z(％)544(100)[M-H]^-,566[M+Na-2H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₂₄H₃₈N₃O₁₁的计算值为544.2506[M-H]^-，实测值为544.2514。

化合物4.6b

遵照通用流程D2，从化合物4.4b得到化合物4.6b(白色固体，247mg，0.43mmol，98％)。

Tm＝165-170℃；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H)1.20-1.38(m,16H),1.54-1.66(m,2H),1.88-2.02(m,2H),2.13-2.28(m,4H),2.35-2.44(m,4H),2.63(dd,J＝15.1 8.1Hz,1H),2.80(dd,J＝15.1,6.1Hz,1H),4.39-4.48(m,2H),4.79(dd,J＝8.1,6.1 1H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),28.0(CH₂),28.1(CH₂),30.3-31.3(8xCH₂),33.1(CH₂),36.9(CH₂),38.4(CH₂),51.7(CH),53.2(CH),53.3(CH),172.1(C),173.1(C),174.7(C),175.2(C),176.5(C),176.6(C)；质量(ESI-)m/z(％)572[M-H]^-,594(100)[M+Na-2H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₂₆H₄₂N₃O₁₁的计算值为572.2819[M-H]^-，实测值为572.2817。

化合物4.6c

遵照通用流程D2，从化合物4.4c得到化合物4.6c(白色固体，208mg，0.35mmol，80％)。

Tm＝155-160℃；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.22-1.38(m,20H),1.54-1.67(m,2H),1.87-2.02(m,2H),2.13-2.29(m,4H),2.36-2.44(m,4H),2.63(dd,J＝15.0,8.0Hz,1H),2.81(dd,J＝15.0,6.1Hz,1H),4.40-4.48(m,2H),4.77-4.83(dd,J＝8.0,6.1,1H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),28.0(CH₂),31.3-30.3(10xCH₂),33.1(CH₂),36.9(CH₂),38.4(CH₂),51.6(CH),53.0(CH),53.2(CH),172.1(C),173.1(C),174.6(C),175.0(C),176.4(C),176.5(2xC)；质量(ESI-)m/z(％)600(100)[M-H]^-,622[M+Na-2H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₂₈H₄₆N₃O₁₁的计算值为600.3132[M-H]^-；实测值为600.3108。

化合物4.6d

遵照通用流程D2，从化合物4.4d得到化合物4.6d(白色固体，208mg，0.33mmol，75％)。

Tm＝158-160℃；¹H NMR(400MHz,MeOD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.22-1.37(m,24H),1.54-1.66(m,2H),1.85-2.02(m,2H),2.13-2.28(m,4H),2.35-2.44(m,4H),2.63(dd,J＝15.1,8.0Hz,1H),2.80(dd,J＝15.1,6.1Hz,1H),4.42-4.48(m,2H),4.79(dd,J＝8.0,6.1 1H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD)δppm 14.4(CH₃),23.7(CH₂),26.8(CH₂),27.9(CH₂),28.0(CH₂),30.3-31.3(12xCH₂),33.1(CH₂),36.9(CH₂),38.4(CH₂),51.7(CH),53.1(CH),53.2(CH),172.1(C),173.1(C),174.6(C),175.0(C),176.4(C),176.5(2xC)；质量(ESI-)m/z(％)628(100)[M-H]^-,650[M+Na-2H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₃₀H₅₀N₃O₁₁的计算值为628.3445[M-H]^-；实测值为628.3448。

实施例6:化合物5.1至5.3

i.Et₃SiH，TFA，CH₂Cl₂，然后是CH₃(CH₂)_n-2CHCH₂，DMPA，THF；ii.乙基氨基麦芽糖苷(乙酸酯)，TBTU，DIEA，DMF；iii.Et₂NH，CH₂Cl₂；iv.RCOOH(R＝EtO₂C(CH₂)₂CHCO₂Me)，TBTU，DIEA，DMF；v.MeONa，MeOH，然后是Dowex；vi.LiOH，THF/H₂O。

化合物5.1a

遵照通用流程L，从L-Fmoc-Cys(Trt)-OH和十二烯得到化合物5.1a(白色固体，1.051g，2.06mmol，60％)。

Rf＝0.16(CH₂Cl₂/MeOH/AcOH 99:0.5:0.5)；Tm＝66-68℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.8Hz,3H),1.17-1.40(m,18H),1.57(m,2H),2.56(t,J＝7.0Hz,2H),3.03(d,J＝4.7Hz,2H),4.24(t,J＝7.0Hz,1H),4.41(d,J＝6.9Hz,2H),4.63(m,1H),5.65(d,J＝7.8Hz,NHFmoc),7.32(m,2H),7.40(t,J＝7.5Hz,2H),7.60(d,J＝6.6Hz,2H),7.76(d,J＝7.5Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.3(CH₃),22.8(CH₂),28.8-32.1(9xCH₂),33.1(CH₂),34.2(CH₂),47.2(CH),53.6(CH),67.6(CH₂),120.2(2xCH),125.3(2xCH),127.3(2xCH),127.9(2xCH),141.5(2xC),143.8(C),143.9(C),156.1(C),175.0(C)；质量(ESI+)m/z(％)512(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₀H₄₂NO₄S的计算值为512.2829，实测值为512.2823。

化合物5.1b

遵照通用流程L，从L-Fmoc-Cys(Trt)-OH和十四烯得到化合物5.1b(白色固体，1.050g，1.95mmol，57％)。

Rf＝0.16(CH₂Cl₂/MeOH/AcOH 99:0.5:0.5)；Tm＝71-72℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.8Hz,3H),1.17-1.40(m,22H),1.57(m,2H),2.55(t,J＝7.0Hz,2H),3.03(d,J＝4.3Hz,2H),4.24(t,J＝7.0Hz,1H),4.41(d,J＝6.8Hz,2H),4.63(m,1H),5.65(d,J＝7.8Hz,NHFmoc),7.31(m,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.60(d,J＝6.7Hz,2H),7.76(d,J＝7.5Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.2(CH₃),22.8(CH₂),28.8-32.1(11xCH₂),33.1(CH₂),34.3(CH₂),47.2(CH),53.6(CH),67.6(CH₂),120.1(2xCH),125.2(2xCH),127.2(2xCH),127.9(2xCH),141.4(2xC),143.8(C),143.9(C),156.1(C),175.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)316(100),538(40)[M+H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₃₂H₄₄NO₄S的计算值为538.2991[M-H]^-，实测值为538.2970。

化合物5.1c

遵照通用流程L，从L-Fmoc-Cys(Trt)-OH和十六烯得到化合物5.1c(白色固体，1.248g，2.20mmol，64％)。

Rf＝0.16(CH₂Cl₂/MeOH/AcOH 99:0.5:0.5)；Tm＝70℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.8Hz,3H),1.14-1.40(m,26H),1.57(m,2H),2.56(t,J＝7.0Hz,2H),3.03(d,J＝4.5Hz,2H),4.24(t,J＝7.0Hz,1H),4.41(d,J＝6.6Hz,2H),4.62(m,1H),5.65(d,J＝7.7Hz,NHFmoc),7.31(m,2H,),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.60(d,J＝6.8Hz,2H),7.76(d,J＝7.5Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.3(CH₃),22.8(CH₂),28.8-32.1(13xCH₂),33.1(CH₂),34.2(CH₂),47.3(CH),53.6(CH),67.6(CH₂),120.2(2xCH),125.3(2xCH),127.3(2xCH),127.9(2xCH),141.5(2xC),143.8(C),143.9(C),156.1(C),174.9(C)；质量(ESI+)m/z(％)568(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₄H₅₀NO₄S的计算值为568.3455[M+H]⁺，实测值为568.3451。

化合物5.1d

遵照通用流程L，从L-Fmoc-Cys(Trt)-OH和十八烯得到化合物5.1d(白色固体，1.230g，2.07mmol，60％)。

Rf＝0.16(CH₂Cl₂/MeOH/AcOH 99:0.5:0.5)；Tm＝74℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.8Hz,3H),1.13-1.40(m,30H),1.57(m,2H),2.56(t,J＝6.7Hz,2H),3.03(d,J＝4.4Hz,2H),4.24(t,J＝7.0Hz,1H),4.42(d,J＝6.7Hz,2H),4.62(d,J＝6.0Hz,1H),5.64(d,J＝7.6Hz,NHFmoc),7.32(m,2H),7.40(t,J＝7.5Hz,2H),7.60(d,J＝7.2Hz,2H),7.77(d,J＝7.5Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm14.3(CH₃),22.8(CH₂),28.9-32.1(15xCH₂),33.1(CH₂),34.2(CH₂),47.2(CH),53.6(CH),67.6(CH₂),120.2(2xCH),125.3(2xCH),127.3(2xCH),127.9(2xCH),141.5(2xC),143.8(C),143.9(C),156.1(C),174.8(C)；质量(ESI+)m/z(％)596(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₃₆H₅₄NO₄S的计算值为596.3768[M+H]⁺，实测值为596.3762。

化合物5.2a

遵照通用流程A，从化合物5.1a和2'-氨基乙基-4-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3,6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(未描述)得到化合物5.2a(无色固体，1.036g，0.87mmol，60％)。

Rf＝0.29(环己烷/EtOAc 5:5)；Tm＝84-85℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.86(t,J＝7.0Hz,3H),1.16-1.38(m,18H),1.50-1.62(m,2H),1.99,1.99,2.01,2.01,2.03,2.08,2.11(s,21H),2.45-2.60(m,2H),2.76-2.96(m,2H),3.32-3.44(m,1H),3.46-3.56(m,1H),3.61-3.71(m,2H),3.75-3.84(m,1H),3.90-3.98(m,2H),4.03(dd,J＝12.4,2.2Hz,1H),4.15(dd,J＝12.2,4.4Hz,1H),4.18-4.28(m,3H),4.34-4.47(m,2H),4.51(d,J＝7.8Hz,1H),4.52(dd,J＝12.2,2.5Hz,1H),4.79(dd,J＝9.3,7.8Hz,1H),4.84(dd,J＝10.4,4.0Hz,1H),5.05(t,J＝9.7Hz,1H),5.23(t,J＝9.3Hz,1H),5.35(dd,J＝10.4,9.7Hz,1H),5.39(d,J＝4.0Hz,1H),5.77(s,NH),6.66(s,NH),7.27-7.33(m,2H),7.41-7.47(m,2H),7.59(d,J＝7.4Hz,2H),7.75(d,J＝7.4Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.3(CH₃),20.6-21.1(7xCH₃),22.8(CH₂),28.9-32.1(9xCH₂),32.8(CH₂),34.8(CH₂),39.7(CH₂),47.3(CH),54.5(CH),61.6(CH₂),62.7(CH₂),67.3(CH₂),68.2(CH),68.6(CH₂),68.7(CH),69.5(CH),70.2(CH),72.3(CH),72.6(2xCH),75.3(CH),95.7(CH),100.5(CH),120.2(2xCH),125.2(CH),125.3(CH),127.2(2xCH),127.9(2xCH),141.5(2xC),143.9(2xC),156.0(C),169.6(C),170.0(C),170.1(C),170.3(C),170.5(C),170.7(3xC)；质量(ESI+)m/z(％)1196(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₅₈H₈₁N₂O₂₁S的计算值为1195.4872[M+Na]⁺，实测值为1195.4875。

化合物5.2b

遵照通用流程A，从化合物5.1b和2'-氨基乙基-4-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3,6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(未描述)得到化合物5.2b(无色固体，708mg，0.60mmol，63％)。

Rf＝0.29(环己烷/EtOAc 5:5)；Tm＝90-91℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.87(t,J＝7.0Hz,3H),1.18-1.39(m,22H),1.52-1.62(m,2H),2.00,2.00,2.02,2.02,2.04,2.09,2.12(s,21H),2.48-2.60(m,2H),2.77-2.97(m,2H),3.31-3.45(m,1H),3.49-3.58(m,1H),3.62-3.73(m,2H),3.77-3.85(m,1H),3.91-3.99(m,2H),4.04(dd,J＝12.4,2.2Hz,1H),4.16(dd,J＝12.1,4.4Hz,1H),4.20-4.28(m,3H),4.35-4.48(m,2H),4.53(d,J＝7.8Hz,1H),4.54(dd,J＝12.1,2.5Hz,1H),4.80(dd,J＝9.3,7.8Hz,1H),4.85(dd,J＝10.4,4.0Hz,1H),5.05(t,J＝9.7Hz,1H),5.25(t,J＝9.3Hz,1H),5.35(dd,J＝10.4,9.7Hz,1H),5.39(d,J＝4.0Hz,1H),5.75(s,NH),6.66(s,NH),7.28-7.34(m,2H),7.3-7.43(m,2H),7.60(d,J＝7.5Hz,2H),7.77(d,J＝7.5Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.3(CH₃),20.6-21.1(7xCH₃),22.8(CH₂),28.9-32.1(11xCH₂),32.8(CH₂),34.7(CH₂),39.7(CH₂),47.3(CH),54.5(CH),61.6(CH₂),62.7(CH₂),67.3(CH₂),68.1(CH),68.6(CH₂),68.7(CH),69.5(CH),70.2(CH),72.3(CH),72.6(2xCH),75.3(CH),95.7(CH),100.5(CH),120.2(2xCH),125.2(2xCH),127.2(2xCH),127.9(2xCH),141.5(2xC),143.9(2xC),156.0(C),169.6(C),170.0(C),170.1(C),170.3(C),170.5(C),170.7(3xC)；质量(ESI+)m/z(％)1201(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₆₀H₈₅N₂O₂₁S的计算值为1201.5360[M+H]⁺，实测值为1201.5359。

化合物5.2c

遵照通用流程A，从化合物5.1c和2'-氨基乙基-4-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3,6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(未描述)得到化合物5.2c(无色固体，331mg，0.27mmol，31％)。

Rf＝0.29(环己烷/EtOAc 5:5)；Tm＝98-99℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.87(t,J＝6.8Hz,3H),1.16-1.40(m,26H),1.52-1.62(m,2H),2.00,2.00,2.02,2.02,2.04,2.09,2.12(s,21H),2.49-2.59(m,2H),2.77-2.97(m,2H),3.34-3.45(m,1H),3.47-3.58(m,1H),3.62-3.73(m,2H),3.77-3.85(m,1H),3.91-3.99(m,2H),4.04(dd,J＝12.4,2.2Hz,1H),4.15(dd,J＝12.1,4.4Hz,1H),4.20-4.28(m,3H),4.35-4.47(m,2H),4.53(d,J＝7.9Hz,1H),4.54(dd,J＝12.1,2.5Hz,1H),4.80(dd,J＝9.3,7.9Hz,1H),4.85(dd,J＝10.4,4.0Hz,1H),5.05(t,J＝9.6Hz,1H),5.24(t,J＝9.3Hz,1H),5.35(dd,J＝10.4,9.6Hz,1H),5.39(d,J＝4.0Hz,1H),5.75(s,NH),6.66(s,NH),7.28-7.34(m,2H),7.37-7.43(m,2H),7.60(d,J＝7.4Hz,2H),7.76(d,J＝7.4Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.3(CH₃),20.6-21.1(7xCH₃),22.8(CH₂),28.9-32.1(13xCH₂),32.8(CH₂),34.7(CH₂),39.6(CH₂),47.3(CH),54.6(CH),61.6(CH₂),62.6(CH₂),67.3(CH₂),68.1(CH),68.6(CH₂),68.7(CH),69.5(CH),70.2(CH),72.3(CH),72.6(2xCH),75.3(CH),95.7(CH),100.5(CH),120.2(2xCH),125.2(2xCH),127.2(2xCH),127.9(2xCH),141.5(2xC),143.9(2xC),156.0(C),169.6(C),170.0(C),170.1(C),170.3(C),170.5(C),170.7(3xC)；质量(ESI+)m/z(％)1230(100)[M+Na]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₆₂H₈₉N₂O₂₁S的计算值为1229.5673[M+H]⁺，实测值为1229.5680。

化合物5.2d

遵照通用流程A，从化合物5.1d和2'-氨基乙基-4-O-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)-2,3,6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(未描述)得到化合物5.2d(无色固体，679mg，0.54mmol，63％)。

Rf＝0.29(环己烷/EtOAc 5:5)；Tm＝100℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm 0.88(t,J＝6.8Hz,3H),1.17-1.40(m,30H),1.52-1.63(m,2H),2.00,2.00,2.02,2.02,2.04,2.09,2.13(s,21H),2.48-2.60(m,2H),2.77-2.97(m,2H),3.34-3.46(m,1H),3.47-3.58(m,1H),3.63-3.73(m,2H),3.77-3.85(m,1H),3.91-3.99(m,2H),4.04(dd,J＝12.4,2.2Hz,1H),4.16(dd,J＝12.2,4.4Hz,1H),4.20-4.29(m,3H),4.36-4.48(m,2H),4.52(d,J＝7.8Hz,1H),4.54(dd,J＝12.2,2.6Hz,1H),4.80(dd,J＝9.3,7.8Hz,1H),4.85(dd,J＝10.5,4.0Hz,1H),5.06(t,J＝9.7Hz,1H),5.25(t,J＝9.3Hz,1H),5.36(dd,J＝10.5,9.7Hz,1H),5.39(d,J＝4.0Hz,1H),5.75(s,NH),6.64(s,NH),7.29-7.34(m,2H),7.40(m,2H),7.60(d,J＝7.5Hz,2H),7.77(d,J＝7.5Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δppm 14.3(CH₃),20.5-21.1(7xCH₃),22.8(CH₂),28.9-32.1(15xCH₂),32.8(CH₂),34.7(CH₂),39.6(CH₂),47.3(CH),54.6(CH),61.6(CH₂),62.7(CH₂),67.3(CH₂),68.1(CH),68.6(CH₂),68.7(CH),69.5(CH),70.2(CH),72.3(CH),72.6(2xCH),75.3(CH),95.7(CH),100.5(CH),120.2(2xCH),125.2(2xCH),127.2(2xCH),127.9(2xCH),141.5(2xC),143.9(2xC),156.0(C),169.6(C),170.0(C),170.1(C),170.3(C),170.5(C),170.7(3xC)；质量(ESI+)m/z(％)1258(100)[M+H]⁺；HRMS(ESI+)m/z为C₆₄H₉₃N₂O₂₁S的计算值为1257.5986[M+H]⁺，实测值为1257.5984。

化合物5.3a

遵照通用流程B、然后是A、J、最后是F，从化合物5.2a和5-乙氧基-2-(甲氧基羰基)-5-氧基戊酸(未描述)得到非对映异构体的混合物形式的化合物5.3a(白色固体，50mg，0.06mmol，35％)。

Tm＝96-98℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.21-1.44(m,18H),1.53-1.63(m,2H),1.70-1.82(m,1H),1.84-1.98(m,1H),2.08-2.22(m,2H),2.34-2.43(m,2H),2.52-2.60(m,2H),2.70-2.89(m,1H),2.90-3.07(m,1H),3.22-3.31(m,2H),3.33-3.43(m,2H),3.46(dd,J＝9.8,3.8Hz,1H),3.48-3.58(m,2H),3.58-3.73(m,5H),3.77-3.95(m,4H),4.29-4.35(m,1H),4.46-4.58(m,1H),5.16(d,J＝3.7Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),23.7(2xCH₂),24.7-25.6(CH₂),29.8-30.8(9xCH₂),32.1-32.3(CH₂),33.0(CH₂),33.0-33.2(CH₂),34.3-34.8(CH₂),40.6-40.8(CH₂),52.0-52.5(CH),54.4-55.0(CH),62.0-62.2(CH₂),62.7(CH₂),69.1-69.4(CH₂),71.4(CH),74.1(CH),74.6-74.7(CH),74.7(CH),75.0(CH),76.4-76.6(CH),77.5-77.7(CH),81.0-81.3(CH),102.8(CH),104.1-104.4(CH),171.3-171.6(C),172.6-172.8(C),172.9-173.2(C),176.3-176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)384(25)[M-CO₂H]^2-,813(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₃₅H₆₁N₂O₁₇S的计算值为813.3686[M-H]^-，实测值为813.3651。

化合物5.3b

遵照通用流程B、然后是A、J、最后是F，从化合物5.2b和5-乙氧基-2-(甲氧基羰基)-5-氧基戊酸(未描述)得到非对映异构体的混合物形式的化合物5.3b(白色固体，52mg，0.06mmol，26％)。

Tm>130℃(分解)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.21-1.44(m,22H),1.53-1.63(m,2H),1.72-1.83(m,1H),1.82-2.00(m,1H),2.07-2.23(m,2H),2.35-2.45(m,2H),2.52-2.61(m,2H),2.70-2.90(m,1H),2.90-3.07(m,1H),3.22-3.30(m,2H),3.33-3.43(m,2H),3.43-3.48(m,1H),3.48-3.58(m,2H),3.58-3.73(m,5H),3.77-3.95(m,4H),4.29-4.35(m,1H),4.46-4.58(m,1H),5.16(d,J＝3.7Hz,1H)。¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.4(CH₃),23.7(2xCH₂),24.7-25.6(CH₂),29.8-30.8(11xCH₂),32.1-32.3(CH₂),33.0(CH₂),33.0-33.2(CH₂),34.3-34.8(CH₂),40.6-40.8(CH₂),52.0-52.5(CH),54.4-55.0(CH),62.0-62.2(CH₂),62.7(CH₂),69.1-69.4(CH₂),71.5(CH),74.1(CH),74.6(CH),74.7(CH),75.0(CH),76.4-76.6(CH),77.6-77.7(CH),81.0-81.1(CH),102.9(CH),104.2-104.4(CH),171.0-171.7(C),172.6-172.8(C),172.9-173.2(C),176.3-176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)841(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₃₇H₆₅N₂O₁₇S的计算值为841.4004[M-H]^-，实测值为841.4025。

化合物5.3c

遵照通用流程B、然后是A、J、最后是F，从化合物5.2c和5-乙氧基-2-(甲氧基羰基)-5-氧基戊酸(未描述)得到非对映异构体的混合物形式的化合物5.3c(白色固体，82mg，0.09mmol，41％)。

Tm>145℃(分解)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.21-1.44(m,26H),1.53-1.63(m,2H),1.72-1.82(m,1H),1.82-2.00(m,1H),2.08-2.23(m,2H),2.32-2.45(m,2H),2.52-2.61(m,2H),2.70-2.90(m,1H),2.90-3.07(m,1H),3.22-3.31(m,2H),3.33-3.43(m,2H),3.46(dd,J＝9.7,3.7Hz,1H),3.48-3.58(m,2H),3.58-3.74(m,5H),3.78-3.95(m,4H),4.30-4.35(m,1H),4.46-4.57(m,1H),5.16(d,J＝3.7Hz,1H)。¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.5(CH₃),23.7(2xCH₂),24.7-25.6(CH₂),29.8-30.9(13xCH₂),32.1-32.3(CH₂),33.0(CH₂),33.0-33.2(CH₂),34.2-34.7(CH₂),40.6-40.9(CH₂),52.0-52.5(CH),54.3-54.9(CH),61.9-62.1(CH₂),62.7(CH₂),69.0-69.4(CH₂),71.4(CH),74.1(CH),74.6(CH),74.7(CH),75.0(CH),76.4-76.5(CH),77.6(CH),81.0-81.2(CH),102.8(CH),104.1-104.3(CH),171.0-171.7(C),172.6-172.8(C),172.9-173.2(C),176.3-176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)412(25)[M-CO₂H]^2-,869(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₃₉H₆₉N₂O₁₇S的计算值为869.4317[M-H]^-，实测值为869.4340。

化合物5.3d

遵照通用流程B、然后是A、J、最后是F，从化合物5.2d和5-乙氧基-2-(甲氧基羰基)-5-氧基戊酸(未描述)得到非对映异构体的混合物形式的化合物5.3d(白色固体，81mg，0.09mmol，30％)。

Tm>155℃(分解)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δppm 0.90(t,J＝6.8Hz,3H),1.21-1.43(m,30H),1.53-1.63(m,2H),1.71-1.82(m,1H),1.86-1.98(m,1H),2.07-2.22(m,2H),2.32-2.43(m,2H),2.52-2.60(m,2H),2.69-2.90(m,1H),2.90-3.07(m,1H),3.22-3.30(m,2H),3.33-3.43(m,2H),3.45(dd,J＝9.7,3.7Hz,1H),3.48-3.58(m,2H),3.58-3.74(m,5H),3.77-3.95(m,4H),4.29-4.35(m,1H),4.46-4.57(m,1H),5.17(d,J＝3.5Hz,1H)。¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δppm 14.5(CH₃),23.7(2xCH₂),24.7-25.6(CH₂),29.8-30.9(15xCH₂),32.1-32.3(CH₂),33.0(CH₂),33.0-33.2(CH₂),34.3-34.7(CH₂),40.6-40.9(CH₂),52.0-52.5(CH),54.4-54.9(CH),61.9-62.2(CH₂),62.7(CH₂),69.0-69.4(CH₂),71.5(CH),74.1(CH),74.6(CH),74.7(CH),75.0(CH),76.4-76.6(CH),77.6(CH),81.0-81.2(CH),102.7-102.9(CH),104.1-104.4(CH),171.1-171.7(C),172.6-172.8(C),172.9-173.2(C),176.3-176.5(C)；质量(ESI-)m/z(％)426(40)[M-CO₂H]^2-,898(100)[M-H]^-；HRMS(ESI-)m/z为C₄₁H₇₃N₂O₁₇S的计算值为897.4630[M-H]^-，实测值为897.4646。

实施例7：本发明的分子在280nm处的吸收值的试验

对本发明的分子进行试验并使用两种细菌的多胞型膜蛋白BmrA和AcrB进行比较。BmrA以对使用去污剂的提取敏感的功能拓扑结构为特征。BmrA是一种组构成3个结构域的多胞型膜蛋白：胞浆，膜和细胞外(图1)。

所述胞浆结构域由2个被称为核苷酸结合结构域NBD的部分形成，当它们被带到一起时，它们结合，然后水解ATP。所述膜结构域也由2个被称为跨膜结构域TMD的部分形成，它们各自连接到NBD。取决于催化循环，所述TMD采取朝向细胞内部或外部的不同构象。这使BmrA能够捕获细胞内空间中(或细胞质膜中)存在的底物(图1中的S)并将它们转移到细胞外部。这种类型的外排泵是普遍存在的。它们属于ABC转运蛋白家族，在由抗生素、抗癌、抗真菌或抗病毒治疗引起的化学应激的情况下细胞过表达它们。这种转运通过构象变化来实施，所述构象变化改变了位于所述蛋白质膜区中的药物结合位点的内部或外部取向(图1)。在转运后，所述蛋白质使用ATP水解产生的能量返回到它的初始构象(Ward,A.B.等，P-糖蛋白的结构揭示出它的构象灵活性和核苷酸结合结构域上的表位(Structures of P-glycoprotein reveal its conformational flexibility and an epitope on thenucleotide-binding domain)，Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 110,13386-13391(2013)([19])；Martinez,L.等，理解人类多药物抗性P-糖蛋白的底物结合腔内的多特异性(Understanding polyspecificitywithin the substrate-binding cavity of the human multidrug resistance P-glycoprotein)，FEBS Journal 281,673-682(2014)([20]))。只有使用其拓扑结构、特别是在膜区处的拓扑结构是本源的功能性蛋白，才可能水解ATP。使用去污剂例如使用十二烷基麦芽糖苷的提取通常是有害的(Matar-Merheb,R.等，([11]))。

也使用AcrB蛋白进行了一些试验，这是一种包埋在革兰氏阴性细菌内膜中的3x100kDa的原核三聚体蛋白，其3D结构已被解析(Seeger,M.A.等，AcrB三聚体的结构不对称性建议了蠕动泵机制(Structural asymmetry of AcrB trimer suggests a peristalticpump mechanism)，Science 313,1295-1298(2006)([21]))。

程序.将本发明的分子和C4C7(Matar-Merheb,R.等，([11]))(由CALIXAR提供)以图2中指示的浓度制备在pH 8.0的50mM tris-HCl中，并中和到该pH。使用Xenius SAFAS分光光度计如所指示的记录吸收光谱。

结果.所述夹的概念源自于在文献WO2009144419([28])和Matar-Merheb,R.等人的文献([11])中开发的脂族杯[4]芳烃C4Cn的夹。尽管在这些去污剂使膜蛋白稳定的能力中证实了它们的益处，但这些去污剂在短波长、特别是220nm至330nm的波长内强烈吸收。这在图2的第一张图中使用C4 C7进行了说明。它们在280nm下的摩尔衰减系数非常高，为15000mol/l/cm。由于所有的C4Cn去污剂都建立在相同的杯[4]芳烃支持物上，因此它们都具有这种特性。因此，它们遮蔽了也在280nm处被检测到的蛋白质的吸收，从而阻止了它们被这种在生物化学、特别是纯化流程中非常常用的手段来监测或定量。

另一方面，正如在图2中证实的，本发明的分子从220至500nm(及以外)范围不吸收或仅仅可忽略地吸收。因此，它们不阻止在280nm处检测蛋白质。

实施例8：本发明分子对二价金属螯合作用的实验

结合有3个酸官能团的杯[4]芳烃结构，意味着相应的去污剂非常有效地螯合二价金属。本发明分子的新设计消除了这种影响。

程序.将本发明的分子和C4C12(Matar-Merheb,R.等，([11]))以图3中指示的浓度制备在pH 8.0的50mM tris-HCl中，并中和到该pH。随后添加MgCl₂浓溶液直至0、5和10mM。在600nm处记录得到的溶液的浊度。

结果.先前开发的杯[4]芳烃去污剂螯合二价阳离子的能力示出在下面的图3中。它显示，在C4C12存在下，添加浓度逐渐提高的MgCl₂引起溶液的浊度提高，这反映出C4C12-镁络合物的沉淀。所述沉淀从5mM MgCl₂完全。这种相互作用对于需要金属钙、镁的存在的酶反应，例如需要超过7mM MgCl₂的ATP酶例如BmrA的ATP酶活性的测量来说，可能是不利的。尽管本发明的分子具有2至4个羧酸官能团，但它们客服了这个技术问题。实际上，如图3中所示，在与C4C12相同的条件下进行试验，当镁添加到甚至高达10mM时，它们不与镁形成不溶性络合物。

这种与金属的相互作用的不存在，在金属亲和类型的层析步骤中也是非常有用的，所述层析使用镍或钴，并且不能使用高浓度的C4Cn来进行，这一点与本发明的分子不同。

实施例9：本发明的分子的临界胶束浓度(CMC)的测量

程序.将本发明的分子以从0.1μM延伸至10mM的多种浓度制备在pH 8.0的50mMtris-HCl中，并中和到该pH。向80μl每种溶液(一式三份)添加相同体积的10μM 1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH，Sigma，D208000)，其以100μM制备在四氢呋喃中，然后在H₂O中稀释10倍。当DPH找到它可以将自身***其中的夹胶束时，发生DPH荧光的增加(Chattopadhyay,A.&London,E.，避免来自于去污剂电荷的干扰的临界胶束浓度的荧光测定(Fluorimetricdetermination of critical micelle concentration avoiding interference fromdetergent charge)，Anal Biochem 139,408-412(1984)([22]))。使用Xenius SAFAS荧光计读取荧光，在358nm处激发并在430nm处记录荧光发射，将9至10nm的狭缝用于所述激发和发射，并根据情况使用100至150的增益。

结果.去污剂的CMC是它们开始彼此缔合以形成胶束的浓度，在所述胶束中，在水性溶液中，疏水部分一起簇集在中心处，并且亲水区暴露于溶剂。这种CMC在这里通过跟踪化合物DPH的荧光增加来测量，所述化合物当将它自身***到胶束中时荧光显著增加(Chattopadhyay,A.&London,E.([22]))。使用具有C13(3.7e)或C18(3.7h)脂族链的化合物3.7获得的典型结果示出在图4中。下面的表1总结了获得的本发明分子的值。

表1

按惯例，对化合物2.3b-g和3.7a-d观察到CMC随着脂族链的长度而降低。这不太适用于CMC高并且变化小的系列4的化合物(#4.5-4.6)，表明它们的极性头部对组装体的亲水性贡献太大。事实上，这些化合物带有3至4个羧酸官能团。考虑到极性头部的大尺寸，这些CMC相对高。因此，用户能够根据所需目的来改变链的长度，例如通过透析或超滤容易地消除具有高CMC的去污剂，或通过使用具有较低CMC的化合物保留所述去污剂。

实施例10：本发明的分子的直径

去污剂的胶束的另一个物理化学参数是它们的直径，假定它们是球形的。这个维度通过光散射(DLS)技术来获得。

程序.将试验的本发明的分子以从0.1延伸至1000x CMC的多种浓度制备在pH 8.0的30mM tris-HCl中，并中和至该pH。将所述溶液在0.22μm上过滤。所述测量在来自于Malvern Instruments的Zetasizer Nano-S上，以100μl一式三份进行。

结果.除了化合物3.7j之外，所试验的夹的估算直径在3nm至5nm的量级上，即对于去污剂来说是相对小尺寸的物体。因此，胶束的尺寸小，与它们的CMC无关，所述CMC随着被试验的化合物的不同从20μM至2mM不等。化合物3.7j是一个例外，形成60nm量级的非常大的物体。可能它的行为类似于月桂基麦芽糖新戊二醇(Chae,P.S.等，([6])；Chaptal,V.等，与膜蛋白复合的去污剂的定量(Quantification of detergents complexed with membraneproteins)，Scientific Reports in press(2017)([23]))。结果示出在图5中。

实施例11：使用本发明的分子提取BmrA和AcrB

在强烈表达BmrA或AcrB的膜上试验了所述系列的去污剂的提取能力。将使用夹(本发明的化合物)的提取与使用商品化去污剂(用作参比)的提取进行比较。

程序.BmrA占所使用的过表达系统(大肠杆菌(E.coli)，C41DE3)中存在的蛋白质的25％。这些膜如先前所描述的来制备(Matar-Merheb,R.等，([11]))。含有AcrB(大约20％的所述膜蛋白，与BmrA相同的表达系统)的膜如先前所描述的来制备(Seeger,M.A.等，([21]))。除非另有指明，否则去污剂以10g/l的浓度使用，并将所述蛋白质以2g/l稀释在pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液，100mM NaCl，15％甘油中，以1片/100ml的量向其添加蛋白酶抑制剂(Roche)。将所述混合物(T)在4℃温育2h，然后在4℃下以100 000xg离心1h，以便将提取的级分(上清液，S)与未提取的部分(沉淀物)分离开。将所述上清液放置在10％SDS-PAGE上，并在迁移后用考马斯蓝染色。所述foscholine 12、DDM和LMNG源自于Anatrace，SDS和Triton X100源自于Sigma-Aldrich。

结果.在不存在去污剂的情况下，BmrA和AcrB当以高速度离心时沉积(“T-”道相比于“S-”)；然而，少部分抵抗住这种处理并保留悬浮状态；它对应于阴性试验(“S-”道)。在SDS或FC12存在下，用于提取所有膜蛋白BmrA和AcrB的参比去污剂有效地提取并存在于相应的上清液“SDS”或“FC12”中，在这里被用作提取阳性对照。在这里用作商品化参比的DDM、TX100和FC12可以溶解这两种蛋白质(图6)。在本发明的分子中，一些提取所述两种蛋白质，其他一些部分地提取所述两种蛋白质，最后一些完全不提取所述两种蛋白质，如表2中所概述。对于BmrA来说，提取性化合物是1.4、2.3[a、d、f、g、h、i]、3.7[c、f、g，h、l]、4.5[d]、4.6d、5.3[a-d]。在部分提取性化合物的组中有1.5、3.7[d、j]、4.5[b、c]，并且在非提取性化合物的组中有2.3[b、c]、3.7[a、b、e、i、k]、3.9a、4.5a和4.6a。对于AcrB来说，提取性化合物是1.5、2.3[a、b、c、d、e、f、g、h、i]、3.7[c、d、e、f、h、j、l]、4.5[b、c、d]、4.6[c、d]，部分提取的是4.5a、4.6d，不提取的是3.7[a、b、i、k]和4.6a。

表2

选择性提取.AcrB是膜蛋白领域中公知的结晶污染物。当共同纯化时，它以痕量结晶，产生大量假象(Psakis,G.,Polaczek,J.&Essen,L.-O.AcrB等，皮克规模的难以控制的污染物，膜蛋白结构流水线中的又一个瓶颈(Obstinate contaminants in a picogramscale.One more bottleneck in the membrane protein structure pipeline)，Journalof Structural Biology 166,107-111(2009)([24]))。因此，开发一种通过不提取这种蛋白质或仅仅轻微提取这种蛋白质来限制这种污染的去污剂是非常有用的，尤其是因为市场上可用的去污剂没有选择性。在这种情况下，化合物4.6b和4.6d是值得注意的，这是因为它们不提取或仅仅非常轻微地提取AcrB的能力，这一点不同于BmrA。相反，化合物1.5和3.9a更有效地提取AcrB。

实施例12：在用去污剂提取后膜蛋白的功能稳定化

将在前述实施例中提取BmrA的本发明的分子在不同的亚增溶和增溶浓度下进行试验，以评估它们对所述蛋白质的本源状态和功能状态的影响。后者通过由所述蛋白质在转运循环期间与溶质的易位相偶联进行的ATP的水解来监测。正如先前报道的(Matar-Merheb,R.等，([11]))，BmrA的ATP酶活性是所述蛋白质的状态的高度敏感的标志物，而蛋白质的状态对提取步骤期间使用的去污剂特别敏感，其中所述去污剂代替脂质与所述膜蛋白进行接触。

程序.如先前所述来制备在大肠杆菌C41DE3的质膜中产生并富集的BmrA(Matar-Merheb,R.等，([11]))。将所述膜以2g/l稀释在pH 8.0的20mM Tris-HCl缓冲液，100mMNaCl，15％甘油中，以1片/100ml的量向其添加蛋白酶抑制剂(Roche)。去污剂以图7中指示的浓度添加。将所述混合物(T)在4℃下温育2h，并使用偶联的酶系统测量ATP酶活性，从总活性中分离出对钒酸盐不敏感的活性(Centeno,F.等，肌浆网Ca²⁺-ATP酶在酵母中的表达(Expression of the sarcoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase in yeast)，FEBS Lett 354,117-122(1994)([25]))。然后将所述溶液在4℃下以100 000xg离心1h，以便将提取的级分(上清液，S)与未提取的部分(沉淀物)分离开。将所述上清液放置在10％SDS-PAGE上，并在迁移后用考马斯蓝染色(图8)。将DDM、LMNG(Chae,P.S.等，([6]))、TritonX100和FA3(Lee,S.C.等，(2013)([9]))作为参比去污剂进行试验。所述DDM和LMNG源自于Anatrace，TritonX100源自于Sigma-Aldrich，并且FA3源自于Avanti-Polars。

结果.如图7中所示，以亚增溶或增溶浓度添加去污剂引起BmrA结构变化，从而影响其功能。因此，在参比去污剂中，最近被成功地开发用于解析G蛋白受体的结构的LMNG(Rasmussen,S.G.等，β2肾上腺素能受体-Gs蛋白络合物的晶体结构(Crystal structureof the beta2adrenergic receptor-Gs protein complex)，Nature 477,549-555(2011)([26]))，在不高于1mM时对BmrA的活性具有相对低的影响，但在溶解所述蛋白所需的10mM浓度下将所述活性降低到25％。在本领域中非常广泛地使用的DDM引起相同的效应，在允许提取的高于5mM的浓度下将BmrA的ATP酶活性从50％降低到15％。最近开发的对应于偶联到甾类的1个二麦芽糖苷的FA3(Lee,S.C.等，(2013)([9]))产生相同的效应，在提取蛋白质的浓度下使BmrA的75％和80％的ATP酶活性失活。

最有效的化合物被一起分组在系列3.7中，其中最好的是3.7[b、c、e、g、j、l]。它们提取BmrA，并同时维持(3.7j、l)所述蛋白质的ATP酶活性或将其提高1.5x(3.7b、c、g)或2x(3.7e)。应该指出，这种活性提高是ABC转运蛋白的特征，其基础活性在溶质存在下可以放大直至2.5倍；这反映出完美的有功能状态。化合物3.7b和3.7c具有相同的设计，包括通过***偶联到所述分子的糖、2个羧酸官能团以及C11和C13脂族链。化合物3.7e和3.7g是3.7c的变体，用麦芽糖苷或PEG化的链代替所述糖。

实施例13：研究膜蛋白在本发明的化合物存在下随时间的稳定性

评估了源自于前面试验的本发明的最佳化合物中的两种，即3.7c和3.7g，在BmrA纯化并在4℃储存后，在非常长的时间段内使BmrA的活性形式稳定的能力。将这两种去污剂与非常广泛地用于这些纯化步骤的DDM以及最近开发并在功能稳定性方面非常有希望的FA3(Lee,S.C.等，(2013)([9]))进行比较。为了能够对它们进行比较，将去污剂添加到纯化的BmrA在DDM中的溶液，然后在4℃储存40天。如图9中所示，测量BmrA随时间而异的ATP酶活性。

程序.如先前所述来制备在大肠杆菌C41DE3的质膜中产生并富集的BmrA(Matar-Merheb,R.等，([11]))。将20毫克这种膜级分在4℃下在100mM NaPi pH 8.0、15％甘油、100mM NaCl、10mM咪唑、1mM DTT中稀释到1g/l。所述悬液添加有蛋白酶抑制剂(Roche，1片/50ml)和全能核酸酶(Sigma，30U/ml)。然后通过添加1％DDM(20mM)，在4℃下1h来提取所述膜蛋白。将所述溶液在4℃下以100 000xg离心1h(Optima XPN-80，50.2Ti)。将上清液以2ml/min的流速装载到在缓冲液A中平衡的5ml Ni-NTA树脂(GE healthcare,HiTrapchelating HP)上，所述缓冲液A含有100mM NaPi pH 8.0、10％甘油、100mM NaCl、10mM咪唑、0.05％DDM((1mM，5xCMC)。将所述树脂第一次用25ml缓冲液A清洗，然后第二次用25ml缓冲液B清洗(＝A加上500mM NaCl和15mM咪唑)，最后第三次用20ml缓冲液A清洗。BmrA用跨越10ml的缓冲液A和缓冲液C(100mM NaPi，10％甘油，100mM NaCl，250mM咪唑，0.05％DDM(1mM，5xCMC))的梯度洗脱，并以3ml/min的流速按照1ml的级分进行收集。将峰的级分合并(3ml)，并将所述混合物在具有12-14000道尔顿的截留值的管中针对400ml冷缓冲液D(50mMHepes-HCl，pH 8.0)，10％甘油，100mM NaCl，0.05％DDM(1mM，5xCMC)，在4℃下透析2h30min，然后在相同条件下针对600ml透析过夜。通过使用二喹啉甲酸的测定法对透析液的蛋白质含量(0.8g/L)进行定量(Smith,P.K.等，使用二喹啉甲酸测量蛋白质(Measurementof protein using bicinchoninic acid)，Analytical Biochemistry 150,76-85(1985)([27]))。将所述溶液分成4个级分，用不含咪唑和DDM的缓冲液A稀释到0.2g/l。最终的[DDM]为0.25mM。向每个等分试样添加0.087mM DDM、FA3、3.7c或3.7g，并在4℃储存40天。在图9中所指示的时间，一式两份测量对钒酸盐敏感的ATP酶活性(Centeno,F.等，([25]))。

结果.如图9中所示，在纯化后并在低浓度去污剂存在下，BmrA在4℃下稳定至少20天。在此以后，当它仅仅在DDM存在下或添加有FA3时，它失去活性。因此，这两种去污剂不能用于使膜蛋白例如BmrA长期稳定。另一方面，在相同的条件下添加3.7c或3.7g可以超过20天，使BmrA稳定至少2倍长的时间，即40天。因此，这两种化合物具有显著的长期稳定化性质，是迄今为止对膜蛋白报道的最好的效果。

实施例14：在本发明的化合物存在下膜蛋白在溶液中的行为

本发明的化合物将膜蛋白维持在本源状态下的能力，以本发明的化合物3.7c为例，通过尺寸排阻层析进行监测，并与参比去污剂DDM进行比较。结果示出在图10中。

程序：如实施例13中所述将BmrA提取在DDM中，并通过Ni-NTA亲和层析进行纯化，然后装载到Superdex 200 10/300尺寸排阻柱上，并用50mM Hepes-HCl pH 8.0、100mMNaCl、0.4mM DDM(2xCMC)洗脱。将含有BmrA的级分合并，分成几个等分试样(～100μg)，保持在4℃下。随后将一个等分试样重新装载到含有1ml树脂的亲和柱上。然后将DDM针对10倍体积的含有2CMC DDM(对照实验)或2CMC化合物3.7c(2mM)的Hepes-NaCl缓冲液进行交换。随后将BmrA洗脱在添加有100mM咪唑的相应缓冲液中。将含有所述蛋白质的级分合并，并在50kDa amicon(再生纤维素)上浓缩至50μl，然后放置在3ml Superdex 200 5/150尺寸排阻柱上，在50mM Hepes-HCl pH 8.0、100mM NaCl和2CMC DDM(0.4mM)或3.7c(2mM)中平衡。随后在相应的缓冲液中以0.3ml/min进行洗脱，并在280nm处检测BmrA。

结果.如图10中所示，在将初始去污剂(DDM)与其自身或化合物3.7c交换后，BmrA在溶液中具有等同的行为，在～1.6ml处洗脱。因此，将DDM与3.7c交换不改变它在溶液中的二聚体状态，并且不引起它的聚集，这将通过在1.2ml(八聚体)或1.4ml(四聚体)附近具有最大值的峰来反映，或者不引起它的解离，这可以通过1.8ml(单体)处的峰看到。因此，本发明的化合物3.7c保全了所述膜蛋白的本源寡聚状态。

实施例15：在本发明的化合物存在下膜蛋白的热稳定性的提高

我们研究了在存在或不存在本发明的化合物的情况下膜蛋白的稳定性与温度的关系(图12B-E)，所述实验可以评估尽管存在由温度引起的搅动，但所述去污剂维持蛋白质的分子内聚的能力。我们按照Ashok等人的程序(Y.Ashok,R.Nanekar,V.-P.Jaakola,Protein Eng.Des.Sel.2015,28,539–542([34]))，在BmrA上对它们进行了试验(图A、B)。我们将本发明的化合物与作为标准品的DDM和在这些条件下表现出稳定化性质的两种最新设计的去污剂LMNG(Chae等，([6]))和FA3(Lee等，([9]))进行了比较。

程序.基于Y.Ashok等([34])。将BmrA的膜(2g蛋白质/l)用0.5％(～10mM)DDM并使用或不使用1mM 3.7d、3.7c、3.7b、3.7a、3.7i、3.7k、3.7f、3.7e、DDM、LMNG或FA3，在4℃下在2ml终体积中溶解2h。随后通过在4℃下以100 000xg离心1h，将溶解的级分澄清。随后将上清液分成50μl的等分试样，各自使用PCR装置(PeqSTAR 2x gradient；Peqlab)在25至90℃的温度下经历30min。随后将所述试验以20 000xg离心40min，并将上清液通过SDS-PAGE和使用抗His抗体的Western印迹进行分析。随后使用Bio-Rad Image Lab软件4.1对每个温度下BmrA条带的相对强度进行定量。每个试验一式两份。随后将所述强度作为温度的函数作图，然后通过3参数S形方程进行拟合；Sigmaplot v12。

对于与A3.7c温育的每个蛋白质级分来说，完整的实验呈现在图11的图A中，使得可以估算50％的BmrA保留在溶液中时的表观熔点Tm(虚线)。正如所指示的，对于BmrA来说，本发明的化合物3.7d、3.7c、3.7j、3.7f和3.7e引起20至29℃的温度迁移，而其他去污剂不产生显著改变。对疏水性组分来说观察到明显的效应，疏水性最大的组分为最佳组分。应该指出，这种热稳定性的提高等同于先前通过在具有C-端96个残基的截短的融合蛋白A_2AR中引入17个突变而获得的热稳定性提高(Magnani等，([32]))。这个结果将本发明的化合物置于能够产生超过1个log Tm提高的非常小的一系列稳定化去污剂的最前列，所述去污剂例如LMNG(Chae等，([6]))、FA3(Lee等，([9]))和最近发表的基于降莰烷的麦芽糖苷(NBM)(M.Das,Y.Du,O.Ribeiro,P.Hariharan,J.S.Mortensen,D.Patra,G.Skiniotis,C.J.Loland,L.Guan,B.K.Kobilka等，J.Am.Chem.Soc.2017,139,3072–3081,([35]))。

参考文献表

1.Israelachvili,J.N.,Mitchell,D.J.&Ninham,B.W.，脂质双层和囊泡的自组装理论(Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles)，Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Biomembranes 470,185-201(1977).

2.Overington,J.P.,Al-Lazikani,B.&Hopkins,A.L.，存在多少药物靶点(Howmany drug targets are there？)，Nat Rev Drug Discov 5,993-996(2006).

3.Mason,J.S.,Bortolato,A.,Congreve,M.&Marshall,F.H.，G蛋白偶联受体的成药性的来自于结构生物学的新见解(New insights from structural biology into thedruggability of G protein-coupled receptors)，Trends in PharmacologicalSciences 33,249-260,doi:10.1016/j.tips.2012.02.005(2012).

4.Schaffhausen,J.，基于结构的药物设计的进展(Advances in structure-based drug design)，Trends in Pharmacological Sciences 33,223,doi:10.1016/j.tips.2012.03.011(2012).

5.Shoichet,B.K.&Kobilka,B.K.，用于G蛋白偶联受体的基于结构的药物筛选(Structure-based drug screening for G-protein-coupled receptors.)，Trends inPharmacological Sciences 33,268-272,doi:10.1016/j.tips.2012.03.007(2012).

6.Chae,P.S.等，用于膜蛋白的增溶、稳定化和结晶的麦芽糖-新戊二醇(MNG)两亲物(Maltose-neopentyl glycol(MNG)amphiphiles for solubilization,stabilizationand crystallization of membrane proteins)，Nat Meth 7,1003-1008,doi:http://www.nature.com/nmeth/journal/vaop/ncurrent/abs/nmeth.1526.h tml#supplementary-information(2010).

7.Chae,P.S.等，用于膜蛋白稳定化的串联面部两亲物(Tandem FacialAmphiphiles for Membrane Protein Stabilization)，Journal of the AmericanChemical Society 132,16750-16752,doi:10.1021/ja1072959(2010).

8.Zhang,Q.等，设计用于整合膜蛋白的稳定化的面部两亲物(Designing FacialAmphiphiles for the Stabilization of Integral Membrane Proteins)，AngewandteChemie International Edition 46,7023-7025(2007).

9.Lee,S.C.等，用于膜蛋白的稳定化和结晶的基于甾类的面部两亲物(Steroid-based facial amphiphiles for stabilization and crystallization of membraneproteins)，Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 110,E1203-1211,doi:10.1073/pnas.1221442110(2013).

10.Suwinska,K.等，三阴离子杯[4]芳烃单烷基衍生物：合成、固态结构和自组装性质(Tri-Anionic Calix[4]arene Monoalkyl Derivatives:Synthesis,Solid-StateStructures and Self-Assembly Properties)，New Journal of Chemistry 32,1988-1998,doi:10.1039/b806342g(2008).

11Matar-Merheb,R.等，用于提取和稳定化有功能的膜蛋白的结构化去污剂(Structuring detergents for extracting and stabilizing functional membraneproteins)，PLoS One 6,e18036,doi:10.1371/journal.pone.0018036(2011).

12.von Heijne,G.，细菌内膜蛋白中带正电荷残基的分布与跨膜拓扑结构相关(The distribution of positively charged residues in bacterial inner membraneproteins correlates with the trans-membrane topology)，Embo J 5,3021-3027(1986).

13.Nilsson,J.,Persson,B.&von Heijne,G.，来自于107个基因组的整合膜蛋白中氨基酸分布的比较性分析(Comparative analysis of amino acid distributions inintegral membrane proteins from 107genomes)，Proteins:Structure,Function,andBioinformatics 60,606-616,doi:10.1002/prot.20583(2005).

14.von Heijne,G.，膜蛋白拓扑结构(Membrane-protein topology)，Nat RevMol Cell Biol 7,909-918(2006).

15.Corzana,F.等，α-GalNAc-Ser基序的新见解：氢键形成与溶剂相互作用相比对优选构象的影响(New Insights intoα-GalNAc-Ser Motif:Influence of HydrogenBonding versus Solvent Interactions on the Preferred Conformation)，Journal ofthe American Chemical Society128,14640-14648,doi:10.1021/ja064539u(2006).

16.Christensen,C.A.&Meldal M.，基于肽的膦配体的高效固相合成：通往选择性过渡金属催化剂的组合文库(Efficient solid-phase synthesis of peptide-basedphosphine ligands:towards combinatorial libraries of selective transitionmetal catalysts)，Chemistry 11,4121-4131,doi:10.1002/chem.200500105(2005).

17.Boyere,C.,Broze,G.,Blecker,C.,Jerome,C.&Debuigne,A.，通过光化学硫醇-烯/-炔反应产生的单悬链分支双头波拉型表面活性糖酯(Monocatenary,branched,double-headed,and bolaform surface active carbohydrate esters viaphotochemical thiol-ene/-yne reactions)，Carbohydr Res 380,29-36,doi:10.1016/j.carres.2013.07.003(2013).

18.Munteanu,M.,Choi,S.&Ritter,H.，通过微波辅助的点击反应产生的环糊精甲基丙烯酸酯(Cyclodextrin Methacrylate via Microwave-Assisted Click Reaction)，Macromolecules 41,9619-9623,doi:10.1021/ma8018975(2008).

19.Ward,A.B.等，P-糖蛋白的结构揭示出它的构象灵活性和核苷酸结合结构域上的表位(Structures of P-glycoprotein reveal its conformational flexibility andan epitope on the nucleotide-binding domain)，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 110,13386-13391,doi:10.1073/pnas.1309275110(2013).

20.Martinez,L.等，理解人类多药物抗性P-糖蛋白的底物结合腔内的多特异性(Understanding polyspecificity within the substrate-binding cavity of thehuman multidrug resistance P-glycoprotein)，FEBS Journal281,673-682,doi:10.1111/febs.12613(2014).

21.Seeger,M.A.等，AcrB三聚体的结构不对称性建议了蠕动泵机制(Structuralasymmetry of AcrB trimer suggests a peristaltic pump mechanism)，Science 313,1295-1298,doi:10.1126/science.1131542(2006).

22.Chattopadhyay,A.&London,E.，避免来自于去污剂电荷的干扰的临界胶束浓度的荧光测定(Fluorimetric determination of critical micelle concentrationavoiding interference from detergent charge)，Anal Biochem 139,408-412(1984).

23.Chaptal,V.等，与膜蛋白复合的去污剂的定量(Quantification ofdetergents complexed with membrane proteins)，Scientific Reports8；7:41751(2017).

24.Psakis,G.,Polaczek,J.&Essen,L.-O.AcrB等，皮克规模的难以控制的污染物，膜蛋白结构流水线中的又一个瓶颈(Obstinate contaminants in a picogramscale.One more bottleneck in the membrane protein structure pipeline)，Journalof Structural Biology 166,107-111,doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.jsb.2008.12.007(2009).

25.Centeno,F.等，肌浆网Ca²⁺-ATP酶在酵母中的表达(Expression of thesarcoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase in yeast)，FEBS Lett 354,117-122(1994).

26.Rasmussen,S.G.等，β2肾上腺素能受体-Gs蛋白络合物的晶体结构(Crystalstructure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex)，Nature 477,549-555,doi:10.1038/nature10361(2011).

27.Smith,P.K.等，使用二喹啉甲酸测量蛋白质(Measurement of protein usingbicinchoninic acid)，Analytical Biochemistry 150,76-85,doi:http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(85)90442-7(1985).

28.WO2009144419.

29.WO02090533.

30.Baiceanu E等，作为ABCC2的第一种有效抑制剂的2-吲哚基亚甲基苯并呋喃酮(2-Indolylmethylenebenzofuranones as first effective inhibitors of ABCC2)，EurJ Med Chem.2016oct21；122:408-18.

31.B.Wiseman,A.Kilburg,V.Chaptal,G.C.Reyes-Mejia,J.Sarwan,P.Falson,J.-M.Jault,PLoS One 2014,9,e114864.

32.F.Magnani,Y.Shibata,M.J.Serrano-Vega,C.G.Tate,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2008,105,10744–9.

33.M.J.Serrano-Vega,F.Magnani,Y.Shibata,C.G.Tate,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2008,105,877–882.

34.Y.Ashok,R.Nanekar,V.-P.Jaakola,Protein Eng.Des.Sel.2015,28,539–542.

35.M.Das,Y.Du,O.Ribeiro,P.Hariharan,J.S.Mortensen,D.Patra,G.Skiniotis,C.J.Loland,L.Guan,B.K.Kobilka等，J.Am.Chem.Soc.2017,139,3072–3081.