具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

该蚕虫草活性成分的制备工艺包括以下步骤：

(1)蚕虫草粗提液的制备：将蚕虫草真空冷冻干燥48h，用粉碎机粉碎后，过40目筛，制成蚕虫草冻干粉末，在-18℃，避光、密封储存备用；准确称取一定量蚕虫草冻干粉末，料液比为1:30，溶剂为1％醋酸水溶液，提取温度为40℃和提取时间为40min；在上述条件下进行恒温水浴搅拌提取，收集滤液，滤渣进行二次提取，合并滤液，减压浓缩，最终得到实验组蚕虫草粗提液；

(2)虫草素-腺苷混合标准溶液的制备：取等量虫草素和腺苷的标准储备液混匀，配成一定浓度的虫草素-腺苷混合标准溶液；

(3)蚕虫草中活性成分的分析：

a、HPLC法分析样品粗提液：a1：样品处理：取蚕虫草粗提液和腺苷-虫草素混合标准溶液各1mL，过0.22μm滤膜，注入液相进样瓶，待HPLC分析；a2：色谱条件：所用仪器：Waters Alliance e2695；C18-HCE分析型色谱柱(4.6×2.5mm，5μm，100A)；流速：0.6mL/min；检测：UV(260nm)；柱温：35℃±5℃；进样量：10μL；洗脱条件：0min～30min，甲醇0％～10％，超纯水(含0.5％CF3COOH)100％～90％，梯度洗脱；

b、制备液相分离纯化虫草素等活性成分：b1：一维制备：C18制备型色谱柱(50×250mm，10μm)；流速60mL/min；上样量50mL；洗脱条件：甲醇:超纯水＝15:85(V:V)，等度洗脱，根据谱图出峰情况，按照A、B、C、D号峰，分别收集各馏分，采用HPLC分析方法，对一维制备所得馏分A、B、C、D进行分析；其中，馏分A中含有多种组分；馏分B和馏分C分别为腺苷和虫草素；b2：二维制备：利用C18-HCE制备型色谱柱(50×230mm，10μm)；流速50mL/min；洗脱条件：0min～40min，甲醇0％～90％，超纯水100％～10％，梯度洗脱，对一维制备所得馏分A进行二维制备，于28min～32min范围内收集馏分E；采用HPLC分析方法，对二维制备所得馏分E进行分析得到化合物I和化合物Ⅱ。

实施例2：虫草素-腺苷检测方法的建立

1.1虫草素-腺苷混合标准曲线的绘制

参照农业部标准规定的方法，并作适当修改，建立同时检测虫草素和腺苷的方法。

准确称取适量标准品，用流动相配成浓度为120μg/mL的标准储备液。取等量虫草素和腺苷的标准储备液混匀，配成60μg/mL虫草素-腺苷混合标准溶液，梯度稀释，得到系列梯度的混合标准溶液，浓度分别为60μg/mL、30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL、3.75μg/mL和1.875μg/mL。吸取各浓度的混合标准溶液2mL，经0.22μm微孔滤膜过滤，按照1.3节中的方法进行测定。以质量浓度(μg/mL)为X轴，峰面积为Y轴，绘制混合标准曲线。

HPLC分析结果如图5所示，线性方程为：y＝59870x-13076，R²＝0.9999(虫草素)；y＝54287x+101.13，R²＝1(腺苷)。

1.2蚕虫草粗提液的制备

蚕虫草真空冷冻干燥48h，用手提式小型粉碎机粉碎，过40目筛，制成蚕虫草粉末，-18℃，避光、密封储存。

准确称取一定量蚕虫草冻干粉末，按照不同料液比，加入不同浸提溶剂，在不同提取温度和提取时间条件下进行恒温水浴搅拌提取，收集滤液，滤渣进行二次提取。合并滤液，减压浓缩，最终得到实验组蚕虫草粗提液。

此外，按照农业部标准规定的蚕虫草提取方法，对同一批样品进行提取。准确称取蚕虫草冻干粉末1.00g于100mL容量瓶中，加入80mL超纯水，40℃恒温超声提取180min，提取结束，超纯水定容并摇匀。提取液低速离心10min，取上清液，作为对照组蚕虫草粗提液。

1.3HPLC法分析虫草素、腺苷含量

(1)色谱条件：

仪器：Waters Alliance e2695；色谱柱：C18-HCE(4.6×2.5mm，5μm，100A)；流速：0.6mL/min；检测：UV(260nm)；柱温：35℃±5℃；进样量：10μL；洗脱时间：0min～30min；流动相：甲醇0％～10％，超纯水(含0.5％CF3COOH)100％～90％，梯度洗脱。

(2)测定

按照保留时间做定性分析，样品与标准品保留时间的相对偏差不大于2％；按照线性方程计算蚕虫草粗提液中的虫草素和腺苷的含量。

虫草素、腺苷含量计算方法：

1.4虫草素提取率测定

计算公式如下：

实施例2：

样品中虫草素、腺苷的检测

虫草素和腺苷是蚕虫草中主要的核苷类物质，采用建立的方法，2018年1月起，多次检测了中非公司提供的虫草样品中虫草素和腺苷的含量，并提供检测报告。部分检测结果见下表2.1。

表2.1不同样品中虫草素含量

实施例3：

针对虫草素单体分离、制备的工艺研究

3.1.各种因素对虫草素提取率的影响

3.1.1浸提溶剂对虫草素提取率的影响

按照1:20(W/V)的料液比，分别用超纯水、30％乙醇和1％醋酸水溶液，在40℃恒温磁力搅拌(240rpm)条件下提取60min，抽滤，滤渣进行二次提取，合并滤液并定容至100mL，混匀，平行提取三次。探究不同浸提溶剂对虫草素提取率的影响。

HPLC分析不同溶剂的提取液，结果如图6(在图6中，a、b、c分别代表三种提取溶剂：超纯水、30％乙醇溶液和1％醋酸溶液)所示。由图6可知，粗提液中各组分的出峰时间集中在16min～33min，30％乙醇提取液中，腺苷的分离度较差，且所含杂峰较多，不利于后续核苷类化合物的分离纯化；1％醋酸提取液中，杂峰较少，且明显可见多个分离度较好的峰。经计算，各提取液中虫草素提取率结果如图7所示。

虫草素提取率从高到低依次水提液、1％醋酸提取液和30％乙醇提取液。水提液和1％醋酸提取液的虫草素提取率相近，分别为78.34％和77.92％，略高于30％乙醇提取液。

为探究提取液稳定性，将其分别静置过夜，观察溶液浑浊情况，结果如图8所示。由图8可知，不同溶剂所得蚕虫草提取液的稳定性不同，其中，水提液稳定性最差，静置过夜后出现混浊，若以此作为后续分离纯化的样液，容易造成制备柱堵塞。因此，最终宜选择1％醋酸水溶液作为浸提溶剂

3.1.2料液比对虫草素提取率的影响

分别以1:5(W/V)、1:10(W/V)、1:20(W/V)、1:30(W/V)、1:40(W/V)和1:50(W/V)的料液比加入1％醋酸水溶液，40℃恒温磁力搅拌(240rpm)提取60min，抽滤，滤渣进行二次提取，合并滤液并定容至100mL，混匀，平行提取三次。探究不同料液比对蚕虫草中虫草素提取率的影响。结果如图9所示：在一定范围内，虫草素提取率随料液比的降低而上升，当料液比低于1:30(g/mL)，提取率有所下降，说明当料液比为1:30(g/mL)时，样品中的虫草素已基本溶出，即使再增加提取溶剂，虫草素提取率也不会再显著提升，反而会因为提取液体积大，浓缩时间延长，大量损耗目标物质，从而降低提取率。

3.1.3提取时间对虫草素提取率的影响

按照1:20(W/V)的料液比加入1％醋酸水溶液，在40℃恒温磁力搅拌(240rpm)条件下，分别提取20min、30min、40min、50min、60min，抽滤，滤渣进行二次提取，合并滤液并定容至100mL，混匀，平行提取三次。探究不同提取时间比对蚕虫草中虫草素提取率的影响。结果如图10所示：在20min～50min时间范围内，虫草素提取率与提取时间呈正相关，表明蚕虫草粉末在提取过程中，伴随磁力搅拌，持续、充分地浸泡在溶剂中，由于溶液的渗透和扩散作用，蚕虫草粉末中的虫草素不断被溶剂所溶出，而当单次提取时间超过50min时，虫草素的提取率有所下降或将趋于平稳。

3.1.4提取温度对虫草素提取率的影响

按照1:20(W/V)的料液比加入1％醋酸水溶液，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃条件下，提取60min，抽滤，滤渣进行二次提取，合并滤液并定容至100mL，混匀，平行提取三次。探究不同提取温度比对蚕虫草中虫草素提取率的影响。结果如图11所示：虫草素提取率随提取温度升高，呈现先上升后缓慢下降的趋势，40℃时，虫草素提取率达到最大值。

3.2虫草素提取工艺的优化(正交实验)

考虑工艺参数间可能存在交叉影响，以虫草素提取率为单一衡量指标，以提取温度(℃)、料液比(W/V)和提取时间(min)为自变量因素，根据单因素实验结果，分别选择三个合适的水平，设计正交实验L9(34)，进一步优化蚕虫草中核苷类化合物的提取工艺。

根据单因素实验结果，设计正交实验的各因素和水平，详见表3.1。

表3.1正交实验因素与水平设计表L₉(3⁴)

用SPSS 20.0软件进行数据分析，结果如表3.2所示。

表3.2正交实验结果直观分析表

注：K_n代表各因素在同一水平条件下(n＝1,2,3)虫草素提取率的总和，R代表极差。

由表3.2中的极差(R值)可以看出，对虫草素提取率影响最大的因素是料液比，其次为提取温度和提取时间。该结果与单因素实验所呈现的趋势相同，改变蚕虫草提取的料液比，虫草素提取率的变化范围最大。根据各因素相同水平条件下的虫草素提取率总和(K值)可知，蚕虫草中核苷类化合物提取工艺的最优组合为A1B2C1，即提取温度为40℃、料液比(W/V)为1:30、提取时间为40min。

3.3优化工艺的验证

为验证上述正交实验结果可行性，按照1:30(W/V)的料液比加入1％醋酸水溶液，在40℃条件下，对蚕虫草冻干粉末进行提取，单次提取时间为40min，测定提取液中虫草素含量，确定虫草素提取率。结果表明，在该提取条件下，虫草素提取率为87.33％±3.83％，高于正交优化试验中任意一组实验的虫草素提取率，且相对误差小于0.05，说明正交实验对蚕虫草中核苷类化合物提取的优化结果可行。

实施例4：虫草素等活性成分的分离制备

4.1HPLC法分析样品粗提液

(1)样品处理：

取样品粗提浓缩液和腺苷-虫草素混合标准溶液各1mL，过0.22μm滤膜，注入液相进样瓶，待HPLC分析。

(2)色谱条件：

仪器：Waters Alliance e2695；C18-HCE分析型色谱柱(4.6×2.5mm，5μm，100A)；流速：0.6mL/min；检测：UV(260nm)；柱温：35℃±5℃；进样量：10μL；洗脱条件：0min～30min，甲醇0％～10％，超纯水(含0.5％CF3COOH)100％～90％，梯度洗脱。

结果如图12(图12中，A和B分别代表蚕虫草粗提浓缩液和腺苷-虫草素混合标准品溶液)所示：

4.2制备液相分离纯化虫草素等活性成分

进样泵：Newstyle NP7000 SERIALS PUMP(Hanbon Sci.&Tech)；检测器：NewstyleNU3000 SERIALS UV/VIS DETECTOR；UV检测：260nm；柱温：室温。

(1)一维制备

C18制备型色谱柱(50×250mm，10μm)；流速60mL/min；上样量50mL；洗脱条件：甲醇:超纯水＝15:85(V:V)，等度洗脱，根据谱图出峰情况，收集相应馏分。

一维制备谱图如图13所。按照A、B、C、D号峰，分别收集各馏分。

采用HPLC分析方法，对一维制备所得馏分A、B、C、D进行分析，结果如图14所示。

由图14可知，馏分B、C、D中的化合物已达到较高纯度，各馏分进过去杂(经C18-HCE制备型色谱柱(50×230mm，10μm)，流速60mL/min，进样泵手动进样，紫外监控(260nm)，随后梯度洗脱，0min-15min，甲醇0％-90％，超纯水100％-10％，接收馏分)，30℃条件下减压浓缩。所得浓缩液进行减压冻干处理，即可得到单体化合物的冻干粉末，-18℃保存。馏分A中仍含有多种组分。经对比图12，根据保留时间定性，确定图13中馏分B和馏分C分别为腺苷和虫草素。

(2)二维制备

C18-HCE制备型色谱柱(50×230mm，10μm)；流速50mL/min；洗脱条件：0min～40min，甲醇0％～90％，超纯水100％～10％，梯度洗脱。对一维制备所得馏分A进行二维制备，制备谱图如图15所示，于28min～32min范围内收集馏分E。采用HPLC分析方法，对二维制备所得馏分E进行分析，结果如图16所示：馏分E中杂峰较少，主要含有两种物质，根据出峰时间定性，确定这两种物质分别为12(A)中的峰5和峰6。脱水除去杂，可有效分离峰5(化合物Ⅰ)和峰6(化合物Ⅱ)。

4.3各单体化合物的纯度和得率

运用HPLC法分析分离纯化所得各单体化合物的馏分，确定单体化合物的色谱纯度，并计算单体化合物的得率(‰)和收率(％)，计算公式如下：

式中，m为单体化合物冻干粉末质量，g；M为蚕虫草样品粉末质量，g。

结果如图17(图17中，a、b、c、d分别代表腺苷、虫草素、化合物Ⅰ和化合物Ⅱ)和表4.1所示。

表4.1四种单体化合物的纯度、得率及收率

由图17可知，在260nm波长下，腺苷、虫草素、化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的出峰时间分别为17.737min、22.850min、30.013min和31.075min。由表4.1可知，虫草素色谱纯度较高，大于98％，说明经过一维制备即可得到较高纯度的虫草素。

实施例5：两种未知活性成分的结构鉴定

对分离纯化得到的两种未知单体化合物，利用超高相液相色谱-三重四级杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF/MS)、核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic ResonanceSpectroscopy，NMR)并结合相关的文献确定其化学结构式：

其中，根据化学结构式，将化合物Ⅰ和化合物Ⅱ分别命名为2-amino-N-((2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-3-yl)-6-ureidohexanamide2-amino-N-((2S,3S,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-3-yl)-6-guanidinohexa namide。经SciFinder数据库检索比对，发现化合物Ⅱ是一种全新的物质，尚未见有关文献报道该结构，它在蚕虫草生长过程中的合成途径以及生物学功效仍有待进一步研究。目前，对于化合物Ⅰ的研究也较少，仅Lichtenthaler F W研究小组在1979年从蚕虫草中分离得到过该物质，囿于其在天然蚕虫草中含量有限，研究人员以高瓜氨酸(L-Homocitrulline)和3′-氨基-3′-脱氧腺苷(3′-amino-3′-deoxyadenosine)为原料，建立了一种人工合成化合物Ⅰ的途径，并在生物学评价中证明该物质能够在肽链延长阶段干扰蛋白的合成，除此之外，尚未见其他文献报道化合物Ⅰ的生物学活性。

实施例6：

虫草素等单体及中药制剂的抗癌活性研究

6.1细胞基本培养

细胞复苏：取1管于液氮中冻存的肿瘤细胞，置于37℃恒温水浴锅中，震荡融化，转入离心管中，并加入适量完全培养基，吹打混匀，1200rpm离心5min，弃上清液，加入适量完全培养基，悬浮，转入培养瓶，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。

细胞传代：当培养瓶底部铺满80％的细胞后，弃去培养基，PBS洗涤细胞2次，加入胰酶使消化1.5min，加入适量完全培养基终止消化，轻轻吹打，悬浮细胞转入离心管，按照1:3的比例进行传代培养。

细胞计数：取消化离心并重悬的细胞悬液10μL，滴加在细胞计数板上(含盖玻片)，稳定后，用倒置显微镜观察并计数。

细胞冻存：取消化后的细胞，1200rpm离心5min，弃上清，加入1mL细胞冻存液，吹打均匀后，转移至冻存管，进行梯度冻存：4℃，30min-1h→-20℃，30min→-80℃，过夜→转移至液氮中保存)。

6.2MTT法测定细胞相对活力

原理：MTT可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原，生成蓝紫色结晶滞留在细胞内，而死细胞则无该功能。DMSO可溶解结晶，测定悬液在490nm波长下的吸光度值(OD值)，OD值与细胞存活率呈正比，由此可检测不同药物对细胞活力的影响。

操作流程：取对数生长期的HepG2细胞计数，将其稀释至2.5104个/mL，接种于96孔板，200μL/孔，“十字型”轻柔摇匀，37℃，5％CO2培养12h使细胞贴壁，除去上清液，加入含药培养基，设空白对照，继续培养，每24h换液。实验组设置三个给药时长，分别为24h、48h和72h，药物设置6个浓度，分别为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL和320μg/mL，每个浓度设置6个复孔。培养结束，避光加MTT，20μL/孔，孵育4h，除去上清液，加150μL/孔的DMSO，置于振荡器上震荡10min，促使结晶溶解，用酶标仪测定OD值，并计算细胞相对活力，计算公式如下：

式中，OD1为样品组；OD0为对照组。

6.3实验结果

6.3.1对肝癌HepG2细胞相对活力的影响

分离制备所得虫草素(a)、化合物I(b)、化合物II(c)体外对肝癌HepG2细胞相对活力的影响，结果如图1所示。

由图1可知，经虫草素、化合物Ⅰ和化合物Ⅱ处理后，HepG2细胞的相对活力显著下降(p<0.05)，呈浓度依赖，并且虫草素和化合物Ⅰ对HepG2细胞的抑制作用与药物作用时间呈正相关。

经计算，虫草素、化合物Ⅰ和化合物Ⅱ对HepG2细胞的半数抑制浓度(IC50)如表6.1所示。IC50指当抑制率为50％时样品的浓度，IC50越小，抑制效果越好。3种药物均能抑制HepG2细胞的增殖，抑制作用效果的顺序依次为：化合物I>虫草素>化合物Ⅱ。

表6.1各组分对HepG2肝癌细胞的半数抑制浓度(IC50)

注：IC₅₀值数据由SPSS软件拟合得到，与实际柱状图存在偏差属正常。

6.3.2对HCT-116结肠癌肿瘤细胞相对活力的影响

分离制备所得虫草素(a)、化合物I(b)、化合物II(c)体外对HCT-116细胞相对活力的影响，结果图2-4所示.

由图3和图4可知，经化合物Ⅰ和化合物Ⅱ处理后，HCT-116细胞的相对活力显著下降，呈时间-剂量效应，且作用效果明显优于相同浓度的虫草素。

经计算，虫草素、化合物Ⅰ和化合物Ⅱ对HCT-116细胞的半数抑制浓度(IC50)如表2所示。

3种药物均能抑制HCT-116细胞的增殖，抑制作用效果的顺序依次为：化合物Ⅱ>化合物I>虫草素。

6.3.3复方汤剂对HepG2细胞相对活力的影响

(1)水分含量测定

利用水分快速测定仪对复方汤剂进行水分含量测定。由表6.3结果可知，复方药物(汤剂)中的固形物含量约为复方药物(未焦化)的3.5倍。

表6.3复方药物水分含量比较

(2)细胞实验结果

用完全培养基将复方药物(汤剂)按照1:140、1:280和1:560(1.79‰、3.57‰、7.14‰)的比例进行稀释，用于细胞实验。结果如表6.4所示。

表6.4复方药物(汤剂)对HepG2细胞的作用

与空白对照组相比，随着复方药物(汤剂)浓度的升高和给药时间的延长，HepG2细胞的相对活力明显降低，呈现较好的时间-剂量效应；给药培养24h、48h和72h后，其不同浓度复方药物(汤剂)对HepG2细胞的IC50值分别为4.427‰、1.896‰和1.996‰。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。