一种用于增强土壤降解环丙酰草胺的生物降解方法
阅读说明：本技术 一种用于增强土壤降解环丙酰草胺的生物降解方法 (Biodegradation method for enhancing soil degradation of carpropamid ) 是由 何健 豆叶枝 李菊颖 孔德洋 许静 余佳 张悦清 曹莉 于 2021-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于增强土壤降解环丙酰草胺的生物降解方法,包括以下步骤：S1微生物的培养：将多种微生物单独在微生物培养基中进行培养发酵3-4d,再将发酵后的菌液混合得到混合液,放入培养液中培养得到稳定的微生物菌体混合液；S2土壤预处理：在土壤内部0.8-1m深度处每隔3m铺设一组气管线,在土壤上方加盖防雨棚；S3微生物施加；S4微生物补加。本发明的生物降解方法通过对多种不同微生物的复配以实现对土壤中农药残留的有效降解尤其是针对环丙酰草胺的降解,同时可以改善土壤质量,有利于促进微生物对土壤中环丙酰草胺的降解,对于生态环境的保护以及对于人们生活健康的保护具有重要意义。(The invention discloses a biodegradation method for enhancing soil degradation of carpropamid, which comprises the following steps: culture of S1 microorganism: culturing and fermenting multiple microorganisms in a microorganism culture medium for 3-4 days, mixing fermented bacteria liquid to obtain a mixed liquid, and culturing in a culture solution to obtain a stable microorganism thallus mixed liquid; s2 soil pretreatment: laying a group of air pipelines at the depth of 0.8-1m in the soil every 3m, and covering a rainproof shed above the soil; s3 microbial application; s4 is supplemented by microorganisms. The biodegradation method realizes effective degradation of pesticide residues in soil, particularly aiming at degradation of the cypionamide, by compounding various microorganisms, can improve the soil quality, is favorable for promoting the degradation of the cypionamide in the soil by the microorganisms, and has important significance for protecting the ecological environment and the living health of people.)
技术领域
本发明涉及土壤污染物降解技术领域，具体是涉及一种用于增强土壤降解环丙酰草胺的生物降解方法。
背景技术
农药残留在农业生产中施用农药后一部分农药直接或间接残存于谷物、蔬菜、果品、畜产品、水产品中以及土壤和水体中的现象，农药残留问题是随着农药大量生产和广泛使用而产生的，当农药被喷洒后只有少部分会作用在植物植株上，另外大部分会渗入到土壤中，如处理不当会对土壤和水体造成严重的影响，对人们生产生活均带来不利影响，严重的可能会通过食物链富集进入人体，危害人体健康，现阶段引起了人们广泛的关注，因此，需要利用合理的手段对土壤中农药残留物进行降解处理。
不同农药的降解方法和降解速率不同，常见的农药残留物降解方法有物理方法、化学方法以及生物方法，物理方法通常是利用农药的物理性质，如水溶性、光不稳定性和热不稳定性等原理去除农药残留，一般有浸泡清洗法、去皮、日光照射法、贮藏法和吸附法等；化学方法是利用双氧水、臭氧、次氯酸盐强氧化剂或自由基的强氧化作用将农药分子的双键断开，苯环开环，破坏其分子结构，生成相应的酸、醇、胺或其氧化物等；用微生物或酶降解农药残留是近几年研究的热点，其中对细菌和真菌的研究较为深入，其中细菌适应性强，易诱发突变菌株而占重要地位，经富集培养或分离筛选等技术已发现许多能降解农药的微生物。
专利CN109651015A公开了可降解土壤农药残留的生物活性剂及其制备方法与应用，具体组分质量比如下：复合菌发酵产物10-15份、复合氨基酸15-20份、腐殖酸20-35份、火山灰20-30份、木薯酒槽25-35份；复合微生物发酵产物，分别将含有解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的菌剂单独发酵，上述发酵产物混合后解淀粉芽孢杆菌≥2.0亿/g、枯草芽孢杆菌≥2.0亿/g。活性剂结构稳定，功能广泛，无毒副作用，在农产品质量安全以及农业生态环保等方面有良好的应用前景，可以在农业生产中有效降解土壤中的农药残留，尤其对除草剂的残留降解效果明显，抑制植物对农药残留物的吸收，还能促进植物生长，提高产量和品质。但对于环丙酰草胺的降解无法起到很好的作用。
环丙酰草胺(cyclanilide)属于环丙羧酸类植物生长调节剂,与乙烯利混配具有协同增效作用,主要用于棉花、禾谷等作物的生长。有研究表明,环丙酰草胺在土壤中易降解为2,4-二氯苯胺,该代谢产物对水生生物有极高毒性,可能对环境产生不良影响。现阶段对于环丙酰草胺生物降解的方法研究较少，因此，需要结合环丙酰草胺的水解、光解以及微生物特征提供一种合适的增强土壤降解环丙酰草胺的生物降解方法。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供了一种用于增强土壤降解环丙酰草胺的生物降解方法。
本发明的技术方案是：
一种用于增强土壤降解环丙酰草胺的生物降解方法，包括以下步骤：
S1微生物的培养：将多种微生物单独在微生物培养基中进行培养发酵3-4d，微生物含量为1-3×108个/g，再将发酵后的菌液混合得到混合液，将混合液放入培养液中培养得到稳定的微生物菌体混合液；
S2土壤预处理：将待处理的土壤含水率调节至55-60％，土壤温度控制在26±3℃，并在土壤内部0.8-1m深度处每隔3m铺设一组气管线(1)，在土壤上方加盖防雨棚；
S3微生物施加：在土壤表面以10-13kg/亩的用量均匀喷洒步骤S1中得到的微生物菌体混合液，同时开始注气，并在夜间开启灯光照射，持续10-15天；
S4微生物补加：在每两组气管线(1)之间的土壤内部0.5-1m深度处通过高压泵枪均匀注入，注入量为5-8kg/亩，每隔7天注入一次，共3次。
进一步地，所述步骤S1中的多种微生物以重量份计包括：假单胞菌25-28份、芽孢杆菌17-19份、绿色木菌6-8份、镰胞霉菌5-6份、草酸青霉1-2份，通过对多种不同微生物的复配以实现对土壤中农药残留的有效降解尤其是针对环丙酰草胺的降解。
进一步地，所述步骤S1中微生物培养基的成分以重量份计包括：水100份、葡萄糖5-10份、琼脂12-15份、食用油3-4份、桃胶2-3份、稻壳7-8份，通过该组分配比得到的微生物培养基能够有效促进微生物的发酵，使得到的微生物活性高。
进一步地，所述步骤S1中培养液的成分以重量份计包括：复合氨基酸45-50份、磷酸二氢钾3-5份、硫酸镁1-3份、氯化钠5-7份、氯化钙3-4份、生物炭10份，调节pH值为7.2-7.5，通过该组分配比得到的培养液能够使微生物聚集，并且能够使微生物进一步活化，原材料成本较低。
进一步地，所述步骤S1中混合液在微生物培养基中的培养方法具体为：
S1-1培养容器消毒：在无菌培养容器中加入培养液，采用110-120℃高温蒸汽灭菌处理1h，随后抽真空至0.1Pa，自然冷却至31-33℃；
S1-2二次发酵：将步骤S1中得到的发酵后的多种微生物分别进行过滤，再将过滤后的微生物菌液混合并搅拌均匀得到混合液，在26-29℃条件下继续发酵24h；
S1-3混合：由培养容器底部连续注入混合液，注入速度为1kg/min，混合液与培养液的重量比为1:5，再由培养容器顶部持续通入混合气体形成气流搅拌，混合气体的注入速度为0.3-0.5L/min，混合气体的成分按体积占比为：氧气20％、一氧化氮1-2％、二氧化碳2-3％、余量为氮气。注入的混合气体中一氧化氮是微生物中重要的活性分子，具有保护微生物、提高微生物耐药性的作用，同时也是对含有NO的有害气体如烟气、尾气等的回收再利用；同样地，CO2能够提高微生物对氮磷的吸收作用，也是对废气尾气的回收再利用。
进一步地，所述步骤S2中气管线左右两端均等间距布设有若干分支导气管，所述分支导气管包括位于其中心的伸缩机构以及在所述伸缩机构外周套设的纤维透气层，伸缩机构包括若干固定连接的伸缩管，伸缩机构末端设有破土钻头，所述伸缩管包括前段管和后段管，所述前段管和后段管通过一组连杆连接，所述连杆两端设有向上凸起的限位滑块，前段管和后段管内上部均设有用于与所述限位滑块滑动连接的滑槽，前段管内位于限位滑块外端设有弹性气囊，后段管内位于限位滑块外端同样设有弹性气囊，两组所述弹性气囊通过位于连杆下方的弹性连接管连接，相邻两组伸缩管通过固定块连接，前一组伸缩管的后段管内的弹性气囊与后一组伸缩管的前段管内的弹性气囊通过贯穿所述固定块的弹性软管连接，通过分支导气管的设置，能够增大通气面积，使好氧微生物活性大大提高，促进对土壤中环丙酰草胺的生物降解。
更进一步地，所述固定块内部中空设置，其内表面设有若干活动块，每组所述活动块拼接为一个完整的圆环，每组活动块通过一组弹簧与固定块的内壁连接，该设置能够使伸缩机构在注气过程中一点点逐步扩展前进而非一次性伸长，使布气效果更加充分。
进一步地，所述步骤S3中所使用的灯光为高压汞灯或氙灯，在该光照条件下能够有效促进微生物对对土壤中环丙酰草胺的生物降解。
进一步地，所述步骤S3中注入的气体为无菌空气，注气量为30m3/亩·d-1，所述步骤S4中仅在微生物补加注入后的第2天注气，注气量为10m3/亩·d-1。分多次注气能够使微生物活性达到最大。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的生物降解方法通过对多种不同微生物的复配以实现对土壤中农药残留的有效降解尤其是针对环丙酰草胺的降解，通过对微生物培养基以及培养液的改进能够促进微生物的发酵，使微生物活性更高，同时可以改善土壤质量，提高土壤含水率和含氧量，有利于促进微生物对土壤中环丙酰草胺的降解，对于生态环境的保护以及对于人们生活健康的保护具有重要意义。
(2)本发明的生物降解方法以绿色清洁生产为出发点，生产成本较低，注入的混合气体中一氧化氮是微生物中重要的活性分子，具有保护微生物、提高微生物耐药性的作用，同时也是对含有NO的有害气体如烟气、尾气等的回收再利用；同样地，CO2能够提高微生物对氮磷的吸收作用，也是对废气尾气的回收再利用。
(3)本发明的生物降解方法还提供了一种高效布气的管线，其通过设有的分支导气管能够增大通气面积，使好氧微生物活性大大提高，促进对土壤中环丙酰草胺的生物降解，同时伸缩机构在注气过程中一点点逐步扩展前进而非一次性伸长，使布气效果更加充分，提高布气效果。
附图说明
图1是本发明气管线布气结构示意图；
图2是本发明分支导气管内部结构示意图；
图3是本发明伸缩机构结构示意图；
图4是本发明固定块结构示意图；
图5是本发明固定块内部结构示意图；
图6是本发明实施例中环丙酰草胺在不同条件下降解示意图。
其中，1-气管线，2-分支导气管，3-伸缩机构，31-伸缩管，32-前段管，33-后段管，34-连杆，35-限位滑块，36-滑槽，37-弹性气囊，38-弹性连接管，39-弹性软管，4-纤维透气层，5-破土钻头，6-固定块，61-活动块，62-弹簧。
具体实施方式
实施例1
一种用于增强土壤降解环丙酰草胺的生物降解方法，包括以下步骤：
S1微生物的培养：将多种微生物单独在微生物培养基中进行培养发酵3d，多种微生物以重量份计包括：假单胞菌25份、芽孢杆菌17份、绿色木菌8份、镰胞霉菌6份、草酸青霉2份，微生物培养基的成分以重量份计包括：水100份、葡萄糖5份、琼脂12份、食用油4份、桃胶3份、稻壳8份，微生物含量为1×108个/g，再将发酵后的菌液混合得到混合液，将混合液放入培养液中培养得到稳定的微生物菌体混合液，微生物培养基与培养液的重量比为1:2，培养液的成分以重量份计包括：复合氨基酸45份、磷酸二氢钾3份、硫酸镁1份、氯化钠7份、氯化钙4份、生物炭10份，调节pH值为7.2；
具体地，步骤S1中混合液在微生物培养基中的培养方法为：
S1-1培养容器消毒：在无菌培养容器中加入培养液，采用110℃高温蒸汽灭菌处理1h，随后抽真空至0.1Pa，自然冷却至31℃；
S1-2二次发酵：将步骤S1中得到的发酵后的多种微生物分别进行过滤，再将过滤后的微生物菌液混合并搅拌均匀得到混合液，在26℃条件下继续发酵24h；
S1-3混合：由培养容器底部连续注入混合液，注入速度为1kg/min，混合液与培养液的重量比为1:5，再由培养容器顶部持续通入混合气体形成气流搅拌，混合气体的注入速度为0.3L/min，混合气体的成分按体积占比为：氧气20％、一氧化氮1％、二氧化碳2％、余量为氮气。
S2土壤预处理：将待处理的土壤含水率调节至55％，土壤温度控制在23℃，并在土壤内部0.8m深度处每隔3m铺设一组气管线1，在土壤上方加盖防雨棚；
S3微生物施加：在土壤表面以10kg/亩的用量均匀喷洒步骤S1中得到的微生物菌体混合液，同时开始注气，注入的气体为无菌空气，注气量为30m3/亩·d-1，并在夜间开启灯光照射，所使用的灯光为氙灯，持续15天；
S4微生物补加：在每两组气管线1之间的土壤内部0.5m深度处通过高压泵枪均匀注入，注入量为8kg/亩，每隔7天注入一次，共3次，在微生物补加注入后的第2天注气，注气量为10m3/亩·d-1。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：微生物的组成成分含量不同。
S1微生物的培养：将多种微生物单独在微生物培养基中进行培养发酵3.5d，多种微生物以重量份计包括：假单胞菌26份、芽孢杆菌18份、绿色木菌7份、镰胞霉菌5份、草酸青霉2份。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：微生物的组成成分含量不同。
S1微生物的培养：将多种微生物单独在微生物培养基中进行培养发酵4d，多种微生物以重量份计包括：假单胞菌28份、芽孢杆菌19份、绿色木菌6份、镰胞霉菌6份、草酸青霉1份。
实施例4
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：微生物培养基的成分含量不同。
S1微生物的培养：微生物培养基的成分以重量份计包括：水100份、葡萄糖7份、琼脂13份、食用油3份、桃胶3份、稻壳7份，微生物含量为2×108个/g。
实施例5
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：微生物培养基的成分含量不同。
S1微生物的培养：微生物培养基的成分以重量份计包括：水100份、葡萄糖10份、琼脂15份、食用油3份、桃胶2份、稻壳7份，微生物含量为3×108个/g。
实施例6
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：培养液的成分含量不同。
S1微生物的培养：培养液的成分以重量份计包括：复合氨基酸48份、磷酸二氢钾4份、硫酸镁2份、氯化钠6份、氯化钙3份、生物炭10份，调节pH值为7.3。
实施例7
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：培养液的成分含量不同。
S1微生物的培养：培养液的成分以重量份计包括：复合氨基酸50份、磷酸二氢钾5份、硫酸镁1份、氯化钠5份、氯化钙3份、生物炭10份，调节pH值为7.5。
实施例8
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤S1中混合液在微生物培养基中的培养方法参数不同。
S1-1培养容器消毒：在无菌培养容器中加入培养液，采用115℃高温蒸汽灭菌处理1h，随后抽真空至0.1Pa，自然冷却至32℃；
S1-2二次发酵：将步骤S1中得到的发酵后的多种微生物分别进行过滤，再将过滤后的微生物菌液混合并搅拌均匀得到混合液，在28℃条件下继续发酵24h；
S1-3混合：由培养容器底部连续注入混合液，注入速度为1kg/min，混合液与培养液的重量比为1:5，再由培养容器顶部持续通入混合气体形成气流搅拌，混合气体的注入速度为0.4L/min，混合气体的成分按体积占比为：氧气20％、一氧化氮2％、二氧化碳2％、余量为氮气。
实施例9
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤S1中混合液在微生物培养基中的培养方法参数不同。
S1-1培养容器消毒：在无菌培养容器中加入培养液，采用120℃高温蒸汽灭菌处理1h，随后抽真空至0.1Pa，自然冷却至33℃；
S1-2二次发酵：将步骤S1中得到的发酵后的多种微生物分别进行过滤，再将过滤后的微生物菌液混合并搅拌均匀得到混合液，在29℃条件下继续发酵24h；
S1-3混合：由培养容器底部连续注入混合液，注入速度为1kg/min，混合液与培养液的重量比为1:5，再由培养容器顶部持续通入混合气体形成气流搅拌，混合气体的注入速度为0.5L/min，混合气体的成分按体积占比为：氧气20％、一氧化氮1％、二氧化碳3％、余量为氮气。
实施例10
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤S2中土壤预处理参数不同。
S2土壤预处理：将待处理的土壤含水率调节至58％，土壤温度控制在26℃，并在土壤内部0.9m深度处每隔3m铺设一组气管线1，在土壤上方加盖防雨棚。
实施例11
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤S2中土壤预处理参数不同。
S2土壤预处理：将待处理的土壤含水率调节至60％，土壤温度控制在29℃，并在土壤内部1m深度处每隔3m铺设一组气管线1，在土壤上方加盖防雨棚。
实施例12
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤S3、S4中具体参数不同。
S3微生物施加：在土壤表面以12kg/亩的用量均匀喷洒步骤S1中得到的微生物菌体混合液，同时开始注气，注入的气体为无菌空气，注气量为30m3/亩·d-1，并在夜间开启灯光照射，所使用的灯光为氙灯，持续12天；步骤S4中仅
S4微生物补加：在每两组气管线1之间的土壤内部0.7m深度处通过高压泵枪均匀注入，注入量为7kg/亩，每隔7天注入一次，共3次，在微生物补加注入后的第2天注气，注气量为10m3/亩·d-1。
实施例13
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤S3、S4中具体参数不同。
S3微生物施加：在土壤表面以13kg/亩的用量均匀喷洒步骤S1中得到的微生物菌体混合液，同时开始注气，注入的气体为无菌空气，注气量为30m3/亩·d-1，并在夜间开启灯光照射，所使用的灯光为高压汞灯，持续10天；
S4微生物补加：在每两组气管线1之间的土壤内部1m深度处通过高压泵枪均匀注入，注入量为5kg/亩，每隔7天注入一次，共3次，在微生物补加注入后的第2天注气，注气量为10m3/亩·d-1。
实施例14
本实施例与实施例1基本相同，其不同之处在于：
步骤S2中气管线1左右两端均等间距布设有若干分支导气管2，分支导气管2包括位于其中心的伸缩机构3以及在伸缩机构3外周套设的纤维透气层4，伸缩机构3包括若干固定连接的伸缩管31，伸缩机构3末端设有破土钻头5，伸缩管31包括前段管32和后段管33，前段管32和后段管33通过一组连杆34连接，连杆34两端设有向上凸起的限位滑块35，前段管32和后段管33内上部均设有用于与限位滑块35滑动连接的滑槽36，前段管32内位于限位滑块35外端设有弹性气囊37，后段管33内位于限位滑块35外端同样设有弹性气囊37，两组弹性气囊37通过位于连杆34下方的弹性连接管38连接，相邻两组伸缩管31通过固定块6连接，前一组伸缩管31的后段管33内的弹性气囊37与后一组伸缩管31的前段管32内的弹性气囊37通过贯穿固定块6的弹性软管39连接，固定块6内部中空设置，其内表面设有若干活动块61，每组活动块61拼接为一个完整的圆环，每组活动块61通过一组弹簧62与固定块6的内壁连接。
上述气管线1的工作原理为：
当对气管线1通气后，空气进入分支导气管2内，首先充入前段管32内的弹性气囊37中，弹性气囊37充气后挤压限位滑块35使其沿滑槽36滑动，当前段管32内的弹性气囊37充满气后在通过弹性连接管38对后段管33内的弹性气囊37充气，同样弹性气囊37充气后挤压限位滑块35使其沿滑槽36滑动，完成伸缩管31的伸长，当一组伸缩管31完全伸长后，气体进入弹性软管39内，弹性软管39内充气后挤压活动块61，使活动块61在弹簧62的作用下向固定块6内壁移动，增大通气面积，以便于对下一组伸缩管31内的弹性气囊37充气，从而完成整个伸缩机构3的伸长；随后通入的气体由纤维透气层4进入到土壤内部。
实验例
对实施例1-13中的土壤样品进行检测，测试土壤内部环丙酰草胺的含量以确定降解效果，所选土壤均为收到相同程度环丙酰草胺污染的江西红壤，检测结果如下：
由以上数据可以看出，实施例1-3中环丙酰草胺残留浓度较低，半衰期差异不大，因此，本发明的微生物的组成成分含量能够对土壤中环丙酰草胺的降解起到良好的作用；
对比实施例1、4、5可知，实施例4中的环丙酰草胺残留浓度最低，因此，实施例4中的微生物培养基的成分含量培养发酵出的微生物混合液对于环丙酰草胺的降解效果最好；
对比实施例1、6、7可知，实施例7中的环丙酰草胺残留浓度最低，因此，实施例7中的培养液的成分含量进一步培养的微生物对于环丙酰草胺的降解效果最好，此外，半衰期与最终环丙酰草胺的浓度呈正比；
对比实施例1、8、9可知，实施例8中的环丙酰草胺残留浓度最低，这是因为实施例8中所选用的二次发酵温度合适，使微生物的活性达到最大，同时注入的混合气体中NO与CO2的配比更为合理，进一步提高了微生物的活性，而实施例9中CO2浓度过高可能是降解效果不好的原因之一；
对比实施例1、10、11可知，三组实施例中环丙酰草胺残留浓度与半衰期成反比，说明初期含水率高则初期的降解速度较快，但最终可能会造成环丙酰草胺残留较多，而初期含水率低则初期的降解速度虽然较慢，但能够使环丙酰草胺降解的更为彻底；
对比实施例1、12、13可知，对于微生物的喷洒方式，需选取合适的喷洒量以及喷洒周期，不宜短时间内喷洒过多也不宜长时间少量喷洒，且还应选取合适的深度进行施加，实施例12中的微生物施加参数最优；
如图6所示，对比例为无氧状态即不使用所述气管线注气所得的降解效果，可以看出，在无氧状态下，环丙酰草胺残留浓度较高，说明无氧状态下微生物活性降低，使用本发明实施例14中的气管线对土壤中进行注气能够对环丙酰草胺的降解起到积极的作用。
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