阅读说明：本技术 一种碱冻融体系预处理几丁质提高几丁质降解率的方法 (Method for improving chitin degradation rate by pretreating chitin with alkali freeze-thaw system ) 是由 陈杰 张阿磊 吴超强 周宁 魏国光 王莹莹 陈可泉 欧阳平凯 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种碱冻融体系预处理几丁质提高几丁质降解率的方法。该方法包括如下步骤：(1)利用微生物发酵获得几丁质酶；(2)称取适量几丁质,加入碱溶液中并搅拌分散,在适宜冻融模式处理下,取出室温融化,煮沸析出几丁质后离心去上清,利用PBS(pH 7.0)缓冲液搅拌重悬,清洗pH至中性；(3)吸取预处理几丁质和几丁质酶于水浴锅中反应,反应结束后,测定还原糖含量。与现有技术相比,本发明方法通过改性处理几丁质,提高几丁质与其酶的附着力,转化效率是未处理的11.01倍,且用时间较短,操作简单,污染较小,具有广阔的应用前景。(The invention discloses a method for improving chitin degradation rate by pretreating chitin with an alkali freeze-thawing system. The method comprises the following steps: (1) obtaining chitinase by microbial fermentation; (2) weighing appropriate amount of chitin, adding into alkali solution, stirring for dispersing, taking out for melting at room temperature under suitable freeze-thaw mode treatment, boiling to separate out chitin, centrifuging to remove supernatant, stirring for resuspending with PBS (pH 7.0) buffer solution, and cleaning pH to neutral; (3) and (3) absorbing the pretreated chitin and chitinase to react in a water bath, and measuring the content of reducing sugar after the reaction is finished. Compared with the prior art, the method improves the adhesive force of the chitin and the enzyme thereof by modifying the chitin, has the conversion efficiency 11.01 times that of the untreated chitin, has short time, simple operation and less pollution, and has wide application prospect.)

一种碱冻融体系预处理几丁质提高几丁质降解率的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种碱冻融体系预处理几丁质提高几丁质降解率的方法。

背景技术

几丁质（Chitin），又称甲壳素、甲壳质，主要存在于虾蟹贝类及昆虫等的外骨骼中，自然界中含量巨大，仅次于纤维素。该大分子多聚糖是一种由单体N-乙酰氨基葡萄糖以α-1，4糖苷键连接而成的聚合物。化学酸碱法和生物酶法均可将其降解为几丁寡糖和单糖（N-乙酰氨基葡萄糖）。但酸碱法因为对环境污染大，且反应过程不易控制，反应效率低，得到的产品生物活性差，不是几丁质降解的最佳选择。近年来，生物酶法由于反应温和、便于控制、环境友好等优点，渐渐得到广大学者的关注。

N-乙酰氨基葡萄糖作为几丁质的基本单元，近年来在医药、农业、化妆品行业及环境保护方面均表现出广阔的应用前景。特别是在医学领域中，其可用于临床增强人体免疫系统，治疗骨关节炎及关节疼痛等炎症，抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长，对恶性肿癌起到了抑制和治疗作用。

然而几丁质链内部氢键复杂，赋予了其较高的结晶度和不溶于水的特性，使得生物酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的效率受到极大限制，难以应用于大规模生产。现已报道的高压均质法、超声法、酸法、研磨法、蒸汽***法等方法由于处理条件恶劣、设备要求高、成本高昂等问题难以具有实际应用前景。因此，开发一种简单高效的几丁质预处理方法，降低其结晶度，使其更有利用几丁质酶的降解几丁质向N-乙酰氨基葡萄糖的转化效率显得尤为重要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种碱冻融体系预处理几丁质提高几丁质降解率的方法，通过与未处理的几丁质对比，并对碱冻融体系预处理几丁质增加其酶降解的条件进行了优化，极大程度提高了几丁质的降解制备N-乙酰氨基葡萄糖的效率，可用于规模化生产。

为解决现有技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种碱冻融体系预处理几丁质提高几丁质降解率的方法，包括以下步骤：

步骤1，微生物发酵产几丁质酶，并获得浓缩酶液

将产几丁质酶的菌株接种至种子液培养基中，37℃、200rpm 条件下培养12 h，再以体积分数5% 的接种量接入装有产酶发酵培养基的摇瓶中，26℃，200 rpm，初始pH7.5的条件下发酵72 h后收集发酵液，并于4℃、8000 rpm下离心，分离菌体，收集上清液，即得几丁质酶粗酶液；

步骤2，碱冻融体系预处理几丁质

称取质量不超过反应体系4%的几丁质粉末，加入质量分数为4%～20%碱液混合均匀，混合溶液于-20℃～-80℃中冻融1～3次，累计冷冻时间6 h～24 h，每次冻融后均需取出在室温融化，并搅拌至冰水混合态，再重复冻融操作，待最后一次冻融融化后煮沸5～30 min充分析出几丁质后离心并回收上清碱液，再向析出的几丁质中加入PBS缓冲液搅拌重悬，重复离心去上清液，重复重悬，直至重悬后的几丁质悬浊液呈中性；融化过程中注意搅拌充分，防止几丁质胶体结团凝聚，不利于酶的结合，影响降解效果；

步骤3，碱冻融体系辅助酶法降解几丁质与几丁质酶直接降解几丁质

吸取等量几丁质悬浊液和几丁质酶液于水浴锅中，37℃下反应0.5～3 h后，测定还原糖含量，计算几丁质的降解率。

作为优选的是，步骤1中所述产几丁质酶的菌株为Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1（2011年7月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO：3438，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所）或者Chitinolyticbacter sp. GC 72（2014年4月1日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2014113，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内）。

进一步改进的是，当步骤1中所述产几丁质酶的菌株为Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1时，酶解温度为20℃～37℃, 酶解时长为0.5 h～4 h。

作为优选的是，步骤2中所述几丁质粉末的粒径为20-100目。

作为优选的是，步骤2中的碱液为NaOH溶液或KOH溶液中一种或两种混合而成。

作为优选的是，步骤2中混合溶液于-25℃～-80℃下冻融，累计冷冻时间6 h～12h，冻融1次；或12 h～24 h期间冻融2～3次。

作为优选的是，步骤2中碱液的质量分数为8%～16%。

反应原理：碱溶液在低温下会形成大的溶剂分子集团，使得甲壳素分子内、分子间氢键被弱化，从而降低甲壳素的结晶度使之溶解，重析出后更利于酶的降解。

有益效果：

与现有技术相比，本发明提供了碱冻融体系预处理几丁质提高几丁质降解率的方法，该方法利用碱体系冻融辅助酶法降解几丁质通过对底物的改性处理，降低几丁质的结晶度，提高了酶的降解，利用碱体系冻融辅助酶法降解几丁质，降解效率是未处理的11.01倍，是传统化学酸法降解几丁质的2.6倍。且相对于传统酸碱法降解对环境有较小污染，冻融所需的碱溶液可重复利用，操作简单，设备要求低。

附图说明

图1为碱处理后的几丁质的宏观变化图，其中（1）为未处理的粉粒几丁质（1%wt），（2）为10%KOH冻融体系处理后的几丁质（1%wt），（3）为10%NaOH冻融体系处理后的几丁质（1%wt）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

步骤1，几丁质酶的获取与浓缩

选用Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 菌株，该菌株于2011年7月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO：3438，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。

本次实验选用Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 菌株由江南大学郝之奎等赠予，本实验室将其保存在-70℃作为种子，接种到培养基（2 g/L葡萄糖，2 g/L 蛋白胨，0.7 g/L KH₂PO₄，0.3g/L KH₂PO₄·3H₂O，0.4 g/LMgSO₄·7H₂O，pH7.0）上，37℃、200rpm下培养 12 h，再以体积分数 5% 的接种量接入装有产酶发酵培养基（3 g/L粉粒几丁质，3g/L菊粉，3g/L 尿素，0.7g/L KH₂PO₄，0.3 g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.5 g/LMgSO₄·7H₂O）的摇瓶，在温度为 26℃，转速为200 rpm，初始 pH7.5下发酵72 h后收集发酵液。

将获得的发酵液在4℃离心机中8000rpm离心，分离菌体，收集上清液，得到几丁质粗酶液；

步骤2，碱冻融体系预处理几丁质

称取0.1g几丁质粉末，加入10 mL质量分数为8%NaOH溶液，放入冰箱在-25℃冷冻12 h，取出后室温融化至冰水混合物状态，融化过程中注意搅拌充分，防止几丁质胶体结团凝聚，不利于酶的结合，影响降解效果，融化后的溶液煮沸5 min充分析出几丁质后离心并回收上清碱液，再加入PBS缓冲液搅拌重悬，重复离心去上清多次至重悬后的几丁质悬浊液呈中性。

步骤3，碱冻融体系辅助酶法降解几丁质与几丁质酶直接降解几丁质

吸取200μL几丁质悬浊液和等量几丁质酶液于水浴锅中37℃反应1 h后，在沸水中煮5min，灭活。然后向体系中各加入体积1:1的DNS（即400μL）,沸水浴5 min，待冷却至室温后在540 nm下测定吸光值，得还原糖1.24 g/L。

对比例：称取0.1g几丁质粉末，加入10 mL纯水，混匀呈悬浊液。吸取200μL几丁质悬浊液和等量几丁质酶液于水浴锅中37℃反应1h后，在沸水中煮5 min，灭活。然后向体系中各加入体积1:1的DNS（即400μL）,沸水浴5 min，待冷却至室温后在540 nm下测定吸光值,得还原糖0.16g/L。

实施例2

与实施例1不同的是：称取0.1g几丁质粉末，加入10 mL质量分数为10%KOH溶液，放入冰箱在-25℃冷冻6 h，冻融两次。

处理后，吸取200μL几丁质悬浊液和等量几丁质酶液于水浴锅中37℃反应1 h后，在沸水中煮5 min，灭活。然后向体系中各加入体积1:1的DNS（即400μL）,沸水浴5 min，待冷却至室温后在540nm下测定吸光值，得还原糖1.59 g/L。

对比例：称取0.1g几丁质粉末，加入10mL纯水，混匀呈悬浊液。吸取200μL几丁质悬浊液和等量几丁质酶液于水浴锅中37℃反应1h后，在沸水中煮5 min，灭活。然后向体系中各加入体积1:1的DNS（即400μL）,沸水浴5 min，待冷却至室温后在540 nm下测定吸光值,得还原糖0.16 g/L。

实施例3

与实施例1不同的是：称取0.1g几丁质粉末，加入10 mL质量分数为10%NaOH溶液，放入冰箱在-80℃冷冻12h。

处理后，吸取200μL几丁质悬浊液和等量几丁质酶液于水浴锅中37℃反应1 h后，在沸水中煮5 min，灭活。然后向体系中各加入体积1:1的DNS（即400μL）,沸水浴5 min，待冷却至室温后在540nm下测定吸光值，得还原糖1.54 g/L。

对比例：称取0.1g几丁质粉末，加入10 mL纯水，混匀呈悬浊液。吸取200μL几丁质悬浊液和等量几丁质酶液于水浴锅中37℃反应1h后，在沸水中煮5 min，灭活。然后向体系中各加入体积1:1的DNS（即400μL）,沸水浴5 min，待冷却至室温后在540 nm下测定吸光值,得还原糖0.16 g/L。

实施例4

与实施例1不同的是：称取0.3 g几丁质粉末，加入10 mL 质量分数为10%KOH溶液，放入冰箱在-25℃冷冻6 h冻融两次。

处理后，吸取200 μL几丁质悬浊液和等量几丁质酶液于水浴锅中37℃反应1 h后，在沸水中煮5 min，灭活。然后向体系中各加入体积1:1的DNS（即400 μL）,沸水浴5 min，待冷却至室温后在540 nm下测定吸光值，得还原糖1.62 g/L。

对比例：称取0.1 g几丁质粉末，加入10 mL纯水，混匀呈悬浊液。吸取200 μL几丁质悬浊液和等量几丁质酶液于水浴锅中37℃反应1 h后，在沸水中煮5 min，灭活。然后向体系中各加入体积1:1的DNS（即400 μL）,沸水浴5 min，待冷却至室温后在540 nm下测定吸光值,得还原糖0.16 g/L。

综合上述实施例与对比例可知，在低温下会形成大的溶剂分子集团，使得甲壳素分子内、分子间氢键被弱化，从而降低甲壳素的结晶度使之溶解，极大程度提高了几丁质的降解制备N-乙酰氨基葡萄糖的效率。