阅读说明：本技术 基于银-金属有机骨架材料作为荧光探针应用于叶酸检测的方法 (Method for applying silver-metal organic framework material as fluorescent probe to folic acid detection ) 是由 李妍 杨斌 李欣書 王璐 丁斌 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于银-金属有机骨架材料作为荧光探针应用于叶酸检测的方法,该材料具有很好的水稳定性和卓越的荧光性能,能够高选择性、高灵敏性地检测叶酸,并且成功地应用于实际样品的检测。与传统的检测方法相比,这种基于MOFs的荧光探针具有灵敏度高、响应时间短、可操作性强等优点。本发明中该方法检测叶酸的传感机制主要归因于内滤效应,因为叶酸的紫外吸收光谱和银-金属有机骨架材料的荧光发射光谱两者之间存在光谱重叠,叶酸可以猝灭其荧光。本发明公开了利用银-金属有机骨架材料作为荧光探针应用于叶酸检测的详细分析工作,且具有选择性好和灵敏度高的特点。(The invention relates to a method for applying a silver-metal organic framework material as a fluorescent probe to folic acid detection, wherein the material has good water stability and excellent fluorescence property, can detect folic acid with high selectivity and high sensitivity, and is successfully applied to the detection of actual samples. Compared with the traditional detection method, the fluorescent probe based on the MOFs has the advantages of high sensitivity, short response time, strong operability and the like. The sensing mechanism for detecting folic acid by the method is mainly attributed to the internal filtering effect, and folic acid can quench the fluorescence of folic acid because the ultraviolet absorption spectrum of folic acid and the fluorescence emission spectrum of the silver-metal organic framework material have spectrum overlap. The invention discloses a detailed analysis work of folic acid detection by using a silver-metal organic framework material as a fluorescent probe, and has the characteristics of good selectivity and high sensitivity.)

基于银-金属有机骨架材料作为荧光探针应用于叶酸检测的 方法

本申请得到国家自然科学基金面上项目21375095和天津市自然科学基金面上项目18JCYBJC89700的资助。

技术领域

本发明属于金属有机骨架材料的制备和荧光检测领域，具体涉及一种水稳定性高的银-金属有机骨架材料作为荧光探针高灵敏性检测叶酸的方法。

背景技术

金属有机骨架（MOFs）材料是一类较新的高结晶度多孔材料，又称多孔配位聚合物（PCPs），由于其具有潜在的应用前景，目前已成为材料化学中的一个重要研究方向。MOFs材料的本质是由金属离子（离子团簇）和有机配体通过强配位键组装成的一种具有扩展性矩阵框架。目前，由于MOFs具有灵活的结合位点、比表面积大、孔隙体积大、孔径可调等优点，在多功能材料领域发挥着重要作用。近些年来，发光MOFs材料由于其开放的通道结构，可控的孔径以及丰富的灵活位点，使得它在分析传感应用领域引起了人们极大的兴趣和关注。

叶酸是维生素B族的一种水溶性化合物，对人体多种生理功能的正常运行起着非常重要的作用。在新细胞***和生长期间，叶酸可以促进新细胞的产生和维持。此外，它有利于胸腺嘧啶和嘌呤（DNA和RNA的基本成分）的合成，防止DNA的变化，从而预防癌症。它也是造血系统的关键组成部分，被认为是控制亚铁血红素合成和生产的辅酶。因此，生物体液中叶酸的异常水平会影响正常生理过程，引发一些相关疾病。例如叶酸缺乏可导致巨幼细胞贫血、白细胞减少、心血管疾病、胎儿神经管缺陷和一些精神疾病。目前，检测叶酸的传统方法有高效液相色谱法、比色法、电化学法、紫外吸收光谱法、毛细管电泳法等。这些方法仍然存在一些不足和局限性，比如检测耗时、复杂的修饰过程、灵敏度低和仪器昂贵等问题。因此，开发一种可靠、有效的分析方法应用于叶酸的定量检测，对相关生理疾病的诊断和预防具有重要意义。

金属有机骨架材料作为一种功能性的多孔配位聚合物，其拥有优异的光学性质和良好的化学稳定性，其已被应用于金属离子、生物小分子、硝基***物、生物标志物、pH、温度等一系列的分析物或条件的传感应用。本发明采用水热法成功制备了银-金属有机骨架材料并将其作为荧光探针，目前关于银-金属有机骨架材料应用于叶酸的荧光分析检测工作尚未报道。

本发明涉及基于银-金属有机骨架材料应用于叶酸分析检测的方法，由于叶酸的紫外吸收光谱和银-金属有机骨架材料的荧光发射光谱之间存在光谱重叠（内滤效应），因此叶酸可以有效的猝灭其银-金属有机骨架材料的荧光。根据荧光发射强度的变化值（I-I₀）与其对应的叶酸浓度（C：µM）可拟合得到良好的线性关系，以此可以实现快速灵敏的检测目的。

其中以上所述的银-金属有机骨架材料指的是：{[Ag₂(abtz)₂(ClO₄)] . (ClO₄)}；abtz指的是：1-（4-氨基苄基）-1, 2, 4,-苯***有机配体。

发明内容

本发明涉及基于水稳定性高的银-金属有机骨架材料作为荧光探针检测生物体液中叶酸含量的方法，由于其叶酸的紫外吸收光谱和银-金属有机骨架材料的荧光发射光谱之间存在光谱重叠（内滤效应），叶酸可以有效地猝灭银-金属有机骨架材料的荧光发射，可依据体系溶液的荧光强度的变化值来实现对叶酸选择性和灵敏性的分析检测。

为实现上述目的，本发明公开了一种基于水稳定性高的银-金属有机骨架材料作为荧光探针选择性检测叶酸的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

1）标准储备溶液的配制

（a）100 mg L^-1银-金属有机骨架材料标准溶液：称取质量为0.0030 g的银-金属有机骨架材料，将其分散于30 mL的去离子水中，超声分散5 min，放于阴暗处储藏待用；

（b）8 mM叶酸标准溶液：称取质量为0.1059 g的叶酸（Mr：441.4）将其溶于30 mL去离子水中摇匀使之完全溶解，放于阴暗处储藏待用；

（c）Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM）：称取质量为0.7780 g的三羟基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl，Mr=157.6）溶于50 mL的去离子水中摇匀使之完全溶解并用pH计调至pH7.0；

2）叶酸检测

（a）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），用去离子水定容至4 mL，静置10 min。然后用荧光分光光度计测量并记录体系溶液的荧光发射光谱和在发射波长为350 nm处的荧光发射强度；

（b）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µ Tris-HClL标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），200 µL一系列不同浓度（2-400 µM）的叶酸标准溶液，最后用去离子水分别定容至4 mL混合均匀，静置反应10 min。然后用荧光分光光度计测量并记录体系溶液的荧光发射光谱和在发射波长为350 nm处的荧光发射强度；

（c）根据两次记录的荧光发射强度之间的变化值（I-I₀）和其对应的叶酸浓度（C：µM）可拟合得到线性方程，通过体系溶液中荧光发射强度的变化值和线性方程可计算未知溶液或实际样品中叶酸的含量；

本发明中所述的银-金属有机骨架材料指的是：{[Ag₂(abtz)₂(ClO₄)] . (ClO₄)}；abtz指的是：1-（4-氨基苄基）-1, 2, 4,-苯***有机配体。

本发明所述检测叶酸的方法，其特征在于拟合的线性方程为I-I₀=15.64C-0.32，线性范围为0.1-20 µM，最低检出限68.1 nM，R²值为0.992。

本发明利用银-金属有机骨架材料去高灵敏性地检测叶酸，并且能够应用于人体血清和血浆实际样品中叶酸含量的分析检测和加标回收。

本发明更进一步公开了该方法检测叶酸具有高灵敏度的检验，其结果显示该方法检测叶酸具有较高的选择性和抗干扰能力，该方法具有较低的检出限，并且成功的应用于人类血清和血浆实际样品中的分析检测，得到了满意的加标回收率。

本发明更加详细的描述如下：

本发明公开了基于水稳定性高的银-金属有机骨架材料作为荧光探针去选择性检测叶酸的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

（1）标准储备溶液的配制

100 mg L^-1银-金属有机骨架材料标准溶液：称取质量为0.0030 g的银-金属有机骨架材料，将其分散于30 mL的去离子水中，超声分散5 min，放于阴暗处储藏待用；

8 mM叶酸标准溶液：称取质量为0.1059 g的叶酸（Mr：441.4）将其溶于30 mL去离子水中摇匀使之完全溶解，并通过逐级稀释配制成一系列不同浓度（2-400 μM）的叶酸标准溶液，放于阴暗处储藏待用；

Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM）：称取质量为0.7780 g的三羟基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl，Mr=157.6）溶于50 mL的去离子水中摇匀使之完全溶解，然后用pH计调至pH7.0。

（2）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀，静置10 min。然后用荧光分光光度计测量并记录体系溶液的荧光发射光谱和在发射波长为350 nm处的荧光发射强度。

（3）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），200 µL一系列不同浓度（2-400 µM）的叶酸标准溶液，最后用去离子水分别定容至4 mL混合均匀，静置反应10 min。利用荧光分光光度计测量并记录体系溶液的荧光发射光谱和在发射波长为350 nm处的荧光发射强度。

（4）通过两次记录的荧光发射强度的变化值（I-I₀）和其对应的叶酸浓度（C：µM）可拟合得到线性方程，其中拟合的线性方程为I-I₀=15.64C-0.32，线性范围为0.10-20 µM，最低检出限为68.1 nM，R²值为0.992。因此可根据体系溶液中荧光强度的变化值（I-I₀）和拟合的线性方程可计算未知溶液或实际样品中叶酸的含量（C：µM）。

（5）本发明为验证该方法采用银-金属有机骨架材料作为荧光探针检测叶酸的灵敏度，进行了选择性和抗干扰能力的检验。结果表明该方法具有很好的选择性和很强的抗干扰能力，能够高灵敏性地检测叶酸。

（6）本发明还将该方法应用于人体血清和血浆实际样品中叶酸含量的分析检测并且得到了满意的加标回收率，说明该方法具有较高的实用性。

本发明中所述的银-金属有机骨架材料指的是：{[Ag₂(abtz)₂(ClO₄)] . (ClO₄)}；abtz指的是：1-（4-氨基苄基）-1, 2, 4,-苯***有机配体。

本发明采用银-金属有机骨架材料作为荧光探针检测叶酸的方法所具有的积极效果在于：

（1）本发明所采用的水稳定性高的银-金属有机骨架材料作为荧光探针，可避免复杂的修饰/功能化过程可直接作为探针去检测生物体液中的叶酸，操作快捷而又简便。

（2）本发明公开的基于银-金属有机骨架材料检测叶酸的荧光分析方法其拥有较宽的检测线性范围（0.10-20 µM）和较低的检出限（68.1 nM），具有良好的选择性、高的灵敏度和强的抗干扰能力等优势。

（3）本发明公开的分析方法能够很好的应用到人类血清和血浆实际样品中的分析检测，具有较高的实用性。

本发明所公开的分析方法还与先前的检测叶酸的不同方法进行了对比，其优势明显如下表1所示：

附图说明

图1是本发明中使用银-金属有机骨架材料的粉末衍射XRD图；

图2是酸性条件和碱性条件下的银-金属有机骨架材料的XRD图；

图3是本发明中使用银-金属有机骨架材料的荧光激发光谱图（曲线1）和荧光发射光谱图（曲线2）；

图4是本发明中叶酸的紫外吸收光谱图（曲线1）和银-金属有机骨架材料的荧光发射光谱图（曲线2）；

图5是本发明中不同浓度下银-金属有机骨架材料的荧光强度变化曲线（曲线1）和不同浓度下银-金属有机骨架材料的荧光猝灭效率曲线图（曲线2）；

图6是不同pH值对银-金属有机骨架材料荧光的效果图（曲线1）和不同pH值对银-金属有机骨架材料和叶酸混合体系的荧光猝灭的效果图（曲线2）；

图7是不同时间内叶酸对银-金属有机骨架材料荧光的猝灭效果图；

图8是不同浓度的叶酸对银-金属有机骨架材料的荧光猝灭光谱图；

图9是本发明中使用的银-金属有机骨架材料检测叶酸的线性拟合关系图；

图10是本发明中银-金属有机骨架材料应用于叶酸检测的选择性识别柱状图。

图11是本发明中银-金属有机骨架材料应用于叶酸检测的抗干扰能力的柱状图。

具体实施方式

通过下面的附图和具体实施方案来详细描述本发明。本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的试剂AgClO₄，***和甲醇购自于天津市光复精细化工研究所。1-（4-氨基苄基）-1, 2, 4,-苯***有机配体购自于西格玛奥德里奇贸易有限公司。三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）购自于北京鼎国生物技术有限公司。叶酸购自于北京伊诺凯科技有限公司。柠檬酸、多巴胺、葡萄糖、果糖、尿素均购自于天津市光复科技发展有限公司。所需的氨基酸（谷氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸）均购于天津市光复精细化工研究所，均为BR生化试剂，纯度为99%。

实施例1

银-金属有机骨架材料的制备：

（1）根据参考文献（Wang Y. Y.; Jin Q.; Liu S. X.; Guo C.; Liu Y. Y.; DingB.; Wu X. X.; Li Y.; Zhu Z. Z. RSC Adv., 2015, 5, 35238）所报道制备银-金属有机骨架材料的方法，称取20.72 mg AgClO₄和17.4 mg（1-（4-氨基苄基）-1, 2, 4,-苯***）有机配体分散在5 mL去离子水和5 mL甲醇中搅拌0.5-1 h。然后将混合溶液转移到具有聚四氟乙烯内胆的不锈钢高压反应釜中，在140-160℃的温度条件下加热10-15 h。最后经过60-80 h冷却至室温，将得到的产物用水和***洗涤多次，抽滤得到无色块状晶体，即{[Ag₂(abtz)₂(ClO₄)] . (ClO₄)}。

如附图1所示，将得到的实验粉末衍射XRD谱图与模拟的粉末衍射XRD谱图作对比，其衍射峰能够很好的吻合证实成功合成了纯相银-金属有机骨架材料。如附图2所示，可以看出该银-金属有机骨架材料在酸性和碱性条件下均能保持结构的稳定，说明具有良好的化学稳定性。

实施例2

标准储备溶液的配制

（1）100 mg L^-1银-金属有机骨架材料标准溶液：称取质量为0.0030 g的银-金属有机骨架材料，将其分散于30 mL去离子水中，超声分散5 min，放于阴暗处储藏待用；

（2）8 mM叶酸标准溶液：称取质量为0.1059 g的叶酸（Mr：441.4）将其溶于30 mL去离子水中摇匀使之完全溶解，并用去离子水分别稀释成一系列不同浓度（2 μM，10 μM，15 μM，20μM，50 μM，100 μM，150 μM，200 μM，400 μM）的叶酸标准溶液，放于阴暗处储藏待用；

（3）Tris-HCl标准缓冲溶液（25℃，100 mM）：分别称取质量为0.7780 g的三羟基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl，Mr=157.6）溶于50 mL的去离子水中摇匀使之完全溶解，用pH计调至pH分别为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.6，8.0，8.5，9.0的一系列不同pH值的Tris-HCl标准缓冲溶液，放于阴暗处储藏待用。

实施例3

银-金属有机骨架材料的荧光激发光谱和发射光谱的测定

依次分别向离心管中添加400 μL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 μL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀，最终体系溶液中银-金属有机骨架材料的浓度为10 mg L^-1。利用荧光分光光度计测量体系溶液的荧光激发光谱和荧光发射光谱；设置其发射波长为350 nm，激发狭缝和发射狭缝均为5 nm，光电倍增管电压600 V的条件下测量体系溶液的激发光谱图。然后设置激发波长为240 nm，激发狭缝和发射狭缝均为5 nm，光电倍增管电压720 V的条件下测定体系溶液的荧光发射光谱图。如附图3所示，曲线1为荧光激发光谱图，曲线2为荧光发射光谱图。结果表明本发明中的银-金属有机骨架材料的最佳激发波长为240 nm，荧光发射位置为350 nm。

实施例4

基于银-金属有机骨架材料的荧光发射光谱和叶酸的紫外吸收光谱图研究其猝灭机制

依次分别向离心管中添加400 μL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 μL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀。设置荧光分光光度计的激发波长为240 nm，激发狭缝和发射狭缝均为5 nm，光电倍增管电压为720 V，利用荧光分光光度计测量并记录此银-金属有机骨架材料体系溶液的荧光发射光谱图。同时，添加200 μL叶酸标准溶液（0.8 mM）至5 mL离心管中，用去离子水定容至4 mL混合均匀，利用紫外-可见吸收分光光度计测量其在200 nm至600 nm范围内的紫外吸收光谱图。如附图4所示，曲线1为叶酸的紫外吸收光谱，曲线2为银-金属有机骨架材料的荧光发射光谱。结果表明叶酸的紫外吸收光谱和银-金属有机骨架材料的荧光发射光谱之间存在光谱重叠（内滤效应），因此叶酸可以有效的猝灭银-金属有机骨架材料的发射荧光。

实施例5

确定银-金属有机骨架材料的最优检测浓度

（1）依次分别向不同的离心管中添加120 µL，200 µL，400 µL，600 µL，800 µL，1200 µL，1600 µL不等体积的银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），然后向这些不同的离心管中分别添加400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀，分别配制成一系列不同浓度的银金属有机骨架材料的悬浮液（3 mg L^-1，5 mg L^-1，10 mg L^-1，15 mg L^-1，20 mg L^-1，30 mg L^-1，40 mg L^-1），静置10 min。利用荧光分光光度计测量并记录其体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度。

（2）依次分别向不同的离心管中添加120 µL，200 µL，400 µL，600 µL，800 µL，1200 µL，1600 µL不等体积的银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），然后向这些不同的离心管中分别添加400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM）和200 µL叶酸标准溶液（0.8 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀，分别配制成一系列不同浓度（3 mg L^-1，5 mg L^-1，10 mg L^-1，15 mg L^-1，20 mg L^-1，30 mg L^-1，40 mg L^-1）的银-金属有机骨架材料的悬浮液，静置反应10 min。利用荧光分光光度计测量并记录其体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度。

（3）根据以上步骤（1）和（2）记录的荧光发射光谱和荧光发射强度可得到不同浓度的银-金属有机骨架材料的荧光强度变化曲线1和荧光猝灭效率变化曲线2。如附图5所示，曲线1显示随着银-金属有机骨架材料的浓度增加其荧光强度也逐渐增强，达到一定程度增加趋于缓慢。曲线2显示在不同浓度的银-金属有机骨架材料溶液中存在等浓度的叶酸条件下，其随着银-金属有机骨架材料的浓度增加而荧光猝灭效率逐渐降低。最终选择曲线1和曲线2的交点所对应的银-金属有机骨架材料的浓度为最佳测试浓度，在本申请中选择浓度为6-12 mg L^-1，优选8-10 mg L^-1。

实施例6

确定检测体系中的最优pH值

（1）依次分别向不同离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），然后分别向这些不同的离心管中添加400 µL不同pH值（5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.6，8.0，8.5，9.0）的Tris-HCl标准缓冲溶液（100 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀，分别配制成一系列不同pH值（5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.6，8.0，8.5，9.0）的银-金属有机骨架材料的悬浮液，静置10 min。利用荧光分光光度计测量并记录其体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度。

（2）依次分别向不同离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mgL^-1），然后依次分别向这些不同的离心管中添加400 µL不同pH值（5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.6，8.0，8.5，9.0）的Tris-HCl标准缓冲溶液（100 mM）和200 µL叶酸标准溶液（0.8 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀，分别配制成一系列不同pH值（5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.6，8.0，8.5，9.0）的银-金属有机骨架材料的悬浮液，静置反应10 min。利用荧光分光光度计测量并记录其体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度。

（3）根据以上步骤（1）和（2）记录的荧光发射光谱和荧光发射强度可得到不同pH值的银-金属有机骨架材料的荧光强度变化曲线1和荧光猝灭效率变化曲线2。如附图6所示，曲线1和曲线2显示了随着体系溶液pH值的增加其银-金属有机骨架材料溶液的荧光强度和荧光猝灭效率几乎保持不变。结果表明在不同pH环境中银-金属有机骨架材料具有良好的化学稳定性和荧光稳定性。最终根据人体体液pH环境选择pH 7.0作为最优测试条件。

实施例7

确定银-金属有机骨架材料荧光猝灭的稳定时间

依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），200 µL 叶酸标准溶液（0.8 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀。利用荧光分光光度计测量体系溶液在0-20 min内的荧光发射光谱和荧光发射强度。如附图7所示，结果表明添加叶酸后银-金属有机骨架材料的荧光强度立即降低至较低值，随着时间的推移，其荧光强度基本持平保持不变。最终选择荧光猝灭的最佳稳定时间为10 min。

实施例8

利用银-金属有机骨架材料检测叶酸

（1）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀，静置10 min。利用荧光分光光度计测量并记录其体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度（I₀）。

（2）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM）和200 µL一系列不同浓度（2 µM，10 µM，15 µM，20 µM，50 µM，100 µM，150 µM，200 µM，400 µM）的叶酸标准溶液，用去离子水分别定容至4 mL混合均匀，配制成一系列含不同浓度叶酸（0.1 µM，0.5 µM，0.75µM，1.0µM，2.5µM，5.0µM，7.5µM，10µM，20µM）的银-金属有机骨架材料的悬浮液，静置反应10 min。利用荧光分光光度计测定并记录其体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度（I）。

（2）如附图8所示，随着体系溶液中叶酸浓度的不断增加其荧光发射光谱和荧光发射强度整体呈现下降趋势。根据以上步骤（1）和（2）所记录的荧光发射强度（I₀）与荧光猝灭强度（I）作差得到猝灭的荧光强度差值（I-I₀），将其猝灭强度差值（I-I₀）和其对应的叶酸浓度进行线性拟合。如附图9所示，随着体系溶液中叶酸浓度的增加，其荧光猝灭强度差值（I-I₀）逐渐增大。在0.10-20 µM的浓度范围内，荧光猝灭强度差值（I-I₀）与叶酸的浓度呈现良好的线性关系，其线性方程为I-I₀=15.64C-0.32，最低检出限为68.1 nM，R²值为0.992。说明了本方法有较宽的线性范围和高的灵敏度。其详细的分析特征量如表2所示。

实施例9

银-金属有机骨架材料检测叶酸的选择性

（1）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀，静置10 min。利用荧光分光光度计测量并记录其溶液体系的荧光发射光谱和荧光发射强度（I₀）。

（2）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH=7.0，100 mM），然后分别向这些不同的离心管中分别添加200 µL相同浓度（0.8 mM）不同种类的有机分子（叶酸，柠檬酸，谷氨酸，多巴胺，苯丙氨酸，蛋氨酸，赖氨酸，葡萄糖，果糖，尿素，组氨酸，丝氨酸）的标准溶液，用去离子水定容至4 mL混合均匀，静置反应10 min。利用荧光分光光度计测量并记录体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度（I₁）。将含有有机分子的体系溶液的荧光发射强度（I₁）与空白体系溶液的荧光强度（I₀）作比值作为选择性参考标准。如附图10所示，结果表明只有叶酸会猝灭银-金属有机骨架材料的荧光，而其他有机分子几乎不会产生影响，此方法能够选择性地检测叶酸分子；

实施例10

银-金属有机骨架材料检测叶酸的抗干扰能力

（1）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），200 µL 叶酸标准溶液（0.8 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀，静置10 min。利用荧光分光光度计测量并记录其体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度（I₂）。

（2）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），200 µL 叶酸标准溶液（0.8 mM），然后再向这些不同的离心管中分别加入不同浓度的有机分子（柠檬酸，谷氨酸，多巴胺，苯丙氨酸，蛋氨酸，赖氨酸，葡萄糖，果糖，尿素，组氨酸，丝氨酸）的标准溶液，用去离子水定容至4 mL混合均匀，静置反应10 min。利用荧光分光光度计测量并记录体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度（I_n）。将含有有机分子和叶酸的混合体系溶液的荧光发射强度（I_n）与只含叶酸的空白体系溶液的荧光强度（I₂）作比值作为抗干扰能力的参考标准，其结果如附图11所示。表3中数据显示了该方法检测叶酸其对不同有机分子浓度的最大耐受程度，证明该银-金属有机骨架材料能够在其他干扰物质共存的情况下也能够灵敏地检测叶酸，该方法具有较强的抗干扰能力；

实施例11

基于银-金属有机骨架材料检测叶酸应用于实际样品的分析

（1）血清、血浆样品均收集于健康的志愿者，该实际样品经过离心机10000的转速离心处理10 min，除去杂质颗粒收集其上清液，待用。

（2）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀，静置10 min。利用荧光分光光度计测量并记录其体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度（I₀）。

（3）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），200 µL处理过的血清或血浆溶液，用去离子水定容至4 mL混合均匀，静置反应10 min。利用荧光分光光度计测量并记录体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度（I_a）。

（4）依次分别向离心管中添加400 µL银-金属有机骨架材料的悬浮液（100 mg L^-1），400 µL Tris-HCl标准缓冲溶液（pH 7.0，100 mM），200 µL处理过的血清或血浆溶液，200 µL 叶酸标准溶液（0.1 mM），用去离子水定容至4 mL混合均匀，静置反应10 min。利用荧光分光光度计测量并记录体系溶液的荧光发射光谱和荧光发射强度（I_b）。

（5）根据以上步骤（1）、（2）、（3）和（4），可得出其加入实际样品溶液后导致的荧光猝灭强度差值（I_a-I₀）和叶酸加标的实际样品导致的荧光猝灭强度差值（I_b-I₀）。将其以上两个荧光猝灭强度差值代入实施例8中的拟合线性方程中即可计算出溶液中含有叶酸的浓度和加标后的叶酸总浓度。如表4所示，该方法检测到其实际样品中的叶酸含量和加标回收率，证明该方法具有较高的实用性；