阅读说明：本技术 一种测定蛋白质或多肽相对含量的方法 (Method for determining relative content of protein or polypeptide ) 是由 赵海义 华权高 李立 周璀 陈亚运 鲁思琴 舒芹 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种测定蛋白质或多肽相对含量的方法,所述方法将样品经过前处理成多肽样品后,往多肽样品中加入参考肽,进行液相色谱-平行反应监测质谱测试,用参考肽做多肽样品定量输出值的归一化标准,得到所述多肽样品相对于所述参考肽的相对含量。本发明的有益效果在于(1)PRM相对定量实验流程简单易操作,能够普遍应用于常规的蛋白或多肽检测项目,不需要花费较长的优化步骤。(2)外加参考肽段不受样品内源性因素的干扰,且不受管家蛋白在不同实验处理条件下表达量不准确的影响以及多肽等样本实验设计的限制；(3)不需要额外合成同位素标记内参肽段,方法建立快速简便,投入小。(The invention provides a method for determining the relative content of protein or polypeptide, which comprises the steps of preprocessing a sample into a polypeptide sample, adding reference peptide into the polypeptide sample, carrying out liquid chromatography-parallel reaction monitoring mass spectrometry, and using the reference peptide as a normalization standard of a quantitative output value of the polypeptide sample to obtain the relative content of the polypeptide sample relative to the reference peptide. The invention has the beneficial effects that (1) the PRM is simple and easy to operate relative to a quantitative experimental process, can be generally applied to conventional protein or polypeptide detection items, and does not need to spend long optimization steps. (2) The additional reference peptide segment is not interfered by endogenous factors of the sample and is not influenced by inaccurate expression of housekeeping protein under different experimental treatment conditions and is not limited by experimental design of samples such as polypeptide and the like; (3) no need of additional synthesis of isotope labeled reference peptide segment, quick and simple method establishment and small investment.)

一种测定蛋白质或多肽相对含量的方法

技术领域

本领域为蛋白质或多肽定量分析领域，具体涉及一种测定蛋白质或多肽相对含量的方法。

背景技术

HPLC-MS/MS靶向定量技术主要是指根据已知或假设的目标，有针对性地设置仪器参数进行采集，对满足设置的离子进行信号记录，去除目标无关的信号干扰，最后通过数据整理和分析获取定量结果的监测技术,对蛋白/多肽进行HPLC-MS/MS靶向定量可以实现对细胞、组织或给定时间的生物体体内的目标蛋白/多肽的含量变化。

基于不同的检测条件、实验目的和应用范围，HPLC-MS/MS靶向定量技术主要有单反应监测技术(SRM)、多反应监测技术(MRM)及最近逐渐受到关注，并越来越多应用在蛋白/多肽检测领域的平行反应监测技术(PRM),传统SRM/MRM技术基于三重四极杆检测器低分辨的检测性能，只能检测有限的前体离子和子离子对，通量有限。检测过程需要大量的时间优化检测条件，且结果仅能用于定量。

常见的靶向定量技术中，为了得到用于定量结果归一化矫正的标准，常用的手段是通过化学合成的方式合成目标肽段的稳定同位素标记形式。通过标记合成，在肽段中引入稳定同位素标记(如2H、13C、15N、18O)，使得在同一次质谱扫描中标记“轻”和“重”同位素的多肽具有相同的色谱行为和离子化效率，成对出现的质谱峰信号的相对强度可以精确地反映样品中多肽的丰度比例(蛋白质的比例)，具有良好的定量可靠性；通过化学合成法得到标准肽段，虽然定量准确性非常高，但需要花费时间寻找检测效果良好、重现性高的特异性肽段，实验过程及合成阶段的时间周期往往很长。并且一次实验中，往往需要合成多条目标肽段的同位素标记形式，额外的金费支出也使研究成本变得更大。

除此之外，样品上机检测定量分析时，为了纠正实验过程中蛋白定量、实验、上机分析造成的目标物表达量差异，往往需要合适的质控手段加以控制。对于蛋白或多肽样品检测时，通常在样品提取等前处理步骤后进行蛋白或多肽的定量质控。但由于定量手段的技术缺陷，往往还会在实验过程中，选择合适的内参蛋白或肽段进行上样量的校正以达到更精准的研究目的，而研究不同类型的样本，不同的实验设计要求，对内参的选择会遇到不同的限制。常见的手法是基于管家蛋白通常执行大量的基本功能，能持续地在组织和细胞内高水平地表达而挑选管家蛋白的特异性肽段进行校正。但在一些特殊的样品中，如某些多肽样品的含量检测，很难通过管家蛋白的含量进行校正。

发明内容

为解决传统检测方法检测通量小，成本高，测试时间长以及现有内参蛋白或肽段难以适应所有样品的技术缺陷，本发明提供一种测定蛋白质或多肽相对含量的方法。

具体技术方案如下：

步骤一，往多肽样品中加入已知量的参考肽或含所述参考肽的蛋白质试剂，得到所述处理样品，所述参考肽响应稳定且不受内源信号干扰，所述参考肽包括一个或多个肽段；

步骤二，将所述处理样品进行脱盐处理，得到检测样品；

步骤三，根据所述检测样品的目标多肽的序列信息，通过skyline软件设计平行反应监测模式检测方法，选取所述步骤一中的所述参考肽的一个或多个肽段的质荷比及所述检测样品的目标肽段质荷比加入到inclusion list中建立质谱采集方法；

步骤四，按所述步骤三质谱采集方法对所述检测样品进行液相-质谱检测，根据检测结果进一步筛选蛋白肽段，采用平行反应监测模式对所筛选的蛋白肽段进行扫描，将所筛选的蛋白肽段打碎得到二级离子图谱，所筛选的蛋白肽段包括所述步骤三中参考肽的一个或多个肽段；

步骤五：将步骤四所得数据进行分析，对每个肽段进行定量，输出所述检测样品蛋白肽段的保留时间与峰强度关系的图形，用所述步骤四中参考肽的一个肽段图形面积或多个肽段的图形面积平均值做多肽样品定量输出值的归一化标准，得到所述多肽样品相对于所述参考肽的相对含量；

其中，所述参考肽从β-半乳糖苷酶中选取；所述含参考肽的蛋白质为β-半乳糖苷酶试剂。

上述技术方案中，所述步骤一中，还包括多肽样品的制备，所述多肽样品的制备包括如下步骤：

S1-1，实验样品经过蛋白brandford定量或细胞计算质控，取等量或等体积样品加入多肽提取裂解液进行裂解后离心，选取上清液；

S1-2，将所述上清液加入还原剂进行还原反应，得到还原样品；

S1-3，将还原样品加入烷基化试剂进行烷基化反应，得到初样品；

S1-4，将所述初样品进行超滤机离心处理，得到所述多肽样品。

上述技术方案中，所述参考肽包括第一参考肽片段、第二参考肽片段、第三参考肽片段、第四参考肽片段及第五参考肽片段中的一种或几种，所述第一参考肽片段质荷比为563.2784，所述第二参考肽片段质荷比为719.3682，所述第三参考肽片段质荷比为832.4523，所述第四参考肽片段质荷比为1061.5222，所述第五参考肽片段质荷比为1176.5491。

上述技术方案中，所述参考肽图形面积为所述第一参考肽段的图形面积、第二参考肽段的图形面积、第三参考肽片段的图形面积、第四参考肽片段的图像面积及第五参考肽片段的图形面积的平均值。

上述技术方案中，所述β-半乳糖苷酶试剂为AB Sciex LC/MSPeptideCalibration Kit。

上述技术方案中，所述β-半乳糖苷酶试剂为加入量为15～30fmol，加入体积为1.2～2.2uL。

上述技术方案中，所述步骤二中，所述处理样品经过C18柱脱盐得到所述检测样品。

上述技术方案中，所述步骤四中，所述检测样品首先到C18捕获柱，洗脱液以250nL/min～350nL/min的流速从C18分析柱上进行梯度洗脱，所述洗脱液的水相由质量百分比为1％～2.5％乙腈、0.05％～0.2％的甲酸及98％～98.5％的H₂O组成，所述洗脱液的有机相由质量百分比为98％～98.5％的乙腈、0.05％～0.2％的甲酸及1％～2.5％的H₂O组成。

上述技术方案中，所述步骤四中，蛋白肽段的筛选经质谱信息依赖性采集所得，质谱条件设置为：以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以100ms的离子累积时间采集30个前体离子的二级质谱图，在350-1500m/z的范围内进行MS¹采集，并且在100-1500m/z的范围内进行MS²采集，前体离子动态排除时间设置为15s。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于(1)PRM相对定量实验流程简单易操作，能够普遍应用于常规的蛋白或多肽检测项目，不需要花费较长的优化步骤。(2)外加参考肽段不受样品内源性因素的干扰，且不受管家蛋白在不同实验处理条件下表达量不准确的影响以及多肽等样本实验设计的限制；(3)不需要额外合成同位素标记内参肽段，方法建立快速简便，投入小。

附图说明

图1实施例八skyline可视化结果展示。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

术语所述“PRM(平行反应监测技术)”是基于Q-Orbitrap和Q-TOF为代表的高分辨、高精度质谱平台，利用四级杆质量分析器的选择能力，用Q1选择目标肽段的母离子，利用Orbitrap或TOF高分辨质谱分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片信息，即可对复杂样本中的目标蛋白/肽段进行准确而特异的分析和定量。由于借助高分辨的质谱分析器，PRM相对于传统的SRM/MRM来说检测通量更高，可以同步对列表中多达100个的前体离子全部进行二级碎裂，检测结果既可以用于定量，也可以用于数据库检索，实现定量。

实施例一

1.1多肽样品的制备

实验样品经过蛋白brandford定量或细胞计算质控，取等量或等体积样品加入多肽提取裂解液(8M urea/100mM TEAB,pH 8.0,1mM PMSF/2mM EDTA)，混匀后冰上孵育5min，加入终浓度为l0mM的DTT，冰浴超声15min，然后13000g，4℃离心30min，取上清转入新的离心管中；向离心管中加入DTT至终浓度10mM，56℃水浴30min进行还原反应，得到还原样品。随后，加入IAM至终浓度55mM，暗处室温放置30min进行烷基化反应，得到初样品，用10kD超滤管处理，10000g，4℃离心30min，收集穿透液，即为多肽样品。

1.2检测样品的制备

往多肽样品中加入量为2uL的25fmol的β-半乳糖苷酶试剂，得到处理样品，将处理样品进一步通过C18柱脱盐，真空冷冻干燥脱盐，得到检测样品。

1.3检测方法的设立

根据所述检测样品的目标多肽的序列信息，通过skyline软件设计平行反应监测模式检测方法，以所述参考肽质荷比及所述检测样品的目标肽段质荷比加入到inclusionlist中建立质谱采集方法；

所述参考肽包括第一参考肽片段、第二参考肽片段、第三参考肽片段、第四参考肽片段及第五参考肽片段，所述第一参考肽片段质荷比为563.2784，所述第二参考肽片段质荷比为719.3682，所述第三参考肽片段质荷比为832.4523，所述第四参考肽片段质荷比为1061.5222，所述第五参考肽片段质荷比为1176.5491。

1.4上机检测

检测样品用10μl Loading Buffer(0.1％甲酸,3％乙腈)进行溶解，离心后取上清点样。样品经过LC-MS/MS系统(ekspert nanoLC；AB Sciex TripleTOF 5600-plus)进行检测，然后对结果进行分析。样品首先到C18捕获柱(5μm，100μm×20mm)上，以300nL/min的流速从C18分析柱(3μm，75μm×150mm)上进行梯度洗脱。

两个流动相分别是水相BufferA(2％乙腈/0.1％甲酸/98％H₂O)和有机相BufferB(98％乙腈/0.1％甲酸/2％H₂O)。IDA(信息依赖性采集)检测时，以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以100ms的离子累积时间采集30个前体离子的二级质谱图。在350-1500m/z的范围内进行MS¹采集，并且在100-1500m/z的范围内进行MS²采集。前体离子动态排除时间设置为15s。

根据IDA检测结果进一步筛选蛋白肽段，采用平行反应监测模式对所筛选的蛋白肽段进行扫描，将所筛选的蛋白肽段打碎得到二级离子图谱，所筛选蛋白肽段包括所述参考肽。

1.5数据分析

下机后，数据导入Skyline软件建立的谱图库(spectra library)中，对每个肽段进行定量，输出所述检测样品蛋白肽段的保留时间与峰强度关系的图形，用所述参考肽的图形面积做多肽样品定量输出值的归一化标准，得到所述多肽样品相对于所述参考肽的相对含量；所述参考肽图形面积为所述第一参考肽段的图形面积、第二参考肽段的图形面积、第三参考肽片段的图形面积、第四参考肽片段的图像面积及第五参考肽片段的图形面积的平均值。

实施例二

2.1多肽样品的制备

实验样品经过蛋白brandford定量或细胞计算质控，取等量或等体积样品加入多肽提取裂解液(8M urea/100mM TEAB,pH 8.0,1mMPMSF/2mM EDTA)，混匀后冰上孵育5min，加入终浓度为l0mM的DTT，冰浴超声15min，然后13000g，4℃离心30min，取上清转入新的离心管中；向离心管中加入DTT至终浓度10mM，56℃水浴30min进行还原反应，得到还原样品。随后，加入IAM至终浓度55mM，暗处室温放置30min进行烷基化反应，得到初样品，用10kD超滤管处理，10000g，4℃离心30min，收集穿透液，即为多肽样品。2.2检测样品的制备

往多肽样品中加入量为2uL的25fmol的β-半乳糖苷酶试剂，得到处理样品，将处理样品进一步通过C18柱脱盐，真空冷冻干燥脱盐，得到检测样品。

2.3检测方法的设立

根据所述检测样品的目标多肽的序列信息，通过skyline软件设计平行反应监测模式检测方法，以所述参考肽质荷比及所述检测样品的目标肽段质荷比加入到inclusionlist中建立质谱采集方法；

所述参考肽包括第一参考肽片段、第二参考肽片段、第三参考肽片段、第四参考肽片段及第五参考肽片段，所述第一参考肽片段质荷比为563.2784，所述第二参考肽片段质荷比为719.3682，所述第三参考肽片段质荷比为832.4523，所述第四参考肽片段质荷比为1061.5222，所述第五参考肽片段质荷比为1176.5491。

2.4上机检测

检测样品用10μl Loading Buffer(0.1％甲酸,3％乙腈)进行溶解，离心后取上清点样。样品经过LC-MS/MS系统(ekspert nanoLC；ABSciex TripleTOF 5600-plus)进行检测，然后对结果进行分析。样品首先到C18捕获柱(5μm，100μm×20mm)上，以300nL/min的流速从C18分析柱(3μm，75μm×150mm)上进行梯度洗脱。

两个流动相分别是水相BufferA(2％乙腈/0.1％甲酸/98％H₂O)和有机相BufferB(98％乙腈/0.1％甲酸/2％H₂O)。IDA(信息依赖性采集)检测时，以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以100ms的离子累积时间采集30个前体离子的二级质谱图。在350-1500m/z的范围内进行MS¹采集，并且在100-1500m/z的范围内进行MS²采集。前体离子动态排除时间设置为15s。

根据IDA检测结果进一步筛选蛋白肽段，采用平行反应监测模式对所筛选的蛋白肽段进行扫描，将所筛选的蛋白肽段打碎得到二级离子图谱，所筛选蛋白肽段包括所述第一参考肽片段。

2.5数据分析

下机后，数据导入Skyline软件建立的谱图库(spectra library)中，对每个肽段进行定量，输出所述检测样品蛋白肽段的保留时间与峰强度关系的图形，用所述第一参考肽片段的图形面积做多肽样品定量输出值的归一化标准，得到所述多肽样品相对于所述参考肽的相对含量。

实施例三

3.1多肽样品的制备

实验样品经过蛋白brandford定量或细胞计算质控，取等量或等体积样品加入多肽提取裂解液(8M urea/100mM TEAB,pH 8.0,1mM PMSF/2mM EDTA)，混匀后冰上孵育5min，加入终浓度为l0mM的DTT，冰浴超声15min，然后13000g，4℃离心30min，取上清转入新的离心管中；向离心管中加入DTT至终浓度10mM，56℃水浴30min进行还原反应，得到还原样品。随后，加入IAM至终浓度55mM，暗处室温放置30min进行烷基化反应，得到初样品，用10kD超滤管处理，10000g,4℃离心30min,收集穿透液，即为多肽样品。

3.2检测样品的制备

往多肽样品中加入量为2uL的25fmol的β-半乳糖苷酶试剂，得到处理样品，将处理样品进一步通过C18柱脱盐，真空冷冻干燥脱盐，得到检测样品。

3.3检测方法的设立

根据所述检测样品的目标多肽的序列信息，通过skyline软件设计平行反应监测模式检测方法，以所述参考肽质荷比及所述检测样品的目标肽段质荷比加入到inclusionlist中建立质谱采集方法；

所述参考肽包括第一参考肽片段、第二参考肽片段、第三参考肽片段、第四参考肽片段及第五参考肽片段，所述第一参考肽片段质荷比为563.2784，所述第二参考肽片段质荷比为719.3682，所述第三参考肽片段质荷比为832.4523，所述第四参考肽片段质荷比为1061.5222，所述第五参考肽片段质荷比为1176.5491。

3.4上机检测

检测样品用10μl Loading Buffer(0.1％甲酸,3％乙腈)进行溶解，离心后取上清点样。样品经过LC-MS/MS系统(ekspert nanoLC；ABSciex TripleTOF 5600-plus)进行检测，然后对结果进行分析。样品首先到C18捕获柱(5μm，100μm×20mm)上，以300nL/min的流速从C18分析柱(3μm，75μm×150mm)上进行梯度洗脱。

两个流动相分别是水相BufferA(2％乙腈/0.1％甲酸/98％H₂O)和有机相BufferB(98％乙腈/0.1％甲酸/2％H₂O)。IDA(信息依赖性采集)检测时，以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以100ms的离子累积时间采集30个前体离子的二级质谱图。在350-1500m/z的范围内进行MS¹采集，并且在100-1500m/z的范围内进行MS²采集。前体离子动态排除时间设置为15s。

根据IDA检测结果进一步筛选蛋白肽段，采用平行反应监测模式对所筛选的蛋白肽段进行扫描，将所筛选的蛋白肽段打碎得到二级离子图谱，所筛选蛋白肽段包括所述参考肽，所述参考肽包括第一参考肽片段、第二参考肽片段、第三参考肽片段、第四参考肽片段及第五参考肽片段。

3.5数据分析

下机后，数据导入Skyline软件建立的谱图库(spectra library)中，对每个肽段进行定量，输出所述检测样品蛋白肽段的保留时间与峰强度关系的图形，并将检测样品目标肽段的数据与参考肽数据进行比对，选用所述第二参考肽段的图形面积做多肽样品定量输出值的归一化标准，得到所述多肽样品相对于所述参考肽的相对含量。

实施例四

4.1多肽样品的制备

实验样品经过蛋白brandford定量或细胞计算质控，取等量或等体积样品加入多肽提取裂解液(8M urea/100mM TEAB,pH 8.0,1mM PMSF/2mM EDTA)，混匀后冰上孵育5min，加入终浓度为l0mM的DTT，冰浴超声15min，然后13000g，4℃离心30min，取上清转入新的离心管中；向离心管中加入DTT至终浓度10mM，56℃水浴30min进行还原反应，得到还原样品。随后，加入IAM至终浓度55mM，暗处室温放置30min进行烷基化反应，得到初样品，用10kD超滤管处理，10000g,4℃离心30min,收集穿透液，即为多肽样品。

4.2检测样品的制备

往多肽样品中加入量为2uL的25fmol的β-半乳糖苷酶试剂，得到处理样品，将处理样品进一步通过C18柱脱盐，真空冷冻干燥脱盐，得到检测样品。

4.3检测方法的设立

根据所述检测样品的目标多肽的序列信息，通过skyline软件设计平行反应监测模式检测方法，以所述参考肽质荷比及所述检测样品的目标肽段质荷比加入到inclusionlist中建立质谱采集方法；

所述参考肽包括第一参考肽片段、第二参考肽片段、第三参考肽片段，所述第一参考肽片段质荷比为563.2784，所述第二参考肽片段质荷比为719.3682，所述第三参考肽片段质荷比为832.4523。

4.4上机检测

检测样品用10μl Loading Buffer(0.1％甲酸,3％乙腈)进行溶解，离心后取上清点样。样品经过LC-MS/MS系统(ekspert nanoLC；AB Sciex TripleTOF 5600-plus)进行检测，然后对结果进行分析。样品首先到C18捕获柱(5μm，100μm×20mm)上，以300nL/min的流速从C18分析柱(3μm，75μm×150mm)上进行梯度洗脱。

两个流动相分别是水相BufferA(2％乙腈/0.1％甲酸/98％H2O)和有机相BufferB(98％乙腈/0.1％甲酸/2％H₂O)。IDA(信息依赖性采集)检测时，以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以100ms的离子累积时间采集30个前体离子的二级质谱图。在350-1500m/z的范围内进行MS1采集，并且在100-1500m/z的范围内进行MS2采集。前体离子动态排除时间设置为15s。

根据IDA检测结果进一步筛选蛋白肽段，采用平行反应监测模式对所筛选的蛋白肽段进行扫描，将所筛选的蛋白肽段打碎得到二级离子图谱，所筛选蛋白肽段包括所述参考肽。

4.5数据分析

下机后，数据导入Skyline软件建立的谱图库(spectra library)中，对每个肽段进行定量，输出所述检测样品蛋白肽段的保留时间与峰强度关系的图形，用所述参考肽的图形面积做多肽样品定量输出值的归一化标准，得到所述多肽样品相对于所述参考肽的相对含量；所述参考肽图形面积为所述第一参考肽段的图形面积、第二参考肽段的图形面积及第三参考肽片段的图形面积的平均值。

实施例五

5.1多肽样品的制备

实验样品经过蛋白brandford定量或细胞计算质控，取等量或等体积样品加入多肽提取裂解液(8M urea/100mM TEAB,pH 8.0,1mMPMSF/2mM EDTA)，混匀后冰上孵育5min，加入终浓度为l0mM的DTT，冰浴超声15min，然后13000g，4℃离心30min，取上清转入新的离心管中；向离心管中加入DTT至终浓度10mM，56℃水浴30min进行还原反应，得到还原样品。随后，加入IAM至终浓度55mM，暗处室温放置30min进行烷基化反应，得到初样品，用10kD超滤管处理，10000g,4℃离心30min,收集穿透液，即为多肽样品。

5.2检测样品的制备

往多肽样品中加入量为2uL的25fmol的β-半乳糖苷酶试剂，得到处理样品，将处理样品进一步通过C18柱脱盐，真空冷冻干燥脱盐，得到检测样品。

5.3检测方法的设立

根据所述检测样品的目标多肽的序列信息，通过skyline软件设计平行反应监测模式检测方法，以所述参考肽质荷比及所述检测样品的目标肽段质荷比加入到inclusionlist中建立质谱采集方法；

所述参考肽包括第一参考肽片段、第二参考肽片段、第三参考肽片段、第四参考肽片段及第五参考肽片段，所述第一参考肽片段质荷比为563.2784，所述第二参考肽片段质荷比为719.3682，所述第三参考肽片段质荷比为832.4523，所述第四参考肽片段质荷比为1061.5222，所述第五参考肽片段质荷比为1176.5491。

5.4上机检测

检测样品用10μl Loading Buffer(0.1％甲酸,3％乙腈)进行溶解，离心后取上清点样。样品经过LC-MS/MS系统(ekspert nanoLC；ABSciex TripleTOF 5600-plus)进行检测，然后对结果进行分析。样品首先到C18捕获柱(5μm，100μm×20mm)上，以300nL/min的流速从C18分析柱(3μm，75μm×150mm)上进行梯度洗脱。

两个流动相分别是水相BufferA(2％乙腈/0.1％甲酸/98％H₂O)和有机相BufferB(98％乙腈/0.1％甲酸/2％H₂O)。IDA(信息依赖性采集)检测时，以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以100ms的离子累积时间采集30个前体离子的二级质谱图。在350-1500m/z的范围内进行MS1采集，并且在100-1500m/z的范围内进行MS2采集。前体离子动态排除时间设置为15s。

根据IDA检测结果进一步筛选蛋白肽段，采用平行反应监测模式对所筛选的蛋白肽段进行扫描，将所筛选的蛋白肽段打碎得到二级离子图谱，所筛选蛋白肽段包括所述参考肽。

5.5数据分析

下机后，数据导入Skyline软件建立的谱图库(spectra library)中，对每个肽段进行定量，输出所述检测样品蛋白肽段的保留时间与峰强度关系的图形，经对比筛选，选用所述第一参考肽段的图形面积、第二参考肽段的图形面积、第三参考肽片段的图形面积的平均值做多肽样品定量输出值的归一化标准，得到所述多肽样品相对于所述参考肽的相对含量。

实施六

多肽样品的制备

实验样品经过蛋白brandford定量或细胞计算质控，取等量或等体积样品加入多肽提取裂解液(7.2M urea/120mM TEAB,pH8.0,1mM PMSF/2mM EDTA)，混匀后冰上孵育5min，加入终浓度为l0mM的DTT，冰浴超声15min，然后13000g，4℃离心30min，取上清转入新的离心管中；向离心管中加入DTT至终浓度10mM，56℃水浴30min进行还原反应，得到还原样品。随后，加入IAM至终浓度55mM，暗处室温放置30min进行烷基化反应，得到初样品，用10kD超滤管处理，10000g,4℃离心30min,收集穿透液，即为多肽样品。

6.2检测样品的制备

往多肽样品中加入量为2uL的25fmol的AB Sciex LC/MS PeptideCalibrationKit(货号：4333606)，得到处理样品，将处理样品进一步通过C18柱脱盐，真空冷冻干燥脱盐，得到检测样品。

6.3检测方法的设立

根据所述检测样品的目标多肽的序列信息，通过skyline软件设计平行反应监测模式检测方法，以所述参考肽质荷比及所述检测样品的目标肽段质荷比加入到inclusionlist中建立质谱采集方法；

所述参考肽包括第一参考肽片段、第二参考肽片段、第三参考肽片段、第四参考肽片段及第五参考肽片段，所述第一参考肽片段质荷比为563.2784，所述第二参考肽片段质荷比为719.3682，所述第三参考肽片段质荷比为832.4523，所述第四参考肽片段质荷比为1061.5222，所述第五参考肽片段质荷比为1176.5491。

6.4上机检测

检测样品用10μl Loading Buffer(0.1％甲酸,3％乙腈)进行溶解，离心后取上清点样。样品经过LC-MS/MS系统(ekspert nanoLC；AB Sciex TripleTOF 5600-plus)进行检测，然后对结果进行分析。样品首先到C18捕获柱(5μm，100μm×20mm)上，以300nL/min的流速从C18分析柱(3μm，75μm×150mm)上进行梯度洗脱。

两个流动相分别是水相BufferA(2％乙腈/0.1％甲酸/98％H₂O)和有机相BufferB(98％乙腈/0.1％甲酸/2％H₂O)。IDA(信息依赖性采集)检测时，以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以100ms的离子累积时间采集30个前体离子的二级质谱图。在350-1500m/z的范围内进行MS¹采集，并且在100-1500m/z的范围内进行MS²采集。前体离子动态排除时间设置为15s。

根据IDA检测结果进一步筛选蛋白肽段，采用平行反应监测模式对所筛选的蛋白肽段进行扫描，将所筛选的蛋白肽段打碎得到二级离子图谱，所筛选蛋白肽段包括所述参考肽。

6.5数据分析

下机后，数据导入Skyline软件建立的谱图库(spectra library)中，对每个肽段进行定量，输出所述检测样品蛋白肽段的保留时间与峰强度关系的图形，用所述参考肽的图形面积做多肽样品定量输出值的归一化标准，得到所述多肽样品相对于所述参考肽的相对含量；所述参考肽图形面积为所述第一参考肽段的图形面积、第二参考肽段的图形面积、第三参考肽片段的图形面积、第四参考肽片段的图像面积及第五参考肽片段的图形面积的平均值。

实施例七

7.1多肽样品的制备

实验样品经过蛋白brandford定量或细胞计算质控，取等量或等体积样品加入多肽提取裂解液(8M urea/100mM TEAB,pH 8.0,1mM PMSF/2mM EDTA)，混匀后冰上孵育5min，加入终浓度为l0mM的DTT，冰浴超声15min，然后13000g，4℃离心30min，取上清转入新的离心管中；向离心管中加入DTT至终浓度10mM，56℃水浴30min进行还原反应，得到还原样品。随后，加入IAM至终浓度55mM，暗处室温放置30min进行烷基化反应，得到初样品，用10kD超滤管处理，10000g,4℃离心30min,收集穿透液，即为多肽样品。

7.2检测样品的制备

往多肽样品中加入量为2uL的28fmol的β-半乳糖苷酶试剂，得到处理样品，将处理样品进一步通过C18柱脱盐，真空冷冻干燥脱盐，得到检测样品。

7.3检测方法的设立

根据所述检测样品的目标多肽的序列信息，通过skyline软件设计平行反应监测模式检测方法，以所述参考肽质荷比及所述检测样品的目标肽段质荷比加入到inclusionlist中建立质谱采集方法；

所述参考肽包括第一参考肽片段、第二参考肽片段、第三参考肽片段、第四参考肽片段及第五参考肽片段，所述第一参考肽片段质荷比为563.2784，所述第二参考肽片段质荷比为719.3682，所述第三参考肽片段质荷比为832.4523，所述第四参考肽片段质荷比为1061.5222，所述第五参考肽片段质荷比为1176.5491。

7.4上机检测

检测样品用10μl Loading Buffer(0.1％甲酸,3％乙腈)进行溶解，离心后取上清点样。样品经过LC-MS/MS系统(ekspert nanoLC；AB Sciex TripleTOF 5600-plus)进行检测，然后对结果进行分析。样品首先到C18捕获柱(5μm，100μm×20mm)上，以300nL/min的流速从C18分析柱(3μm，75μm×150mm)上进行梯度洗脱。

两个流动相分别是水相BufferA(2％乙腈/0.1％甲酸/98％H₂O)和有机相BufferB(98％乙腈/0.1％甲酸/2％H₂O)。IDA(信息依赖性采集)检测时，以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以100ms的离子累积时间采集30个前体离子的二级质谱图。在350-1500m/z的范围内进行MS¹采集，并且在100-1500m/z的范围内进行MS²采集。前体离子动态排除时间设置为15s。

根据IDA检测结果进一步筛选蛋白肽段，采用平行反应监测模式对所筛选的蛋白肽段进行扫描，将所筛选的蛋白肽段打碎得到二级离子图谱，所筛选蛋白肽段包括所述参考肽。

7.5数据分析

下机后，数据导入Skyline软件建立的谱图库(spectra library)中，对每个肽段进行定量，输出所述检测样品蛋白肽段的保留时间与峰强度关系的图形，用所述参考肽的图形面积做多肽样品定量输出值的归一化标准，得到所述多肽样品相对于所述参考肽的相对含量；所述参考肽图形面积为所述第一参考肽段的图形面积、第二参考肽段的图形面积、第三参考肽片段的图形面积、第四参考肽片段的图像面积及第五参考肽片段的图形面积的平均值。

实施例八

实验可靠性验证

采用实施例一方法对多轮样品进行重复实验，skyline可视化结果展示如图1所示，表现出参考肽具有良好的检测效果，并且在多轮优化中表现出质谱离子化、液相TIC峰型、子离子峰面积比等重现性俱佳的特性。

与标准实验流程中使用多个管家蛋白特异性肽段作归一化标准，得到的样品定量表达量差异及差异倍数基本一致，且在多轮样品重复实验中，表现出良好的定量重复性(RSD％<20％)，结果如表1所示。

表1样品定量表达量差异及差异倍数

本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。