阅读说明：本技术 一种金纳米团簇-金纳米棒新型免疫传感器对睾酮的检测方法 (Method for detecting testosterone by using gold nanocluster-gold nanorod novel immunosensor ) 是由 丁伟华 孙斐 顾亚云 赵喜 李文清 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种金纳米团簇-金纳米棒新型免疫传感器对睾酮的检测方法,包括：步骤1、金纳米团簇(荧光供体)和金纳米棒(荧光受体)的制备；步骤2、金纳米团簇(荧光供体)和金纳米棒(荧光受体)分别修饰连接；步骤3、对睾酮分子的检测,金纳米团簇(荧光供体)与睾酮修饰连接,金纳米棒(荧光受体)与睾酮抗体修饰连接；该发明基于FRET机理设计新型免疫传感器,选用具有生物相容性、光学性能好、易于合成的金纳米团簇为荧光供体,选用LSPR峰可调的金纳米棒为荧光受体,将睾酮、睾酮抗体分别与金纳米团簇、金纳米棒进行连接,通过调控合成条件及进行功能修饰,提高两者间的FRET效率,实现对睾酮分子的特异性、高效性检测。(The invention discloses a method for detecting testosterone by a gold nanocluster-gold nanorod novel immunosensor, which comprises the following steps: step 1, preparing gold nanoclusters (fluorescence donors) and gold nanorods (fluorescence acceptors); step 2, respectively modifying and connecting the gold nanoclusters (fluorescence donors) and the gold nanorods (fluorescence acceptors); step 3, detecting testosterone molecules, namely modifying and connecting the gold nanoclusters (fluorescence donors) and testosterone, and modifying and connecting the gold nanorods (fluorescence acceptors) and testosterone antibodies; the invention designs a novel immunosensor based on FRET mechanism, selects gold nanoclusters with biocompatibility, good optical performance and easy synthesis as fluorescence donors, selects gold nanorods with adjustable LSPR peak as fluorescence acceptors, connects testosterone and testosterone antibodies with the gold nanoclusters and the gold nanorods respectively, improves FRET efficiency between the two by regulating synthesis conditions and performing functional modification, and realizes specificity and high-efficiency detection of testosterone molecules.)

一种金纳米团簇-金纳米棒新型免疫传感器对睾酮的检测 方法

技术领域

本发明属于激素检测分析技术技术领域，尤其涉及一种金纳米团簇-金纳米棒新型免疫传感器对睾酮的检测方法。

背景技术

睾酮，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用，是主要的内源性雄性激素。睾酮的浓度降低可能会引起多种不适，比如焦虑、急躁、性功能障碍、记忆力减退、腹部肥胖等；然而，睾酮水平过高也会引起多种疾病，如性早熟、肾上腺疾病、睾丸疾病等等。此外，睾酮作为一种性激素***在体育比赛中的滥用也成为人们关注的热点。因此，监测生物体液中的睾酮水平对临床、生化和运动内分泌学研究具有实际意义。

传统的检测手段，比如电化学分析法、原子光谱法、液相色谱法、放射性标记法等，由于操作复杂、灵敏度差等缺点，使得对睾酮分子的检测应用大大受限。随着生物工程技术的不断发展，生物传感器已被逐渐应用于环境检测、食品、工业和临床医学等领域。免疫传感器作为一种新兴的生物传感器，基于抗原与抗体特异性结合的原理，以其鉴定物质的高度特异性、敏感性和稳定性受到众多科研工作者青睐，它的问世使传统的免疫分析技术发生了很大变化。免疫传感器将生物传感技术与传统的免疫测试融为一体，集两者的诸多优点于一身，提高了检测灵敏度和精确度，不仅减少了分析时间，也使得测定过程变得简单，易于实现自动化，因此有着潜在的应用前景。

近年来，基于表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)的免疫传感器在生物、化学物质的分析和监测方面引起了人们的研究兴趣。然而，这类免疫传感器自身亦存在很多缺陷，比如对小分子物质的检测灵敏度较差。尽管Huang和Komatsu等人曾成功运用不同的纳米粒子提高了基于SPR免疫传感器对蛋白质分子和寡苷核酸的响应信号及灵敏度，但是这类传感器在对小分子的测定研究中并没有取得显著进展。

荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)是一种灵敏的光谱检测技术，是荧光共振能量通过长程偶极-偶极相互作用从作为供体的激发态荧光团向基态受体的非辐射能量转移过程，可用于研究均相体系中分子的结构变化。其中，最常用的技术之一是将荧光供体和受体分别与生物分子(比如抗原与抗体)结合使其发生特异性相互作用而成为一种“人工免疫传感器”。因此，基于FRET机理的免疫传感器对目标分子具有显著的特异性，在生物分析方面被认为是一种非常灵敏的检测方法。在此类免疫传感器中，检测方法的灵敏度主要取决于荧光供体与受体之间的FRET效率。而决定FRET效率的主要有以下两个因素：(1)荧光供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度；(2)供体分子与受体分子之间的空间距离。一般情况下，供体分子与受体分子发生FRET过程的最佳距离为2～9nm。因此，在实验设计中必须考虑尽可能缩短供体和受体之间的距离及提高供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度。

目前，基于FRET机理的免疫传感器用于生物分子的检测已被广泛报道。比如，Wang等人基于FRET机理设计了一种检测人血清蛋白(HSA)的均相免疫传感器，其中，分别将HSA抗原和抗体与两段DNA结合使其发生特异性作用，从而实现快速、精确地检测血清、尿液和唾液中的人血清蛋白。Bazan等人将荧光素连接到dsDNA的末端作为荧光供体，使其与有机聚合物分子发生FRET效应，通过荧光衰减动力学和荧光各向异性测试探究级联能量转移过程。在以上免疫传感器中，均是将有机染料和荧光蛋白作为荧光供体或受体。然而，此类免疫传感器存在很多缺陷，比如发射/吸收波长固定、稳定性差、有光漂白性等。为了克服以上不足，有学者考虑到将量子点材料作为荧光供体，因为量子点具有较高的量子产率、较强的光稳定性、窄的发射峰和宽的激发波长范围。比如，Cai等人选用CdTe量子点作为荧光供体，以量子点-溶菌酶与溶菌酶抗体-金纳米材料为免疫传感器，基于FRET机理对溶菌酶分子进行检测，检测限为33.43ng/mL。然而，量子点材料的潜在人体毒性及细胞毒性是其体外和体内应用的两个主要问题。因此，选择荧光性能好、稳定性好、易于合成、低毒或无毒的荧光供体和受体对于设计基于FRET机理的荧光免疫传感器至关重要。

发明内容

基于以上现有技术的不足，本发明所解决的技术问题在于提供一种金纳米团簇-金纳米棒新型免疫传感器对睾酮的检测方法，选用具有生物相容性、光学性能好、易于合成的金纳米团簇为荧光供体，选用LSPR峰可调的金纳米棒为荧光受体，将睾酮、睾酮抗体分别与金纳米团簇、金纳米棒进行连接，通过调控合成条件及进行功能修饰，提高两者间的FRET效率，实现对睾酮分子的特异性、高效性检测。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案来实现：本发明提供一种金纳米团簇-金纳米棒新型免疫传感器对睾酮的检测方法，包括：步骤1、金纳米团簇(荧光供体)和金纳米棒(荧光受体)的制备；步骤2、金纳米团簇(荧光供体)和金纳米棒(荧光受体)分别修饰连接；步骤3、对睾酮分子的检测，所述金纳米团簇(荧光供体)与睾酮修饰连接，所述金纳米棒(荧光受体)与睾酮抗体修饰连接；所述步骤3为：

1)混合，将同体积的金纳米团簇-睾酮溶液与睾酮抗体-金纳米棒溶液混合反应制备得混合液A；

2)混合液A荧光性能测试，检测不同条件下的荧光性能变化，选取荧光发射强度的变化绝对值最大时对应的检测条件，确定为最佳条件；

3)检测，将混合液A与睾酮分子溶液混合(待检测液)，在上述2)步骤中所述的最佳条件下进行检测，根据荧光发射强度与紫外可见吸收强度的变化求得睾酮浓度。

进一步的，所述金纳米团簇(荧光供体)的制备方法为：

步骤A1：将HAuCl₄(10.0mM)溶液水稀释，再加入谷胱甘肽(GSH)(10.0mM)，所述各组份HAuCl₄、水、谷胱甘肽的体积比为1:(1-2):(0.5-1)，在90℃、1200rpm搅拌下进行反应30-70分钟得反应溶液a1；

步骤A2：将反应溶液a1在11000rpm下离心分离20-40分钟得上清液a2；

步骤A3：将上清液a2用透析膜透析40-60小时去除未反应的有机物得金纳米团簇液体a3；

步骤A4：将金纳米团簇液体a3冷冻干燥后得到金纳米团簇(荧光供体)。

进一步的，所述金纳米棒(荧光受体)的制备方法：

步骤B1：在搅拌下冰冷油酸钠溶液加入到在CTAB溶液中制备的HAuCl₄溶液中，溶液黄色变为棕色，表明形成金种b1；

步骤B2：将金种b1老化1-3小时以使未反应的NaBH₄水解，将生长过程按比例放大以获得金纳米棒；

步骤B3：将0.1mM CTAB溶液，4mM硝酸银溶液，25mM HAuCl₄水溶液和1mM HCl溶液依次加入混合，然后向其中加入0.0788mM抗坏血酸作为还原剂，并通过搅拌使混合物均匀化，得到混合物b3；上述CTAB溶液、硝酸银溶液、HAuCl₄水溶液、HCl溶液、抗坏血酸的体积比为100：(5-10):(1-2):(0.6-2):(0.5-1.2)；

步骤B4：向上述混合物b3中加入体积比为的0.5-1.5％的金种，将整个溶液静置36小时后得到金纳米棒。

进一步的，所述金纳米团簇(荧光供体)与睾酮修饰连接为：

步骤C1：将金纳米团簇溶液加入含有PBS(0.01mol/L，pH 7.4)和4mg/mL EDC的混合溶液中制得混合溶液c1，并将混合溶液c1先搅拌5分钟，然后再搅拌20分钟来活化金纳米团簇上的游离羧酸基团；

步骤C2：将0.15mg/mL磺基-NHS加入到上述混合溶液c1中制得混合溶液c2，并将混合溶液c2搅拌20分钟；

步骤C3：将0.01mg/mL睾酮溶液加入到上述混合溶液c2中制得混合溶液c3，并在黑暗、37℃以下反应2小时后，将混合溶液c3在4℃下保存；上述各组份金纳米团簇溶液、PBS、EDC、磺基-NHS、睾酮溶液的体积比为1：3:(0.8-1.2)：(0.04-0.08)：(0.01-0.02)；

步骤C4：通过荧光光谱与紫外可见吸收光谱测试，得到的金纳米团簇-睾酮及睾酮抗体-金纳米棒体系的光谱重叠；实现金纳米团簇(荧光供体)与睾酮抗体修饰连接得到金纳米团簇-睾酮溶液；

所述金纳米棒(荧光受体)与睾酮抗体修饰连接为：

步骤D1：在磁力搅拌下，将10μg/mL睾酮抗体加入到47.8μg/mL金纳米棒中；搅拌10分钟后，加入3％PEG20000作为稳定剂制得混合物d1；所述各组份睾酮抗体、金纳米棒、PEG20000的体积比为：1:(50-85)：(0.13-0.4)；

步骤D2：将混合物d1搅拌15分钟并在4℃下储存，实现金纳米棒与睾酮抗体修饰连接，得到金纳米棒与睾酮抗体溶液。

由上，本发明具有如下有益效果：

本发明金纳米团簇-金纳米棒新型免疫传感器对睾酮的检测方法，选用具有生物相容性、光学性能好、易于合成的金纳米团簇为荧光供体，选用LSPR峰可调的金纳米棒为荧光受体，将睾酮、睾酮抗体分别与金纳米团簇、金纳米棒进行连接，通过调控合成条件及进行功能修饰，提高两者间的FRET效率，实现对睾酮分子的特异性、高效性检测：

1、借助当前制备及表征金纳米团簇、金纳米棒的方法手段，通过调控合成条件及选择保护配体类型，使金纳米团簇的发射光谱与金纳米棒的吸收光谱发生最大重叠，提高免疫传感器的FRET性能。

2、对金纳米团簇及金纳米棒的表面进行功能修饰，使其分别与睾酮、睾酮抗体进行有效连接，利用抗体与抗原特异性结合原理缩短供体与受体距离，进一步增强FRET效率。

3、对睾酮分子进行传感检测应用，通过探究最佳检测条件，实现对睾酮分子的灵敏、快速、特异性检测。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，并配合附图，详细说明如下。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。

图1为本发明的反应合成图。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式，其作为本说明书的一部分，通过实施例来说明本发明的原理，本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。在所参照的附图中，不同的图中相同或相似的部件使用相同的附图标号来表示。

参照图1，实施例一:

一种金纳米团簇-金纳米棒新型免疫传感器对睾酮的检测方法，包括：步骤1、金纳米团簇(荧光供体)和金纳米棒(荧光受体)的制备；步骤2、金纳米团簇(荧光供体)和金纳米棒(荧光受体)分别修饰连接；步骤3、对睾酮分子的检测，所述金纳米团簇(荧光供体)与睾酮修饰连接，所述金纳米棒(荧光受体)与睾酮抗体修饰连接；所述步骤3为：

1)混合，在常温、pH值为5.5的条件下，将同体积的金纳米团簇-睾酮溶液与睾酮抗体-金纳米棒溶液混合反应制备得混合液A；

2)混合液A荧光性能测试，检测不同条件下的荧光性能变化，选取荧光发射强度的变化绝对值最大时对应的检测条件，确定为最佳条件；

3)检测，将混合液A与睾酮分子溶液混合(待检测液)，在上述2)步骤中所述的最佳条件下进行检测，根据荧光发射强度与紫外可见吸收强度的变化求得睾酮浓度。

具体的，所述金纳米团簇(荧光供体)的制备方法为：

步骤A1：将HAuCl₄(10.0mM)溶液水稀释，再加入谷胱甘肽(GSH)(10.0mM)，所述各组份HAuCl₄、水、谷胱甘肽的体积比为1:1:0.5，在90℃、1200rpm搅拌下进行反应30分钟得反应溶液a1；

步骤A2：将反应溶液a1在11000rpm下离心分离20-分钟得上清液a2；

步骤A3：将上清液a2用透析膜透析40小时去除未反应的有机物得金纳米团簇液体a3；

步骤A4：将金纳米团簇液体a3冷冻干燥后得到在840nm处荧光的金纳米团簇(荧光供体)。

具体的，所述金纳米棒(荧光受体)的制备方法：

步骤B1：在搅拌下冰冷油酸钠溶液加入到在CTAB溶液中制备的HAuCl₄溶液中，溶液黄色变为棕色，表明形成金种b1；

步骤B2：将金种b1老化1小时以使未反应的NaBH₄水解，将生长过程按比例放大以获得金纳米棒；

步骤B3：将0.1mM CTAB溶液，4mM硝酸银溶液，25mM HAuCl₄水溶液和1mM HCl溶液依次加入混合，然后向其中加入0.0788mM抗坏血酸作为还原剂，并通过搅拌使混合物均匀化，得到混合物b3；上述CTAB溶液、硝酸银溶液、HAuCl₄水溶液、HCl溶液、抗坏血酸的体积比为100：5:1:0.6:0.5；

步骤B4：向上述混合物b3中加入体积比为的0.5％的金种，将整个溶液静置36小时后得到在842nm处的金纳米棒。

具体的，所述金纳米团簇(荧光供体)与睾酮修饰连接为：

步骤C1：将金纳米团簇溶液加入含有PBS(0.01mol/L，pH 7.4)和4mg/mLEDC的混合溶液中制得混合溶液c1，并将混合溶液c1搅拌5分钟，然后再搅拌20分钟来活化金纳米团簇上的游离羧酸基团；

步骤C2：将0.15mg/mL磺基-NHS加入到混合溶液c1中制得混合溶液c2，并将混合溶液c2再搅拌20分钟；

步骤C3：将0.01mg/mL睾酮溶液加入到上述混合溶液c2中制得混合溶液c3，并在黑暗、37℃以下反应2小时后，将混合溶液c3在4℃下保存，上述各组份金纳米团簇溶液、PBS、EDC、磺基-NHS、睾酮溶液的体积比为1:3:0.8:0.04:0.01；

步骤C4：通过荧光光谱与紫外可见吸收光谱测试，得到的金纳米团簇-睾酮及睾酮抗体-金纳米棒体系的光谱重叠；实现金纳米团簇(荧光供体)与睾酮抗体修饰连接得到金纳米团簇-睾酮溶液；

所述金纳米棒与睾酮抗体修饰连接为：

步骤D1：在磁力搅拌下，将10μg/mL睾酮抗体加入到47.8μg/mL金纳米棒中；搅拌10分钟后，加入3％PEG20000作为稳定剂混合物d1；所述各组份睾酮抗体、金纳米棒、PEG20000的体积比为：1:50：0.13；

步骤D2：将混合物d1搅拌15分钟并在4℃下储存，实现金纳米棒与睾酮抗体修饰连接，得到金纳米棒与睾酮抗体溶液。

实施例二:

一种金纳米团簇-金纳米棒新型免疫传感器对睾酮的检测方法，包括：步骤1、金纳米团簇(荧光供体)和金纳米棒(荧光受体)的制备；步骤2、金纳米团簇(荧光供体)和金纳米棒(荧光受体)分别修饰连接；步骤3、对睾酮分子的检测，所述金纳米团簇(荧光供体)与睾酮修饰连接，所述金纳米棒(荧光受体)与睾酮抗体修饰连接；所述步骤3为：

2)混合，在常温、PH值为6的条件下，将同体积的金纳米团簇-睾酮溶液与睾酮抗体-金纳米棒溶液混合反应制备得混合液A；

2)混合液A荧光性能测试，检测不同条件下的荧光性能变化，选取荧光发射强度的变化绝对值最大时对应的检测条件，确定为最佳条件；

3)检测，将混合液A与睾酮分子溶液混合(待检测液)，在上述2)步骤中所述的最佳条件下进行检测，根据荧光发射强度与紫外可见吸收强度的变化求得睾酮浓度。

具体的，所述金纳米团簇(荧光供体)的制备方法为：

步骤A1：将HAuCl₄(10.0mM)溶液水稀释，再加入谷胱甘肽(GSH)(10.0mM)，所述各组份HAuCl₄、水、谷胱甘肽的体积比为1:1.5:0.8，在90℃、1200rpm搅拌下进行反应50分钟得反应溶液a1；

步骤A2：将反应溶液a1在11000rpm下离心分离30分钟得上清液a2；

步骤A3：将上清液a2用透析膜透析50小时去除未反应的有机物得金纳米团簇液体a3；

步骤A4：将金纳米团簇液体a3冷冻干燥后得到在750nm处荧光的金纳米团簇(荧光供体)。

具体的，所述金纳米棒(荧光受体)的制备方法：

步骤B1：在搅拌下冰冷油酸钠溶液加入到在CTAB溶液中制备的HAuCl₄溶液中，溶液黄色变为棕色，表明形成金种b1；

步骤B2：将金种b1老化2小时以使未反应的NaBH₄水解，将生长过程按比例放大以获得金纳米棒；

步骤B3：将0.1mM CTAB溶液，4mM硝酸银溶液，25mM HAuCl₄水溶液和1mM HCl溶液依次加入混合，然后向其中加入0.0788mM抗坏血酸作为还原剂，并通过搅拌使混合物均匀化，得到混合物b3；上述CTAB溶液、硝酸银溶液、HAuCl₄水溶液、HCl溶液、抗坏血酸的体积比为100：8:1.5:1.2:0.9；

步骤B4：向上述混合物b3中加入体积比为的1.1％的金种，将整个溶液静置36小时后得到在745nm处的金纳米棒。

具体的，所述金纳米团簇(荧光供体)与睾酮修饰连接为：

步骤C1：将金纳米团簇溶液加入含有PBS(0.01mol/L，pH 7.4)和4mg/mLEDC的混合溶液中制得混合溶液c1，并将混合溶液c1搅拌5分钟，然后再搅拌20分钟来活化金纳米团簇上的游离羧酸基团；

步骤C2：将0.15mg/mL磺基-NHS加入到混合溶液c1中制得混合溶液c2，并将混合溶液c2再搅拌20分钟；

步骤C3：将0.01mg/mL睾酮溶液加入到上述混合溶液c2中制得混合溶液c3，并在黑暗、37℃以下反应2小时后，将混合溶液c3在4℃下保存，上述各组份金纳米团簇溶液、PBS、EDC、磺基-NHS、睾酮溶液的体积比为1:3:1:0.06:0.015；

步骤C4：通过荧光光谱与紫外可见吸收光谱测试，得到的金纳米团簇-睾酮及睾酮抗体-金纳米棒体系的光谱重叠；实现金纳米团簇(荧光供体)与睾酮抗体修饰连接得到金纳米团簇-睾酮溶液；

所述金纳米棒与睾酮抗体修饰连接为：

步骤D1：在磁力搅拌下，将10μg/mL睾酮抗体加入到47.8μg/mL金纳米棒中；搅拌10分钟后，加入3％PEG20000作为稳定剂混合物d1；所述各组份睾酮抗体、金纳米棒、PEG20000的体积比为：1:65：0.22；

步骤D2：将混合物d1搅拌15分钟并在4℃下储存，实现金纳米棒与睾酮抗体修饰连接，得到金纳米棒与睾酮抗体溶液。

实施例三：

一种金纳米团簇-金纳米棒新型免疫传感器对睾酮的检测方法，包括：步骤1、金纳米团簇(荧光供体)和金纳米棒(荧光受体)的制备；步骤2、金纳米团簇(荧光供体)和金纳米棒(荧光受体)分别修饰连接；步骤3、对睾酮分子的检测，所述金纳米团簇(荧光供体)与睾酮修饰连接，所述金纳米棒(荧光受体)与睾酮抗体修饰连接；所述步骤3为：

3)混合，在常温、PH值为7的条件下，将同体积的金纳米团簇-睾酮溶液与睾酮抗体-金纳米棒溶液混合反应制备得混合液A；

2)混合液A荧光性能测试，检测不同条件下的荧光性能变化，选取荧光发射强度的变化绝对值最大时对应的检测条件，确定为最佳条件；

3)检测，将混合液A与睾酮分子溶液混合(待检测液)，在上述2)步骤中所述的最佳条件下进行检测，根据荧光发射强度与紫外可见吸收强度的变化求得睾酮浓度。

具体的，所述金纳米团簇(荧光供体)的制备方法为：

步骤A1：将HAuCl₄(10.0mM)溶液水稀释，再加入谷胱甘肽(GSH)(10.0mM)，所述各组份HAuCl₄、水、谷胱甘肽的体积比为1:2:1，在90℃、1200rpm搅拌下进行反应70分钟得反应溶液a1；

步骤A2：将反应溶液a1在11000rpm下离心分离40分钟得上清液a2；

步骤A3：将上清液a2用透析膜透析60小时去除未反应的有机物得金纳米团簇液体a3；

步骤A4：将金纳米团簇液体a3冷冻干燥后得到在690nm处荧光的金纳米团簇(荧光供体)。

具体的，所述金纳米棒(荧光受体)的制备方法：

步骤B1：在搅拌下冰冷油酸钠溶液加入到在CTAB溶液中制备的HAuCl₄溶液中，溶液黄色变为棕色，表明形成金种b1；

步骤B2：将金种b1老化3小时以使未反应的NaBH₄水解，将生长过程按比例放大以获得金纳米棒；

步骤B3：将0.1mM CTAB溶液，4mM硝酸银溶液，25mM HAuCl₄水溶液和1mM HCl溶液依次加入混合，然后向其中加入0.0788mM抗坏血酸作为还原剂，并通过搅拌使混合物均匀化，得到混合物b3；上述CTAB溶液、硝酸银溶液、HAuCl₄水溶液、HCl溶液、抗坏血酸的体积比为100：10:2:2:1.2；

步骤B4：向上述混合物b3中加入体积比为的1.5％的金种，将整个溶液静置36小时后得到在701nm处的金纳米棒。

具体的，所述金纳米团簇(荧光供体)与睾酮修饰连接为：

步骤C1：将金纳米团簇溶液加入含有PBS(0.01mol/L，pH 7.4)和4mg/mLEDC的混合溶液中制得混合溶液c1，并将混合溶液c1搅拌5分钟，然后再搅拌20分钟来活化金纳米团簇上的游离羧酸基团；

步骤C2：将0.15mg/mL磺基-NHS加入到混合溶液c1中制得混合溶液c2，并将混合溶液c2再搅拌20分钟；

步骤C3：将0.01mg/mL睾酮溶液加入到上述混合溶液c2中制得混合溶液c3，并在黑暗、37℃以下反应2小时后，将混合溶液c3在4℃下保存，上述各组份金纳米团簇溶液、PBS、EDC、磺基-NHS、睾酮溶液的体积比为1:3:1.2：0.08：0.02；

步骤C4：通过荧光光谱与紫外可见吸收光谱测试，得到的金纳米团簇-睾酮及睾酮抗体-金纳米棒体系的光谱重叠；实现金纳米团簇(荧光供体)与睾酮抗体修饰连接得到金纳米团簇-睾酮溶液；

所述金纳米棒与睾酮抗体修饰连接为：

步骤D1：在磁力搅拌下，将10μg/mL睾酮抗体加入到47.8μg/mL金纳米棒中；搅拌10分钟后，加入3％PEG20000作为稳定剂混合物d1；所述各组份睾酮抗体、金纳米棒、PEG20000的体积比为：1:85：0.4；

步骤D2：将混合物d1搅拌15分钟并在4℃下储存，实现金纳米棒与睾酮抗体修饰连接，得到金纳米棒与睾酮抗体溶液。

综上所述，该检测方法，考虑到FRET性能的影响因素，选用合成简单、荧光性能更好、尺寸更小、具有生物相容性的金纳米团簇作为荧光供体，以最大吸收峰位置可调的金纳米棒作为受体。该检测方法拓宽了此类免疫传感器中荧光供体与受体的波长重叠范围，使供体与受体分子的合成更加灵活，也为此类免疫传感器在更多应用领域中的研究提供了新思路。

同时，该检测方法利用抗体-抗原特异性结合原理，将睾酮、睾酮抗体分别与金/银纳米团簇、金纳米棒进行修饰连接，实现对睾酮分子的高效、特异性检测。

以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。