甘松提取物的应用
阅读说明：本技术 甘松提取物的应用 (Application of nardostachys chinensis extract ) 是由 宋肖洁 姜丹 姚期凤 王越 蒋耀权 吴越 章漳 于 2018-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物提取及日化领域,具体涉及甘松提取物在制备皮肤外用剂中的应用,所述甘松提取物作为皮肤外用剂中的抗衰老活性成分,具体为皮肤修复活性成分、和/或皮肤结构稳固活性成分,具有提高细胞修复和/或生长活性,稳固基底膜结构和功能,促进细胞外基质分泌,延缓皮肤衰老的效果。本发明甘松提取物的活性高,在含量极低的情况下即产生显著效果,天然、安全且有效,不刺激皮肤,皮肤外用剂应用前景广阔。(The invention belongs to the field of plant extraction and daily chemicals, and particularly relates to application of a nardostachys chinensis bunge extract in preparation of a skin external preparation. The nardostachys chinensis bunge extract has high activity, can generate obvious effect under the condition of extremely low content, is natural, safe and effective, does not irritate the skin, and has wide application prospect.)
技术领域
本发明属于植物提取及日化领域，具体涉及甘松提取物的应用。
背景技术
皮肤覆盖于整个人体表面，与外界环境直接接触，除了保护机体免受外界各种因素的伤害外，又是反应机体健康状况的一面镜子。皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，并含有皮肤附属器、丰富的神经、血管、***及肌肉。真皮和表皮的连接区域称为基底膜带，基底膜是上皮细胞的支撑垫，在上皮细胞组织与***之间，具有支持和连接作用，亦是物质通透的半透膜，便于物质交换。基底膜不仅作为一层结构模型，支撑表皮细胞，还作为细胞的选择性通过屏障，阻止***细胞与基底膜上的上皮细胞接触，但允许淋巴细胞、巨噬细胞和神经元突触穿越通过；细胞形态、细胞极性、细胞代谢、质膜上蛋白质分布、细胞存活、细胞增殖分化、细胞迁移等许多生命现象，均与基底膜有着非常密切的关系。
真皮由细胞和细胞外基质共同构成，成纤维细胞是真皮的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤真皮结构，组成正常的结构和生理功能；细胞外基质是由细胞合成并分泌，围绕细胞相互作用的一类大分子物质，细胞的增殖分化、细胞迁移等许多生命现象，均与细胞外基质有着非常密切的关系。细胞外基质主要由四大类分子组成：胶原、弹性蛋白、糖蛋白及蛋白多糖。细胞外基质通过其分子间不同的精细巧妙缠结交织，构成各种各样的精美三维立体结构，赋予肌肤弹性、抗张强度，使肌肤看起来饱满、充满活力。
长寿基因是能够长时间保持活跃的基因，能大大提高生物体的健康，延长生物体寿命。当人遭遇严寒、酷热或者水和食物匮乏的环境时，这些基因会调动人体内的自我防御系统，让细胞修复能力变得强大。
SIRT1(sirtuin 1)：著名的长寿基因之一。SIRT1是一类高度保守的组蛋白去乙酰化酶，参与调节由能量限制引发的长寿作用，被称为“长寿基因”；SIRT1生理作用复杂，参与调节糖脂代谢、炎症、氧化应激、细胞衰老与凋亡等。在皮肤中的研究发现，Sirt1具有提高皮肤修护能力的作用。比如Sirt1可保护皮下胶原蛋白，防止紫外线照射引发的光老化；它还可下调STAT3、环氧化酶2等细胞因子，发挥抗炎作用；此外Sirt1还具有抑皮肤癌的功能。Sirt1的激活剂可能在今后皮肤病的治疗和预防中发挥重要的作用。一些国外的化妆品公司将对Sirt1调节作为重要靶标用于研发提高皮肤修护能力，用于抗衰老产品。
NID1(Nidogen1)基因编码的巢蛋白1是构成基底膜糖蛋白的nidogen家族成员，其是连接皮肤真皮和表皮的基底膜的重要成分。此基因编码的蛋白质与基底膜的几种其他成分相互作用，并可在与细胞外基质的细胞相互作用中起作用。当缺乏巢蛋白的时候，皮肤DEJ以及DEJ上的半桥粒将不能正常生成。补充巢蛋白则有助于DEJ的稳定并形成功能性的DEJ结构，有助于延缓皮肤衰老。
FGF7(fibroblast growth factor 7)基因编码的蛋白质是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员。FGF家族成员具有广泛的促有丝***和细胞存活活性，并参与各种生物过程，包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和侵袭。这种蛋白质是一种有效的上皮细胞特异性生长因子，其促有丝***活性主要在角质形成细胞中表达，但不在成纤维细胞和内皮细胞中表达。该基因的小鼠和大鼠同源物的研究涉及上皮形态发生，伤口的上皮再生，毛发发育和早期肺器官发生的作用。
因此，研究如何提高皮肤关键部位及功能相关的基因的表达，对于提高皮肤修复能力，保持结构的稳定性，延缓皮肤衰老具有重要意义。
甘松(拉丁文名:Nardostachys chinensis Batal.)，多年生草本，全株有强烈松脂样香气。生于海拔3000-4500的高山草原地带或疏林中，分布于甘肃、内蒙古、青海、四川、贵州、云南西北部、西藏等地。味辛、甘，性温，归脾、胃经。《本草求真》：甘松，虽有类山柰，但山柰气多辛窜，此则甘多于辛，故书载能入脾开郁也。《本草汇言》：甘松，醒脾畅胃之药也。甘松作为药用有助于理气止痛、醒脾健胃的功效，有助于治疗脘腹胀痛、不思饮食、牙痛、脚气的作用，气虚血热者忌服甘松。
本发明首次证实甘松提取物具有提高细胞修复相关基因、基底膜稳固相关基因和抗衰老相关基因表达的能力，提高细胞修复活性，稳固基底膜结构和功能，促进细胞外基质分泌，延缓皮肤衰老，适用于制备皮肤外用剂。
发明内容
本发明旨在提供一种甘松提取物的应用。
甘松提取物具有延缓皮肤衰老的作用，可提高皮肤修复活性，稳固皮肤结构，适用于制备皮肤外用剂。
甘松提取物通过提高细胞修复和/或增殖相关基因的表达，增强细胞增殖和/或修复活性，进而提高皮肤修复活性；通过提高基底膜稳固相关基因的表达，增强基底膜的结构和功能，进而稳固皮肤结构；通过提高皮肤修复活性，稳固皮肤结构，进而延缓皮肤衰老。
因此，甘松提取物可用于制备皮肤外用剂，作为皮肤外用剂中抗衰老活性成分，尤其是作为皮肤外用剂中皮肤修复的活性成分、和/或皮肤结构的稳固活性成分实现抗衰老作用。
所述甘松提取物作为促进细胞修复和/或增殖的活性成分，通过促进细胞尤其是表皮细胞或真皮细胞的增殖和修复，增强皮肤修复活性，实现皮肤修复功能，延缓皮肤衰老。
所述甘松提取物作为基底膜结构和功能稳固的活性成分，稳固皮肤结构，延缓皮肤衰老。
甘松提取物作为提高细胞修复和/或增殖相关基因表达的活性成分，和/或提高基底膜相关基因表达的活性成分。优选的，所述的细胞修复和/或增殖相关基因为SIRT1基因或FGF7基因，所述的基底膜相关基因为NID1基因。
甘松提取物通过提高细胞修复和/或增殖相关基因的表达，促进细胞(包括角质细胞、真皮细胞)修复和/或增殖，促进创伤修复，进而提高皮肤修复活性，延缓皮肤衰老；通过提高基底膜稳固相关基因的表达，促进细胞外基质分泌，增强基底膜的结构和功能进而稳固皮肤结构，并延缓皮肤衰老；通过提高角质细胞再生相关基因表达，促进角质细胞的再生和生长，促进细胞外基质分泌，增强皮肤细胞修复和增殖活性，促进创伤修复，进而延缓皮肤衰老。
所述甘松提取物通过提高SIRT1基因表达促进合成组蛋白去乙酰化酶，促进角质细胞、真皮细胞的修复和生长，提高皮肤的抵抗、抵御能力。
所述甘松提取物通过提高NID1基因表达促进合成巢蛋白1，促进细胞外基质分泌，增强表皮与真皮的连接，稳固基底膜的结构和功能。
所述甘松提取物通过提高FGF7基因表达促进合成细胞生长因子7，促进角质细胞再生和细胞外基质分泌，增强皮肤尤其是表皮层的修复和生长。
所述甘松提取物指以任何合理的方式提取得到的含有效成分的提取物。
所述甘松提取物的制备方法为：以甘松为原料，溶剂提取后，取滤液。提取溶剂包括水、醇类或者醇水混合液，优选为60％～95％(v/v)乙醇，进一步优选为70％(v/v)乙醇。
提取方法为超声法、浸提法、超临界法、渗漉法、回流法或者蒸馏法等提取方法，其中，超声法、浸提法、渗漉法在室温下进行。提取方法优选为超声提取。
优选的，用溶剂提取1～3次，并合并滤液。每次提取时，甘松与溶剂的用量比为1kg：2～20L，优选为1kg：5～15L；每次提取时间为10分钟～90分钟，优选为15～45分钟。
滤液可进一步浓缩或者浓缩干燥。浓缩的方式为减压浓缩。浓缩干燥的方式为真空干燥或者冷冻干燥。
所述甘松指甘松的全草、根、根茎或者其混合物，优选为甘松的全草。甘松提取前粉碎为粒径20～300目的颗粒，优选为粒径50～200目的颗粒，并干燥至含水量低于10％。
本发明的一个优选实施方式中，甘松提取物的制备方法为，将粉碎至50～200目的甘松全草和70％乙醇(体积浓度)按1kg/10L混合后，室温超声提取2次，每次15～40分钟；合并滤液后去除溶剂并干燥。
上述甘松提取物在含量为0.001wt％时，即可使SIRT1基因、NID1基因和FGF7基因的表达量明显提高。因此甘松提取物可以稳固皮肤基底膜结构和功能，提高皮肤结构的稳定性；可以促进表皮(角质)细胞和真皮细胞的生长和再生，增强皮肤修复活性和生长活性，使皮肤的抵抗抵御能力提高，延缓皮肤衰老。
甘松提取物可用于制备皮肤外用剂，所述甘松提取物用作皮肤外用剂中的抗衰老活性成分，尤其是皮肤修复活性成分、皮肤结构稳固活性成分、抗衰老活性成分中的一种或者多种。皮肤外用剂中甘松提取物的用量为0.0001wt％～10wt％，优选为0.0005wt％～5wt％，更优选为0.001wt％～5wt％。
甘松提取物作为皮肤外用剂中的皮肤修复活性成分，提高SIRT1基因和FGF7基因的表达，作为皮肤外用剂中稳固皮肤结构的活性成分，提高基底膜相关基因NID1基因和FGF7基因的表达。
所述甘松提取物可用于制备增强SIRT1基因表达、促进合成组蛋白去乙酰化酶的皮肤外用剂，制备增强FGF7基因表达、促进合成细胞生长因子7的皮肤外用剂；用于制备增强NID1基因表达、促进合成巢蛋白1的皮肤外用剂，制备增强FGF7基因表达、促进合成细胞生长因子7的皮肤外用剂。
皮肤外用剂指以涂抹、喷洒或者其它类似方法，散布于人体表面的任何部位，以达到清洁、保养、美容、修饰、改变外观或者修正人体气味，保持良好状态的产品。皮肤外用剂可以是起到清洁、护理、美化或保养等作用的基础化妆品、面部化妆品、头部护理品、身体护理品。
皮肤外用剂的剂型无特殊限制，可根据使用情况而定，如洁面霜、精华液、乳液、霜膏、化妆水(如柔肤水、爽肤水)、面膜、卸妆水、啫喱、气雾或者喷雾等。
甘松提取物通过增强细胞修复和/或增殖相关基因表达，促进皮肤修复，延缓皮肤衰老。
甘松提取物通过增强基底膜相关基因表达，促进细胞外基质分泌，增强表皮和真皮连接，延缓皮肤衰老。
一种皮肤外用剂，具有皮肤修复活性、和/或皮肤稳固活性、和/或抗衰老活性的功效，含有甘松提取物。其中，甘松提取物的含量为0.0001wt％～10wt％，优选为0.0005wt％～5wt％，更优选为0.001wt％～5wt％。
含有甘松提取物的皮肤外用剂还可以含有其它活性成分，包括补水活性成分、美白活性成分、保湿活性成分、抗氧化活性成分、抗皱活性成分、祛斑活性成分、消痘活性成分、防晒活性成分、祛粉刺/痤疮活性成分、祛头屑活性成分、抗过敏活性成分或者皮脂腺抑制活性成分中的一种或者多种。
皮肤外用剂中还含有增稠剂、增溶剂、助溶剂、稳定剂、柔顺剂、气雾剂溶剂、防腐剂、表面活性剂、控释剂、缓释剂、芳香剂、调色剂、促渗剂、保湿剂、乳化剂、塑形剂或者珠光剂中的一种或者多种。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
(1)本发明甘松提取物提高细胞修复相关基因、基底膜稳固相关基因和抗衰老相关基因的表达，提高细胞修复和/或生长活性，稳固基底膜结构和功能，促进细胞外基质分泌，延缓皮肤衰老，皮肤外用剂应用前景广阔，尤其是化妆品应用。
(2)本发明甘松提取物的制备工艺简单，工艺条件易于控制，制备成本低。
(3)本发明甘松提取物的活性高，在含量极低的情况下即产生显著效果，天然、安全且有效，不刺激皮肤。
附图说明
图1是本发明空白对照(NT)和甘松提取物的SIRT1基因表达结果。
图2是本发明空白对照(NT)和甘松提取物的NID1基因表达结果。
图3是本发明空白对照(NT)和甘松提取物的FGF7基因表达结果。
具体实施方式
实施例1甘松提取物的制备
取粉碎为50～200目、并干燥至含水量5％的甘松(全草)10g置于70％(v/v)乙醇中500W超声提取2次，每次加入100mL 70％乙醇，每次提取30min，合并2次提取滤液，旋转蒸发至干，得到甘松提取物约1.1g。
实施例2甘松提取物提高皮肤细胞修复相关基因的表达
实施例1所获得的甘松提取物用于基因表达活性测试，步骤为：
1.皮肤模型的制备
从皮肤组织中分别提取人原代成纤维细胞(NHDF)及人原代角质细胞(NHEK)。将人原代成纤维细胞复苏，培养消化后与胶原混合进行3～4天的真皮阶段培养，然后将使用饲养层培养的人原代角质细胞消化接种到真皮阶段培养的皮肤模型表面，再依次经过表皮浸没培养及气液相培养阶段，培养至18天得到可用于检测的3D皮肤模型。
在人原代角质细胞接种到真皮阶段的皮肤模型表面培养至形成3D皮肤模型的第3天至第18天的过程中，根据所使用培养基的不同进行分组，分为空白对照(NT)组、甘松提取物(10μg/mL)组和甘松提取物(100μg/mL)组。
其中，甘松提取物(10μg/mL)，指所得甘松提取物在单位体积(mL)培养基中的量为10μg，以甘松提取物干重计，约0.001wt％。
甘松提取物(100μg/mL)，指所得甘松提取物在单位体积(mL)培养基中的量为100μg，以甘松提取物干重计，约0.01wt％。
2.RNA的提取
剪取3D皮肤模型组织约2*3mm，放入2mL EP管中；加入1mL Trizol，加入2颗钢珠，用组织破碎仪匀浆，50Hz超声5min后；9000rpm、4℃条件下离心1min，将上清液转移到新的1.5mL EP管中；加入200μL氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5分钟；9000rpm、4℃条件下离心15min；转上层水相(约400μL)于新1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；9000rpm、4℃条件下离心10min；弃上清，沉淀用预冷的70％无水乙醇洗1次，8000rpm、4℃条件下离心5min；弃上清，沉淀于空气干燥5～10分钟，溶于30μL DEPC(焦炭酸二乙酯)水中；分光光度计测定RNA浓度。
3.基因表达分析
根据QuantiGene R 2.0Plex Assay试剂盒进行RNA的纯化和基因定量分析，使用luminex平台对基因表达进行分析，检测SIRT1基因的表达水平，结果如图1。
由图1可知，相较于空白对照组(NT)，添加甘松提取物(10μg/mL)后，与组蛋白去乙酰化酶合成相关的SIRT1基因的表达上调至1.74倍。该基因编码合成的组蛋白去乙酰化酶，能与多种蛋白相互作用，在抵抗外界不良环境的应激过程中，增强细胞活性，提高细胞自我修复活性，尤其是创伤修复活性，改善细胞存活力。本发明甘松提取物增强SIRT1基因表达，促进表皮(角质)细胞和真皮细胞再生，增强皮肤修复活性，使皮肤的抵抗抵御能力提高，延缓皮肤衰老。
实施例3甘松提取物提高基底膜稳固相关基因的表达
皮肤模型的制备方法、RNA提取以及基因表达分析方法同实施例2，检测NID1基因的表达水平，结果如图2。
由图2可知，相较于空白对照(NT)，添加甘松提取物(10μg/mL、100μg/mL)后，与巢蛋白1合成相关的NID1基因的表达分别上调至1.9倍和1.92倍。且在甘松提取物用量为10μg/mL，NID1基因表达与用量之间的平衡效益最佳。该基因编码合成的巢蛋白1是构建基底膜的重要组成成分，保证基底膜结构的稳固性，维持基底膜功能的完整性。本发明甘松提取物能够增强NID1基因表达，稳固基底膜的结构和功能，增强表皮与真皮连接，有利于维持皮肤结构稳定性，延缓皮肤衰老。
实施例4甘松提取物提高表皮细胞再生相关基因的表达
皮肤模型的制备方法、RNA提取以及基因表达分析方法同实施例2，检测FGF7基因的表达水平，结果如图3。
由图3可知，相较于空白对照(NT)，添加甘松提取物(10μg/mL)后，与成纤维细胞生长因子7合成相关的FGF7基因的表达上调47％。该基因编码合成的成纤维细胞生长因子7能加速损伤有关细胞的繁殖，调节和促进细胞间基质的合成和分泌，促进表皮细胞再生，提高表皮和真皮细胞修复和增殖活性，延缓细胞衰老。本发明甘松提取物增强FGF7基因表达，促进表皮细胞生长，增强皮肤修复和生长活性，延缓皮肤衰老，具有抗衰老的活性。
由以上基因表达测试结果可知，相对于空白对照组(NT)，添加本发明甘松提取物后，SIRT1、NID1和FGF7基因的表达显著升高。SIRT1基因编码合成的SIRT1蛋白去乙酰化酶可提高细胞修复活性，增强细胞抵御能力；NID1基因编码合成的巢蛋白1可稳固基底膜的结构和功能；FGF7基因编码合成的成纤维细胞生长因子7可调节细胞间基质的合成和分泌，促进角质细胞再生，提高表皮细胞修复和生长活性，延缓细胞衰老。由此，本发明甘松提取物可提高皮肤修复活性、稳固皮肤结构和延缓皮肤衰老。