阅读说明：本技术 一种降低单一相关杂质含量的腺苷提取方法 (Adenosine extraction method for reducing content of single related impurities ) 是由 李静 张孟涛 李闯 封浪 刘晓东 刘永超 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种降低单一相关杂质含量的腺苷提取方法,属于生物工程技术领域,所述方法是在发酵结束后,发酵液过膜进行固液分离,得到含有腺苷的清液；向所得清液中加入絮凝剂A缓慢搅拌至出现白色絮状物,然后再加入絮凝剂B缓慢搅拌至出现蛋白絮状物时静置,得料液；向所得料液中加入活性炭进行预脱色,然后过板框；经减压蒸发浓缩后养晶、降温结晶、离心、粗品重溶脱色、降温结晶、洗涤、干燥后,即可得腺苷晶体。所述方法,通过加入絮凝剂和采用预脱的方式降低腺苷成品中单一相关杂质含量,从而提高产品收率。(The invention relates to an adenosine extraction method for reducing the content of single related impurities, which belongs to the technical field of bioengineering, and the method comprises the following steps of performing solid-liquid separation on fermentation liquor through a membrane after the fermentation is finished to obtain a clear liquid containing adenosine; adding a flocculating agent A into the obtained clear liquid, slowly stirring until white floccules appear, then adding a flocculating agent B, slowly stirring until protein floccules appear, and standing to obtain feed liquid; adding active carbon into the obtained feed liquid for pre-decoloring, and then passing through a plate frame; after decompression evaporation and concentration, crystal growing, cooling crystallization, centrifugation, crude product redissolution and decoloration, cooling crystallization, washing and drying, the adenosine crystal can be obtained. According to the method, the content of single related impurities in an adenosine finished product is reduced by adding a flocculating agent and adopting a pre-removing mode, so that the product yield is improved.)

一种降低单一相关杂质含量的腺苷提取方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种降低单一相关杂质含量的腺苷提取方法。

背景技术

腺苷是一种内源性嘌吟核苷酸，在心血管方面，腺苷是一种可靠的生理调节剂。临床上腺苷作为一种血管舒张剂被有效地用于治疗，也可以作为抗心律不齐的药物。其最大优点是具有较短的血浆半衰期。腺苷作为一种多用途的原料药，无论是应用于临床还是作为生产ATP的前体,都具有重要价值。而目前国内腺苷的生产主要是酶法或化学法，成本较高。随着腺苷作用范围的不断扩大，其市场需求也在不断增长，腺苷的生产方法主要有化学合成法、酶法和发酵法，而目前国内腺苷的生产主要是化学法和酶法，成本高、污染严重，推广应用受到严重的限制。发酵法生产腺苷的具有反应条件温和、成本低、绿色、清洁、环保等优势。

目前对原料药的质量标准要求越来越严格而单一相关杂质又是腺苷成品检测标准中非常重要的一个指标，但是现有腺苷提取工艺中仅凭借脱色环节少量活性炭可以辅助性的降低很少一部分单一相关杂质，并没有一个明确的单一环节来降低此成品指标含量，因此，在低碳环保的形势下使用发酵法生产腺苷，优化腺苷的提取工艺进一步提高腺苷的收率与质量具有重要的意义。

发明内容

为了解决现有技术中采用发酵法生产腺苷提取质量差且收率较低的问题，本发明的目的在于提供一种降低单一相关杂质含量的腺苷提取方法，通过加入絮凝剂和采用预脱的方式降低腺苷成品中单一相关杂质含量，从而提高产品收率。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种降低单一相关杂质含量的腺苷提取方法，包括以下步骤：

步骤一、发酵结束后，发酵液过膜进行固液分离，得到含有腺苷的清液；

步骤二、向步骤一所得清液中加入絮凝剂A缓慢搅拌至出现白色絮状物，然后再加入絮凝剂B缓慢搅拌至出现蛋白絮状物时静置30min，得料液；所述絮凝剂A为硫酸铝，加入量为2g/L，所述絮凝剂B为聚丙烯酰胺，加入量为0.1g/L；

步骤三、向步骤二所得料液中加入3％活性炭进行预脱色；所述活性炭的加入量为30g/L；所述预脱色温度为90℃、时间为30min~1h，然后过板框；

步骤四、经减压蒸发浓缩后养晶、降温结晶、离心、粗品重溶脱色、降温结晶、洗涤、干燥后，即可得腺苷晶体。

作为对上述方案的进一步优化，步骤一所述固液分离采用过陶瓷膜或采用超滤膜过滤发酵液来进行。更近一步地，所述超滤膜的膜通量为15m³/h至20m³/h。

作为对上述方案的进一步优化，步骤四所述蒸发浓缩波镁为12。

作为对上述方案的进一步优化，步骤四所述降温结晶是在温度为10℃以下搅拌育晶1h。

作为对上述方案的进一步优化，步骤四所述重溶脱色浓度为70g/L，温度为90℃，时间为1h。

有益效果：

本发明对陶瓷清液进行絮凝不但进一步降低了发酵清液中蛋白质含量，而且预脱处理既可以除去絮凝蛋白又可以吸附清夜中部分杂质，与原提取工艺相比该工艺大大的改善了清液质量，降低了结晶波美度，不仅降低了蒸发工段蒸汽消耗而且成品中单一相关杂质含量也明显降低。

附图说明

图1是本发明所述方法的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

小试下罐发酵液25.0L，腺苷浓度40.0g/L，过超滤膜后（为使过膜完全后期加纯水10L）取发酵液清液30L，腺苷含量30.2g/L；加入硫酸铝60.0g缓慢搅拌均匀至出现白色絮状物然后再加入3.0g聚丙烯酰胺缓慢搅拌30min后静置30min，加入900.0g活性炭90℃脱色1h，过板框除去絮凝蛋白和活性炭。旋转蒸发仪蒸发浓缩浓缩倍数130.0g/L，抽滤得粗品853.0g，粗品母液含酸16.6g/L，重溶脱色、降温结晶、抽滤烘干得成品共764.0g，成品检测单一相关杂质含量0.153%，收率76.4%。

实施例2

小试下罐发酵液28.0L，腺苷浓度42.0g/L，过超滤膜后（为使过膜完全后期加纯水11.2L）取发酵液清液30L，腺苷含量26g/L；加入硫酸铝60.0g缓慢搅拌均匀至出现白色絮状物然后再加入3.0g聚丙烯酰胺缓慢搅拌30min后静置30min，加入900.0g活性炭90℃脱色1h，过板框除去絮凝蛋白和活性炭。旋转蒸发仪蒸发浓缩浓缩倍数130.0g/L，抽滤得粗品722.4g，粗品母液含酸17.2g/L，重溶脱色、降温结晶、抽滤烘干得成品共656.8g，成品检测单一相关杂质含量0.142%，收率78.2%。

实施例3

小试下罐发酵液30.0L，腺苷浓度44.5g/L，过超滤膜后（为使过膜完全后期加纯水12L）取发酵液清液30L，腺苷含量32.2g/L；加入硫酸铝60.0g缓慢搅拌均匀至出现白色絮状物然后再加入3.0g聚丙烯酰胺缓慢搅拌30min后静置30min，加入900.0g活性炭90℃脱色1h，过板框除去絮凝蛋白和活性炭。旋转蒸发仪蒸发浓缩浓缩倍数130.0g/L，抽滤得粗品895.8g，粗品母液含酸15.4g/L，重溶脱色、降温结晶、抽滤烘干得成品共862.8g，成品检测单一相关杂质含量0.112%，收率82.8%。

对比例1

小试下罐发酵液29.0L，腺苷浓度50g/L，过超滤膜后（为使过膜完全后期加纯水11.6L）取发酵液清液30L，腺苷含量29.6g/L；旋转蒸发仪蒸发浓缩浓缩倍数130.0g/L，抽滤得粗品815.4g，粗品母液含酸30.4g/L，重溶脱色、降温结晶、抽滤烘干得成品共538.16g，成品检测单一相关杂质含量0.189%，收率65.99%。

对比例2

小试下罐发酵液30.0L，腺苷浓度52g/L,过超滤膜后（为使过膜完全后期加纯水12L）取发酵液清液30L，腺苷含量30.8g/L；旋转蒸发仪蒸发浓缩浓缩倍数130.0g/L，抽滤得粗品835g，粗品母液含酸35.6g/L，重溶脱色、降温结晶、抽滤烘干得成品共568.8g，成品检测单一相关杂质含量0.186%，收率68.12%。

值得一提的是，在本发明所述方法中，为了减少提取过程中的损失还可以将单批洗涤晶体的洗涤液加入下一批发酵液中做陶瓷膜透析水回收套用，腺苷的平均收率可达80%。

本发明过滤絮凝沉淀和预脱分离活性炭一起处理，减少了工作量且成品单一相关杂质含量可降低到0.015%，粗品母液含酸可降低到17g/L以下。洗涤后的母液（精品母液）经过多次套用既能提高收率有可节约用水量，收率可达80%以上。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。