阅读说明：本技术 表达嵌合活化受体及嵌合刺激受体的细胞及其用途 (Cells expressing chimeric activating receptors and chimeric stimulating receptors and uses thereof ) 是由 刘宏 张鹏博 L·霍兰 许奕阳 B·K·斯特利 刘连兴 云泓若 于 2018-04-24 设计创作，主要内容包括：本申请案提供免疫细胞(诸如T细胞),其包括嵌合抗体-T细胞受体TCR构筑体caTCR及嵌合信号传导受体CSR构筑体。所述caTCR包括特异性结合于靶抗原的抗原结合模块及能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的T细胞受体模块TCRM,且所述CSR包括特异性结合于靶配体的配体结合域及能够提供刺激信号至所述免疫细胞的协同刺激信号传导域。还提供制造及使用这些细胞的方法。(The present application provides immune cells (such as T cells) comprising a chimeric antibody-T cell receptor TCR construct, caTCR, and a chimeric signaling receptor CSR construct. The calcr comprises an antigen binding moiety that specifically binds to a target antigen and a T cell receptor moiety TCRM capable of recruiting at least one TCR-associated signaling molecule, and the CSR comprises a ligand binding domain that specifically binds to a target ligand and a costimulatory signaling domain capable of providing a stimulatory signal to the immune cell. Methods of making and using these cells are also provided.)

表达嵌合活化受体及嵌合刺激受体的细胞及其用途

相关申请案的交叉参考

本申请案要求保护2017年4月26日提交的美国临时申请案第62/490,576号、2017年4月26日提交的美国临时申请案第62/490,578号及2017年4月26日提交的美国临时申请案第62/490,580号的优先权，所述申请案的内容在此以全文引用的方式并入本文中。

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技术领域

发明涉及免疫细胞(诸如T细胞)，其包括嵌合抗体-T细胞受体(TCR)构筑体(caTCR)及嵌合信号传导受体(CSR)构筑体。所述caTCR包括特异性结合于靶抗原的抗原结合模块及能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的T细胞受体模块(TCRM)，且所述CSR包括特异性结合于靶配体的配体结合域及能够提供刺激信号至所述免疫细胞的协同刺激信号传导域。

背景技术

T细胞介导免疫为发展出抗原(Ag)-特异性T淋巴细胞来消除病毒、细菌、寄生虫感染或恶性细胞的适应过程。其也可涉及自体抗原的异常识别，导致自体免疫性发炎疾病。T淋巴细胞的Ag特异性是基于T细胞受体(TCR)对由主要组织相容性复合体(MHC)分子在Ag呈递细胞(APC)上呈递的独特抗原肽的识别(Broere等人,免疫药理学原理(Principles ofImmunopharmacology),2011)。由于在胸腺中成熟后的发育选择，各T淋巴细胞于细胞表面上表达独特的TCR。TCR以两种形式存在：αβ杂二聚体或γδ杂二聚体。T细胞于细胞表面上表达αβ形式或γδ形式的TCR。四条链α/β/γ/δ皆具有由高度多形“免疫球蛋白可变区”样N端域及“免疫球蛋白恒定区”样第二域组成的特征性胞外结构。这些域各自具有特征性域内二硫桥键。恒定区邻近细胞膜，其后为连接肽、跨膜区及短胞质尾区。杂二聚TCR的2条链之间的共价键是由位于短连接肽序列内的半胱氨酸残基形成，所述短连接肽序列桥接胞外恒定域与跨膜区，所述半胱氨酸残基与所配对的TCR链半胱氨酸残基在对应位置形成二硫键(The T cell Receptor Factsbook,2001)。

αβ及γδTCR与非多形膜结合CD3蛋白结合以形成功能性八聚TCR-CD3复合体，由TCR杂二聚体及三个二聚信号传导分子CD3δ/ε、CD3γ/ε及CD3ζ/ζ或ζ/η组成。各亚单位的跨膜域中的可电离残基形成将复合体固定在一起的极性相互作用网。关于T细胞活化，TCR N端可变区识别于靶细胞表面上呈递的肽/MHC复合体，而CD3蛋白则参与信号转导(Call等人,Cell.111(7):967-79,2002；The T cell Receptor Factsbook,2001)。

αβTCR也称作常规TCR，表达于大部分淋巴细胞上且由糖基化多形α及β链组成。不同的αβTCR可区分嵌入于尺寸及形状相对恒定的MHC II(大部分表达于APC细胞表面上)及MHC I(表达于所有有核细胞上)分子的表面中的不同肽。γδTCR尽管在结构上类似于αβTCR，但以与MHC呈递无关的方式识别携带碳水化合物、核苷酸或磷光体的抗原(The T cellReceptor Factsbook,2001；Girardi等人,J.Invest.Dermatol.126(1):25-31,2006；Hayes等人,Immunity.16(6):827-38,2002)。

在过去的二十年里，在免疫学及肿瘤生物学方面的根本性进展以及大量肿瘤抗原的鉴别促成了基于细胞的免疫疗法领域的显著进展。在基于细胞的免疫疗法领域中，T细胞疗法占据重要位置，其目标为通过将自体及离体扩增的T细胞转移给患者来治疗癌症，且已产生了一些值得注意的抗肿瘤反应(Blattman等人,Science.305(5681):200-5,2004)。举例来说，在黑色素瘤患者中，包含庞大的侵袭性肿瘤，在包括肝、肺、软组织及大脑的多个部位投与经离体扩增的天然存在的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)可介导在50-70％范围内的客观反应率(Rosenberg等人,Nat.Rev.Cancer.8(4):299-308,2008；Dudley ME等人,J.Clin.Oncol.23(10):2346-57,2005)。

TIL疗法的普遍应用的主要限制为难以产生具有抗肿瘤潜力的人类T细胞。作为替代方法，可经由T细胞工程改造将外源性高亲和力TCR引入患者的正常自体性T细胞中。这些细胞至淋巴缺乏患者中的授受性转移已显示可介导诸如黑色素瘤、结肠直肠癌及滑膜肉瘤的癌症的癌症消退(Kunert R等人,Front.Immunol.4:363,2013)。最新的I期临床试验使用针对滑膜肉瘤的抗NY-ESO-1TCR，报告66％的整体反应率且在一名接受T细胞疗法的患者中达成完全反应(Robbins PF等人,Clin.Cancer Res.21(5):1019-27,2015)。

TCR工程改造T细胞疗法的优势之一在于其可靶向潜在胞内肿瘤特异性蛋白的整个阵列，所述蛋白质经由MHC呈递经处理及传递至细胞表面。另外，TCR为高度敏感的且可仅由一些抗原肽/MHC分子活化，其又可触发细胞溶解性T细胞反应，包含细胞因子分泌、T细胞增殖及限定靶细胞的细胞溶解。因此，相较于抗体或小分子疗法，经TCR工程改造的T细胞因其以胞内靶抗原的极少拷贝杀灭靶细胞的能力而特别有价值(Kunert R等人,Front.Immunol.4:363,2013)。

然而，不同于治疗性抗体，其多半经由融合瘤或呈现技术发现，靶特异性TCR的鉴别要求从患者T细胞建立靶肽/MHC特异性TCR克隆且筛选出具有最佳靶抗原结合亲和力的正确α-β链组合。经常在从患者T细胞克隆TCR之后采用噬菌体/酵母呈现来进一步增强TCR的靶标结合亲和力。整个过程要求诸多领域的专业知识且耗时(Kobayashi E等人,Oncoimmunology.3(1):e27258,2014)。TCR探索过程中的困难极大地阻碍了经TCR工程改造的T细胞疗法的普遍应用。其也受到治疗相关的毒性的妨碍，尤其是针对于肿瘤细胞上过度表达且也表达于健康细胞上的抗原的TCR，或识别脱靶肽/MHC复合体的TCR(Rosenberg SA等人,Science.348(6230):62-8,2015)。

近年来已研发出一种不同的方法来使T细胞参与靶向癌症免疫疗法。此新方法称作嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)。其合并单克隆抗体的敏锐的靶向特异性与由细胞毒性T细胞提供的强力细胞毒性及长期存留。CAR是由识别细胞表面抗原的胞外域、跨膜区及胞内信号传导域构成。胞外域由来自单克隆抗体的重链及轻链的抗原结合可变区组成，所述可变区融合成单链可变片段(scFv)。胞内信号传导域含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，诸如来自CD3ζ或FcRγ的那些，及一或多个协同刺激信号传导域，诸如来自CD28、4-1BB或OX40的那些(Barrett DM等人,Annu.Rev.Med.65:333-47,2014；Davila ML等人,Oncoimmunology.1(9):1577-1583,2012)。移植至T细胞表面上的CAR对靶抗原的结合可触发与TCR-肽/MHC复合体相互作用无关的T细胞效应功能。因此，具有CAR的T细胞可重定向以攻击多种细胞，包含不匹配T细胞上的TCR的MHC类型但表达靶细胞表面抗原的那些细胞。此方法克服了MHC限制性TCR识别的约束且避免了经由抗原呈递或MHC分子表达障碍所致的肿瘤逃逸。临床试验已显示CAR-T疗法在神经母细胞瘤(Louis CU等人,Blood.118(23):6050-6056,2011)、B-ALL(Maude,SL等人,New England Journal of Medicine 371:16:1507-1517,2014)、CLL(Brentjens,RJ等人Blood 118:18:4817-4828,2011)及B细胞淋巴瘤(Kochenderfer,JN等人Blood 116:20:4099-4102,2010)中在临床上具有显著抗肿瘤活性。在一个研究中，报告用CD19-CAR T疗法治疗的30位患有B-ALL的患者中90％的完全缓解率(Maude,SL等人，同前文献)。

迄今为止的全部CAR研究皆针对具有高细胞表面表达的肿瘤抗原。为靶向低拷贝数细胞表面肿瘤抗原及胞内肿瘤抗原，其代表95％的所有已知的肿瘤特异性抗原，需要研发更强力且更有效的经工程改造的细胞疗法(Cheever等人,Clin.Cancer Res.15(17):5323-37,2009)。

已作出若干尝试来工程改造具有抗体特异性与T细胞受体效应功能的嵌合受体分子。参见例如Kuwana,Y等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.149(3):960-968,1987；Gross,G等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:10024-10028,1989；Gross,G及Eshhar,Z,FASEB J.6(15):3370-3378,1992；及美国专利第7,741,465号。迄今为止，这些嵌合受体中无一者用于临床使用，且需要针对在人类T细胞中具有改进表达及功能的抗体-TCR嵌合受体的新颖设计。

本文所提及的所有公开案、专利、专利申请案及公开专利申请案的揭示内容特此以全文引用的方式并入本文中。PCT申请案第PCT/US2016/058305号特此以全文引用的方式并入本文中。

发明内容

本申请案在一个方面中提供免疫细胞(诸如T细胞)，其包括嵌合抗体-T细胞受体(TCR)构筑体(caTCR)及嵌合信号传导受体(CSR)构筑体。所述caTCR包括特异性结合于靶抗原的抗原结合模块及能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的T细胞受体模块(TCRM)，且所述CSR包括特异性结合于靶配体的配体结合域及能够提供刺激信号至所述免疫细胞的协同刺激信号传导域。

在一些实施例中，提供一种免疫细胞，所述免疫细胞包括：a)嵌合抗体-T细胞受体(TCR)构筑体(caTCR)，其包括i)特异性结合于靶抗原的抗原结合模块；及ii)T细胞受体模块(TCRM)，其包括含有第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有第二TCR-TM的第二TCRD，其中TCRM有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子；及b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括：i)能够与靶配体结合及相互作用的配体结合模块；ii)跨膜模块；及ⅲ)能够提供协同刺激信号至免疫细胞的协同刺激免疫细胞信号传导模块，其中配体结合模块及协同刺激免疫细胞信号传导模块并非源自同一分子，且其中CSR缺乏功能性原代免疫细胞信号传导域。

在一些实施例中，提供一或多种核酸，其编码如此处所描述的caTCR及CSR，其中caTCR及CSR各自由经一或多个核酸编码的一或多个多肽链组成。

在一些实施例中，提供一或多种核酸，所述一或多种核酸编码：a)嵌合抗体-T细胞受体(TCR)构筑体(caTCR)，其包括：i)特异性结合于靶抗原的抗原结合模块；及ii)T细胞受体模块(TCRM)，其包括含有第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有第二TCR-TM的第二TCRD，其中TCRM有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子，且其中caTCR由一或多个多肽链组成；及b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括：i)能够与靶配体结合或相互作用的配体结合模块；ii)跨膜模块；及iii)能够提供协同刺激信号至免疫细胞的协同刺激免疫细胞信号传导模块，其中配体结合模块及协同刺激免疫细胞信号传导模块并非源自同一分子，其中CSR缺乏功能性原代免疫细胞信号传导域，且其中CSR由一或多个多肽链组成。

在一些实施例中，提供一或多种载体，其包括如本文所描述的一或多种核酸。

在一些实施例中，提供一种组合物，其包括如本文所描述的一或多种核酸或一或多种载体。

在一些实施例中，提供一种免疫细胞，其包括如本文所描述的一或多种核酸或一或多种载体。

在一些实施例中，提供一种医药组合物，其包括如本文所描述的免疫细胞及药学上可接受的载剂。

在一些实施例中，提供一种杀灭呈递靶抗原的靶细胞的方法，其包括使所述靶细胞与本文描述的免疫细胞接触。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的靶抗原相关疾病的方法，其包括向个体投与有效量的如本文所描述的医药组合物。

在一些实施例中，提供一种将协同刺激信号提供至包括caTCR或用编码caTCR的核酸转导的免疫细胞的方法，其包括将如本文所描述的一或多种核酸或一或多种载体引入至所述细胞中。

附图说明

图1展示具有不同抗原结合模块的若干caTCR分子的示意性表示。

图2展示来***灭癌细胞系NALM6(CD19⁺)的特异性裂解百分比，所述杀灭由用单独的抗CD19 caTCR-1-0、单独的抗CD19 CSR或抗CD19 caTCR(1-0及1-TM5)+抗CD19CSR转导的T细胞介导。

图3展示在由用单独的抗CD19 caTCR-1-0、单独的抗CD19 CSR或抗CD19 caTCR(1-0及1-TM5)+抗CD19 CSR转导的T细胞介导体外杀灭癌细胞系NALM6之后，上清液中发现的细胞因子(IL-2、GM-CSF、IFN-γ及TNF-α)的浓度。

图4展示用癌细胞系NALM6刺激之后，用单独的抗CD19 caTCR-1-0、单独的抗CD19CSR或抗CD19 caTCR(1-0及1-TM5)+抗CD19 CSR转导的T细胞中的脱粒活性(如通过CD107a表达所测定)。

图5展示用癌细胞系BV173或NALM6刺激之后，用单独的抗CD19 caTCR-1-0或抗CD19 caTCR(1-0及1-TM5)+抗CD19 CSR转导的T细胞的增殖(如通过CFSE染料稀释所测定)。

图6展示从杀灭癌细胞系HepG2(AFP⁺/GPC3⁺)及HepG2-GPC3.ko(AFP⁺/GPC3^-)的特异性裂解百分比，所述杀灭由用单独的抗AFP158/HLA-A*2:01caTCR-1-0、单独的抗GPC3CSR或抗AFP158/HLA-A*2:01caTCR(1-0及1-TM5)+抗GPC3 CSR转导的T细胞介导。

图7展示由用单独的抗AFP158/HLA-A*2:01caTCR-1-0、单独的抗GPC3 CSR或抗AFP158/HLA-A*2:01caTCR(1-0及1-TM5)+抗GPC3 CSR转导的T细胞介导体外杀灭癌细胞系HepG2及HepG2-GPC3.ko之后，上清液中发现的细胞因子(IL-2、GM-CSF、IFN-γ及TNF-α)的浓度。

图8展示用癌细胞系HepG2刺激之后，用单独的抗AFP158/HLA-A*2:01caTCR-1-0、单独的抗GPC3 CSR或抗AFP158/HLA-A*2:01caTCR(1-0及1-TM5)+抗GPC3 CSR转导的T细胞中的脱粒活性(如通过CD107a表达所测定)。

图9展示用癌细胞系HepG2刺激之后，用单独的抗AFP158/HLA-A*2:01caTCR-1-0、单独的抗GPC3 CSR或抗AFP158/HLA-A*2:01caTCR(1-0及1-TM5)+抗GPC3 CSR转导的T细胞的增殖(如通过CFSE染料稀释所测定)。

图10展示从杀灭癌细胞系Raji、BV173、NALM6及Jeko-1(各CD19⁺/CD20⁺)的特异性裂解百分比，所述杀灭由用抗CD19 caTCR(1-0及1-TM5)+抗CD20 CSR转导的T细胞介导。

图11展示由用单独的抗CD19 caTCR-1-0或抗CD19 caTCR(1-0及1-TM5)+抗CD20CSR转导的T细胞介导体外杀灭癌细胞系Raji之后，上清液中发现的细胞因子(IL-2、GM-CSF、IFN-γ及TNF-α)的浓度。

图12展示用癌细胞系Raji刺激之后，用单独的抗CD19 caTCR-1-0、单独的抗CD20CSR或抗CD19 caTCR(1-0及1-TM5)+抗CD20 CSR转导的T细胞的脱粒活性(如通过CD107a表达所测定)。

图13A至13E展示示范性双特异性caTCR分子的示意性结构。

图14至15展示用癌细胞系NALM6刺激之后，表达抗CD19 caTCR-1-0及抗CD19 CSR的T细胞的增殖(如通过CFSE染料稀释所测定)。

图16展示NALM6在皮下小鼠模型中的肿瘤生长，其经模拟处理或单次瘤内注射表达抗CD19 caTCR-1或与抗CD19 CSR-1组合的抗CD19 caTCR-1的T细胞。

图17展示经表达抗CD19 CAR的T细胞或表达抗CD19 caTCR-1及抗CD19 CSR-1两者的T细胞处理的小鼠中的血清细胞因子含量。将司徒顿氏t测试(student t-test)用于分析两个组中的血清细胞因子含量的统计显著性(**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001)。

图18展示HepG2在皮下小鼠模型中的肿瘤生长，其经模拟处理或单次瘤内注射表达抗AFP CAR或与抗GPC3 CSR组合的抗AFP CAR的T细胞。

具体实施方式

本申请案提供免疫细胞(诸如T细胞)，其包括嵌合抗体-T细胞受体(TCR)构筑体(caTCR)及嵌合信号传导受体(CSR)构筑体。所述caTCR包括特异性结合于靶抗原的抗原结合模块及能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的T细胞受体模块(TCRM)。所述CSR包括特异性结合于靶配体的配体结合域及能够将刺激信号提供至免疫细胞的协同刺激免疫细胞信号传导域，且不包括功能性原代免疫细胞信号传导序列。靶抗原及靶配体可为表达于细胞表面上的蛋白质或包括肽及MHC蛋白的复合体(在本文中被称作“pMHC复合体”或“pMHC”)，诸如病变细胞表面上的MHC呈递疾病相关抗原肽。通过控制T细胞受体活化的天然存在的机制调节caTCR，且经由CSR的信号传导能够增强由caTCR介导的免疫反应。

已研发出一系列包括caTCR及CSR构筑体的新颖T细胞。其展现对携带靶标的肿瘤细胞的强细胞毒性，其中相较于仅表达caTCR而无CSR存在的细胞，增加了响应于靶细胞接合的细胞因子表达。这些细胞中含有CSR相较于表达仅caTCR的细胞进一步增强了脱粒、增殖及存活力。

本申请案因此提供免疫细胞，其包括对靶抗原具有特异性的caTCR及对靶配体具有特异性的CSR，其中所述caTCR包括特异性结合于靶抗原的抗原结合模块及能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的T细胞受体模块(TCRM)，且其中所述CSR：a)包括特异性结合于靶配体的配体结合域及能够将刺激信号提供至免疫细胞的协同刺激免疫细胞信号传导域，且b)不包括功能性原代免疫细胞信号传导序列。caTCR可采用抗原结合模块及/或TCRM变化的多种型式中的任一者。举例来说，所述caTCR可具有：抗原结合模块，其包括选自由Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv及scFv组成的群组的部分；及TCRM，其包括源自α/β或γ/δTCR的一或多个序列，所述一或多个序列包含跨膜域、连接肽及胞内域中的一或多者中的变异体。参见图1。在一些实施例中，所述抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。所述CSR可类似地具有配体结合模块，其包括选自由Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv及scFv组成的群组的部分。在一些实施例中，靶抗原与靶配体相同。在一些实施例中，caTCR的抗原结合模块与CSR的配体结合模块相同，或包括赋予抗原特异性的相同序列，诸如CDR或可变域。在一些实施例中，靶抗原与靶配体不同。

在其它方面中，提供：a)一或多个核酸，其编码caTCR及CSR；b)免疫细胞，其包括一或多个编码caTCR及CSR的核酸，及c)组合物，其包括免疫细胞，所述免疫细胞包括i)caTCR及CSR或ii)一或多个编码caTCR及CSR的核酸。所述组合物可为医药组合物。

也提供制备包括caTCR及CSR的免疫细胞及将其用于治疗用途的方法，以及适用于这些方法的试剂盒及制品。另外提供使用包括caTCR及CSR的免疫细胞治疗疾病的方法。

定义

术语“抗体”或“抗体部分”包含全长抗体及其抗原结合片段。全长抗体包括两个重链及两个轻链。轻链及重链的可变区负责抗原结合。两种链中的可变区一般均含有三个称作互补决定区(CDR)的高度可变环(轻链(LC)CDR包含LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，重链(HC)CDR包含HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3)。本文所揭示的抗体及抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani惯例(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)界定或鉴别。重链或轻链的三个CDR***于称为框架区(FR)的侧接伸长部之间，所述侧接伸长部比CDR更高度保守且形成支撑高变环的架构。重链及轻链的恒定区不参与抗原结合，但展现各种效应功能。抗体基于其重链的恒定区的氨基酸序列归为各种类别。五种主要抗体类别或同型为IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其特征为分别存在α、δ、ε、γ及μ重链。若干主要抗体类别分成子类，如lgG1(γ1重链)、lgG2(γ2重链)、lgG3(γ3重链)、lgG4(γ4重链)、lgA1(α1重链)或lgA2(α2重链)。

如本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体片段，其包含例如双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、由包括一或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼的单域抗体、纳米抗体、域抗体、二价域抗体、或结合于抗原但不包括完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段能够结合于与亲本抗体或亲本抗体片段(例如亲本scFv)所结合相同的抗原。在一些实施例中，抗原结合片段可包括接枝至来自一或多种不同人类抗体的框架区的来自特定人类抗体的一或多种CDR。

如本文所用，当在等摩尔浓度的第一抗体部分存在下，第一抗体部分抑制第二抗体部分的靶抗原结合至少约50％(诸如至少约以下中的任一者：55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)时，第一抗体部分与第二抗体部分“竞争”结合于靶抗原，或反之亦然。基于抗体的交叉竞争而将其“分组”的高通量方法描述于PCT公开案第WO 03/48731号中。

如本文所用，术语“特异性结合”或“对......具有特异性”是指可测量及可再生相互作用，诸如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其在非均质分子(包含生物分子)群体存在下决定靶标的存在。举例来说，特异性结合于靶标(其可为抗原决定基)的抗体部分为以比其结合于其它靶标更高的亲和力、亲和性、更容易及/或更长持续时间结合靶标的抗体部分。在一些实施例中，特异性结合于抗原的抗体部分与抗原(例如细胞表面抗原或肽/MHC蛋白复合体)的一或多个抗原决定子，以呈其针对其它靶标的结合亲和力至少约10倍的结合亲和力反应。

术语“T细胞受体”或“TCR”是指由T细胞表面上配对的αβ或γδ链构成的杂二聚体受体。各α、β、γ及δ链由两个Ig样域构成：经由互补决定区(CDR)赋予抗原识别的可变域(V)，随后为通过连接肽及跨膜(TM)区锚定至细胞膜的恒定域(C)。TM区与CD3信号传导设备的恒定亚单位结合。V域各自具有三个CDR。这些CDR与结合于由主要组织相容性复合体(pMHC)编码的蛋白质的抗原肽之间的复合体相互作用(Davis及Bjorkman(1988)Nature,334,395-402；Davis等人(1998)Annu Rev Immunol,16,523-544；Murphy(2012),xix,第868页)。

术语“TCR相关信号传导分子”是指具有基于细胞质免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的分子，其为TCR-CD3复合体的一部分。TCR相关信号传导分子包含CD3γε、CD3δε及ζζ(也称为CD3ζ或CD3ζζ)。

如本文关于表达CD3的细胞所用的“活化”是指已经足够刺激以诱导CD3信号传导路径的下游效应功能(包含但不限于细胞增殖及细胞因子产生)的可检测提高的细胞的状态。

术语“模块”在提及蛋白质的一部分时意味着包含构成蛋白质的一或多种多肽的结构上及/或功能上相关的部分。举例来说，二聚体受体的跨膜模块可指受体的每一多肽链的跨膜部分。模块也可指单一多肽链的相关部分。举例来说，单体受体的跨膜模块可指受体的单一多肽链的跨膜部分。模块也可仅包含多肽的单一部分。

如本文所用的术语“经分离核酸”意在意味着基因组核酸、cDNA或合成来源或其某一组合的核酸，借助于其来源，“经分离核酸”(1)不与发现“经分离核酸”的自然界中的所有或一部分聚核苷酸结合，(2)可操作地连接于自然界中不与其连接的聚核苷酸，或(3)在自然界中不作为较大序列的部分存在。

如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意在意味着重链与轻链多肽两者的可变区内存在的非邻接抗原组合位点。以下文献已对这些特定区进行描述：Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人,美国卫生与公众服务部(U.S.Dept.ofHealth and Human Services),“所关注免疫蛋白序列(Sequences of proteins ofimmunological interest)”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan及Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger及Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)，其中当彼此对照比较时，定义包含氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，使用任一定义来提及抗体或接枝抗体的CDR或其变异体意在属于如本文所定义及使用的术语的范围。涵盖如上文所引用的参考文献中的每一者所定义的CDR的氨基酸残基阐述于下表1中作为比较。CDR预测算法及界面为所属领域中已知的，包含(例如)Abhinandan及Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.等人,Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；以及Adolf-Bryfogle J.等人,Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)。此段落中所引用的参考文献内容以其全文引用的方式并入本文中以用于本发明中且可能包含于本文的一或多个技术方案中。

表1：CDR定义

¹残基编号遵循前述Kabat等人的命名法

²残基编号遵循前述Chothia等人的命名法

³残基编号遵循前述MacCallum等人的命名法

⁴残基编号遵循前述Lefranc等人的命名法

⁵残基编号遵循前述Honegger及Plückthun的命名法

术语“嵌合抗体”是指其中重链及/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或子类别的抗体中的对应序列一致或与其同源，而其余链与源自另一物种或属于另一抗体类别或子类别的抗体中的对应序列一致或与其同源的抗体，以及此类抗体的片段，只要其展现本发明的生物活性即可(参见美国专利第4,816,567号；及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。

关于抗体或抗体部分的术语“半合成”意味着抗体或抗体部分具有一或多个天然存在的序列及一或多个非天然存在的(即合成)序列。

关于抗体或抗体部分的术语“全合成”意味着抗体或抗体部分具有固定的天然存在的V_H/V_L框架配对，而非重链及轻链两者的所有6种CDR的非天然存在的(即合成)序列。

非人类(例如啮齿动物)抗体的“人类化”形式是含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人类化抗体为人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区(HVR)的残基经来自诸如具有期望抗体特异性、亲和力及能力的小鼠、大鼠、家兔或非人类灵长类动物的非人类物种(供体抗体)的高变区的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基经对应非人类残基置换。此外，人类化抗体可包括在接受者抗体或供者抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。一般来说，人类化抗体将包括至少一个且通常两个可变域中的基本上所有可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环且所有或基本上所有FR为人类免疫球蛋白序列的FR。人类化抗体任选地也将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常，人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于其它细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列一致性。当两个比较序列中的一个位置由相同碱基或氨基酸单体亚单位占据时，例如若两个DNA分子中的每一者中的一个位置由腺嘌呤占据，则所述分子在所述位置处“同源”。两个序列之间的“同源性百分比”或“序列一致性百分比”为两个序列共用的匹配或同源位置的数目除以所比较位置的数目乘以100的函数，任何保守取代视为序列一致性的一部分。举例来说，如果两个序列中的10个位置中有6个匹配或同源，则两个序列为60％同源。举例来说，DNA序列ATTGCC及TATGGC共用50％同源性。一般来说，当两个序列经比对以产生最大百分比同源时进行比较。出于测定氨基酸序列一致性百分比目的的比对可以所属领域中的技能范围内的各种方式达成，例如使用公开可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。所属领域的技术人员可确定用于测量比对(包含用于达成所比较序列的全长内的最大比对所需的任何算法)的适当参数。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序MUSCLE产生氨基酸序列一致性％值(Edgar,R.C.,Nucleic AcidsResearch 32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMC Bioinformatics 5(1):113,2004)。

人类IgG Fc区的“C_H1域”(也被称作“H1”域的“C1”域)通常从约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号系统)。

除非另外指定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包含为彼此的简并型式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。片语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包含内含子，其达到编码蛋白质的核苷酸序列可在一些型式中含有内含子的程度。

术语“可操作地连接”是指调节序列与异源核酸序列之间的官能键，其导致后者的表达。举例来说，当第一核酸序列与第二核酸序列处于官能性关系时，第一核酸序列可操作地连接第二核酸序列。举例来说，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子可操作地连接于编码序列。一般来说，可操作地连接的DNA序列为连续的，且当必需接合两个蛋白质编码区时，在相同阅读框中。

术语“诱导性启动子”是指可通过添加或移除一或多个特定信号来调节活性的启动子。举例来说，诱导性启动子可在一组特定条件下，例如在活化启动子及/或缓解启动子的抑制的诱导剂或条件存在下活化可操作地连接的核酸的转录。

如本文所用，“治疗(treatment/treating)”为用于获得有益或所需结果(包含临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包含(但不限于)以下中的一或多者：缓解疾病所引起的一或多种症状、减弱疾病程度、稳定疾病(例如预防或延迟疾病恶化)、预防或延迟疾病扩散(例如转移)、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病状态、使得疾病缓解(部分或完全)、减少治疗疾病所需的一或多种其它药物的剂量、延迟疾病进展、增加或改进生活品质、增大体重增加及/或延长存活期。“治疗”也涵盖减少疾病的病理性结果(诸如癌症的肿瘤体积)。本发明的方法涵盖这些治疗方面中的任何一或多者。

术语“复发(recurrence/relapse/relapsed)”是指癌症或疾病在疾病消失的临床评估之后的恢复。远端癌转移或局部复发的诊断可视为复发。

术语“难治性”或“耐受性”是指不响应于治疗的癌症或疾病。

如本文所揭示的caTCR或包括caTCR的组合物的“有效量”为足以进行具体陈述的目的的量。“有效量”可凭经验及通过与所陈述目的相关的已知方法确定。

术语“治疗有效量”是指如本文中所揭示的caTCR或包括caTCR的组合物有效“治疗”个别的疾病或病症的量。在癌症的情况下，如本文中所揭示的caTCR或包括caTCR的组合物的治疗有效量可降低癌细胞的数目；减小肿瘤尺寸或重量；抑制(即在一定程度上减缓且优选地停止)癌细胞浸润至周边器官中；抑制(即在一定程度上减缓且优选地停止)肿瘤癌转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；及/或在一定程度上缓解一或多个与癌症相关的症状。在如本文所揭示的caTCR或包括caTCR的组合物可预防生长及/或杀灭现有癌细胞的程度上，其可为细胞生长抑制及/或细胞毒性的。在一些实施例中，治疗有效量为生长抑制量。在一些实施例中，治疗有效量为改进患者的无进展存活期的量。在诸如病毒感染的传染性疾病的情况下，如本文所揭示的caTCR或包括caTCR的组合物的治疗有效量可减少受到病原体感染的细胞的数目；减少源自病原体的抗原的产生或释放；抑制(即在一定程度上减缓且优选地停止)病原体扩散至未感染细胞中；及/或在一定程度上缓解一或多个与感染相关的症状。在一些实施例中，治疗有效量为延长患者存活期的量。

如本文所用，“药学上可接受”或“药理学上相容”意味着不为生物学上或其它方面不适宜的物质，例如，所述物质可并入向患者投与的医药组合物中而不会引起任何显著不适宜生物效果或以有害方式与含有其的组合物的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载剂或赋形剂优选地满足毒理学及制造测试的所要求标准及/或包含于美国食品药物管理局(U.S.Food and Drug administration)制定的非活性成分导引(Inactive IngredientGuide)中。

应了解，本文所描述的本发明实施例包含“由实施例组成”及/或“基本上由实施例组成”。

本文中，对“约”一个值或参数的参考包含(及描述)针对所述值或参数本身的变化。举例来说，提及“约X”的描述包含“X”的描述。

如本文所用，提及“并非”一值或参数一般意指及描述“除”一值或参数“以外”。举例来说，方法不用于治疗X型癌症意味着方法用于治疗除X以外的类型的癌症。

除非上下文另外明确指示，否则如在本文及所附权利要求书中所用，单数形式“一(a)”、“或(or)”及“所述(the)”包含多个指示物。

caTCR加CSR免疫细胞

本发明提供一种免疫细胞(诸如T细胞)，其于其表面上呈递根据本文所描述的caTCR及CSR中的任一者的caTCR及CSR(此免疫细胞在本文中也称作“caTCR加CSR免疫细胞”)。在一些实施例中，免疫细胞包括编码cabTCR及CSR的核酸，其中cabTCR及CSR由核酸表达且定位于免疫细胞表面。在一些实施例中，免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，免疫细胞不表达TCR亚单位，caTCR的TCR-TM源自所述TCR亚单位。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRδ及γ链的序列，或T细胞为γδT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少免疫细胞的内源性TCR亚单位中的一或两者的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα及/或β链表达的αβT细胞，或者免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ及/或δ链表达的γδT细胞。用于破坏基因表达的细胞修饰包含所属领域中已知的任何此类技术，包含例如RNA干扰(例如，siRNA、shRNA、miRNA)、基因编辑(例如，基于CRISPR或TALEN的基因剔除)及类似者。

举例来说，在一些实施例中，提供一种免疫细胞(诸如T细胞)，其包括编码根据本文所描述的caTCR中的任一者的caTCR及根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR的核酸，其中caTCR及CSR由核酸表达且定位于免疫细胞表面。在一些实施例中，所述核酸包括编码caTCR的第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列、编码caTCR的第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列及编码CSR的CSR多肽链的CSR核酸序列。在一些实施例中，第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列各包括于不同载体中。在一些实施例中，核酸序列中的一些或全部包括于同一载体中。载体可选自例如由哺乳动物表达载体及病毒载体(诸如源自反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒及慢病毒的那些载体)组成的群组。在一些实施例中，将一或多种载体整合于免疫细胞的宿主基因组中。在一些实施例中，第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列各自处于不同启动子的控制下。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有相同序列。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有不同序列。在一些实施例中，核酸序列中的一些或全部处于单一启动子的控制下。在一些实施例中，启动子中的一些或全部为可诱导的。在一些实施例中，免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。

因此，在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞(诸如T细胞)，其于其表面上表达根据本文所描述的caTCR中的任一者的caTCR及根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR，其中caTCR加CSR免疫细胞包括：a)编码caTCR的第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列；b)编码caTCR的第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列；以及c)编码CSR的CSR多肽链的CSR核酸序列，其中第一及第二caTCR多肽链由第一及第二caTCR核酸序列表达以形成caTCR，其中CSR多肽链由CSR核酸表达以形成CSR，且其中caTCR及CSR定位于免疫细胞的表面。在一些实施例中，第一caTCR核酸序列包括于第一载体(诸如慢病毒载体)中，第二caTCR核酸序列包括于第二载体(诸如慢病毒载体)中，且CSR核酸序列包括于第三载体(诸如慢病毒载体)中。在一些实施例中，第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列中的一些或全部包括于同一载体(诸如慢病毒载体)中。在一些实施例中，第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列各自个别地可操作地连接于启动子。在一些实施例中，核酸序列中的一些或全部处于单一启动子的控制下。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有相同序列。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有不同序列。在一些实施例中，启动子中的一些或全部为可诱导的。在一些实施例中，载体中的一些或全部为病毒载体(诸如慢病毒载体)。在一些实施例中，免疫细胞不表达TCR亚单位，caTCR的TCR-TM源自所述TCR亚单位。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRδ及γ链的序列，或免疫细胞为γδT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少其内源性TCR亚单位中的一或两者的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα及/或β链表达的αβT细胞，或者免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ及/或δ链表达的γδT细胞。在一些实施例中，免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，载体中的一些或全部为整合于免疫细胞的宿主基因组中的病毒载体(诸如慢病毒载体)。

在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞(诸如T细胞)，其于其表面上表达根据本文所描述的caTCR中的任一者的caTCR及根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR，其中caTCR加CSR免疫细胞包括：a)第一载体，其包括第一启动子，所述第一启动子可操作地连接于编码caTCR的第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列；b)第二载体，其包括第二启动子，所述第二启动子可操作地连接于编码caTCR的第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列；以及c)第三载体，其包括第三启动子，所述第三启动子可操作地连接于编码CSR的CSR多肽链的CSR核酸序列，其中第一及第二caTCR多肽链由第一及第二caTCR核酸序列表达以形成caTCR，且CSR多肽链由CSR核酸序列表达以形成CSR，且其中caTCR及CSR定位于免疫细胞的表面。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有相同序列。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有不同序列。在一些实施例中，启动子中的一些或全部为可诱导的。在一些实施例中，免疫细胞不表达TCR亚单位，caTCR的TCR-TM源自所述TCR亚单位。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRδ及γ链的序列，或免疫细胞为γδT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少其内源性TCR亚单位中的一或两者的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα及/或β链表达的αβT细胞，或者免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ及/或δ链表达的γδT细胞。在一些实施例中，免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，第一及第二载体为整合于免疫细胞的宿主基因组中的病毒载体(诸如慢病毒载体)。

在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞(诸如T细胞)，其于其表面上表达根据本文所描述的caTCR中的任一者的caTCR及根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR，其中caTCR加CSR免疫细胞包括：a)第一载体，其包括：i)第一启动子，所述第一启动子可操作地连接于编码caTCR的第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列，及ii)第二启动子，所述第二启动子可操作地连接于编码caTCR的第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列；以及b)第二载体，其包括第三启动子，所述第三启动子可操作地连接于编码CSR的CSR多肽链的CSR核酸序列，其中第一及第二caTCR多肽链由第一及第二caTCR核酸序列表达以形成caTCR，且CSR多肽链由CSR核酸序列表达以形成CSR，且其中caTCR定位于免疫细胞的表面。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有相同序列。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有不同序列。在一些实施例中，启动子中的一些或全部为可诱导的。在一些实施例中，免疫细胞不表达TCR亚单位，caTCR的TCR-TM源自所述TCR亚单位。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRδ及γ链的序列，或免疫细胞为γδT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少其内源性TCR亚单位中的一或两者的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα及/或β链表达的αβT细胞，或者免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ及/或δ链表达的γδT细胞。在一些实施例中，免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，第一及第二载体为整合于免疫细胞的宿主基因组中的病毒载体(诸如慢病毒载体)。应了解，也涵盖交换核酸序列中的任一者，诸如第一或第二caTCR核酸序列与CSR核酸序列交换的实施例。

在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞(诸如T细胞)，其于其表面上表达根据本文所描述的caTCR中的任一者的caTCR及根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR，其中caTCR加CSR免疫细胞包括：a)第一载体，其包括：i)编码caTCR的第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列，及ii)编码caTCR的第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列，其中第一及第二caTCR核酸序列处于第一启动子的控制下；以及b)第二载体，其包括第三启动子，所述第三启动子可操作地连接于编码CSR的CSR多肽链的CSR核酸序列，其中第一及第二caTCR多肽链由第一及第二caTCR核酸序列表达以形成caTCR，且CSR多肽链由CSR核酸序列表达以形成CSR，且其中caTCR及CSR定位于免疫细胞的表面。在一些实施例中，第一启动子可操作地连接于第一caTCR核酸序列的5'端，且存在选自由内部核糖体进入位点(IRES)及编码自裂解2A肽(诸如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸组成的群组的核酸连接子以将第一caTCR核酸序列的3'端连接至第二caTCR核酸序列的5'端，其中第一caTCR核酸序列及第二caTCR核酸序列在启动子控制下转录为单一RNA。在一些实施例中，第一启动子可操作地连接于第二caTCR核酸序列的5'端，且存在选自由内部核糖体进入位点(IRES)及编码自裂解2A肽(诸如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸组成的群组的核酸连接子以将第二caTCR核酸序列的3'端连接至第一caTCR核酸序列的5'端，其中第一caTCR核酸序列及第二caTCR核酸序列在启动子控制下转录为单一RNA。在一些实施例中，第一及/或第二启动子具有相同序列。在一些实施例中，第一及/或第二启动子具有不同序列。在一些实施例中，第一及/或第二启动子为可诱导的。在一些实施例中，免疫细胞不表达TCR亚单位，caTCR的TCR-TM源自所述TCR亚单位。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRδ及γ链的序列，或免疫细胞为γδT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少其内源性TCR亚单位中的一或两者的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα及/或β链表达的αβT细胞，或者免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ及/或δ链表达的γδT细胞。在一些实施例中，免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，载体为整合于免疫细胞的宿主基因组中的病毒载体(诸如慢病毒载体)。应了解，也涵盖交换核酸序列中的任一者，诸如第一或第二caTCR核酸序列与CSR核酸序列交换的实施例。

在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞(诸如T细胞)，其于其表面上表达根据本文所描述的caTCR中的任一者的caTCR及根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR，其中caTCR加CSR免疫细胞包括载体，所述载体包括a)编码caTCR的第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列；b)编码caTCR的第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列；以及c)编码CSR的CSR多肽链的CSR核酸序列，其中第一及第二caTCR核酸序列以及CSR核酸序列处于单一启动子的控制下；且其中第一及第二caTCR多肽链由第一及第二caTCR核酸序列表达以形成caTCR，且CSR多肽链由CSR核酸序列表达以形成CSR，且其中caTCR及CSR定位于免疫细胞的表面。在一些实施例中，启动子可操作地连接于核酸序列中的一者，所述一者通过个别地选自由内部核糖体进入位点(IRES)及编码自裂解2A肽(诸如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸组成的群组的核酸连接子连接至其它核酸序列，使得第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列在启动子控制下转录为单一RNA。在一些实施例中，启动子为可诱导的。在一些实施例中，免疫细胞不表达TCR亚单位，caTCR的TCR-TM源自所述TCR亚单位。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为αβT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRδ及γ链的序列，或免疫细胞为γδT细胞且所引入caTCR的TCR-TM包括源自TCRα及β链的序列。在一些实施例中，免疫细胞经修饰以阻断或减少其内源性TCR亚单位中的一或两者的表达。举例来说，在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα及/或β链表达的αβT细胞，或者免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ及/或δ链表达的γδT细胞。在一些实施例中，免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，载体为整合于免疫细胞的宿主基因组中的病毒载体(诸如慢病毒载体)。

嵌合抗体/T细胞受体(caTCR)构筑体

在一个方面中，本文所描述的靶抗原特异性嵌合抗体/T细胞受体(caTCR)特异性结合于靶抗原(诸如细胞表面抗原或肽/MHC复合体)且能够募集至少一种TCR相关信号传导分子(诸如CD3δε、CD3γε、及/或ζζ)。在一些实施例中，抗caTCR包括天然存在的TCR域。在一些实施例中，caTCR包括至少一个非天然存在的TCR域。caTCR包括提供抗原特异性的抗原结合模块及允许CD3募集及信号传导的T细胞受体模块(TCRM)。抗原结合模块并非天然存在的T细胞受体抗原结合部分。在一些实施例中，抗原结合模块连接于TCRM中的多肽链的氨基端。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。TCRM包括源自一或多个TCR的跨膜域的跨膜模块(TCR-TM)，诸如αβ及/或γδTCR，且任选地进一步包括TCR的连接肽或其片段及/或一或多个TCR胞内域或其片段中的一或两者。在一些实施例中，TCRM包括两个多肽链，各多肽链从氨基端至羧基端包括连接肽、跨膜域及任选地存在的TCR胞内域。在一些实施例中，TCRM包括一或多个非天然存在的TCR域。举例来说，在一些实施例中，TCRM包括一或两个非天然存在的TCR跨膜域。非天然存在的TCR域可为天然存在的TCR的对应域，其通过一或多个氨基酸的取代及/或通过用来自另一TCR的类似域的一部分置换对应域的一部分而经修饰。caTCR可包括第一多肽链及第二多肽链，其中第一及第二多肽链一起形成抗原结合模块及TCRM。在一些实施例中，第一及第二多肽链为分开的多肽链，且caTCR为多聚体，诸如二聚体。在一些实施例中，第一及第二多肽链诸如通过肽键或通过另一化学键(诸如，二硫键)共价连接。在一些实施例中，第一多肽链及第二多肽链由至少一个二硫键连接。在一些实施例中，caTCR进一步包括一或多个T细胞协同刺激信号传导序列。一或多个协同刺激信号传导序列可个别地为协同刺激分子的胞内域的全部或一部分，包含例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体，及其类似物。在一些实施例中，一或多个协同刺激信号传导序列处于第一TCR-TM与第一TCR胞内域之间及/或第二TCR-TM与第二TCR胞内域之间。在一些实施例中，一或多个协同刺激信号传导序列处于第一TCRD及/或第二TCRD的羧基端。在一些实施例中，caTCR缺乏T细胞协同刺激信号传导序列。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，稳定模块位于抗原结合模块与TCRM之间。在一些实施例中，caTCR进一步包括处于任何两个caTCR模块或域之间的间隔模块。在一些实施例中，间隔模块包括连接两个caTCR模块或域的一或多个肽连接子。

本文所描述的caTCR可具有此部分中描述的一或多个特征。意在使本文所描述的caTCR的各组分(例如抗原结合模块、TCRD、TCR-TM、间隔模块、稳定模块、T细胞协同刺激序列及各种连接子等)的特征中的任一者可彼此组合、与CSR的特征中的任一者组合及与SSE的特征中的任一者组合，如同每一组合经个别描述一般。

在一些实施例中，抗原结合模块(诸如抗体部分)以下列亲和力或K_d特异性结合于靶抗原：a)所述亲和力为其对其它分子的结合亲和力的至少约10倍(包含例如至少约10、20、30、40、50、75、100、200、300、400、500、750、1000或更多倍中的任一者)；b)所述K_d不超过其结合于其它分子的K_d的约1/10(诸如不超过约1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/75、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/750、1/1000或更小中的任一者)。结合亲和力可通过所属领域中已知的方法测定，诸如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀分析(RIA)。K_d可通过所属领域中已知的方法测定，诸如利用例如Biacore仪器的表面等离子体共振(SPR)分析，或利用例如Sapidyne仪器的动力学排除分析(KinExA)。

稳定域的实例包含Fc区；铰链区；C_H3域；C_H4域；C_H1或C_L域；亮氨酸拉链域(例如jun/fos亮氨酸拉链域,参见例如Kostelney等人,J.Immunol,148:1547-1553,1992；或酵母菌GCN4亮氨酸拉链域)；异亮氨酸拉链域；二聚合细胞表面受体(例如介白素-8受体(IL-8R)或整合素杂二聚体(诸如LFA-1或GPIIIb/IIIa)的二聚合区；分泌性二聚合配体(例如神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、介白素-8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)或脑衍生神经营养因子(BDNF)；参见例如Arakawa等人,J.Biol.Chem.269:27833-27839,1994，及Radziejewski等人,Biochem.32:1350,1993)的二聚合区；卷曲螺旋二聚域(参见例如WO2014152878；Fletcher等人,ACS Synth.Biol.1:240-250,2012；及Thomas等人,J.Am.Chem.Soc.135(13):5161-5166,2013)；以及多肽，其包括至少一个半胱氨酸残基(例如约一个、两个或三个至约十个半胱氨酸残基)，使得可在所述多肽与包括至少一个半胱氨酸残基的第二多肽之间形成二硫键。

在一些实施例中，本文所描述的TCRM包括：a)第一T细胞受体域(TCRD)，其包括第一TCR跨膜域(TCR-TM)；及b)第二TCRD，其包括第二TCR-TM，其中TCRM有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，两个TCR-TM均为非天然存在的。在一些实施例中，第一TCR-TM源自T细胞受体(诸如αβTCR或γδTCR)的跨膜域中的一者，且第二TCR-TM源自T细胞受体的另一跨膜域。在一些实施例中，TCRM相较于包括天然存在的T细胞受体的跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。TCR相关信号传导分子的募集可通过所属领域中已知的方法测定，诸如TCR-CD3复合体表面表达的FACS分析或CD3亚单位与caTCR的共免疫沉淀。

举例来说，在一些实施例中，本文所描述的TCRM的第一TCR-TM包括TCRα链(例如GenBank寄存编号：CCI73895)的跨膜域或其变异体、基本上由其组成或由其组成；且TCRM的第二TCR-TM包括TCRβ链(例如GenBank寄存编号：CCI73893)的跨膜域或其变异体、基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，第一TCR-TM包括TCRδ链(例如Genbank寄存编号：AAQ57272)的跨膜域或其变异体、基本上由其组成或由其组成；且第二TCR-TM包括TCRγ链(例如Genbank寄存编号：AGE91788)的跨膜域或其变异体、基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，本文所描述的TCRM的第一及第二TCR-TM分别地包括以下跨膜域、基本上由其组成或由其组成：TCRα链恒定域(例如SEQ ID NO:1)的跨膜域或其变异体，及TCRβ链恒定域(例如SEQ ID NO:2)的跨膜域一其变异体。在一些实施例中，第一及第二TCR-TM分别包括以下跨膜域、基本上由其组成或由其组成：TCRδ链恒定域(例如SEQ ID NO:3)的跨膜域或其变异体，及TCRγ链恒定域(例如SEQ ID NO:4)的跨膜域或其变异体。在一些实施例中，第一及第二TCR-TM分别包括SEQ ID NO:5及6的氨基酸序列或其变异体、基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，第一及第二TCR-TM分别包括SEQ ID NO:7及8的氨基酸序列或其变异体、基本上由其组成或由其组成。相较于参考序列，跨膜域的变异体包含(但不限于)具有一或多个氨基酸取代的跨膜域。在一些实施例中，相较于参考序列，变异跨膜域包括不超过5个氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括在跨膜域的氨基端的第一连接肽及/或第二TCRD进一步包括在跨膜域的氨基端的第二连接肽。在一些实施例中，第一连接肽包括第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽中的全部或一部分或其变异体，及/或第二连接肽包括第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽中的全部或一部分或其变异体。在一些实施例中，第一及/或第二连接肽分别包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：TCRα链恒定域(例如SEQ ID NO:1)的连接肽中的全部或一部分或其变异体，及TCRβ链恒定域(例如SEQ ID NO:2)的连接肽中的全部或一部分或其变异体。在一些实施例中，第一及/或第二连接肽分别包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:27或28的连接肽中的全部或一部分或其变异体，及SEQ ID NO:29或30的连接肽中的全部或一部分或其变异体。在一些实施例中，第一及/或第二连接肽分别包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：TCRδ链恒定域(例如SEQ ID NO:3)的连接肽中的全部或一部分或其变异体，及TCRγ链恒定域(例如SEQ ID NO:4)的连接肽中的全部或一部分或其变异体。在一些实施例中，第一及/或第二连接肽分别包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:31或32的连接肽中的全部或一部分或其变异体，及SEQ ID NO:33或34的连接肽中的全部或一部分或其变异体。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括在第一TCR-TM的羧基端的第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括在第二TCR-TM的羧基端的第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域包括第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域中的全部或一部分或其变异体，及/或第二胞内域包括第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域中的全部或一部分或其变异体。在一些实施例中，第二TCR胞内域包括SEQ ID NO:35-36的氨基酸序列中的任一者或其变异体。在一些实施例中，第一TCRD为天然存在的TCR的一个链的片段或其变异体，及/或第二TCRD为天然存在的TCR的另一链的片段或其变异体。在一些实施例中，TCRD中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，第一及第二TCRD通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二TCRD通过第一连接肽中的残基与第二连接肽中的残基之间的二硫键连接。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM能够募集CD3δε、CD3γε及ζζ中的每一者以形成caTCR-CD3复合体(即，促进caTCR-CD3复合体形成)。

所涵盖的caTCR构筑体包括例如特异性结合于细胞表面抗原的caTCR、特异性结合于细胞表面呈递肽/MHC复合体的caTCR及特异性结合于细胞表面抗原及细胞表面呈递肽/MHC复合体两者的caTCR。

在一些实施例中，抗原结合模块为选自由以下组成的群组的抗体部分：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗体部分为单特异性的。在一些实施例中，抗体部分为多特异性的。在一些实施例中，抗体部分为双特异性的。在一些实施例中，抗体部分为串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双亲和力再靶向(DART)抗体、双可变域(DVD)抗体、化学交联的抗体、杂多聚体抗体或杂结合物抗体。在一些实施例中，抗体部分为包括两个通过肽连接子连接的scFv的串联scFv。在一些实施例中，抗体部分为不直接连接的两个scFv。在一些实施例中，抗体部分为全人类抗体部分、具有人类抗体框架区半合成抗体部分或人类化抗体部分。

在一些实施例中，抗原结合模块包括含V_H抗体域的第一抗原结合域及含V_L抗体域的第二抗原结合域。在一些实施例中，所有V_H抗体域及V_L抗体域CDR均源自同一抗体部分。在一些实施例中，一些V_H抗体域及V_L抗体域CDR均源自不同抗体部分。在一些实施例中，V_H抗体域及/或V_L抗体域为人类、人类化、嵌合、半合成或全合成抗体域。

在一些实施例中，抗原结合模块为包括全人类序列及一或多个合成区的半合成抗体部分。在一些实施例中，抗原结合模块为包括全人类V_L及半合成V_H的半合成抗体部分，其包括全人类FR1、HC-CDR1、FR2、HC-CDR2、FR3及FR4区以及合成HC-CDR3。在一些实施例中，半合成V_H包括全合成HC-CDR3，其序列长度为约5至约25(诸如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者)个氨基酸。在一些实施例中，半合成V_H或合成HC-CDR3获自半合成文库(诸如半合成人类文库)，所述半合成文库包括全合成HC-CDR3区，其序列长度为约5至约25(诸如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25中的任一者)个氨基酸，其中序列中的各氨基酸彼此独立地随机选自减去半胱氨酸的标准人类氨基酸。在一些实施例中，合成HC-CDR3的长度为约10至约19(诸如约10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中的任一者)个氨基酸。在一些实施例中，抗原结合模块为半合成抗体部分，其包括半合成V_L及半合成V_H。在一些实施例中，抗原结合模块为包括具有固定的人类V_H/V_L框架配对的全合成抗体部分，但重链及轻链的所有6种CDR为随机合成序列。

在一些实施例中，抗原结合模块为包括源自一或多个抗体部分(诸如单克隆抗体)或包括一或多个氨基酸取代的此类序列的某些变异体的特异性CDR序列的抗体部分。在一些实施例中，变异体序列中的氨基酸取代不基本上降低抗原结合模块结合靶抗原的能力。也涵盖基本上改进靶抗原结合亲和力或影响一些其它特性(诸如特异性及/或与靶抗原的相关变异体的交叉反应性)的改变。

在一些实施例中，稳定模块源自抗体部分。举例来说，在一些实施例中，稳定模块包括含C_H1抗体域或其变异体的第一稳定域，及含C_L抗体域或其变异体的第二稳定域。在另一实施例中，稳定模块包括含C_H3抗体域或其变异体的第一稳定域，及含C_H3抗体域或其变异体的第二稳定域。在一些实施例中，稳定模块中所含的抗体重链恒定域(例如，C_H1或C_H3)源自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgM或IgE重链，任选地为人类的。在一些实施例中，稳定模块中所含的抗体重链恒定域(例如C_H1或C_H3)为相较于所述抗体重链恒定域所源自的序列包括一或多个修饰(例如氨基酸取代、***及/或缺失)的变异体。在一些实施例中，稳定模块中所含的抗体轻链恒定域(C_L)源自κ或λ轻链，任选地为人类的。在一些实施例中，稳定模块中所含的抗体轻链恒定域(C_L)为相较于所述抗体轻链恒定域所源自的序列包括一或多个修饰(例如氨基酸取代、***及/或缺失)的变异体。在一些实施例中，第一及/或第二稳定域包括不基本上改变其彼此的结合亲和力的一或多个修饰。在一些实施例中，第一及/或第二稳定域包括增加其彼此的结合亲和力及/或引入非天然存在的二硫键的一或多个修饰。在一些实施例中，稳定模块包括杵-臼(knob-into-hole)修饰(参见例如Carter P.J Immunol Methods.248:7-15,2001)。举例来说，在一些实施例中，稳定模块包括含杵-臼修饰的抗体恒定域区(例如C_H3域)。在一些实施例中，稳定模块包括通过静电转向经修饰以增强其结合的抗体恒定域区(例如C_H3域)(参见例如WO2006106905及Gunasekaran K等人.J Biol Chem.285:19637-46,2010)。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。

在一些实施例中，caTCR包括连接于本文所描述的TCRM的本文所描述的抗原结合模块，任选地包含稳定模块。举例来说，在一些实施例中，caTCR包括连接于TCRD中的一或两者的N端的抗原结合模块。在一些实施例中，caTCR包括TCRM与抗原结合模块之间的稳定模块。在一些实施例中，caTCR进一步包括任何两个caTCR模块或域之间的间隔模块。在一些实施例中，间隔模块包括长度在约5至约70(诸如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70中的任一者，包含这些值之间的任何范围)个氨基酸之间的一或多个肽连接子。在一些实施例中，caTCR进一步包括一或多个辅助胞内域。在一些实施例中，所述一或多个辅助胞内域在第一及/或第二TCRD的羧基端。在一些实施例中，所述一或多个辅助胞内域在第一TCR-TM与第一TCR胞内域之间，及/或在第二TCR-TM与第二TCR胞内域之间。在一些实施例中，所述一或多个辅助胞内域个别地包括TCR协同刺激域。在一些实施例中，TCR协同刺激域包括免疫协同刺激分子(诸如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体及其类似者)的胞内域中的全部或一部分。在一些实施例中，TCR协同刺激域包括SEQ ID NO:51-56中的任一者的氨基酸序列或其变异体的全部或一部分。

在一些实施例中，抗原结合模块特异性结合细胞表面抗原。在一些实施例中，细胞表面抗原是选自由蛋白质、碳水化合物及脂质组成的群组。在一些实施例中，细胞表面抗原为于病变细胞中表达的疾病相关抗原。在一些实施例中，抗原结合模块特异性结合包括肽与MHC蛋白的复合体。肽/MHC复合体包含例如表面呈递复合体，其包括源自在病变细胞中表达的疾病相关抗原的肽及MHC蛋白。在一些实施例中，全长疾病相关抗原通常不表达于病变细胞(例如，疾病相关抗原为胞内或分泌蛋白)的表面上。在一些实施例中，疾病为癌症且疾病相关抗原为在癌细胞中表达的肿瘤相关抗原。在一些实施例中，肿瘤相关抗原为癌蛋白。在一些实施例中，癌蛋白为原癌基因的突变结果，且癌蛋白包括含突变的新生抗原决定基。举例来说，在一些实施例中，抗原结合模块特异性结合细胞表面肿瘤相关抗原(例如包括新生抗原决定基的癌蛋白)。在一些实施例中，抗原结合模块特异性结合包括源自不通常在癌细胞表面上表达的肿瘤相关抗原(例如包括新生抗原决定基的癌蛋白)(例如胞内或分泌肿瘤相关抗原)的肽与MHC蛋白的复合体。在一些实施例中，疾病为病毒感染且疾病相关抗原为在感染细胞中表达的病毒相关抗原。举例来说，在一些实施例中，抗原结合模块特异性结合细胞表面病毒相关抗原。在一些实施例中，抗原结合模块特异性结合包括源自通常不在病毒感染细胞表面上表达的病毒相关抗原(例如胞内或分泌病毒相关抗原)的肽与MHC蛋白的复合体。在一些实施例中，caTCR构筑体以约0.1pM至约500nM(诸如约0.1pM、1.0pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM、50nM、100nM或500nM中的任一者，包含这些值之间的任何范围)之间的K_d结合靶抗原。

在一些实施例中，caTCR包括特异性结合于细胞表面抗原的抗原结合模块，其中细胞表面抗原为CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5，包含其变异体或突变体。与例如细胞表面抗原的完全抗原的特异性结合有时被称作“非MHC限制结合”。

在一些实施例中，caTCR包括特异性结合于包括肽与MHC蛋白的复合体的抗原结合模块，其中肽源自选自由以下组成的群组的蛋白质：WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。与包括肽与MHC蛋白的复合体的特异性结合有时被称作“MHC限制结合”。

在一些实施例中，caTCR包括特异性结合于包括源自疾病相关抗原(诸如肿瘤相关或病毒编码抗原)的肽与MHC I类蛋白质的复合体的抗原结合模块，其中MHC I类蛋白质为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A、HLA-B或HLA-C。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-B。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-C。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A01、HLA-A02、HLA-A03、HLA-A09、HLA-A10、HLA-A11、HLA-A19、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A28、HLA-A29、HLA-A30、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A36、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69、HLA-A74或HLA-A80。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A02。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A*02:01-555中的任一者，诸如HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:04、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、HLA-A*02:08、HLA-A*02:09、HLA-A*02:10、HLA-A*02:11、HLA-A*02:12、HLA-A*02:13、HLA-A*02:14、HLA-A*02:15、HLA-A*02:16、HLA-A*02:17、HLA-A*02:18、HLA-A*02:19、HLA-A*02:20、HLA-A*02:21、HLA-A*02:22或HLA-A*02:24。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A*02:01。

在一些实施例中，caTCR包括特异性结合于包括源自疾病相关抗原(诸如肿瘤相关或病毒编码抗原)的肽与MHC II类蛋白质的复合体的抗原结合模块，其中MHC II类蛋白质为HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR。在一些实施例中，MHC II类蛋白质为HLA-DP。在一些实施例中，MHC II类蛋白质为HLA-DQ。在一些实施例中，MHC II类蛋白质为HLA-DR。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR包括：a)特异性结合于靶抗原的抗原结合模块，及b)包括源自TCR(诸如αβTCR或γδTCR)的跨膜域的第一及第二TCR-TM的TCRM，其中TCRM能够募集至少一种TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，抗原结合模块连接于TCRM中的一或多个多肽链的氨基端。举例来说，在一些实施例中，TCRM包括两个多肽链，且抗原结合模块连接于TCRM多肽链中的一或两者的氨基端。在一些实施例中，第一及第二TCR-TM为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，第一及第二TCR-TM为非天然存在的。在一些实施例中，TCRM进一步包括在TCR-TM的氨基端的TCR的至少一个连接肽或其片段。在一些实施例中，TCRM进一步包括至少一个TCR胞内域，其包括来自在TCR-TM的羧基端的TCR的胞内域的序列。在一些实施例中，TCRM包括源自TCR链的片段的TCRD。在一些实施例中，TCRD中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括在TCR-TM的羧基端的T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR缺乏协同刺激信号传导序列。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分包括V_H抗体域及V_L抗体域。在一些实施例中，抗体部分为人类、人类化、嵌合、半合成或全合成的。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，稳定模块包括连接稳定域的至少一个二硫键。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，caTCR为杂多聚体，诸如杂二聚体。举例来说，在一些实施例中，caTCR为杂二聚体，其包括含有第一TCRD的第一多肽链及含有第二TCRD的第二多肽链，其中所述抗原结合模块连接于第一及/或第二多肽链。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自TCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自TCR的另一跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，TCR为αβTCR，且第一及第二TCR-TM源自TCRα及β亚单位跨膜域。在一些实施例中，TCR为γδTCR，且第一及第二TCR-TM源自TCRγ及δ亚单位跨膜域。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽包括第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽的全部或一部分或其变异体，及/或第二连接肽包括第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽的全部或一部分或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域包括来自第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域的序列，及/或第二TCR胞内域包括来自第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域的序列。在一些实施例中，第一TCRD为第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的片段，及/或第二TCRD为第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的片段。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自天然存在的αβTCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自天然存在的αβTCR的另一跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽包括第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽的全部或一部分或其变异体，及/或第二连接肽包括第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽的全部或一部分或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域包括来自第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域的序列，及/或第二TCR胞内域包括来自第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域的序列。在一些实施例中，第一TCRD为第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的片段，及/或第二TCRD为第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的片段。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括天然存在的αβT细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自天然存在的γδTCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自天然存在的γδTCR的另一跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽包括第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽的全部或一部分或其变异体，及/或第二连接肽包括第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽的全部或一部分或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域包括来自第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域的序列，及/或第二TCR胞内域包括来自第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域的序列。在一些实施例中，第一TCRD为第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的片段，及/或第二TCRD为第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的片段。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括天然存在的γδT细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的一者中所含的跨膜域的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列中所含的跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列中的任一者中所含的连接肽的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4中的任一者中所含的胞内域的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:1及2中所含的跨膜域的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的一者中所含的跨膜域的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列中所含的跨膜域的第二TCR-TM，其中TCR-TM中的至少一者相较于所述TCR-TM所源自的氨基酸序列包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代，且第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者相较于其所源自的氨基酸序列彼此独立地包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM及/或第二TCR-TM相较于其所源自的氨基酸序列各自彼此独立地包括不超过5个氨基酸取代。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者经定位使得其在caTCR中可与第二TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者相互作用。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列中的任一者中所含的连接肽的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4中的任一者中所含的胞内域的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:1及2中所含的跨膜域的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的一者中所含的跨膜域的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列中所含的跨膜域的第二TCR-TM，其中TCR-TM中的至少一者包括含有来自SEQ ID NO:3或4中所含的跨膜域的相连氨基酸中的一部分的嵌合序列，且第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者彼此独立地包括含有来自SEQ ID NO:3或4中所含的跨膜域的相连氨基酸中的一部分的嵌合序列。在一些实施例中，第一TCR-TM及/或第二TCR-TM各自彼此独立地包括含有来自SEQ ID NO:3或4中所含的跨膜域的一部分不超过约10(诸如不超过约9、8、7、6、5或更少)个连续氨基酸的嵌合序列。在一些实施例中，第一或第二TCR-TM中的嵌合序列来自SEQ ID NO:3中所含的跨膜域，且另一TCR-TM中的嵌合序列来自SEQ ID NO:4中所含的跨膜域。在一些实施例中，第一TCR-TM中的嵌合序列经定位使得其可与第二TCR-TM中的嵌合序列相互作用。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列中的任一者中所含的连接肽的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4中的任一者中所含的胞内域的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:1及2中所含的跨膜域的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的一者中所含的跨膜域的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列中所含的跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列中的任一者中所含的连接肽的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4中的任一者中所含的胞内域的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:3及4中所含的跨膜域的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的一者中所含的跨膜域的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列中所含的跨膜域的第二TCR-TM，其中TCR-TM中的至少一者相较于其所源自的氨基酸序列包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代，且第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者相较于其所源自的氨基酸序列彼此独立地包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM及/或第二TCR-TM相较于其所源自的氨基酸序列各自彼此独立地包括不超过5个氨基酸取代。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者经定位使得其在caTCR中可与第二TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者相互作用。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列中的任一者中所含的连接肽的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4中的任一者中所含的胞内域的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:3及4中所含的跨膜域的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:31及SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的一者中所含的跨膜域的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列中所含的跨膜域的第二TCR-TM，其中TCR-TM中的至少一者包括含有来自SEQ ID NO:1或2中所含的跨膜域的相连氨基酸中的一部分的嵌合序列，且第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者彼此独立地包括含有来自SEQ ID NO:1或2中所含的跨膜域的相连氨基酸中的一部分的嵌合序列。在一些实施例中，第一TCR-TM及/或第二TCR-TM各自彼此独立地包括含有来自SEQ ID NO:1或2中所含的跨膜域的一部分不超过约10(诸如不超过约9、8、7、6、5或更少)个连续氨基酸的嵌合序列。在一些实施例中，第一或第二TCR-TM中的嵌合序列来自SEQ ID NO:1中所含的跨膜域，且另一TCR-TM中的嵌合序列来自SEQ ID NO:2中所含的跨膜域。在一些实施例中，第一TCR-TM中的嵌合序列经定位使得其可与第二TCR-TM中的嵌合序列相互作用。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列中的任一者中所含的连接肽的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:1-4中的任一者中所含的胞内域的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:3及4中所含的跨膜域的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ IDNO:5及6的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列的第二TCR-TM，其中TCR-TM中的至少一者相较于其所源自的氨基酸序列包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代，且第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者相较于其所源自的氨基酸序列彼此独立地包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM及/或第二TCR-TM相较于其所源自的氨基酸序列各自彼此独立地包括不超过5个氨基酸取代。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者经定位使得其在caTCR中可与第二TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者相互作用。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:5及6的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列的第二TCR-TM，其中TCR-TM中的至少一者包括含有来自SEQ ID NO:7或8的相连氨基酸中的一部分的嵌合序列，且第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者彼此独立地包括包括有来自SEQ ID NO:7或8的相连氨基酸中的一部分的嵌合序列。在一些实施例中，第一TCR-TM及/或第二TCR-TM各自彼此独立地包括含有来自SEQ ID NO:7或8的一部分不超过约10(诸如不超过约9、8、7、6、5或更少)个连续氨基酸的嵌合序列。在一些实施例中，第一或第二TCR-TM中的嵌合序列来自SEQ ID NO:7，且另一TCR-TM中的嵌合序列来自SEQ IDNO:8。在一些实施例中，第一TCR-TM中的嵌合序列经定位使得其可与第二TCR-TM中的嵌合序列相互作用。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:5及6的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8的氨基酸序列中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ IDNO:7及8的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8的氨基酸序列中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列的第二TCR-TM，其中TCR-TM中的至少一者相较于其所源自的氨基酸序列包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代，且第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者相较于其所源自的氨基酸序列彼此独立地包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM及/或第二TCR-TM相较于其所源自的氨基酸序列各自彼此独立地包括不超过5个氨基酸取代。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者经定位使得其在caTCR中可与第二TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者相互作用。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:7及8的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8的氨基酸序列中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自另一氨基酸序列的第二TCR-TM，其中TCR-TM中的至少一者包括含有来自SEQ ID NO:5或6的相连氨基酸中的一部分的嵌合序列，且第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，TCR-TM中的每一者彼此独立地包括包括有来自SEQ ID NO:5或6的相连氨基酸中的一部分的嵌合序列。在一些实施例中，第一TCR-TM及/或第二TCR-TM各自彼此独立地包括含有来自SEQ ID NO:5或6的一部分不超过约10(诸如不超过约9、8、7、6、5或更少)个连续氨基酸的嵌合序列。在一些实施例中，第一或第二TCR-TM中的嵌合序列来自SEQ ID NO:5，且另一TCR-TM中的嵌合序列来自SEQ IDNO:6。在一些实施例中，第一TCR-TM中的嵌合序列经定位使得其可与第二TCR-TM中的嵌合序列相互作用。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽及第二连接肽各自彼此独立地包括SEQ ID NO:27-34中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域及第二TCR胞内域各自彼此独立地包括SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:7及8的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(诸如双特异性的)。

不同方面更详细地论述于下文各部分中。

TCR-TM变异体

在一些实施例中，caTCR的TCR-TM源自T细胞受体，其中TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。源自T细胞受体的非天然存在的TCR-TM包含来自T细胞受体的跨膜域，其已通过取代一或多个氨基酸来修饰。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者邻近(在一级序列上或空间上)TCRM中参与结合CD3的氨基酸。举例来说，在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者与TCRM中参与结合CD3的氨基酸间隔不超过3(诸如0、1、2或3)个氨基酸。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者与TCRM中参与结合CD3的氨基酸间隔不超过约15(诸如不超过约14、12、10、8、6、4、2或1中的任一者)埃。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。

举例来说，在一些实施例中，源自T细胞受体的非天然存在的TCR-TM包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：通过一或多个氨基酸残基的取代修饰的α、β、γ或δTCR亚单位的跨膜域。在一些实施例中，TCR亚单位的跨膜域通过不超过5个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，TCR亚单位的跨膜域通过单一氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。

因此，在一些实施例中，源自本文所描述的T细胞受体的非天然存在的TCR-TM包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：包括SEQ ID NO:1中所含的跨膜域(例如SEQ IDNO:5)的氨基酸序列的αTCR亚单位的跨膜域，所述跨膜域通过一或多个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，αTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:1中所含的跨膜域中的不超过5个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，αTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:1中所含的跨膜域中的单一氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。

在一些实施例中，源自本文所描述的T细胞受体的非天然存在的TCR-TM包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列的的αTCR亚单位的跨膜域，所述跨膜域通过一或多个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，αTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:5中的不超过5个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，αTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:5中的单一氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。

在一些实施例中，源自本文所描述的T细胞受体的非天然存在的TCR-TM包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：包括SEQ ID NO:2中所含的跨膜域(例如SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的βTCR亚单位的跨膜域，所述跨膜域通过一或多个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，βTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:2中所含的跨膜域中的不超过5个氨基酸残基取代修饰。在一些实施例中，βTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:2中所含的跨膜域中的单一氨基酸残基取代修饰。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。

在一些实施例中，源自本文所描述的T细胞受体的非天然存在的TCR-TM包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的βTCR亚单位的跨膜域，所述跨膜域通过一或多个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，βTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:6中的不超过5个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，βTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:6中的单一氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。

在一些实施例中，源自本文所描述的T细胞受体的非天然存在的TCR-TM包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：包括SEQ ID NO:3中所含的跨膜域(例如SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的δTCR亚单位的跨膜域，所述跨膜域通过一或多个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，δTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:3中的不超过5个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，δTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:3中的单一氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。

在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:3中所含的跨膜域(例如SEQ ID NO:7)的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:7中的以下的氨基酸中的一或多个取代(诸如经更具疏水性的残基取代)经修饰：L4、M6、V12、N15、F245及L25。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:3中所含的跨膜域的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:7中的V12及N15的氨基酸中的取代(诸如用更具疏水性的残基取代)修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:3中所含的跨膜域的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:7中的以下取代的一或多个取代修饰：L4C、M6V、V12F、N15S、F245S及L25S。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:3中所含的跨膜域的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:7中的V12F及N15S取代的取代修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:9-13中的任一者的氨基酸序列。

在一些实施例中，源自本文所描述的T细胞受体的非天然存在的TCR-TM包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的δTCR亚单位的跨膜域，其通过一或多个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，δTCR亚单位的跨膜域通过SEQID NO:7中的不超过5个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，δTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:7中的单一氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。

在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:7中的以下氨基酸的氨基酸中的一或多个取代(诸如用更具疏水性的残基取代)修饰：L4、M6、V12、N15、F245及L25。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ IDNO:7的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:7中的V12及N15的氨基酸中的取代(诸如用更具疏水性的残基取代)修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:7中的以下取代的一或多个取代修饰：L4C、M6V、V12F、N15S、F245S及L25S。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:7中的V12F及N15S的取代修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:9-13中的任一者的氨基酸序列。

在一些实施例中，源自本文所描述的T细胞受体的非天然存在的TCR-TM包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：包括SEQ ID NO:4中所含的跨膜域(例如SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的γTCR亚单位的跨膜域，其通过一或多个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，γTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:4中所含的跨膜域中的不超过5个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，γTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:4中所含的跨膜域中的单一氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。

在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:4中所含的跨膜域(例如SEQ ID NO:8)的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的以下氨基酸的氨基酸中的一或多个取代(诸如用更具疏水性的残基取代)修饰：Y1、Y2、M3、L5、L8、V12、V13、F15、A16、I18、C19、C20及C21。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:4中所含的跨膜域的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的Y2、M3、A16及I18的氨基酸中的取代(诸如用更具疏水性的残基取代)修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:4中所含的跨膜域的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的L8、V12及F15的氨基酸中的取代(诸如用更具疏水性的残基取代)修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQID NO:4中所含的跨膜域的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的以下取代的一或多个取代修饰：Y1Q、Y2L、Y2I、M3V、M3I、L5C、L8F、V12F、V13Y、F15S、A16V、A16I、I18V、I18L、C19M、C20M及C21G。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:4中所含的跨膜域的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的Y2L、M3V、A16V及I18V取代的取代修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:4中所含的跨膜域的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的Y2I、M3I、A16I及I18L取代的取代修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:4中所含的跨膜域的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的L8F、V12F及F15S取代的取代修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ IDNO:14-26中的任一者的氨基酸序列。

在一些实施例中，源自本文所描述的T细胞受体的非天然存在的TCR-TM包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的γTCR亚单位的跨膜域，其通过一或多个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，γTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:8中的不超过5个氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，γTCR亚单位的跨膜域通过SEQ ID NO:8中的单一氨基酸残基的取代修饰。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者经比对应未经取代残基更具疏水性的残基取代。在一些实施例中，经取代氨基酸中的至少一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。在一些实施例中，经取代氨基酸中的每一者邻近TCRM中参与结合CD3的氨基酸。

在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的以下氨基酸的氨基酸中的一或多个取代(诸如用更具疏水性的残基取代)修饰：Y1、Y2、M3、L5、L8、V12、V13、F15、A16、I18、C19、C20及C21。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的Y2、M3、A16及I18的氨基酸中的取代(诸如用更具疏水性的残基取代)修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的L8、V12及F15的氨基酸中的取代(诸如用更具疏水性的残基取代)修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的以下取代的一或多个取代修饰：Y1Q、Y2L、Y2I、M3V、M3I、L5C、L8F、V12F、V13Y、F15S、A16V、A16I、I18V、I18L、C19M、C20M及C21G。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的Y2L、M3V、A16V及I18V取代的取代修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的Y2I、M3I、A16I及I18L取代的取代修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其通过对应于SEQ ID NO:8中的L8F、V12F及F15S取代的取代修饰。在一些实施例中，非天然存在的TCR-TM包括SEQ ID NO:14-26中的任一者的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括含有SEQ ID NO:7及9-13的氨基酸序列中的任一者、基本上由其组成或由其组成的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括含有SEQ ID NO:8及14-26中的任一者的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗原结合模块，其特异性结合于靶抗原，其中抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，第一TCR-TM及第二TCR-TM是根据表2中所列的caTCR中的任一者选择。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽包括SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列或其变异体，及/或第二连接肽包括SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第二TCR胞内域包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:7及8的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。

表2

抗原结合模块

在一些实施例中，根据本文所描述的caTCR中的任一者，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分选自由以下组成的群组：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv及单链Fv(scFv)。在一些实施例中，当抗体部分为包括第一抗体部分链及第二抗体部分链的多聚体时，caTCR包括连接于第一或第二抗体部分链的第一TCRD及连接于另一抗体部分链的第二TCRD。在一些实施例中，抗体部分特异性结合细胞表面抗原，包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，抗体部分特异性地结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。

在一些实施例中，根据本文所描述的caTCR中的任一者，抗原结合模块为包括C_H1及C_L域的抗体部分。在一些实施例中，C_H1域源自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)重链，任选地为人类的。在一些实施例中，C_H1域为相较于其所源自的序列包括一或多个修饰(例如氨基酸取代、***及/或缺失)的变异体。在一些实施例中，C_H1域包括SEQ ID NO:37-47中的任一者的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，C_H1域包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，C_L域源自κ或λ轻链，任选地为人类的。在一些实施例中，C_L域为相较于其所源自的序列包括一或多个修饰(例如氨基酸取代、***及/或缺失)的变异体。在一些实施例中，C_L域包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，C_H1及/或C_L域包括基本上不改变其彼此的结合亲和力的一或多个修饰。在一些实施例中，C_H1及/或C_L域包括增加其彼此的结合亲和力及/或引入非天然存在的二硫键的一或多个修饰。

在一些实施例中，根据本文所描述的caTCR中的任一者包括特异性结合于靶抗原的抗体部分，所述抗体部分包括对靶抗原具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD19具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2017066136A2)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD19具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:59的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD20具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQ ID NO:60的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD22具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如2018年3月30日提交的USSN 62/650,955，其内容以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD22具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQ IDNO:101的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:102的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对GPC3具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如2017年4月26日提交的USSN 62/490,586，其内容以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，抗体部分包括对GPC3具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如V_H域，其包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对ROR1具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/187220及WO2016/187216)。在一些实施例中，抗体部分包括对ROR2具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/142768)。在一些实施例中，抗体部分包括对BCMA具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/090327及WO2016/090320)。在一些实施例中，抗体部分包括对GPRC5D具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/090329及WO2016/090312)。在一些实施例中，抗体部分包括对FCRL5具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/090337)。在一些实施例中，抗体部分包括对WT-1具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2012/135854、WO2015/070078及WO2015/070061)。在一些实施例中，抗体部分包括对AFP具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/161390)。在一些实施例中，抗体部分包括对HPV16-E7具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/182957)。在一些实施例中，抗体部分包括对NY-ESO-1具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/210365)。在一些实施例中，抗体部分包括对PRAME具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/191246)。在一些实施例中，抗体部分包括对EBV-LMP2A具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/201124)。在一些实施例中，抗体部分包括对KRAS具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/154047)。在一些实施例中，抗体部分包括对PSA具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2017/015634)。在一些实施例中，抗体部分为Fab，其包括：一个Fab链，其包括V_H域及C_H1域；及另一Fab链，其包括V_L域及C_L域。在一些实施例中，C_H1域包括SEQ ID NO:37-47中的任一者的氨基酸序列，及/或C_L域包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施例中，C_H1域包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，且C_L域包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

caTCR构筑体

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括源自TCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自TCR的另一跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗体部分，其特异性结合于靶抗原，其中抗体部分连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，抗体部分选自由以下组成的群组：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv及单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗体部分特异性结合细胞表面抗原，包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，抗体部分特异性地结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，稳定模块位于TCRM与抗体部分之间。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括含有SEQ ID NO:7及9-13的氨基酸序列中的任一者、基本上由其组成或由其组成的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括含有SEQ ID NO:8及14-26中的任一者的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗体部分，其特异性结合于靶抗原，其中抗体部分连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，第一TCR-TM及第二TCR-TM是根据表2中所列的caTCR中的任一者选择。在一些实施例中，抗体部分选自由以下组成的群组：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv及单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗体部分特异性结合细胞表面抗原，包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，抗体部分特异性地结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽包括SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列或其变异体，及/或第二连接肽包括SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第二TCR胞内域包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:7及8的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括第二TCR-TM，其中第一及第二TCR-TM分别包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:7及8、9及8、7及14、7及15、7及16、10及16、7及17、7及18、7及19、7及20、7及21、7及22、11及23、12及24、7及25或13及26的氨基酸序列，且其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗体部分，其特异性结合于靶抗原，其中抗体部分连接于第一及/或第二TCRD。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，所述caTCR包括：a)第一TCRD，其包括含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)抗体部分，其特异性结合于靶抗原，其中抗体部分连接于第一及/或第二TCRD。在一些实施例中，抗体部分选自由以下组成的群组：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv及单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗体部分特异性结合细胞表面抗原，包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，抗体部分特异性地结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽包括SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列或其变异体，及/或第二连接肽包括SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第二TCR胞内域包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:7及8的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，其包括：a)第一多肽链，其包括含有第一Fab链的第一抗原结合域，所述第一Fab链连接于包括源自TCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM的第一TCRD；及b)第二多肽链，其包括含有第二Fab链的第二抗原结合域，所述第二Fab链连接于包括源自TCR的另一跨膜域的第二TCR-TM的第二TCRD，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，且其中第一及第二Fab链形成特异性结合靶抗原的Fab样抗原结合模块。在一些实施例中，a)第一Fab链包括V_H及C_H1抗体域，且第二Fab链包括V_L及C_L抗体域；或b)第一Fab链包括V_L及C_L抗体域，且第二Fab链包括V_H及C_H1抗体域。举例来说，在一些实施例中，caTCR包括：a)第一多肽链，其包括连接于第一TCRD、包括V_H及C_H1抗体域的第一Fab链；及b)第二Fab链，其连接于第二TCRD、包括V_L及C_L抗体域。在一些实施例中，caTCR包括：a)第一Fab链，其连接于第一TCRD、包括V_L及C_L抗体域；及b)第二Fab链，其连接于第二TCRD、包括V_H及C_H1抗体域。在一些实施例中，在TCRD中的一或两者与其连接的Fab链之间存在肽连接子。在一些实施例中，在C_H1域中的残基与C_L域中的残基之间存在二硫键。在一些实施例中，C_H1及/或C_L域包括增加Fab链彼此的结合亲和力的一或多个修饰。在一些实施例中，交换C_H1及C_L域，使得Fab链中的一者包括V_H及C_L抗体域，且另一Fab链包括V_L及C_H1抗体域。在一些实施例中，Fab样抗原结合模块特异性结合细胞表面抗原，包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，Fab样抗原结合模块特异性结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一或第二稳定域位于第一TCRD与其连接的Fab链之间，且另一稳定稳定位于第二TCRD与其连接的Fab链之间。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，其包括：a)第一多肽链，其包括含有第一Fab链的第一抗原结合域，所述第一Fab链连接于包括含有SEQ ID NO:7及9-13的氨基酸序列中的任一者、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成的第一TCR-TM的第一TCRD；及b)第二多肽链，其包括含有第二Fab链的第二抗原结合域，所述第二Fab链连接于包括含有SEQ ID NO:8及14-26中的任一者的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成的第二TCR-TM的第二TCRD，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，且其中第一及第二Fab链形成特异性结合靶抗原的Fab样抗原结合模块。在一些实施例中，第一TCR-TM及第二TCR-TM是根据表2中所列的caTCR中的任一者选择。在一些实施例中，a)第一Fab链包括V_H及C_H1抗体域，且第二Fab链包括V_L及C_L抗体域；或b)第一Fab链包括V_L及C_L抗体域，且第二Fab链包括V_H及C_H1抗体域。在一些实施例中，C_H1域包括SEQ ID NO:37-47中的任一者的氨基酸序列，及/或C_L域包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施例中，C_H1域包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，且C_L域包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，Fab样抗原结合模块特异性结合细胞表面抗原，包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，Fab样抗原结合模块特异性结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽包括SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列或其变异体，及/或第二连接肽包括SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第二TCR胞内域包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:7及8的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，其包括：a)第一多肽链，其包括含有第一Fab链的第一抗原结合域，所述第一Fab链连接于包括第一TCR-TM的第一TCRD及第二多肽链，其包括含有第二Fab链的第二抗原结合域，所述第二Fab链连接于包括第二TCR-TM的第二TCRD，其中第一及第二TCR-TM分别包括以下氨基酸序列、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:7及8、9及8、7及14、7及15、7及16、10及16、7及17、7及18、7及19、7及20、7及21、7及22、11及23、12及24、7及25或13及26，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，且其中第一及第二Fab链形成特异性结合靶抗原的Fab样抗原结合模块。在一些实施例中，a)第一Fab链包括V_H及C_H1抗体域，且第二Fab链包括V_L及C_L抗体域；或b)第一Fab链包括V_L及C_L抗体域，且第二Fab链包括V_H及C_H1抗体域。在一些实施例中，C_H1域包括SEQ ID NO:37-47中的任一者的氨基酸序列，及/或C_L域包括SEQ IDNO:48的氨基酸序列。在一些实施例中，C_H1域包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成，且C_L域包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，Fab样抗原结合模块特异性结合细胞表面抗原，包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，Fab样抗原结合模块特异性结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽包括SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列或其变异体，及/或第二连接肽包括SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第二TCR胞内域包括SEQID NO:36的氨基酸序列或其变异体。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括具有SEQ ID NO:7及8的序列的T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，其包括a)第一TCRD，其包括衍生自天然存在的TCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括衍生自天然存在的TCR的另一跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，且其中第一及/或第二TCR-TM为非天然存在的；及b)Fab'，其特异性结合于靶抗原，其中Fab'包括含有V_H、C_H1及部分铰链抗体域的第一Fab'链，及含有V_L及C_L抗体域的第二Fab'链，且其中第一Fab'链连接于第一或第二TCRD，且第二Fab'链连接于另一TCRD。在一些实施例中，在TCRD中的一或两者与其连接的Fab'链之间存在肽连接子。在一些实施例中，在C_H1域中的残基与C_L域中的残基之间存在二硫键。在一些实施例中，C_H1及/或C_L域包括增加Fab'链彼此的结合亲和力的一或多个修饰。在一些实施例中，交换C_H1及C_L域，使得第一Fab'链包括V_H、C_L及部分铰链抗体域，且第二Fab'链包括V_L及C_H1域。在一些实施例中，Fab'特异性地结合细胞表面抗原，包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，Fab'特异性地结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一或第二稳定域位于第一TCRD与其连接的Fab'链之间，且另一稳定稳定位于第二TCRD与其连接的Fab'链之间。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，其包括：a)第一TCRD，其包括源自TCR的跨膜域中的一者第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自TCR的其它跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)(Fab')2，其特异性结合于靶抗原，其中(Fab')2包括：第一及第二(Fab')2链，其包括V_H、C_H1及部分铰链抗体域；及第三及第四(Fab')2链，其包括V_L及C_L抗体域，且其中第一(Fab')2链连接于第一或第二TCRD，且第二(Fab')2链连接于另一TCRD。在一些实施例中，在TCRD中的一或两者与其连接的(Fab')2链之间存在肽连接子。在一些实施例中，在C_H1域中的残基与C_L域中的残基之间存在二硫键。在一些实施例中，C_H1及/或C_L域包括增加(Fab')2链彼此的结合亲和力的一或多个修饰。在一些实施例中，交换C_H1及C_L域，使得第一及第二(Fab')2链包括V_H、C_L及部分铰链抗体域，且第三及第四(Fab')2链包括V_L及C_H1域。在一些实施例中，(Fab')2特异性结合细胞表面抗原，包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，(Fab')2特异性结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一或第二稳定域位于第一TCRD与其连接的(Fab')2链之间，且另一稳定稳定位于第二TCRD与其连接的(Fab')2链之间。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，其包括：a)第一TCRD，其包括源自TCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自TCR的其它跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)Fv，其特异性结合于靶抗原，其中Fv包括含有V_H抗体域的第一Fv链及含V_L抗体域的第二Fv链，且其中第一Fv链连接于第一或第二TCRD且第二Fv链连接于另一TCRD。在一些实施例中，在TCRD中的一或两者与其连接的Fv链之间存在肽连接子。在一些实施例中，Fv特异性结合细胞表面抗原，包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，Fv特异性结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一或第二稳定域位于第一TCRD与其连接的Fv链之间，且另一稳定稳定位于第二TCRD与其连接的Fv链之间。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性结合靶抗原，其包括：a)第一TCRD，其包括源自TCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自TCR的另一跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)第一scFv，其特异性地结合于靶抗原，其中第一scFv包括V_H及V_L抗体域，且其中第一scFv连接于第一或第二TCRD。在一些实施例中，caTCR进一步包括连接于第一scFv或连接于未连接于第一scFv的TCRD的第二抗原结合模块。在一些实施例中，第二抗原结合模块特异性地结合于靶抗原。在一些实施例中，第二抗原结合模块特异性地结合于不同于靶抗原的抗原。在一些实施例中，第二抗原结合模块为第二scFv。在一些实施例中，在第一scFv与其连接的TCRD之间或在第二抗原结合模块与其连接的scFv或TCRD之间存在肽连接子。在一些实施例中，scFv特异性地结合细胞表面抗原，其包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，scFv特异性地结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，所述蛋白质包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一或第二稳定域位于第一scFv与其连接的TCRD之间，且另一稳定域连接于第二TCRD。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。

在一些实施例中，本文所描述的caTCR特异性地结合靶抗原，其包括a)第一TCRD，其包括源自TCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM；及第二TCRD，其包括源自TCR的另一跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)第一scFv，其特异性地结合于靶抗原及第二scFv，其中第一及第二scFv包括V_H及V_L抗体域，且其中第一scFv连接于第一或第二TCRD且第二scFv连接于另一TCRD。在一些实施例中，第二TCRD特异性地结合于靶抗原。在一些实施例中，第二scFv包括第一scFv的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，第二scFv特异性地结合于不同于靶抗原的抗原。在一些实施例中，第一及/或第二scFv单独特异地性结合细胞表面抗原，其包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体及突变体。在一些实施例中，第一及/或第二scFv单独特异性地结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一或第二稳定域位于第一scFv与其连接的TCRD之间，且另一稳定域位于第二scFv与其连接的TCRD之间。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。

多特异性caTCR

在一些实施例中，caTCR为特异性地结合于两个或多于两个(例如2、3、4或更多个)不同靶抗原或抗原决定基的多特异性caTCR。在一些实施例中，多特异性caTCR特异性地结合于两个或多于两个(例如2、3、4或更多个)不同靶抗原。在一些实施例中，多特异性caTCR特异性地结合于相同靶抗原上的两个或多于两个(例如2、3、4或更多个)不同抗原决定基。在一些实施例中，多特异性caTCR包括用于各抗原或抗原决定基的抗原结合模块。在一些实施例中，多特异性caTCR包括用于至少一个抗原或抗原决定基的超过两个抗原结合模块。在一些实施例中，多特异性caTCR包括多特异性抗原结合模块，其包括各自特异性地结合于抗原或抗原决定基的两个或多于两个(例如2、3、4或更多个)抗原结合域。在一些实施例中，多特异性caTCR为双特异性的。在一些实施例中，多特异性caTCR为三特异性的。

多特异性分子为对于至少两种不同抗原或抗原决定基具有结合特异性的分子(例如双特异性抗体对两种抗原或抗原决定基具有结合特异性)。也涵盖具有超过两个价及/或特异性的多特异性caTCR。已描述双特异性抗体，例如参见Brinkmann U.及KontermannR.E.(2017)MABS,9(2),182-212。可制备三特异性抗体，参见Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)。应了解，所属领域的技术人员可选择所属领域中已知的单独多特异性分子的适当特征以形成多特异性caTCR。

在一些实施例中，caTCR(在本文中也称为“多特异性caTCR”)包括：a)多特异性(例如双特异性)抗原结合模块，其包括特异性地结合于第一靶抗原的第一抗原结合域及特异性地结合于第二靶抗原的第二抗原结合域；及b)TCRM，其包括含有第一TCR-TM的第一TCRD(TCRD1)及含有第二TCR-TM的第二TCRD(TCRD2)；其中TCRM有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽包括第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽的全部或一部分或其变异体，及/或第二连接肽包括第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽的全部或一部分或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域包括来自第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域的序列，及/或第二TCR胞内域包括来自第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域的序列。在一些实施例中，第一TCRD为第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的片段，及/或第二TCRD为第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的片段。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体部分，诸如C_H1及C_L抗体域，或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括天然存在的αβT细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，第一TCR-TM及第二TCR-TM两者为天然存在的。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，第一TCR-TM与所述第一TCR-TM所源自的跨膜域相比包括至多5个氨基酸取代(例如单一氨基酸取代)，及/或第二TCR-TM与所述第二TCR-TM所源自的跨膜域相比包括至多5个氨基酸取代(例如单一氨基酸取代)。在一些实施例中，所述第一TCR-TM中的经取代氨基酸邻近所述第二TCR-TM中的经取代氨基酸。在一些实施例中，一或多个经取代氨基酸邻近所述第一或第二TCR-TM中参与结合于CD3的氨基酸。在一些实施例中，一或多个(例如每一)经取代氨基酸的疏水性比其对应的未经取代的氨基酸大。在一些实施例中，第一TCR-TM包括SEQ IDNO:7及9-13中的任一者的氨基酸序列，且其中第二TCR-TM包括SEQ ID NO:8及14-26中的任一者的氨基酸序列。

双特异性caTCR的示范性结构经展示于图13A至13E中，其中靶抗原为CD19及CD22，但所属领域的技术人员将容易理解，可使用相同结构格式来制备靶向其它靶抗原或抗原决定基的双特异性caTCR。

举例来说，源自DVD IgG的双可变域(DVD)(参见DiGiammarino等人，mAbs 3(5):487-494)可用作caTCR中的双特异性抗原结合模块(图13A)。用于融合外可变域及内可变域的各种连接子已经开发且最佳化以用于DVD-Ig，其可适用于构建具有DVD模块的双特异性caTCR。然而，DVD模块中的可变域堆叠方法可影响内可变域的折叠及靶结合亲和力。两种可变域之间的连接子及两种可变域的次序可影响caTCR的功效。

在一些实施例中，caTCR包括：a)多特异性(例如双特异性)抗原结合模块，其包括特异性地结合于第一靶抗原的Fv及特异性地结合于第二靶抗原的Fab；及b)TCRM，其包括含有第一TCR-TM的第一TCRD(TCRD1)及含有第二TCR-TM的第二TCRD(TCRD2)；其中TCRM有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子。

在一些实施例中，caTCR包括：(i)包括N端至C端的第一多肽链：V_H1-L1-V_H2-C_H1-TCRD1；及包括N端至C端的第二多肽链：V_L1-L2-V_L2-C_L-TCRD2；(ii)包括N端至C端的第一多肽链：V_H1-L1-V_L2-C_L-TCRD1；及包括N端至C端的第二多肽链：V_L1-L2-V_H2-C_H1-TCRD2；(iii)包括N端至C端的第一多肽链：V_L1-L1-V_H2-C_H1-TCRD1；及包括N端至C端的第二多肽链：V_H1-L2-V_L2-C_L-TCRD2；或(iv)包括N端至C端的第一多肽链：V_L1-L1-V_L2-C_L-TCRD1；及包括N端至C端的第二多肽链：V_H1-L2-V_H2-C_H1-TCRD2，其中V_H1及V_L1形成特异性地结合于第一靶抗原的第一抗原结合域，且V_H2及V_L2形成特异性地结合于第二靶抗原的第二抗原结合域，其中TCRD1及TCRD2形成有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，且其中L1及L2为肽连接子。在一些实施例中，L1及/或L2为约5至约50个(例如约5-10、约10-15或约15-30个)氨基酸长。在一些实施例中，L1及L2具有相同长度。在一些实施例中，L1及L2具有相同氨基酸序列。在一些实施例中，L1及L2具有不同长度。在一些实施例中，L1及L2具有不同氨基酸序列。示范性双特异性caTCR经展示于图13A中。

源自CODV-IgG的交叉双可变域(CODV)(参见Steinmetz等人；mAbs(2016),8(5):867-878)可用作caTCR中的双特异性抗原结合模块(图13B)。CODV允许各Fv有相对无障碍抗原结合位点。用于融合重链及轻链可变区的各种连接子已经开发且最佳化以用于CODV-Ig，其可适用于构建具有CODV模块的双特异性caTCR。然而，CODV模块的适当折叠可受到挑战，且用于CODV模块中的长连接子可为免疫原性的潜在来源且易受蛋白质裂解影响。

在一些实施例中，caTCR包括：a)多特异性(例如双特异性)抗原结合模块，其包括特异性地结合于第一靶抗原的第一Fv及特异性地结合于第二靶抗原的第二Fv；及b)TCRM，其包括含有第一TCR-TM的第一TCRD(TCRD1)，及含有第二TCR-TM的第二TCRD(TCRD2)；其中TCRM有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，caTCR进一步包括C_H1及C_L。

在一些实施例中，caTCR包括：(i)包括N端至C端的第一多肽链：V_H1-L1-V_H2-C_H1-TCRD1，及包括N端至C端的第二多肽链：V_L2-L2-V_L1-C_L-TCRD2；或(ii)包括N端至C端的第一多肽链：V_L1-L1-V_L2-C_L-TCRD1，及包括N端至C端的第二多肽链：V_H2-L2-V_H1-C_H1-TCRD2,其中V_H1及V_L1形成特异性地结合于第一靶抗原的第一抗原结合域，且V_H2及V_L2形成特异性地结合于第二靶抗原的第二抗原结合域，其中TCRD1及TCRD2形成有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，且其中L1及L2为肽连接子。在一些实施例中，L1及/或L2为约5至约50个(例如约5-20、约15-30或约30-50个)氨基酸长。在一些实施例中，L1及L2具有相同长度。在一些实施例中，L1及L2具有相同氨基酸序列。在一些实施例中，L1及L2具有不同长度。在一些实施例中，L1及L2具有不同氨基酸序列。示范性双特异性caTCR经展示于图13B中。

源自scFv融合蛋白的双特异性抗原结合模块(诸如Chen等人，mAbs 8(4):761-774中所描述的那些者)可用于双特异性caTCR中(图13C)。具有类似融合格式的双特异性抗体的表达已展现此格式的适当折叠及稳定性。用于将scFv融合至恒定域的各种连接子已经开发且最佳化以用于这些双特异性抗体，其可适用于构建具有类似scFv融合域的双特异性caTCR。然而，scFv之间的位阻可危害scFv与其靶抗原的结合。

在一些实施例中，caTCR包括：a)多特异性(例如双特异性)抗原结合模块，其包括特异性地结合于第一靶抗原的第一scFv及特异性地结合于第二靶抗原的第二scFv；及b)TCRM，其包括含有第一TCR-TM的第一TCRD(TCRD1)及含有第二TCR-TM的第二TCRD(TCRD2)；其中TCRM有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，caTCR进一步包括C_H1及C_L。

在一些实施例中，caTCR包括：(i)包括N端至C端的第一多肽链：scFv1-L1-C_H1-TCRD1，及包括N端至C端的第二多肽链：scFv2-L2-C_L-TCRD2；或(ii)包括N端至C端的第一多肽链：scFv2-L1-C_H1-TCRD1，及包括N端至C端的第二多肽链：scFv1-L2-C_L-TCRD2，其中scFv1特异性结合于第一靶抗原且scFv2特异性地结合于第二靶抗原，其中TCRD1及TCRD2形成有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，且L1及L2为肽连接子。在一些实施例中，L1及/或L2为约5至约50个(例如约5-10、约10-15或约15-30个)氨基酸长。在一些实施例中，L1及L2具有相同长度。在一些实施例中，L1及L2具有相同氨基酸序列。在一些实施例中，L1及L2具有不同长度。在一些实施例中，L1及L2具有不同氨基酸序列。示范性双特异性caTCR经展示于图13C中。

源自IgG-scFv双特异性抗体或Fab-scFv-Fc双特异性抗体的双特异性抗原结合模块可用于双特异性caTCR中。在一种格式(图13D)中，scFv连接于Fab的V_H或V_L，其使scFv有较大可挠性且因此使Fab更多地接近其靶抗原。然而，scFv-Fab模块可具有稳定性问题。在第二格式(图13E)中，Fab融合至第一TCRD且scFv融合至第二TCRD。

在一些实施例中，caTCR包括：a)多特异性(例如双特异性)抗原结合模块，其包括特异性地结合于第一靶抗原的scFv及特异性地结合于第二靶抗原的Fab；及b)TCRM，其包括含有第一TCR-TM的第一TCRD(TCRD1)及含有第二TCR-TM的第二TCRD(TCRD2)；其中TCRM有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子。

在一些实施例中，caTCR包括：(i)包括N端至C端的第一多肽链：scFv-L1-V_H-C_H1-TCRD1，及包括N端至C端的第二多肽链：V_L-C_L-TCRD2；或(ii)包括N端至C端的第一多肽链：V_H-C_H1-TCRD1，及包括N端至C端的第二多肽链：scFv-L2-V_L-C_L-TCRD2；其中scFv特异性地结合于第一靶抗原，且V_H及V_L形成特异性地结合于第二靶抗原的第二抗原结合域，其中TCRD1及TCRD2形成有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，且其中L1及L2为肽连接子。在一些实施例中，L1及/或L2为约5至约50个(例如约5-10、约10-15或约15-30个)氨基酸长。示范性双特异性caTCR经展示于图13D中。

在一些实施例中，caTCR包括：(i)含有N端至C端的第一多肽链：V_L-C_L-L1-TCRD1、含有N端至C端的第二多肽链：V_H-C_H1，及含有N端至C端的第三多肽链：scFv-L2-TCRD2；(ii)含有N端至C端的第一多肽链：V_H-C_H1-L1-TCRD1、含有N端至C端的第二多肽链：V_L-C_L，及含有N端至C端的第三多肽链：scFv-L2-TCRD2；(iii)含有N端至C端的第一多肽链：scFv-L1-TCRD1、含有N端至C端的第二多肽链：V_H-C_H1，及含有N端至C端的第三多肽链：V_L-C_L-L2-TCRD2；或(iv)含有N端至C端的第一多肽链：scFv-L1-TCRD1、含有N端至C端的第二多肽链：V_L-C_L，及含有N端至C端的第三多肽链：V_H-C_H1-L2-TCRD2；其中scFv特异性地结合于第一靶抗原，且V_H及V_L形成特异性地结合于第二靶抗原的第二抗原结合域，其中TCRD1及TCRD2形成有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，且其中L1及L2为肽连接子。在一些实施例中，L1及/或L2为约5至约50个(例如约5-10、约10-15或约15-30个)氨基酸长。示范性双特异性caTCR经展示于图13E中。scFv与TCRD之间的肽连接子的长度及Fab与TCRD之间的肽连接子的长度可经最佳化，是因为其可影响scFv及Fab与其靶抗原的可接近性。

多特异性caTCR的多特异性抗原结合模块可特异性地结合于靶抗原或抗原决定基的任何合适组合。在一些实施例中，多特异性抗原结合模块特异性地结合于至少一个细胞表面抗原。在一些实施例中，至少一个细胞表面抗原是选自由以下组成的群组：CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，多特异性抗原结合模块特异性地结合于至少一个肽/MHC复合体。在一些实施例中，至少一个肽/MHC复合体包括源自蛋白质的肽，所述蛋白质选自由以下组成的群组：WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、KRAS、组蛋白H3.3及PSA，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，多特异性抗原结合模块特异性地结合于第一细胞表面抗原及第二细胞表面抗原。在一些实施例中，多特异性抗原结合模块特异性地结合于CD19及CD22。在一些实施例中，多特异性抗原结合模块特异性地结合于CD19及CD20。在一些实施例中，多特异性抗原结合模块特异性地结合于第一肽/MHC复合体及第二肽/MHC复合体。在一些实施例中，多特异性抗原结合模块特异性地结合细胞表面抗原及肽/MHC复合体。

嵌合协同刺激受体(CSR)构筑体

本文所描述的配体特异性嵌合协同刺激受体(CSR)特异性地结合于靶配体(诸如细胞表面抗原或肽/MHC复合体)，且能够在靶配体结合之后刺激表面上的功能性表达所述CSR的免疫细胞。CSR包括提供配体结合特异性的配体结合模块、跨膜模块及允许刺激免疫细胞的协同刺激免疫细胞信号传导模块。CSR缺乏功能性原代免疫细胞信号传导序列。在一些实施例中，CSR缺乏任何原代免疫细胞信号传导序列。在一些实施例中，CSR包括含有配体结合模块、跨膜模块及协同刺激信号传导模块的单一多肽链。在一些实施例中，CSR包括第一多肽链及第二多肽链，其中所述第一与第二多肽链一起形成配体结合模块、跨膜模块及协同刺激信号传导模块。在一些实施例中，第一及第二多肽链为分开的多肽链，且CSR为多聚体，诸如二聚体。在一些实施例中，第一与第二多肽链共价连接，诸如通过肽键或通过另一种化学键(诸如二硫键)连接。在一些实施例中，第一多肽链与第二多肽链通过至少一个二硫键连接。在一些实施例中，CSR在caTCR加CSR免疫细胞中的表达为可诱导的。在一些实施例中，在经由caTCR的信号传导后，CSR在caTCR加CSR免疫细胞中的表达为可诱导的。

用于本发明的CSR的协同刺激免疫细胞信号传导域的实例包含T细胞受体(TCR)的协同受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变异体及具有相同功能性能力的任何合成序列，所述T细胞受体可与caTCR相配合起作用以在caTCR参与后引发信号转导。

在一些情形下，经由单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞且也需要次级或协同刺激信号。因此，在一些实施例中，T细胞活化是通过两种不同类别的胞内信号传导序列介导：经由TCR引发抗原依赖性一级活化的那些序列(在本文中被称作“原代T细胞信号传导序列”)；及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或协同刺激信号的那些序列(在本文中被称作“协同刺激T细胞信号传导序列”)。

以刺激方式起作用的原代免疫细胞信号传导序列可含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。含ITAM的原代免疫细胞信号传导序列的实例包含衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d的那些序列。“功能性”原代免疫细胞信号传导序列为在可操作地耦接于适当受体时能够转导免疫细胞活化信号的序列。可包括原代免疫细胞信号传导序列的片段或变异体的“非功能性”原代免疫细胞信号传导序列不能转导免疫细胞活化信号。本文所描述的CSR缺乏功能性原代免疫细胞信号传导序列，诸如包括ITAM的功能性信号传导序列。在一些实施例中，CSR缺乏任何原代免疫细胞信号传导序列。

协同刺激免疫细胞信号传导序列可为协同刺激分子的胞内域的一部分，所述协同刺激分子包含(例如)CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，及其类似物。

在一些实施例中，靶配体为细胞表面抗原。在一些实施例中，靶配体为肽/MHC复合体。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为呈递靶抗原的细胞的表面上所呈递的分子。举例来说，在一些实施例中，caTCR的靶抗原为癌细胞上所呈递的癌症相关抗原，且靶配体为表达于癌细胞的表面上的遍在分子，诸如整合素。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为例如CD19、CD20、CD22、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，癌症相关配体为肽/MHC复合体，其包括源自包含WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA的蛋白质的肽。在一些实施例中，靶配体为病毒相关配体。在一些实施例中，靶配体为免疫检查点分子。在一些实施例中，免疫检查点分子包含PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。在一些实施例中，靶配体为细胞凋亡分子。在一些实施例中，细胞凋亡分子包含FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。

在一些实施例中，配体结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗体部分特异性地结合细胞表面抗原，所述细胞表面抗原包含(但不限于)CD19、CD20、CD22、CD47、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5。在一些实施例中，抗体部分特异性地结合肽/MHC复合体，其中肽源自蛋白质，所述蛋白质包含(但不限于)WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA。在一些实施例中，抗体部分包括对CD19具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2017066136A2)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD19具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:59的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD20具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQ ID NO:60的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD22具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如2018年3月30日申请的USSN62/650,955)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD22具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:102的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对GPC3具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如2017年4月26日申请的USSN 62/490,586)。在一些实施例中，抗体部分包括对GPC3具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对ROR1具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/187220及WO2016/187216)。在一些实施例中，抗体部分包括对ROR2具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/142768)。在一些实施例中，抗体部分包括对BCMA具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/090327及WO2016/090320)。在一些实施例中，抗体部分包括对GPRC5D具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/090329及WO2016/090312)。在一些实施例中，抗体部分包括对FCRL5具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/090337)。在一些实施例中，抗体部分包括对WT-1具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2012/135854、WO2015/070078及WO2015/070061)。在一些实施例中，抗体部分包括对AFP具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/161390)。在一些实施例中，抗体部分包括对HPV16-E7具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/182957)。在一些实施例中，抗体部分包括对NY-ESO-1具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/210365)。在一些实施例中，抗体部分包括对PRAME具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/191246)。在一些实施例中，抗体部分包括对EBV-LMP2A具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/201124)。在一些实施例中，抗体部分包括对KRAS具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/154047)。在一些实施例中，抗体部分包括对PSA具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2017/015634)。

在一些实施例中，配体结合模块为(或衍生自)用于靶配体的受体的胞外域的全部或一部分。在一些实施例中，受体包含例如FasR、TNFR1、TNFR2、PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG-3、4-1BB、OX40、CD27及TIM-3。

在一些实施例中，跨膜模块包括一或多个跨膜域，其衍生自例如CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。

在一些实施例中，协同刺激信号传导模块包括免疫细胞协同刺激分子的胞内域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞协同刺激分子包含(例如)CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，及其类似物。在一些实施例中，协同刺激信号传导分子包括CD28的片段，其包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施例中，协同刺激信号传导分子包括CD28的片段，其包括SEQ ID NO:52的氨基酸序列。在一些实施例中，协同刺激信号传导分子包括4-1BB的片段，其包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在一些实施例中，协同刺激信号传导分子包括4-1BB的片段，其包括SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施例中，协同刺激信号传导分子包括CD8的片段，其包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在一些实施例中，协同刺激信号传导分子包括OX40的片段，其包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些实施例中，协同刺激信号传导分子包括OX40的片段，其包括SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在一些实施例中，协同刺激信号传导分子包括CD27的片段，其包括SEQ ID NO:86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，协同刺激信号传导分子包括CD30的片段，其包括SEQ IDNO:88或89的氨基酸序列。

在一些实施例中，CSR进一步包括在配体结合模块、跨膜模块及协同刺激信号传导模块中的任一者之间的间隔模块。在一些实施例中，间隔模块包括连接两个CSR模块的一或多个肽连接子。在一些实施例中，间隔模块包括长度在约5至约70个氨基酸之间(诸如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70中的任一者，包含这些值之间的任何范围)的一或多个肽连接子。

在一些实施例中，配体结合模块(诸如抗体部分)以下列各者特异性地结合于靶抗原：a)为其对其它分子的结合亲和力的至少约10倍(包含例如至少约10、20、30、40、50、75、100、200、300、400、500、750、1000或更大倍的任一者)的亲和力；或b)不超过其用于结合于其它分子的K_d的约1/10(诸如不超过约1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/75、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/750、1/1000或更小中的任一者)的K_d。结合亲和力可通过所属领域中已知的方法测定，诸如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀分析(RIA)。K_d可通过所属领域中已知的方法测定，诸如利用例如Biacore仪器的表面等离子体共振(SPR)检定，或利用例如Sapidyne仪器的动力学排除分析(KinExA)。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性地结合于靶配体(诸如细胞表面抗原或肽/MHC复合体)，其包括：a)靶配体结合域(LBD)；b)跨膜域；及c)协同刺激信号传导域，其中CSR能够在靶配体结合之后刺激表面上的功能性表达所述CSR的免疫细胞。在一些实施例中，靶配体为细胞表面抗原。在一些实施例中，靶配体为肽/MHC复合体。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为例如CD19、CD20、CD22、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，癌症相关配体为肽/MHC复合体，其包括源自包含WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA的蛋白质的肽。在一些实施例中，靶配体为病毒相关配体。在一些实施例中，靶配体为免疫检查点分子。在一些实施例中，免疫检查点分子包含PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。在一些实施例中，靶配体为细胞凋亡分子。在一些实施例中，细胞凋亡分子包含FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。在一些实施例中，配体结合域为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，配体结合域为(或衍生自)用于靶配体的受体的胞外域的全部或一部分。在一些实施例中，受体包含例如FasR、TNFR1、TNFR2、PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG-3、4-1BB、OX40、CD27及TIM-3。在一些实施例中，跨膜域包括衍生自跨膜蛋白的跨膜域，所述跨膜蛋白包含(例如)CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。在一些实施例中，CSR包括跨膜蛋白的片段(fTMP)，其中fTMP包括CSR跨膜域。在一些实施例中，协同刺激信号传导域包括免疫细胞协同刺激分子的胞内域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞协同刺激分子包含(例如)CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，及其类似物。在一些实施例中，CSR包括免疫细胞协同刺激分子的片段(fCSM)，其中fCSM包括CSR跨膜域及CSR协同刺激信号传导域。在一些实施例中，CSR进一步包括在配体结合域、跨膜域及协同刺激信号传导域中的任一者之间的间隔域。在一些实施例中，间隔域包括连接两个CSR域的肽连接子。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性结合于靶配体，其包括：a)靶配体结合域；b)跨膜域；及c)协同刺激信号传导域，其中靶配体为细胞表面抗原，且其中CSR能够在靶配体结合之后刺激表面上的功能性表达所述CSR的免疫细胞。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为例如CD19、CD20、CD22、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，靶配体为病毒相关配体。在一些实施例中，靶配体为免疫检查点分子。在一些实施例中，免疫检查点分子包含PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。在一些实施例中，靶配体为细胞凋亡分子。在一些实施例中，细胞凋亡分子包含FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。在一些实施例中，配体结合域为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，配体结合域为(或源自)用于靶配体的受体的胞外域的全部或一部分。在一些实施例中，受体包含例如FasR、TNFR1、TNFR2、PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG-3、4-1BB、OX40、CD27及TIM-3。在一些实施例中，跨膜域包括源自跨膜蛋白的跨膜域，所述跨膜蛋白包含(例如)CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。在一些实施例中，CSR包括跨膜蛋白的片段(fTMP)，其中fTMP包括CSR跨膜域。在一些实施例中，协同刺激信号传导域包括免疫细胞协同刺激分子的胞内域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞协同刺激分子包含(例如)CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，及其类似物。在一些实施例中，CSR包括免疫细胞协同刺激分子的片段(fCSM)，其中fCSM包括CSR跨膜域及CSR协同刺激信号传导域。在一些实施例中，CSR进一步包括在配体结合域、跨膜域及协同刺激信号传导域中的任一者之间的间隔域。在一些实施例中，间隔域包括连接两个CSR域的肽连接子。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性结合于靶配体，其包括：a)靶配体结合域；b)跨膜域；及c)协同刺激信号传导域，其中靶配体为肽/MHC复合体，且其中CSR能够在靶配体结合之后刺激表面上的功能性表达所述CSR的免疫细胞。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为肽/MHC复合体，其包括源自包含WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA的蛋白质的肽。在一些实施例中，靶配体为病毒相关配体。在一些实施例中，配体结合域为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，跨膜域包括源自跨膜蛋白的跨膜域，所述跨膜蛋白包含(例如)CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。在一些实施例中，CSR包括跨膜蛋白的片段(fTMP)，其中fTMP包括CSR跨膜域。在一些实施例中，协同刺激信号传导域包括免疫细胞协同刺激分子的胞内域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞协同刺激分子包含(例如)CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，及其类似物。在一些实施例中，CSR包括免疫细胞协同刺激分子的片段(fCSM)，其中fCSM包括CSR跨膜域及CSR协同刺激信号传导域。在一些实施例中，CSR进一步包括在配体结合域、跨膜域及协同刺激信号传导域中的任一者之间的间隔域。在一些实施例中，间隔域包括连接两个CSR域的肽连接子。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性结合于靶配体(诸如细胞表面抗原或肽/MHC复合体)，其包括：a)靶配体结合域；b)跨膜域；及c)协同刺激信号传导域，其中配体结合域为抗体部分，且其中CSR能够在靶配体结合之后刺激表面上的功能性表达所述CSR的免疫细胞。在一些实施例中，靶配体为细胞表面抗原。在一些实施例中，靶配体为肽/MHC复合体。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为例如CD19、CD20、CD22、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，癌症相关配体为肽/MHC复合体，其包括源自包含WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA的蛋白质的肽。在一些实施例中，靶配体为病毒相关配体。在一些实施例中，靶配体为免疫检查点分子。在一些实施例中，免疫检查点分子包含PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。在一些实施例中，靶配体为细胞凋亡分子。在一些实施例中，细胞凋亡分子包含FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，跨膜域包括源自跨膜蛋白的跨膜域，所述跨膜蛋白包含(例如)CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。在一些实施例中，CSR包括跨膜蛋白的片段(fTMP)，其中fTMP包括CSR跨膜域。在一些实施例中，协同刺激信号传导域包括免疫细胞协同刺激分子的胞内域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞协同刺激分子包含(例如)CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，及其类似物。在一些实施例中，CSR包括免疫细胞协同刺激分子的片段(fCSM)，其中fCSM包括CSR跨膜域及CSR协同刺激信号传导域。在一些实施例中，CSR进一步包括在配体结合域、跨膜域及协同刺激信号传导域中的任一者之间的间隔域。在一些实施例中，间隔域包括连接两个CSR域的肽连接子。在一些实施例中，根据表3中所列的CSR中的任一者选择CSR域。

表3

在一些实施例中，CSR包括CD28的fCSM。在一些实施例中，CSR包括：a)靶配体结合域；b)CD8跨膜域，其包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列；及c)CD28的片段，其包括SEQ ID NO:52的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括：a)靶配体结合域；及b)CD28的片段，其包括SEQID NO:51的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括：靶配体结合域及包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CSR域。

在一些实施例中，CSR包括4-1BB的fCSM。在一些实施例中，CSR包括：a)靶配体结合域；b)CD8跨膜域，其包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列；及c)4-1BB的片段，其包括SEQ IDNO:54的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括：a)靶配体结合域；及b)4-1BB的片段，其包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括：靶配体结合域及包括SEQ IDNO:91或92的氨基酸序列的CSR域。

在一些实施例中，CSR包括CD27的fCSM。在一些实施例中，CSR包括：a)靶配体结合域；b)CD8跨膜域，其包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列；及c)CD27的片段，其包括SEQ ID NO:87的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括：a)靶配体结合域；及b)CD27的片段，其包括SEQID NO:86的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括：靶配体结合域及包括SEQ ID NO:93或94的氨基酸序列的CSR域。

在一些实施例中，CSR包括CD30的fCSM。在一些实施例中，CSR包括：a)靶配体结合域；b)CD8跨膜域，其包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列；及c)CD30的片段，其包括SEQ ID NO:89的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括：a)靶配体结合域；及b)CD30的片段，其包括SEQID NO:88的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括：靶配体结合域及包括SEQ ID NO:95或96的氨基酸序列的CSR域。

在一些实施例中，CSR包括OX40的fCSM。在一些实施例中，CSR包括：a)靶配体结合域；b)CD8跨膜域，其包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列；及c)OX40的片段，其包括SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括：a)靶配体结合域；及b)OX40的片段，其包括SEQID NO:55的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括：靶配体结合域及包括SEQ ID NO:97或98的氨基酸序列的CSR域。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性地结合于靶配体(诸如细胞表面抗原或肽/MHC复合体)，其包括：a)靶配体结合域；b)跨膜域；及c)协同刺激信号传导域，其中配体结合域为(或衍生自)用于靶配体的受体的胞外域的全部或一部分，且其中CSR能够在靶配体结合之后刺激表面上的功能性表达所述CSR的免疫细胞。在一些实施例中，靶配体为细胞表面抗原。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与表达于相同免疫细胞中的caTCR的靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为例如CD19、CD20、CD22、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，靶配体为免疫检查点分子。在一些实施例中，免疫检查点分子包含PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。在一些实施例中，靶配体为细胞凋亡分子。在一些实施例中，细胞凋亡分子包含FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。在一些实施例中，靶配体受体包含例如FasR、TNFR1、TNFR2、PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG-3、4-1BB、OX40、CD27及TIM-3。在一些实施例中，跨膜域包括衍生自例如CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜域。在一些实施例中，协同刺激信号传导域包括免疫细胞协同刺激分子的胞内域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞协同刺激分子包含(例如)CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，及其类似物。在一些实施例中，CSR进一步包括在配体结合域、跨膜域及协同刺激信号传导域中的任一者之间的间隔域。在一些实施例中，间隔域包括连接两个CSR域的肽连接子。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性地结合于CD19，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域；及b)CD28的片段，其包括SEQ ID NO:51或52的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ IDNO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，scFv包括SEQ ID NO:77的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，CD28的片段包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:103的肽连接子及CD28的片段。在一些实施例中，CSR包括SEQ ID NO:80的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性地结合于CD20，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的V_L域；及b)CD28的片段，其包括SEQ ID NO:51或52的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ IDNO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，scFv包括SEQ ID NO:78的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，CD28的片段包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:103的肽连接子及CD28的片段。在一些实施例中，CSR包括SEQ ID NO:81的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性地结合于GPC3，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的V_L域；及b)CD28的片段，其包括SEQ ID NO:51或52的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ IDNO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，scFv包括SEQ ID NO:79的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，CD28的片段包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:103的肽连接子及CD28的片段。在一些实施例中，CSR包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性结合于CD20，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的V_L域；及b)CD28的片段，其包括SEQ ID NO:51或52的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ IDNO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，scFv包括SEQ ID NO:78的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，CD28的片段包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:103的肽连接子及CD28的片段。在一些实施例中，CSR包括SEQ ID NO:81的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性地结合于CD19，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域；及b)4-1BB的片段，其包括SEQ ID NO:53或54的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ IDNO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，4-1BB的片段包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:104的肽连接子及4-1BB的片段。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性结合于CD19，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域；b)CD8的片段，其包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及c)4-1BB的片段，其包括SEQ ID NO:54的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:104的肽连接子、CD8的片段及4-1BB的片段。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性结合于CD19，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域；b)CD8的片段，其包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及c)OX40的片段，其包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:104的肽连接子、CD8的片段及OX40的片段。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性结合于CD19，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域；及b)OX40的片段，其包括SEQ ID NO:56或57的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ IDNO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，OX40的片段包括SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:104的肽连接子及OX40的片段。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性结合于CD19，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域；b)CD8的片段，其包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及c)CD27的片段，其包括SEQ ID NO:87的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:104的肽连接子、CD8的片段及CD27的片段。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性结合于CD19，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域；及b)CD27的片段，其包括SEQ ID NO:86或87的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ IDNO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，CD27的片段包括SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:104的肽连接子及CD27的片段。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性结合于CD19，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域；b)CD8的片段，其包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及c)CD30的片段，其包括SEQ ID NO:89的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:104的肽连接子、CD8的片段及CD30的片段。

在一些实施例中，本文所描述的CSR特异性结合于CD19，所述CSR包括：a)scFv，其包括具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域及具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域；及b)CD30的片段，其包括SEQ ID NO:88或89的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，scFv自氨基端至羧基端包括V_L域、包括SEQ IDNO:76的氨基酸序列的肽连接子及V_H域。在一些实施例中，CD30的片段包括SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR自氨基端至羧基端包括scFv、包括SEQ ID NO:104的肽连接子及CD30的片段。

在一些实施例中，CSR在caTCR加CSR免疫细胞中的表达为可诱导的。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞包括编码CSR的核酸序列，其可操作地连接于诱导性启动子，包含本文所描述的诱导性启动子中的任一者。在一些实施例中，在经由caTCR的信号传导后，CSR在caTCR加CSR免疫细胞中的表达为可诱导的。在一些此类实施例中，caTCR加CSR免疫细胞包括编码CSR的核酸序列，其响应于经由caTCR的信号传导而可操作地连接于启动子或调节元件。在一些实施例中，编码CSR的核酸序列可操作地连接于经活化T细胞(NFAT)衍生的启动子的核因子。在一些实施例中，NFAT衍生的启动子为NFAT衍生的最小启动子(参见例如Durand,D等人,Molec.Cell.Biol.8,1715-1724(1988)；Clipstone,NA、Crabtree,GR.Nature.1992 357(6380):695-7；Chmielewski,M.等人.Cancer research 71.17(2011):5697-5706；及Zhang,L.等人.Molecular therapy 19.4(2011):751-759)。在一些实施例中，NFAT衍生的启动子包括SEQ ID NO:85的核苷酸序列。在一些实施例中，编码CSR的核酸序列可操作地连接于IL-2启动子。

分泌性次级效应子(SSE)构筑体

在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞(诸如T细胞)能够分泌分泌性次级效应子(SSE)。此类免疫细胞在本文中被称作“caTCR加CSR及SSE免疫细胞”。SSE增强通过SSE经功能性表达于其中及自其分泌的caTCR加CSR及SSE免疫细胞介导的免疫反应。在一些实施例中，SSE能够将其它免疫细胞(诸如旁观者T细胞或NK细胞)重定向于靶疾病细胞(诸如靶癌细胞)。在一些实施例中，SSE为靶向免疫细胞(诸如T细胞或NK细胞)及疾病细胞(诸如癌细胞)的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)。在一些实施例中，SSE保护caTCR加CSR及SSE免疫细胞免受免疫抑制环境(诸如免疫抑制肿瘤环境)影响。在一些实施例中，SSE提供caTCR加CSR及SSE免疫细胞上的刺激受体的自分泌活化。在一些实施例中，SSE为外源性生长因子或刺激细胞因子。在一些实施例中，SSE在caTCR加CSR及SSE免疫细胞中的表达为可诱导的。在一些实施例中，在经由caTCR的信号传导后，SSE在caTCR加CSR及SSE免疫细胞中的表达为可诱导的。

在一些实施例中，SSE为靶向T细胞及疾病细胞的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)。在一些实施例中，SSE包括特异性地结合于T细胞的表面抗原的抗体部分。.在一些实施例中，T细胞表面抗原为CD。在一些实施例中，SSE包括特异性地结合于疾病相关抗原(诸如癌症相关抗原)的抗体部分。在一些实施例中，疾病相关抗原为疾病细胞(诸如癌细胞)的表面抗原。在一些实施例中，疾病相关抗原为磷脂肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、CD47、粘蛋白-16(MUC16)、CD19、CD20、CD22、EpCAM、EGFR、HER2、CEA、PSMA、AFP、PSA、BCMA、FCRL5、NY-ESO、HPV16或FoxP3，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，SSE为选自由以下组成的群组的多特异性抗体：串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双亲和力重靶向(DART)抗体及双可变域(DVD)抗体。在一些实施例中，SSE为双特异性抗体。在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括靶向T细胞表面抗原的第一scFv及靶向疾病相关抗原的第二scFv。

在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括靶向CD3的第一scFv及靶向疾病相关抗原的第二scFv。在一些实施例中，疾病相关抗原为GPC3、CD47、MUC16、CD19、CD20、CD22、EpCAM、EGFR、HER2、CEA、PSMA、AFP、PSA、BCMA、FCRL5、NY-ESO、HPV16或FoxP3，包含其变异体或突变体。

在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括靶向CD3的第一scFv及靶向GPC3的第二scFv。在一些实施例中，第二scFv包括：V_H域，其包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及V_L域，其包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，V_H域处于V_L域的氨基端。在一些实施例中，V_L域处于V_H域的氨基端。在一些实施例中，第二scFv包括SEQID NO:79的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在一些实施例中，第一scFv处于第二scFv的氨基端。在一些实施例中，第二scFv处于第一scFv的氨基端。在一些实施例中，SSE包括SEQ ID NO:105的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括靶向CD3的第一scFv及靶向CD47的第二scFv。在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括靶向CD3的第一scFv及靶向MUC16的第二scFv。

在一些实施例中，SSE为靶向NK细胞及疾病相关抗原(诸如癌症相关抗原)的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)。在一些实施例中，SSE包括特异性地结合于NK细胞的表面抗原的抗体部分。在一些实施例中，NK细胞表面抗原为CD16a。在一些实施例中，SSE包括特异性地结合于疾病相关抗原(诸如癌症相关抗原)的抗体部分。在一些实施例中，疾病相关抗原为疾病细胞(诸如癌细胞)的表面抗原。在一些实施例中，疾病相关抗原为GPC3、CD47、MUC16、CD19、CD20、CD22、EpCAM、EGFR、HER2、CEA、PSMA、AFP、PSA、BCMA、FCRL5、NY-ESO、HPV16或FoxP3，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，SSE为选自由以下组成的群组的多特异性抗体：串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双亲和力重靶向(DART)抗体及双可变域(DVD)抗体。在一些实施例中，SSE为双特异性抗体。在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括靶向NK细胞表面抗原的第一scFv及靶向疾病相关抗原的第二scFv。

在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括靶向CD16a的第一scFv及靶向疾病相关抗原的第二scFv。在一些实施例中，疾病相关抗原为GPC3、CD47、MUC16、CD19、CD20、CD22、EpCAM、EGFR、HER2、CEA、PSMA、AFP、PSA、BCMA、FCRL5、NY-ESO、HPV16或FoxP3，包含其变异体或突变体。

在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括靶向CD16a的第一scFv及靶向GPC3的第二scFv。在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括靶向CD16a的第一scFv及靶向CD47的第二scFv。在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括靶向CD16a的第一scFv及靶向MUC16的第二scFv。

在一些实施例中，本文所描述的SSE包括特异性地结合于疾病相关抗原的抗体部分，其中所述抗体部分包括对疾病相关抗原具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD19具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2017066136A2)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD19具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ IDNO:59的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD20具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQ ID NO:60的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD22具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如2018年3月30日提交的USSN 62/650,955，其内容以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，抗体部分包括对CD22具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQID NO:101的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:102的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对GPC3具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如2017年4月26日提交的USSN 62/490,586，其内容以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，抗体部分包括对GPC3具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，抗体部分包括对ROR1具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/187220及WO2016/187216)。在一些实施例中，抗体部分包括对ROR2具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/142768)。在一些实施例中，抗体部分包括对BCMA具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/090327及WO2016/090320)。在一些实施例中，抗体部分包括对GPRC5D具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/090329及WO2016/090312)。在一些实施例中，抗体部分包括对FCRL5具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/090337)。在一些实施例中，抗体部分包括对WT-1具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2012/135854、WO2015/070078及WO2015/070061)。在一些实施例中，抗体部分包括对AFP具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/161390)。在一些实施例中，抗体部分包括对HPV16-E7具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/182957)。在一些实施例中，抗体部分包括对NY-ESO-1具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/210365)。在一些实施例中，抗体部分包括对PRAME具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/191246)。在一些实施例中，抗体部分包括对EBV-LMP2A具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/201124)。在一些实施例中，抗体部分包括对KRAS具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/154047)。在一些实施例中，抗体部分包括对PSA具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2017/015634)。在一些实施例中，抗体部分为scFv。在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括：a)特异性地结合于T细胞(诸如CD3)或NK细胞(诸如CD16a)的表面抗原的第一scFv；及b)抗体部分，其中所述抗体部分为第二scFv。在一些实施例中，SSE包括通过肽连接子连接的第一及第二scFv。在一些实施例中，第一scFv处于第二scFv的氨基端。在一些实施例中，第二scFv处于第一scFv的氨基端。

在一些实施例中，SSE为靶向一或多种可溶免疫抑制剂的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)。此类SSE可充当捕获剂以自其靶标螯合可溶免疫抑制剂，从而减少其免疫抑制效应。在一些实施例中，SSE包括特异性地结合于一或多种可溶免疫抑制剂的一或多种抗体部分。在一些实施例中，免疫抑制剂为免疫抑制细胞因子。在一些实施例中，免疫抑制细胞因子包含TGF-β家族成员(诸如TGF-β1至4)、IL-4及IL-10，包含其变异体或突变体。在一些实施例中，SSE为选自由以下组成的群组的多特异性抗体：串联scFv、双功能抗体(Db)、单链双功能抗体(scDb)、双亲和力重靶向(DART)抗体及双可变域(DVD)抗体。在一些实施例中，SSE为双特异性抗体。举例来说，在一些实施例中，SSE为串联scFv，其包括靶向第一免疫抑制细胞因子(诸如TGFβ)的第一cFv及靶向第二免疫抑制细胞因子(诸如IL-4)的第二scFv。

在一些实施例中，SSE为靶向免疫检查点分子的抗体部分。在一些实施例中，SSE为抑制性免疫检查点分子的拮抗剂。在一些实施例中，抑制性免疫检查点分子是选自由以下组成的群组：PD-1、PD-L1、CTLA-4、HVEM、BTLA、KIR、LAG-3、TIM-3及A2aR。在一些实施例中，SSE为刺激性免疫检查点分子的促效剂。在一些实施例中，刺激性免疫检查点分子是选自由以下组成的群组：CD28、ICOS、4-1BB、OX40、CD27及CD40。在一些实施例中，抗体部分为全长抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗体部分为scFv。

在一些实施例中，SSE为靶向PD-1的拮抗性抗体部分。在一些实施例中，抗体部分包括对PD-1具有特异性的拮抗性抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(参见例如WO2016/210129)。在一些实施例中，拮抗性抗体部分为全长抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，拮抗性抗体部分为scFv。

在一些实施例中，SSE为靶向CD47的拮抗性抗体部分。在一些实施例中，拮抗性抗体部分包括对CD47具有特异性的拮抗性抗体部分的CDR或可变域(V_H及/或V_L域)(例如，V_H域，其包括SEQ ID NO:66的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；及/或V_L域，其包括SEQ ID NO:67的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成；或其中所含的CDR)。在一些实施例中，拮抗性抗体部分为全长抗体、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，拮抗性抗体部分为scFv。

在一些实施例中，SSE包括抗体部分，其以下列各者结合于靶抗原：a)为其对其它分子的结合亲和力的至少约10倍(包含例如至少约10、20、30、40、50、75、100、200、300、400、500、750、1000或更大倍中的任一者)的亲和力；或b)不超过其用于结合于其它分子的K_d的约1/10(诸如不超过约1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/75、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/750、1/1000或更小中的任一者)的K_d。结合亲和力可通过所属领域中已知的方法测定，诸如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀分析(RIA)。K_d可通过所属领域中已知的方法测定，诸如利用例如Biacore仪器的表面等离子体共振(SPR)分析，或利用例如Sapidyne仪器的动力学排除分析(KinExA)。

在一些实施例中，SSE为特异性地结合免疫抑制受体的配体的可溶分子。在一些实施例中，SSE包括源自免疫抑制受体的胞外域的配体结合域。在一些实施例中，配体结合域为受体的胞外域的一部分。在一些实施例中，免疫抑制受体是选自由以下组成的群组：FasR、TNFR1、TNFR2、SIRPα、PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG-3、4-1BB、OX40、CD27、CD40及TIM-3。

在一些实施例中，SSE为特异性地结合于免疫抑制受体且拮抗免疫抑制受体的可溶分子。在一些实施例中，SSE包括源自免疫抑制受体的配体的胞外域的受体结合域。在一些实施例中，受体结合域为配体的胞外域的一部分。在一些实施例中，配体是选自由以下组成的群组：FasL、PD-L1、PD-L2、CD47、CD80、CD86、ICOSL、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40L及GAL9。

在一些实施例中，SSE为外源性刺激细胞因子。本文所描述的外源性细胞因子为自外源性基因表达的细胞因子。在一些实施例中，外源性刺激细胞因子为IL-12家族成员。在一些实施例中，IL-12家族成员为IL-12、IL-23、IL-27或IL-35。在一些实施例中，外源性刺激细胞因子为IL-2、IL-15、IL-18或IL-21。在一些实施例中，外源性刺激细胞因子能够提供caTCR加CSR及SSE免疫细胞上的细胞因子的受体的自分泌活化。

在一些实施例中，SSE在caTCR加CSR及SSE免疫细胞中的表达为可诱导的。在一些实施例中，caTCR加CSR及SSE免疫细胞包括编码SSE的核酸序列，其可操作地连接于诱导性启动子，包含本文所描述的诱导性启动子中的任一者。在一些实施例中，在经由caTCR的信号传导后，SSE在caTCR加CSR及SSE免疫细胞中的表达为可诱导的。在一些此类实施例中，caTCR加CSR及SSE免疫细胞包括编码SSE的核酸序列，其响应于经由caTCR的信号传导而可操作地连接于启动子或调节元件。在一些实施例中，编码SSE的核酸序列可操作地连接于经活化T细胞(NFAT)衍生的启动子的核因子。在一些实施例中，NFAT衍生的启动子为NFAT衍生的最小启动子(参见例如Durand,D等人,Molec.Cell.Biol.8,1715-1724(1988)；Clipstone,NA、Crabtree,GR.Nature.1992357(6380):695-7；Chmielewski,M.等人.Cancerresearch 71.17(2011):5697-5706；及Zhang,L.等人.Molecular therapy 19.4(2011):751-759)。在一些实施例中，NFAT衍生的启动子包括SEQ ID NO:85的核苷酸序列。在一些实施例中，编码SSE的核酸序列可操作地连接于IL-2启动子。

核酸

也涵盖编码本文所描述的caTCR、CSR及/或SSE的核酸分子。在一些实施例中，根据本文所描述的caTCR、CSR及SSE中的任一者，提供一种编码caTCR、CSR及/或SSE的核酸(一组核酸)。

本发明也提供其中***有本发明的核酸的载体。

简单地说，通过编码caTCR及/或CSR及/或SSE的核酸表达本文所描述的caTCR及/或CSR及/或SSE可通过以下达成：将核酸***至适当表达载体中，使得核酸可操作地连接于5'及3'调节元件，包含(例如)启动子(例如淋巴细胞特异性启动子)及3'非转译区(UTR)。载体可适合于在真核宿主细胞中复制及整合。典型的克隆及表达载体含有转录及转译终止子、起始序列及适用于调节所要核酸序列表达的启动子。

本发明的核酸也可用于使用标准基因传递方案的核酸免疫接种及基因疗法。基因传递方法为所属领域中已知的。参见例如美国专利第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，本发明提供基因疗法载体。

核酸可克隆至许多类型的载体中。举例来说，核酸可克隆至包含(但不限于)质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒及粘粒的载体中。尤其受关注的载体包含表达载体、复制载体、探针产生载体及定序载体。

此外，表达载体可以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术为所属领域中熟知的且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)及其它病毒学及分子生物学手册中。适用作载体的病毒包含(但不限于)反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒及慢病毒。大体来说，适合的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、适宜限制性核酸内切酶位点及一或多个可选标记物(参见例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美国专利第6,326,193号)。

已开发出多种基于病毒的系统用于将基因转移至哺乳动物细胞中。举例来说，反转录病毒提供基因传递系统的适宜平台。所选基因可***载体中且使用所属领域中已知的技术封装于反转录病毒粒子中。接着可分离重组型病毒且体内或离体传递至个体的细胞中。多种反转录病毒系统为所属领域中已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。多种腺病毒载体为所属领域中已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。源自反转录病毒(诸如慢病毒)的载体为达成长期基因转移的适合工具，因为其允许转殖基因的长期稳定整合及其在子细胞中的传播。慢病毒载体具有优于源自致癌反转录病毒(诸如鼠类白血病病毒)的载体的额外优势，因为其可转导非增殖性细胞，诸如肝细胞。其也具有低免疫原性的额外优势。

额外启动子元件(例如，强化子)调节转录起始频率。通常，这些元件定位于起始位点上游30-110bp区中，但多个启动子最近已展示含有也位于起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常为灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距在活性开始下降之前可增加至相隔50bp。

适合启动子的一个实例为即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列为能够驱使任何与其可操作地连接的聚核苷酸序列的高表达量的强组成性启动子序列。适合启动子的另一实例为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其它组成性启动子序列，包含(但不限于)猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠***肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺乏病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、艾巴二氏病毒即刻早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人类基因启动子，诸如(但不限于)肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子及肌酸激酶启动子。

此外，本发明应不限于组成性启动子的使用。也涵盖诱导性启动子作为本发明的一部分。诱导性启动子的使用提供分子开关，所述分子开关能够在需要此类表达时打开其可操作地连接的聚核苷酸序列的表达或在不需要表达时关闭表达。用于真核细胞中的示范性诱导性启动子系统包含(但不限于)激素调节元件(参见例如Mader,S.及White,J.H.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5603-5607)、合成配体调节元件(参见例如Spencer,D.M.等人,1993)Science 262:1019-1024)及电离辐射调节元件(参见例如Manome,Y.等人(1993)Biochemistry 32:10607-10613；Datta,R.等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1014-10153)。用于体外或体内哺乳动物系统中的其它示范性诱导性启动子系统评述于Gingrich等人(1998)Annual Rev.Neurosci 21:377-405中。

用于本发明的示范性诱导性启动子系统为Tet系统。此类系统是基于Gossen等人(1993)所描述的Tet系统。在一示范性实施例中，所关注的聚核苷酸处于包括一或多个Tet操纵基因(TetO)位点的启动子控制下。处于非活性状态时，Tet抑制子(TetR)将结合至TetO位点且抑制自启动子转录。处于活性状态时，例如在诸如四环素(Tc)、无水四环素、多西环素(Dox)或其活性类似物的诱导剂存在下，诱导剂促使TetR自TetO释放，从而允许转录发生。多西环素为四环素抗生素家族的成员，化学名称为1-二甲氨基-2,4a,5,7,12-五羟基-11-甲基-4,6-二侧氧基-1,4a,11,11a,12,12a-六氢并四苯-3-甲酰胺。

在一个实施例中，TetR的密码子经最佳化以便表达于哺乳动物细胞(例如鼠类或人类细胞)中。由于遗传密码的简并，所以大部分氨基酸是由超过一个密码子编码，从而允许指定核酸的核苷酸序列有基本性变化，但由核酸编码的氨基酸序列无任何改变。然而，许多生物体显示出密码子使用的差异，其也被称作“密码子偏倚”(即，指定氨基酸的特定密码子的使用的偏倚)。密码子偏倚常常与特定密码子的tRNA的主要种类的存在相关，其又可提高mRNA的转译效率。因此，可经由密码子最佳化来调整源自特定生物体(例如原核生物)的编码序列，以改进在不同生物体(例如真核生物)中的表达。

Tet系统的其它特定变化形式包含以下“Tet关”及“Tet开”系统。在Tet关系统中，转录在Tc或Dox存在下为不活跃的。在彼系统中，四环素控制的转活化蛋白(tTA)调节在四环素反应性启动子元件(TRE)的转录控制下的靶核酸的表达，tTA是由与来自单纯疱疹病毒的VP16的强转活化域融合的TetR构成。TRE是由与启动子(通常为源自人类巨细胞病毒(hCMV)即刻早期启动子的最小启动子序列)融合的TetO序列多联体组成。在不存在Tc或Dox的情况下，tTA结合至TRE且活化靶基因的转录。在Tc或Dox存在下，tTA不能结合至TRE，且来自靶基因的表达仍不活跃。

反之，在Tet开系统中，转录在Tc或Dox存在下为活跃的。Tet开系统是基于反向四环素控制的转活化剂rtTA。如同tTA一样，rtTA也为由TetR抑制因子及VP16转活化域构成的融合蛋白。然而，TetR DNA结合部分中的四个氨基酸改变使得rtTA的结合特征改变，使得其仅可在Dox存在下识别标靶转殖基因的TRE中的tetO序列。因此，在Tet开系统中，TRE调节的靶基因的转录仅在Dox存在下受到rtTA刺激。

另一诱导性启动子系统为来自大肠杆菌(E.coli)的lac抑制因子系统。(参见Brown等人，Cell 49:603-612(1987))。lac抑制因子系统通过调节可操作地连接于包括lac操纵基因(lacO)的启动子的所关注聚核苷酸的转录来起作用。lac抑制因子(lacR)结合于LacO，从而防止所关注聚核苷酸的转录。所关注聚核苷酸的表达是由适合诱导剂诱导，例如异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。

用于本发明的另一示范性诱导性启动子系统为活化T细胞的核因子(NFAT)系统。NFAT转录因子家族为T细胞活化的重要调节因子。NFAT反应元件发现于例如IL-2启动子中(参见例如Durand,D.等人,Molec.Cell.Biol.8,1715-1724(1988)；Clipstone,NA,Crabtree,GR.Nature.1992 357(6380):695-7；Chmielewski,M.等人,Cancer research71.17(2011):5697-5706；及Zhang,L.等人,Molecular therapy 19.4(2011):751-759)。在一些实施例中，本文所描述的诱导性启动子包括一或多个(诸如2、3、4、5、6或更多个)NFAT反应元件。在一些实施例中，诱导性启动子包括6个例如包括SEQ ID NO:83的核苷酸序列的NFAT反应元件。在一些实施例中，本文所描述的诱导性启动子包括一或多个(诸如2、3、4、5、6或更多个)NFAT反应元件，所述反应元件连接于最小启动子(诸如最小TA启动子)。在一些实施例中，最小TA启动子包括SEQ ID NO:84的核苷酸序列。在一些实施例中，诱导性启动子包括SEQ ID NO:85的核苷酸序列。

为了评定多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体也可含有可选标记基因或报告基因或两者以有助于自设法经病毒载体转染或感染的细胞群体鉴别及选择表达细胞。在其它方面中，可选标记物可携载于独立DNA段上且用于共转染程序。可选标记物及报告基因皆可侧接适当调节序列以使能够在宿主细胞中表达。有用可选标记物包含例如耐抗生素基因，诸如neo及其类似物。

报告基因用于识别潜在经转染细胞及评估调节序列的功能。大体来说，报告基因为接受者生物体或组织中不存在或表达且编码表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶促活性)体现的多肽的基因。在DNA已引入接受者细胞中之后的适合时间分析报告基因的表达。适合报告基因可包含编码荧光素酶、β-半乳糖、氯霉素乙酰基转移酶、分泌碱性磷酸酯酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei等人,2000FEBS Letters 479:79-82)。适合表达系统为熟知的且可使用已知技术制备或商购获得。大体来说，具有展示报告基因最高表达量的最小5'侧接区的构筑体经鉴别为启动子。此类启动子区可连接于报告基因且用于评估调节启动子驱动的转录能力的试剂。

在一些实施例中，提供编码根据本文所描述的caTCR、CSR及SSE中的任一者的caTCR及/或CSR的核酸。在一些实施例中，核酸包括一或多种编码caTCR的所有多肽链的核酸序列。在一些实施例中，核酸包括一或多种编码CSR的所有多肽链的核酸序列。在一些实施例中，核酸包括一或多种编码caTCR及CSR的所有多肽链的核酸序列。在一些实施例中，一或多种核酸序列中的每一者包括于单独载体中。在一些实施例中，至少一些核酸序列包括于同一载体中。在一些实施例中，所有核酸序列包括于同一载体中。载体可选自例如由哺乳动物表达载体及病毒载体(诸如源自反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒及慢病毒的那些载体)组成的群组。

举例来说，在一些实施例中，caTCR为二聚体，其包括第一caTCR多肽链及第二caTCR多肽链；且CSR为单体，其包括单一CSR多肽链；且核酸包括编码第一caTCR多肽链的第一核酸序列、编码第二caTCR链的第二核酸及编码CSR多肽链的第三核酸序列。在一些实施例中，第一核酸序列包括于第一载体中，第二核酸序列包括于第二载体中，且第三核酸序列包括于第三载体中。在一些实施例中，第一及第二核酸序列包括于第一载体中，且第三核酸序列包括于第二载体中。在一些实施例中，第一及第三核酸序列包括于第一载体中，且第二核酸序列包括于第二载体中。在一些实施例中，第二及第三核酸序列包括于第一载体中，且第一核酸序列包括于第二载体中。在一些实施例中，第一、第二及第三核酸序列包括于同一载体中。在一些实施例中，第一核酸序列处于第一启动子控制下，第二核酸序列处于第二启动子控制下，且第三核酸序列处于第三启动子控制下。在一些实施例中，第一、第二及第三启动子中的一些或全部具有相同序列。在一些实施例中，第一、第二及第三启动子中的一些或全部具有不同序列。在一些实施例中，第一、第二及第三核酸序列中的一些或全部在多顺反子载体中、处于单一启动子控制下以单一转录物形式表达。参见例如Kim、JH等人，PLoSOne6(4):e18556,2011。在一些实施例中，启动子中的一或多者为可诱导的。在一些实施例中，编码CSR多肽链的第三核酸序列可操作地连接于诱导性启动子。在一些实施例中，诱导性启动子包括响应于免疫细胞活化的一或多个元件，诸如NFAT反应元件。

在一些实施例中，第一、第二及第三核酸序列中的一些或全部在宿主细胞(诸如T细胞)中具有相似(诸如基本上或约相同)的表达量。在一些实施例中，第一、第二及第三核酸序列中的一些在宿主细胞(诸如T细胞)中具有相差至少约两倍(诸如至少约2、3、4、5或更多倍中的任一者)的表达量。可以mRNA或蛋白质含测量定表达。mRNA的表达量可通过使用各种熟知方法测量从核酸转录的mRNA的量来测定，所述方法包含RNA印迹法、定量RT-PCR、微阵列分析及其类似者。蛋白质表达量可通过已知方法测量，包含免疫细胞化学染色、酶联免疫吸附分析(ELISA)、蛋白质印迹分析、发光分析、质谱、高效液相色谱、高压液相色谱-串联质谱及其类似者。

应理解，可调适及组合本文所描述的实施例的特征，以涵盖包括任何数目的核酸序列的实施例，例如其中编码caTCR及/或CSR及/或SSE的核酸包括五个或多于五个核酸序列(例如其中caTCR及SSE各自包括2个或多于2个不同多肽链)。

因此，在一些实施例中，提供一种编码以下的核酸：a)二聚体caTCR，其包括根据本文所描述的caTCR中的任一者的第一caTCR多肽链及第二caTCR多肽链，所述核酸包括i)编码第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列，及ii)编码第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列；及b)单体CSR，其包括根据本文所描述的CSR中的任一者的单一CSR多肽链，所述核酸进一步包括编码CSR多肽链的CSR核酸序列。在一些实施例中，第一caTCR核酸序列包括于第一载体(诸如慢病毒载体)中，第二caTCR核酸序列包括于第二载体(诸如慢病毒载体)中，且CSR核酸序列包括于第三载体(诸如慢病毒载体)中。在一些实施例中，第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列中的一些或全部包括于同一载体(诸如慢病毒载体)中。在一些实施例中，第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列各自个别地可操作地连接于启动子。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有相同序列。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有不同序列。在一些实施例中，启动子中的一些或全部为可诱导的。在一些实施例中，CSR核酸序列可操作地连接于诱导性启动子。在一些实施例中，诱导性启动子包括响应于免疫细胞活化的一或多个元件。在一些实施例中，CSR核酸序列可操作地连接于NFAT衍生的启动子。在一些实施例中，载体中的一些或全部为病毒载体(诸如慢病毒载体)。

在一些实施例中，提供：a)第一载体(诸如慢病毒载体)，其包括编码二聚体caTCR的核酸，所述二聚体caTCR包括根据本文所描述的caTCR中的任一者的第一caTCR多肽链及第二caTCR多肽链，所述核酸包括i)可操作地连接于编码第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列的第一启动子；及ii)可操作地连接于编码第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列的第二启动子；及b)第二载体(诸如慢病毒载体)，其包括编码单体CSR的核酸，所述单体CSR包括根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR多肽链，所述核酸包括可操作地连接于编码CSR多肽链的CSR核酸序列的第三启动子。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有相同序列。在一些实施例中，启动子中的一些或全部具有不同序列。在一些实施例中，启动子中的一些或全部为可诱导的。在一些实施例中，第一及/或第二载体为病毒载体(诸如慢病毒载体)。

在一些实施例中，提供：a)第一载体(诸如慢病毒载体)，其包括编码二聚体caTCR的核酸，所述二聚体caTCR包括根据本文所描述的caTCR中的任一者的第一caTCR多肽链及第二caTCR多肽链，所述核酸包括i)编码第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列；及ii)编码第二caTCR多肽链的caTCR核酸序列，其中第一及第二caTCR核酸序列处于第一启动子控制下；及b)第二载体(诸如慢病毒载体)，其包括编码单体CSR的核酸，所述单体CSR包括根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR多肽链，所述核酸包括可操作地连接于编码CSR多肽链的CSR核酸序列的第二启动子。在一些实施例中，第一启动子可操作地连接于第一caTCR核酸序列的5'端，且存在选自由内部核糖体进入位点(IRES)及编码自裂解2A肽(诸如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸组成的群组的核酸连接子，所述核酸连接子将第一caTCR核酸序列的3'端连接于第二caTCR核酸序列的5'端，其中第一caTCR核酸序列及第二caTCR核酸序列在第一启动子控制下转录为单一RNA。在一些实施例中，第一启动子可操作地连接于第二caTCR核酸序列的5'端，且存在选自由内部核糖体进入位点(IRES)及编码自裂解2A肽(诸如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸组成的群组的核酸连接子，所述核酸连接子将第二caTCR核酸序列的3'端连接于第一caTCR核酸序列的5'端，其中第一caTCR核酸序列及第二caTCR核酸序列在第一启动子控制下转录为单一RNA。在一些实施例中，第一及/或第二启动子为可诱导的。在一些实施例中，第一及/或第二载体为病毒载体(诸如慢病毒载体)。应了解，也涵盖交换核酸序列中的任一者，诸如第一或第二caTCR核酸序列与CSR核酸序列交换的实施例。

在一些实施例中，提供一种载体(诸如病毒载体，例如慢病毒载体)，其包括：a)编码二聚体caTCR的核酸，所述二聚体caTCR包括根据本文所描述的caTCR中的任一者的第一caTCR多肽链及第二caTCR多肽链，所述核酸包括i)编码第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列；及ii)编码第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列；及b)编码单体CSR的核酸，所述单体CSR包括根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR多肽链，所述核酸包括编码CSR多肽链的CSR核酸序列，其中第一及第二caTCR核酸序列处于第一启动子控制下，且其中CSR核酸序列处于第二启动子控制下。在一些实施例中，第一启动子可操作地连接于caTCR核酸序列中的一者，所述caTCR核酸序列通过选自由内部核糖体进入位点(IRES)及编码自裂解2A肽(诸如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸组成的群组的核酸连接子连接于另一caTCR核酸序列，使得第一及第二caTCR核酸序列在第一启动子控制下转录为单一RNA。在一些实施例中，第一及/或第二启动子为可诱导的。在一些实施例中，第二启动子为诱导性启动子。在一些实施例中，诱导性启动子包括响应于免疫细胞活化的一或多个元件。在一些实施例中，第二启动子为NFAT衍生的启动子。在一些实施例中，NFAT衍生的启动子包括SEQ ID NO:85的核苷酸序列。在一些实施例中，载体为病毒载体(诸如慢病毒载体)。

在一些实施例中，提供一种载体(诸如慢病毒载体)，其包括：a)编码二聚体caTCR的核酸，所述二聚体caTCR包括根据本文所描述的caTCR中的任一者的第一caTCR多肽链及第二caTCR多肽链，所述核酸包括i)编码第一caTCR多肽链的第一caTCR核酸序列；及ii)编码第二caTCR多肽链的第二caTCR核酸序列；及b)编码单体CSR的核酸，所述单体CSR包括根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR多肽链，所述核酸包括编码CSR多肽链的CSR核酸序列，其中第一及第二caTCR核酸序列及CSR核酸序列处于单一启动子控制下。在一些实施例中，启动子可操作地连接于核酸序列中的一者，所述核酸序列通过个别地选自由内部核糖体进入位点(IRES)及编码自裂解2A肽(诸如P2A、T2A、E2A或F2A)的核酸组成的群组的核酸连接子连接于其它核酸序列，使得第一及第二核酸序列及CSR核酸序列在启动子控制下转录为单一RNA。在一些实施例中，启动子为诱导型启动子。在一些实施例中，载体为病毒载体(诸如慢病毒载体)。

向细胞中引入及表达基因的方法为所属领域中已知。在表达载体的上下文中，载体可易于通过所属领域中的任何方法引入至宿主细胞中，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。举例来说，表达载体可通过物理、化学或生物方式转移至宿主细胞中。

用于将聚核苷酸引入至宿主细胞中的物理方法包含磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔及其类似方法。用于制造包括载体及/或外源性核酸的细胞的方法为所属领域中熟知的。参见例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。在一些实施例中，通过磷酸钙转染进行将聚核苷酸引入至宿主细胞中。

将所关注的聚核苷酸引入宿主细胞中的生物方法包含使用DNA及RNA载体。病毒载体及尤其反转录病毒载体已成为最广泛用于将基因***至哺乳动物(例如人类)细胞中的方法。其它病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、1型单纯疱疹病毒、腺病毒及腺相关病毒及其类似者。参见例如美国专利第5,350,674号及第5,585,362号。

将聚核苷酸引入宿主细胞中的化学方式包含胶态分散系统，诸如大分子复合物、纳米囊剂、微球、珠粒及基于脂质的系统，包含水包油乳液、微胞、混合微胞及脂质体。用作体外及体内传递媒剂的一示范性胶态系统为脂质体(例如，人工膜泡)。

在利用非病毒传递系统的情况下，示范性传递媒剂为脂质体。预期使用脂质调配物将核酸引入至宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面中，核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可囊封于脂质体的水性内部中，穿插于脂质体的脂质双层内，经由与脂质体及寡核苷酸相关联的连接分子附接至脂质体，包覆于脂质体中，与脂质体复合，分散于含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式含于脂质中，含有微胞或与微胞复合，或以其它方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何特定结构。举例来说，其可存在于双层结构中，以微胞形式存在或具有“塌陷”结构。其也可简单地穿插于溶液中，可能形成尺寸或形状上不均匀的聚集物。脂质为可为天然存在的脂质或合成脂质的脂肪物质。举例来说，脂质包含细胞质中天然存在的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃及其衍生物的化合物类别(诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇及醛)。

不管用于将外源性核酸引入宿主细胞或以其它方式使细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可进行多种分析。此类分析包含例如所属领域的技术人员熟知的“分子生物”分析，诸如DNA印迹法及RNA印迹法、RT-PCR及PCR；“生物化学”分析，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方式(ELISA及蛋白质印迹法)或通过本文所描述的分析来识别在本发明的范围内的试剂。

caTCR、CSR及SSE的制备

在一些实施例中，根据本文所描述的包括抗体部分的caTCR、CSR及SSE中的任一者，抗体部分(例如Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或scFv)包括源自单克隆抗体的序列。在一些实施例中，抗体部分包括来自单克隆抗体的V_H及V_L域，或其变异体。在一些实施例中，抗体部分进一步包括来自单克隆抗体的C_H1及C_L域，或其变异体。单克隆抗体可例如使用融合瘤方法制备，诸如由Kohler及Milstein,Nature,256:495(1975)及Sergeeva等人,Blood,117(16):4262-4272所描述的那些方法。

在融合瘤方法中，仓鼠、小鼠或其它适当宿主动物通常用免疫剂免疫以产生淋巴细胞，其产生或能够产生将特异性结合于免疫剂的抗体。或者，淋巴细胞可在体外免疫。免疫剂可包含多肽或所关注蛋白质的融合蛋白，或包括至少两种分子的复合体，诸如包括肽及MHC蛋白的复合体。大体来说，如果需要人类来源的细胞，那么使用末梢血液淋巴细胞(“PBL”)；或如果需要非人类哺乳动物来源，那么使用脾细胞或***细胞。淋巴细胞接着使用适合融合剂(诸如聚乙二醇)经永生化细胞系融合以形成融合瘤细胞。参见例如Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(New York:Academic Press,1986)，第59-103页。永生化细胞系通常为经转化哺乳动物细胞，确切地说，啮齿动物、牛类及人类来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。融合瘤细胞可在优选地含有一或多种抑制未融合、永生化细胞的生长或存活的物质的适合培养基中培养。举例来说，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于融合瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤及胸苷(“HAT培养基”)，其阻止缺乏HGPRT的细胞生长。

在一些实施例中，永生化细胞系有效融合，通过所选产抗体细胞支持抗体的稳定高水准表达且对于诸如HAT培养基的培养基敏感。在一些实施例中，永生化细胞系为鼠类骨髓瘤细胞系，其可例如获自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California及American Type Culture Collection,Manassas,Virginia。已描述用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤及小鼠-人类杂骨髓瘤细胞系。Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications(Marcel Dekker,Inc.:New York,1987)第51-63页。

接着可分析培养融合瘤细胞的培养基中针对所述多肽的单克隆抗体的存在。可通过免疫沉淀或通过体外结合分析(诸如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA))测定由融合瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。所述技术及分析法是所属领域中已知的。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson及Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的史卡查分析测定。

在鉴别所需融合瘤细胞之后，克隆可通过限制稀释程序亚克隆且通过标准方法生长。前述编码。适用于此目的的培养基包含例如达尔伯克改进型伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle's Medium)及RPMI-1640培养基。或者，融合瘤细胞可以腹水形式体内生长于哺乳动物中。

亚克隆所分泌的单克隆抗体可通过常规免疫球蛋白纯化程序(诸如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱)从培养基或腹水液分离或纯化。

在一些实施例中，根据本文所描述的包括抗体部分的caTCR、CSR及SSE中的任一者，抗体部分包括来自选自抗体部分库(诸如呈递scFv或Fab片段的噬菌体库)的克隆的序列。克隆可通过筛选组合库中具有所需一或多种活性的抗体片段来鉴别。举例来说，所属领域中已知多种方法用于产生噬菌体呈现库及针对具有所需结合特征的抗体筛选此类库。此类方法评述于例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,Totowa,N.J.,2001)中，且进一步描述于例如McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；及Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中。

在某些噬菌体呈现方法中，V_H及V_L基因的谱系分别通过聚合酶链反应(PCR)克隆且在噬菌体库中随机重组，其接着可如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)中所描述，针对抗原结合噬菌体进行筛选。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈现抗体片段。来自经免疫来源的库向免疫原提供高亲和力抗体而无需构建融合瘤。或者，可克隆(例如自人类)原生谱系以提供针对广泛范围的非自体抗原以及自体抗原的单一抗体来源而无需任何免疫接种，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所描述。最后，也可以合成方式如下制备原生库：从干细胞克隆未重排V基因区段，且使用含有随机序列的PCR引子编码CDR3高度可变区及实现体外重排，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述。描述人类抗体噬菌体库的专利公开案包含例如：美国专利第5,750,373号及美国专利公开案第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号及第2009/0002360号。

可使用噬菌体呈现以筛选对靶抗原(诸如肽/MHC I/II级复合体或细胞表面抗原)具有特异性的抗体库来制备抗体部分。库可为具有至少1×10⁹(诸如至少约1×10⁹、2.5×10⁹、5×10⁹、7.5×10⁹、1×10¹⁰、2.5×10¹⁰、5×10¹⁰、7.5×10¹⁰或1×10¹¹中的任一者)个独特人类抗体片段的多样性的人类scFv噬菌体呈现库。在一些实施例中，库为原生人类库，其由来自健康供者的人类PMBC及脾提取的DNA构建，包括所有人类重链及轻链亚家族。在一些实施例中，库为原生人类库，所述库由分离自患有各种疾病的患者(诸如患有自体免疫疾病的患者、癌症患者及患有感染性疾病的患者)的PBMC提取的DNA构建。在一些实施例中，库为半合成人类库，其中重链CDR3为完全随机化的，所有氨基酸(除半胱氨酸之外)同等地可能存在于任何指定位置(参见例如Hoet,R.M.等人,Nat.Biotechnol.23(3):344-348,2005)。在一些实施例中，半合成人类库的重链CDR3的长度为约5至约24(诸如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24中的任一者)个氨基酸。在一些实施例中，库为全合成噬菌体呈现库。在一些实施例中，库为非人类噬菌体呈现库。

可通过以下来选择以高亲和力结合于靶抗原的噬菌体克隆：噬菌体与靶抗原迭代结合，所述靶抗原经结合于固体支撑物(诸如用于溶液淘选(solution panning)的珠粒或用于细胞淘选(cell panning)的哺乳动物细胞)，随后移除非结合噬菌体及洗脱特异性结合的噬菌体。在溶液淘选的一个实例中，靶抗原可经生物素标记以固定至固体支撑物。经生物素标记的靶抗原与噬菌体库及固体支撑物(诸如抗生蛋白链菌素结合的戴诺珠粒(Dynabead)M-280)混合，且接着分离靶抗原-噬菌体-珠粒复合体。结合噬菌体克隆接着经洗脱且用于感染适当宿主细胞，诸如大肠杆菌XL1-Blue，用于表达及纯化。在细胞淘选的实例中，负载有AFP肽的T2细胞(TAP缺陷、HLA-A*02:01⁺淋巴母细胞系)与噬菌体库混合，其后收集细胞，且经结合克隆经洗脱且用以感染适当宿主细胞(用于表达及纯化)。可通过溶液淘选、细胞淘选或两者的组合进行多轮(诸如约2、3、4、5、6或更大中的任一者)淘选，以富集特异性结合于靶抗原的噬菌体克隆。可通过所属领域中已知的任何方法(包含例如ELISA及FACS)测试所富集的噬菌体克隆对靶抗原的特异性结合。

人类及人类化抗体部分

caTCR、CSR及SSE抗体部分可为人类或经人类化。人类化形式的非人类(例如鼠类)抗体部分为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂、scFv或抗体的其它抗原结合子序列)，通常含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列。人类化抗体部分包含人类免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(接受者抗体)，其中来自接受者的CDR的残基经来自具有所需特异性、亲和力及能力的非人类物种(供者抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架残基经对应非人类残基置换。人类化抗体部分也可包括既未在接受者抗体部分中、也未在所输入的CDR或框架序列中发现的残基。大体来说，人类化抗体部分可包括至少一个且通常两个可变域的基本上全部，其中CDR区的全部或基本上全部对应于非人类免疫球蛋白的那些区，且FR区的全部或基本上全部为人类免疫球蛋白共同序列的那些区。参见例如Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。

大体来说，人类化抗体部分中已引入来自非人类来源的一或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基往往称为“输入”残基，其通常从“输入”可变域获得。根据一些实施例，人类化基本上可遵循Winter及同事的方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人类抗体的对应序列进行。因此，此类“人类化”抗体部分为抗体部分(美国专利第4,816,567号)，其中基本上少于完整人类可变域已经来自非人类物种的对应序列取代。实际上，人类化抗体部分通常为一些CDR残基及可能一些FR残基经来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人类抗体部分。

作为人类化的替代方案，可产生人类抗体部分。举例来说，现可能产生基因转殖动物(例如小鼠)，其在免疫接种后能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生完整的人类抗体谱系。举例来说，已描述嵌合及生殖系突变小鼠中的抗体重链接合区(JH)基因的同型接合缺失导致完全抑制内源性抗体产生。将人类生殖系免疫球蛋白基因阵列转移至此类生殖系突变小鼠中将导致在抗原攻击时产生人类抗体。参见例如Jakobovits等人,PNAS USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year inImmunol.,7:33(1993)；美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,591,669号；第5,545,807号；及WO 97/17852。或者，可通过将人类免疫球蛋白基因座引入基因动转殖物(例如内源性免疫球蛋白基因已部分或完全不活化的小鼠)来制备人类抗体。在攻击之后，观察人类抗体产生，其在所有方面与在人类中所见极其类似，包含基因重排、组合及抗体谱系。此方法描述于例如美国专利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；及第5,661,016号，及Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology,14:826(1996)；Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)中。

人类抗体也可由体外活化的B细胞产生(参见美国专利5,567,610及5,229,275)或通过使用所属领域中已知的各种技术(包含噬菌体呈现库)产生。Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等人及Boerner等人的技术也可用于制备人类单克隆抗体。Cole等人,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)及Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。

其它变异体

在一些实施例中，涵盖本文所提供的抗原结合模块的氨基酸序列变异体。举例来说，可能需要改进抗原结合模块的结合亲和力及/或其它生物特性。可通过引入适当修饰至编码抗原结合模块的核苷酸序列或通过肽合成来制备抗原结合模块的氨基酸序列变异体。此类修饰包含例如抗原结合模块的氨基酸序列内的残基缺失及/或***及/或取代。可制造缺失、***及取代的任一组合以获得最终构筑体，其限制条件为最终构筑体具有所需特征，例如抗原结合。

在一些实施例中，提供具有一或多个氨基酸置换的抗原结合模块变异体。用于取代性突变诱发的所关注位点包含抗体部分的HVR及FR。氨基酸置换可经引入至所关注的抗原结合模块中，且针对所需活性进行筛选的产物例如保持/改进抗原结合或减少免疫原性。

保守取代经展示于下表4中。

表4：保守取代

氨基酸可根据常见侧链特性分组为不同类别：

a.疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

c.酸性：Asp、Glu；

d.碱性：His、Lys、Arg；

e.影响链定向的残基：Gly、Pro；

f.芳香族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代必然伴有这些类别中的一者的一员与另一类别的一员的交换。

示范性取代型变异体为亲和力成熟抗体部分，其可例如使用基于噬菌体呈现的亲和力成熟技术便利地产生。简单地说，使一或多个CDR残基突变且在噬菌体上呈现变异抗体部分且针对特定生物活性(例如结合亲和力)筛选。改变(例如取代)可在HVR中进行以例如改进抗体部分亲和力。此类改变可在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程期间经历高频率突变的密码子所编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，及/或特异性决定残基(SDR)中进行，其中测试所得变异体V_H或V_L的结合亲和力。通过构建二级库及从二级库再选择来达成亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等人的Methods inMolecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。

在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向突变诱发)中的任一种将多样性引入为了成熟所选的可变基因中。随后产生二级库。接着筛选库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体部分变异体。引入多样性的另一方法涉及HVR引导途径，其中将若干HVR残基(例如一次4-6个残基)随机分组。可例如使用丙氨酸扫描突变诱发或建立模型来特异性鉴别参与抗原结合的HVR残基。尤其通常靶向CDR-H3及CDR-L3。

在一些实施例中，取代、***或缺失可出现于一或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗体部分结合抗原的能力。举例来说，可在HVR中进行不基本上降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代)。此类改变可位于HVR“热点”或SDR外部。在上文所提供的变异V_H及V_L序列的一些实施例中，各HVR未改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。

一种适用于鉴别突变诱发可靶向的抗原结合模块的残基或区的方法称为“丙氨酸扫描突变诱发”，如Cunningham及Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述。在此方法中，鉴别残基或一组目标残基(例如带电残基，诸如arg、asp、his、lys及glu)且经中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定抗原结合模块与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展现功能敏感性的氨基酸位置处引入其它取代。或者或另外，可测定抗原-抗原结合模块复合体的晶体结构以鉴别抗原结合模块与抗原之间的接触点。此类接触残基及邻近残基可作为取代候选物的靶标或排除在取代候选物之外。可筛选变异体以确定其是否含有所需特性。

氨基酸序列***包含长度在一个残基至含有一百个或多于一百个残基的多肽范围内的氨基端及/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包含具有N端甲硫胺酰基残基的抗原结合模块。抗原结合模块的其它***变异体包含抗原结合模块的N或C端与增加抗原结合模块的血清半衰期的酶(例如对于ADEPT)或多肽的融合。

衍生物

在一些实施例中，根据本文所描述的caTCR中的任一者的caTCR及/或根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR及/或根据本文所描述的SSE中的任一者的SSE可进一步经修饰为含有所属领域中已知且易于获得的额外非蛋白性部分。适合于衍生caTCR及/或CSR及/或SSE的部分包含(但不限于)水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包含(但不限于)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)及聚葡萄糖或聚(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其于水中的稳定性而可在制造中具有优势。聚合物可具有任何分子量，且可为分支链或未分支的。附接至caTCR及/或CSR及/或SSE的聚合物的数目可变化，且如果附接超过一个聚合物，则其可为相同或不同分子。大体来说，用于衍生的聚合物的数目及/或类型可基于包含但不限于以下的考量来确定：待改进的caTCR及/或CSR及/或SSE的特定特性或功能，而不管caTCR及/或CSR及/或SSE衍生物是否将用于经限定条件下的疗法等。

在一些实施例中，提供caTCR及/或CSR及/或SSE与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白性部分的结合物。在一些实施例中，非蛋白质部分为碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，且包含(但不限于)不损害普通细胞但将非蛋白质部分加热至杀灭caTCR及/或CSR及/或SSE-非蛋白性部分近侧的细胞的温度的波长。

caTCR加CSR免疫细胞的制备

在一个方面中，本发明提供表达根据本文所描述的实施例中的任一者的caTCR及CSR的免疫细胞(诸如淋巴细胞，例如T细胞)。本文提供制备表达caTCR及CSR的免疫细胞(诸如T细胞)(caTCR加CSR免疫细胞，诸如caTCR加CSR T细胞)的示范性方法。

在一些实施例中，可通过将编码caTCR(诸如本文所描述的caTCR中的任一者)及CSR(诸如本文所描述的CSR中的任一者)的一或多个核酸(包含例如慢病毒载体)引入至免疫细胞中来产生caTCR加CSR免疫细胞(诸如caTCR加CSR T细胞)，所述caTCR特异性结合于靶抗原(诸如疾病相关抗原)，所述CSR特异性结合于靶配体。将一或多个核酸引入至免疫细胞中可使用所属领域中已知的技术实现，诸如本文针对核酸所描述的那些技术。在一些实施例中，本发明的caTCR加CSR免疫细胞(诸如caTCR加CSR T细胞)能够在体内复制，产生可促成与靶抗原的表达相关的疾病(诸如癌症或病毒感染)的持续控制的长期存留。

在一些实施例中，本发明涉及使用淋巴细胞输注投与表达根据本文所描述的caTCR中的任一者的特异性结合于靶抗原的caTCR及根据本文所描述的CSR中的任一者的特异性结合于靶配体的CSR的经基因修饰的T细胞，以用于治疗患有与靶抗原的表达相关的疾病及/或病症(在本文中也被称作“靶抗原-阳性”或“TA-阳性”疾病或病症)或有罹患所述疾病及/或病症风险的患者，所述疾病及/或病症包含(例如)癌症或病毒感染。在一些实施例中，在治疗中使用自体淋巴细胞输注。自需要治疗的患者收集自体PBMC且使用本文所描述及所属领域中已知的方法活化及扩增T细胞，且随后将其输注回患者体内。

在一些实施例中，提供一种表达根据本文所描述的caTCR中的任一者的特异性结合于靶抗原的caTCR及根据本文所描述的CSR中的任一者的特异性结合于靶配体的CSR的T细胞(在本文中也被称作“caTCR加CSR T细胞”)。本发明的caTCR加CSR T细胞可经历稳固的体内T细胞扩增且可建立以高含量在血液及骨髓中存留较长时间的靶抗原特异性记忆细胞。在一些实施例中，输注至患者体内的本发明的caTCR加CSR T细胞可体内消除患有靶抗原相关疾病的患者内呈递靶抗原的细胞，诸如呈递靶抗原的癌症或病毒感染细胞。在一些实施例中，输注至患者体内的本发明的caTCR加CSR T细胞可体内消除患有难以用至少一种常规疗法治疗的靶抗原相关疾病的患者内呈递靶抗原的细胞，诸如呈递靶抗原的癌症或病毒感染细胞。

在T细胞扩增及基因修饰之前，T细胞来源获自个体。T细胞可获自许多来源，包含末梢血液单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、肋膜积液、脾组织及肿瘤。在本发明的一些实施例中，可使用任何数目的所属领域中可用的T细胞系。在本发明的一些实施例中，T细胞可获自使用任何数目的所属领域的技术人员已知的技术(诸如FICOLL^TM分离)自个体收集的血液单元。在一些实施例中，通过清除术获得来自个体的循环血液的细胞。清除术产物通常含有淋巴细胞，包含T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它成核白血球、红血球及血小板。在一些实施例中，通过清除术收集的细胞可经洗涤以移除血浆部分且将细胞置于适当缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施例中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些实施例中，洗涤溶液缺乏钙且可能缺乏镁或可能缺乏许多(若并非全部)二价阳离子。如一般技术人员将易于了解，洗涤步骤可通过所属领域的技术人员已知的方法实现，诸如通过根据制造商说明书使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics细胞保存器5)。洗涤之后，可将细胞再悬浮于多种生物相容性缓冲液中，诸如无Ca²⁺、无Mg²⁺的PBS、PlasmaLyte A或其它具有或不具有缓冲液的生理盐水溶液。或者，可移除清除术样品的非所要组分且细胞直接再悬浮于培养基中。

在一些实施例中，通过溶解红血球及例如通过经PERCOLL^TM梯度离心或通过逆流离心淘析耗尽单核细胞而自末梢血液淋巴细胞分离T细胞。T细胞的特异性亚群(诸如CD3⁺、CD28⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺及CD45RO⁺T细胞)可通过正选择或负向选择技术进一步分离。举例来说，在一些实施例中，通过用抗CD3/抗CD28(即3×28)结合的珠粒(诸如

M-450CD3/CD28 T)培育足够用于所需T细胞的正选择的时段来分离T细胞。在一些实施例中，时段为约30分钟。在一些实施例中，时段在30分钟至36小时或更长(包含这些值之间的所有范围)的范围内。在一些实施例中，时段为至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施例中，时段为10至24小时。在一些实施例中，培育时段为24小时。为了自患有白血病的患者分离T细胞，使用较长培育时间(诸如24小时)可提高细胞产量。在相较于其它细胞类型存在极少T细胞的任何情况下可使用较长培育时间分离T细胞，诸如自肿瘤组织或免疫功能不全个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。此外，使用较长培育时间可提高捕捉CD8⁺T细胞的效率。因此，通过仅缩短或延长允许T细胞结合至CD3/CD28珠粒的时间及/或通过增加或减小珠粒与T细胞的比率，可关于或针对培养起始或方法期间的其它时间点优先选择T细胞亚群。另外，通过增加或减小珠粒或其它表面上抗CD3及/或抗CD28抗体的比率，对于或针对在培养起始时或在其它所要时间点可优先选择T细胞的亚群。所属领域的技术人员将认识到本发明的上下文中也可使用多个选择回合。在一些实施例中，可能需要进行选择程序且在活化及扩增过程中使用“未经选择的”细胞。“未经选择的”细胞也可进行其它选择回合。

通过负向选择富集T细胞群体可使用针对负向选择的细胞所独特的表面标记的抗体的组合来实现。一种方法为经负磁性免疫粘附或流动式细胞测量术分选及/或选择细胞，所述负磁性免疫粘附或流动式细胞测量术使用针对负向选择细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体混合物。举例来说，为了通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合液通常包含CD 14、CD20、CD11b、CD 16、HLA-DR及CD8的抗体。在一些实施例中，可能需要富集或正选择调节T细胞，其通常表达CD4⁺、CD25⁺、CD62Lhi、GITR⁺及FoxP3⁺。或者，在一些实施例中，T调节细胞通过抗CD25结合珠粒或其它类似选择方法耗尽。

为了通过正向或负向选择分离出所需细胞群体，可改变细胞浓度及表面(例如粒子，诸如珠粒)。在一些实施例中，可能需要显著减小珠粒及细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞及珠粒的最大接触。举例来说，在一些实施例中，使用约20亿个细胞/毫升的浓度。在一些实施例中，使用约10亿个细胞/毫升的浓度。在一些实施例中，使用大于约100,000,000个细胞/毫升。在一些实施例中，使用约10,000,000、15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000或50,000,000个细胞/毫升中的任一者的细胞浓度。在一些实施例中，使用约75,000,000、80,000,000、85,000,000、90,000,000、95,000,000或100,000,000个细胞/毫升中的任一者的细胞浓度。在一些实施例中，使用约125,000,000或约150,000,000个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产量、细胞活化及细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效捕获可弱表达所关注的靶抗原的细胞(诸如CD28-阴性T细胞)或自其中存在许多肿瘤细胞的样本(即，白血病血液、肿瘤组织等)更有效捕获所述细胞。此类细胞群体可具有治疗价值且将需要获得。举例来说，使用高细胞浓度允许更有效选择通常具有较弱CD28表达的CD8⁺T细胞。

在本发明的一些实施例中，T细胞直接获自治疗之后的患者。就此来说，已观测到在某些癌症治疗之后，确切地说使用破坏免疫系统的药物治疗之后，在患者通常将自治疗恢复的时段期间治疗之后不久，获得的T细胞品质可最佳或其离体扩增的能力得到改进。同样，在使用本文所描述的方法离体操纵之后，这些细胞的增强移植及体内扩增可呈优选状态。因此，本发明的上下文内涵盖在此恢复阶段期间收集血细胞(包含T细胞)、树突状细胞或造血谱系的其它细胞。此外，在一些实施例中，移动(例如用GM-CSF移动)及调节方案可用于建立个体内的条件，其中尤其在治疗之后的制定时间窗期间宜再增殖、再循环、再生及/或扩增特定细胞类型。说明性细胞类型包含T细胞、B细胞、树突状细胞及免疫系统的其它细胞。

无论在基因修饰T细胞以表达合乎需要的caTCR、CSR及任选地存在的SSE之前抑或之后，大体可使用例如以下中所描述的方法来活化或扩增T细胞：美国专利号第6,352,694号、第6,534,055号、第6,905,680号、第6,692,964号、第5,858,358号、第6,887,466号、第6,905,681号、第7,144,575号、第7,067,318号、第7,172,869号、第7,232,566号、第7,175,843号、第5,883,223号、第6,905,874号、第6,797,514号、第6,867,041号及美国专利申请公开案第20060121005号。

大体来说，本发明的T细胞通过使与其连接的表面与刺激CD3/TCR复合体相关信号的试剂及刺激T细胞表面上的协同刺激分子的配体接触而扩增。确切地说，T细胞群体可诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段，或固定于表面上的抗CD2抗体接触，或通过同与钙离子载体结合的蛋白激酶C活化剂(例如苔藓虫素)接触而刺激。为了协同刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。举例来说，T细胞群体可与抗CD3抗体及抗CD28抗体在适于刺激T细胞增殖的条件下接触。为了刺激CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞的增殖，抗CD3抗体及抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包含9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,

France)，可如所属领域中通常已知的其它方法使用(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。

基因修饰

在一些实施例中，本发明的caTCR加CSR免疫细胞(诸如caTCR加CSR T细胞)是通过用编码如本文所描述的caTCR及如本文中所描述的CSR的一或多种病毒载体转导免疫细胞(诸如通过本文所描述的方法制备的T细胞)而产生。病毒载体传递系统包含DNA及RNA病毒，其在传递至免疫细胞之后具有游离或整合基因组。为了评述基因疗法程序，参见Anderson,Science 256:808-813(1992)；Nabel及Feigner,TIBTECH 11:211-217(1993)；Mitani及Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993)；Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller,Nature357:455-460(1992)；Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)；Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995)；Kremer及Perricaudet,British Medical Bulletin 51(l):31-44(1995)；及Yu等人,Gene Therapy 1:13-26(1994)。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞包括整合至caTCR加CSR免疫细胞基因组中的一或多个载体。在一些实施例中，所述一或多个病毒载体为慢病毒载体。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞为包括整合至其基因组中的慢病毒载体的caTCR加CSR T细胞。

在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞为经修饰以阻断或减少其内源性TCR链中的一者或两者的表达的T细胞。举例来说，在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα及/或β链的表达的αβT细胞，或者caTCR加CSR免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRγ及/或δ链的表达的γδT细胞。用于破坏基因表达的细胞修饰包含所属领域中已知的任何此类技术，包含例如RNA干扰(例如，siRNA、shRNA、miRNA)、基因编辑(例如，基于CRISPR或TALEN的基因剔除)及其类似者。

在一些实施例中，使用CRISPR/Cas系统产生T细胞的内源性TCR链中的一者或两者的表达减少的caTCR加CSR T细胞。为了评述基因编辑的CRISPR/Cas系统，参见例如Jian W及Marraffini LA,Annu.Rev.Microbiol.69,2015；Hsu PD等人,Cell,157(6):1262-1278,2014；及O'Connell MR等人,Nature第516卷:第263-266页,2014。在一些实施例中，使用基于TALEN的基因组编辑产生T细胞的内源性TCR链中的一者或两者的表达减少的caTCR加CSRT细胞。

富集

在一些实施例中，提供一种富集异质性细胞群体中根据本文所描述的caTCR加CSR免疫细胞中的任一者的caTCR加CSR免疫细胞的方法。

可通过正选择技术富集特异性结合于靶抗原及靶配体的caTCR加CSR免疫细胞(诸如caTCR加CSR T细胞)的特异性亚群。举例来说，在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞(诸如caTCR加CSR T细胞)通过与靶抗原结合的珠粒及/或靶配体结合的珠粒一起培育足以正选择所需caTCR加CSR免疫细胞的时段来进行富集。在一些实施例中，所述时段为约30分钟。在一些实施例中，所述时段在30分钟至36小时或更长(包含这些值之间的所有范围)的范围内。在一些实施例中，所述时段为至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施例中，所述时段为10至24小时。在一些实施例中，培育时段为24小时。关于异质性细胞群体中以低含量存在的caTCR加CSR免疫细胞的分离，使用较长培育时间(诸如24小时)可提高细胞产量。在任何相较于其它细胞类型存在较少caTCR加CSR免疫细胞的情形中可使用较长培育时间分离caTCR加CSR免疫细胞。所属领域的技术人员将认识到本发明的上下文中也可使用多个选择回合。

为了通过正选择分离所需caTCR加CSR免疫细胞群体，细胞浓度及表面(例如，粒子，诸如珠粒)可变化。在一些实施例中，可能需要显著减小珠粒及细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)以确保细胞及珠粒的最大接触。举例来说，在一些实施例中，使用约20亿个细胞/毫升的浓度。在一些实施例中，使用约10亿个细胞/毫升的浓度。在一些实施例中，使用大于约100,000,000个细胞/毫升。在一些实施例中，使用约10,000,000、15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000或50,000,000个细胞/毫升中的任一者的细胞浓度。在一些实施例中，使用约75,000,000、80,000,000、85,000,000、90,000,000、95,000,000或100,000,000个细胞/毫升中的任一者的细胞浓度。在一些实施例中，使用约125,000,000或约150,000,000个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产量、细胞活化及细胞扩增。此外，使用高细胞浓度使得更有效捕捉可能弱表达caTCR及/或CSR的caTCR加CSR免疫细胞。

在本文所描述的任何此类实施例中的一些中，富集导致caTCR加CSR免疫细胞的最小程度耗竭或基本上无耗竭。举例来说，在一些实施例中，富集导致少于约50％(诸如少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一者)的caTCR加CSR免疫细胞发生耗竭。免疫细胞耗竭可通过所属领域中已知的任何方式测定，包含本文所描述的任何方式。

在本文所描述的任何此类实施例中的一些中，富集导致caTCR加CSR免疫细胞的最小程度最后分化或基本上无最后分化。举例来说，在一些实施例中，富集导致少于约50％(诸如少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一者)的caTCR加CSR免疫细胞发生最后分化。免疫细胞分化可通过所属领域中已知的任何方式测定，包含本文所描述的任何方式。

在本文所描述的任何此类实施例中的一些中，富集导致caTCR加CSR免疫细胞上的caTCR及/或CSR的最小程度或基本上无内化。举例来说，在一些实施例中，富集导致caTCR加CSR免疫细胞上小于约50％(诸如小于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一者)的caTCR及/或CSR发生内化。caTCR加CSR免疫细胞上的caTCR及/或CSR的内化可通过所属领域中已知的任何方式测定，包含本文所描述的任何方式。

在本文所描述的任何此类实施例中的一些中，富集导致caTCR加CSR免疫细胞的增殖增加。举例来说，在一些实施例中，富集导致caTCR加CSR免疫细胞的数目在富集后的至少约10％(诸如约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％或更大中的至少一者)的增加。

因此，在一些实施例中，提供一种富集异质性细胞群体中表达特异性结合于靶抗原的caTCR及特异性结合于靶配体的CSR的caTCR加CSR免疫细胞的方法，其包括：a)使异质性细胞群体与包括靶抗原或其中所含的一或多个抗原决定基的第一分子及/或包括靶配体或其中所含的一或多个抗原决定基的第二分子接触，形成包括caTCR加CSR免疫细胞结合于第一分子的复合体及/或包括caTCR加CSR免疫细胞结合于第二分子的复合体；及b)自异质性细胞群体分离复合体，从而产生caTCR加CSR免疫细胞富集的细胞群体。在一些实施例中，第一及/或第二分子经个别地固定至固体支撑体。在一些实施例中，固体支撑物为微粒(诸如珠粒)。在一些实施例中，固体支撑物为表面(诸如孔的底部)。在一些实施例中，第一及/或第二分子个别地经标签标记。在一些实施例中，标签为荧光分子、亲和力标签或磁性标签。在一些实施例中，所述方法进一步包括自第一及/或第二分子洗脱caTCR加CSR免疫细胞及回收洗脱液。

库筛选

在一些实施例中，为分离对靶抗原具有特异性的候选caTCR构筑体，caTCR库(例如表达编码多个caTCR的核酸库的细胞)可暴露于包括靶抗原或其中所含的一或多个抗原决定基的捕获分子，接着分离特异性结合捕获分子的库的亲和力成员。在一些实施例中，将捕获分子固定于固体支撑物上。在一些实施例中，支撑物可为珠粒表面、微量滴定板、免疫管或所属领域中已知适用于此类目的的任何材料。在一些实施例中，在溶液中发生与经标记捕获分子(例如经生物素标记的捕获分子)的相互作用。在一些实施例中，所述程序涉及一或多个用于移除非特异性且非反应性库成员的洗涤步骤(淘选)。在一些实施例中，为了纯化溶液中的复合体，通过固定或通过离心收集复合体。在一些实施例中，在可溶性经生物素标记的捕获分子上捕获亲和力成员，随后将亲和力复合体(亲和力成员及捕获分子)固定于抗生蛋白链菌素珠粒上。在一些实施例中，固体支撑物为珠粒。在一些实施例中，珠粒包含例如磁性珠粒(例如来自Bangs Laboratories,Polysciences inc.,Dynal Biotech,Miltenyi Biotech or Quantum Magnetic)、非磁性珠粒(例如Pierce and Upstatetechnology)、单分散珠粒(例如Dynal Biotech and Microparticle Gmbh)及多分散珠粒(例如Chemagen)。磁性珠粒的使用在文献中已有详尽描述(Uhlen,M等人(1994)Advancesin Biomagnetic Separation,BioTechniques press,Westborough,MA)。在一些实施例中，通过正选择纯化亲和力成员。在一些实施例中，通过负选择纯化亲和力成员以移除不合需要的库成员。在一些实施例中，通过正及负选择步骤纯化亲和力成员。

在一些实施例中，为分离对靶配体具有特异性的候选CSR构筑体，CSR库(例如表达编码多个CSR的核酸库的细胞)可暴露于包括靶配体或其中所含的一或多个抗原决定基的捕获分子，接着分离特异性结合捕获分子的库的亲和力成员。在一些实施例中，将捕获分子固定于固体支撑物上。在一些实施例中，支撑物可为珠粒表面、微量滴定板、免疫管或所属领域中已知适用于此类目的的任何材料。在一些实施例中，在溶液中发生与经标记捕获分子(例如经生物素标记的捕获分子)的相互作用。在一些实施例中，所述程序涉及一或多个用于移除非特异性且非反应性库成员的洗涤步骤(淘选)。在一些实施例中，为了纯化溶液中的复合体，通过固定或通过离心收集复合体。在一些实施例中，在可溶性经生物素标记的捕获分子上捕获亲和力成员，随后将亲和力复合体(亲和力成员及捕获分子)固定于抗生蛋白链菌素珠粒上。在一些实施例中，固体支撑物为珠粒。在一些实施例中，珠粒包含例如磁性珠粒(例如来自Bangs Laboratories,Polysciences inc.,Dynal Biotech,MiltenyiBiotech or Quantum Magnetic)、非磁性珠粒(例如Pierce and Upstate technology)、单分散珠粒(例如Dynal Biotech and Microparticle Gmbh)及多分散珠粒(例如Chemagen)。在一些实施例中，通过正选择纯化亲和力成员。在一些实施例中，通过负选择纯化亲和力成员以移除不合需要的库成员。在一些实施例中，通过正及负选择步骤纯化亲和力成员。

大体来说，用于制备库构筑体的技术将基于已知的基因工程技术。就此来说，将编码库中待表达的caTCR或CSR的核酸序列并入至适合于待使用类型的表达系统的表达载体中。用于在诸如CD3+细胞的细胞中呈现的适当表达载体在所属领域中为熟知的且有描述。举例来说，在一些实施例中，表达载体为病毒载体，诸如慢病毒载体。

在一些实施例中，提供一种核酸库，其包括编码多个根据本文所描述的实施例中的任一者的caTCR的序列。在一些实施例中，核酸库包括编码多个caTCR的病毒载体。在一些实施例中，病毒载体为慢病毒载体。

在一些实施例中，提供一种核酸库，其包括编码根据本文所描述的实施例中的任一者的多个CSR的序列。在一些实施例中，核酸库包括编码多个CSR的病毒载体。在一些实施例中，病毒载体为慢病毒载体。

在一些实施例中，提供一种针对编码对靶抗原具有特异性的caTCR的序列而筛选根据本文所描述的实施例中的任一者的核酸库的方法，其包括：a)引入核酸库至多个细胞中，使得caTCR表达于多个细胞上的表面上；b)用包括靶抗原或其中所含的一或多个抗原决定基的捕获分子培育多个细胞；c)收集结合于捕获分子的细胞；及d)自步骤c)中所收集的细胞分离编码caTCR的序列，由此鉴别对靶抗原具有特异性的caTCR。在一些实施例中，所述方法进一步包括一或多个洗涤步骤。在一些实施例中，一或多个洗涤步骤是在步骤b)与c)之间进行。在一些实施例中，多个细胞为多个CD3+细胞。在一些实施例中，将捕获分子固定于固体支撑物上。在一些实施例中，固体支撑物为珠粒。在一些实施例中，收集结合于捕获分子的细胞包括从结合于固体支撑物的捕获配体洗脱细胞及收集洗脱液。在一些实施例中，捕获分子经标签标记。在一些实施例中，标签为荧光分子、亲和力标签或磁性标签。在一些实施例中，收集结合于捕获分子的细胞包括分离包括所述细胞及经标记配体的复合体。在一些实施例中，从复合体解离所述细胞。

在一些实施例中，提供一种针对编码对靶配体具有特异性的CSR的序列而筛选根据本文所描述的实施例中的任一者的核酸库的方法，其包括：a)引入核酸库至多个细胞中，使得CSR表达于多个细胞的表面上；b)用包括靶配体或其中所含的一或多个抗原决定基的捕获分子培育多个细胞；c)收集结合于捕获分子的细胞；及d)从步骤c)中所收集的细胞分离编码CSR的序列，由此鉴别对靶配体具有特异性的CSR。在一些实施例中，所述方法进一步包括一或多个洗涤步骤。在一些实施例中，一或多个洗涤步骤是在步骤b)与c)之间进行。在一些实施例中，多个细胞为多个CD3+细胞。在一些实施例中，将捕获分子固定于固体支撑物上。在一些实施例中，固体支撑物为珠粒。在一些实施例中，收集结合于捕获分子的细胞包括从结合于固体支撑物的捕获配体洗脱细胞及收集洗脱液。在一些实施例中，捕获分子经标签标记。在一些实施例中，标签为荧光分子、亲和力标签或磁性标签。在一些实施例中，收集结合于捕获分子的细胞包括分离包括所述细胞及经标记配体的复合体。在一些实施例中，从复合体解离所述细胞。

MHC蛋白

MHC I类蛋白质为两种主要类别的主要组织相容复合体(MHC)分子中的一者(另一者为MHC II类)且发现于身体的几乎每一成核细胞上。其功能为向T细胞呈现细胞内的蛋白质片段；健康细胞将忽略，而含有外来的或突变的蛋白质的细胞将受到免疫系统攻击。由于MHC I类蛋白质呈递源自胞溶质蛋白质的肽，MHC I类呈递路径通常称作胞溶质或内源性路径。I类MHC分子结合主要由蛋白酶体降解胞溶质蛋白质产生的肽。MHC I:肽复合体接着***至细胞的质膜中。肽结合于I类MHC分子的胞外部分。因此，I类MHC的功能为向细胞毒性T细胞(CTL)呈现胞内蛋白。然而，I类MHC也可在称为交叉呈递的方法中呈递产生自外源蛋白质的肽。

MHC I类蛋白质由两个多肽链组成：α及β2-微球蛋白(β2M)。两条链经由β2M与α3域的相互作用非共价连接。仅α链为多形的且由HLA基因编码，而β2M亚单位并非多形的且由β-2微球蛋白基因编码。α3域为跨越质膜且与T细胞的CD8共受体相互作用。α3-CD8相互作用将MHC I分子保持在适当的位置，而细胞毒性T细胞表面上的T细胞受体(TCR)结合其α1-α2杂二聚体配体，且检查偶合肽的抗原性。α1及α2域折叠而构成凹槽，用于肽结合。MHC I类蛋白质结合长度为8-10个氨基酸的肽。

MHC II类分子为通常仅发现于抗原呈递细胞上的分子家族，抗原呈递细胞诸如树突状细胞、单核吞噬细胞、一些内皮细胞、胸腺上皮细胞及B细胞。由II类肽呈递的抗原源自胞外蛋白(并非如同I类中的胞溶质蛋白质)；因此，MHC II类依赖性抗原呈递路径称作胞吞或外源性路径。MHC II类分子的负载通过吞噬作用发生；胞外蛋白遭胞吞，在溶酶体中消化，且所得抗原决定基肽片段负载至MHC II类分子上，其随后迁移至细胞表面。

如同MHC I类分子一样，II类分子也为杂二聚体，但在此情况下由两个均质肽组成：α及β链。子名称α1、α2等是指HLA基因内的单独域；各域通常由所述基因内的不同外显子编码，且一些基因具有编码前导序列、跨膜序列等的其它域。因为MHC II类分子的抗原结合凹槽在两个末端均打开而I类分子上的对应凹槽在各末端关闭，所以由MHC II类分子呈递的抗原更长，长度一般介于15个与24个氨基酸残基之间。

人类白血球抗原(HLA)基因为MHC基因的人类型式。人体中的三种主要MHC I类蛋白质为HLA-A、HLA-B及HLA-C，而3种次要MHC I类蛋白质为HLA-E、HLA-F及HLA-G。人体中参与抗原呈递的三种主要MHC II类蛋白质为HLA-DP、HLDA-DQ及HLA-DR，而其它MHC II类蛋白质HLA-DM及HLA-DO则参与抗原的内部处理及负载。HLA-A位列人体中具有最快演进编码序列的基因中。截至2013年12月，存在2432种编码1740种活性蛋白质及117种无效蛋白质的已知HLA-A等位基因。HLA-A基因位于染色体6的短臂上且编码HLA-A的较大α链成分。HLA-Aα-链的变化对于HLA功能至关重要。此变化促进群体中的基因多样性。由于各HLA对于某些结构的肽具有不同亲和力，所以较多种HLA意味着较多种抗原‘呈递’于细胞表面上，提高群体子组将对任何指定外来侵入物具抗性的可能性。此降低单一病原体具有消灭整个人类群体的能力的可能性。各个体可表达至多两种类型的HLA-A，分别来自其亲本。一些个体将自亲本继承相同HLA-A，减少其个体HLA多样性；然而，大多数个体将接受HLA-A的两种不同拷贝。所有HLA组遵循此相同模式。换句话说，个体可仅表达2432种已知HLA-A等位基因中的一者或两者。

所有等位基因接受至少四种数位分类，例如HLA-A*02:12。A表示等位基因所属的HLA基因。存在许多HLA-A等位基因，使得通过血清型的分类使分类简化。下一对数字指示此分配。举例来说，HLA-A*02:02、HLA-A*02:04及HLA-A*02:324全部为A2血清型的成员(通过*02字首指示)。此组为造成HLA相容性的主要因素。此后的所有数字无法通过血清分型测定且经由基因定序指示。第二组数字指示产生何种HLA蛋白。这些以发现顺序指定且截至2013年12月，存在456种不同的已知HLA-A02蛋白(指定名称HLA-A*02:01至HLA-A*02:456)。可能的最短HLA名称包含这些细节中的两者。超出其的各扩展表示可或可不改变蛋白质的核苷酸变化。

在一些实施例中，Fab样抗原结合模块特异性结合于包括来源于疾病相关抗原(诸如肿瘤相关或病毒编码抗原)的肽及MHC I类蛋白质的复合体，其中MHC I类蛋白质为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A、HLA-B或HLA-C。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-B。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-C。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A01、HLA-A02、HLA-A03、HLA-A09、HLA-A10、HLA-A11、HLA-A19、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A28、HLA-A29、HLA-A30、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A36、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69、HLA-A74或HLA-A80。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A02。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A*02:01-555中的任一者，诸如HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:04、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、HLA-A*02:08、HLA-A*02:09、HLA-A*02:10、HLA-A*02:11、HLA-A*02:12、HLA-A*02:13、HLA-A*02:14、HLA-A*02:15、HLA-A*02:16、HLA-A*02:17、HLA-A*02:18、HLA-A*02:19、HLA-A*02:20、HLA-A*02:21、HLA-A*02:22或HLA-A*02:24。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A*02:01。所有高加索人(Caucasian)中有39-46％的人表达HLA-A*02:01且因此表示用于本发明的MHC I类蛋白质的适合选择。

在一些实施例中，Fab样抗原结合模块特异性结合于包括来源于疾病相关抗原(诸如肿瘤相关或病毒编码抗原)的肽及MHC II类蛋白的复合体，其中MHC II类蛋白为HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR。在一些实施例中，MHC II类蛋白为HLA-DP。在一些实施例中，MHC II类蛋白为HLA-DQ。在一些实施例中，MHC II类蛋白为HLA-DR。

适用于产生Fab样抗原结合模块的肽可例如基于蛋白酶体及免疫蛋白酶体的HLA(诸如HLA-A*02:01)结合基序及裂解位点的存在、使用所属领域的技术人员已知的计算机预测模型来确定。关于预测MHC结合位点，此类模型包含(但不限于)ProPred1(更详细地描述于Singh及Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.BIOINFORMATICS17(12):1236-1237,2001中)及SYFPEITHI(参见Schuler等人SYFPEITHI,Database forSearching and T-Cell Epitope Prediction.Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,第409卷(1):75-93,2007)。

一旦鉴别出适当肽，即可根据所属领域的技术人员熟知的方案完成肽合成。本发明的肽由于其相对较小尺寸而可根据常规肽合成技术直接在溶液中或固体支撑物上合成。各种自动合成器为可商购的且可根据已知方案使用。在溶液相中合成肽已变为大规模生产合成肽的公认程序且因此为制备本发明的肽的适合替代方法(参见例如Solid PhasePeptide Synthesis,John Morrow Stewart及Martin等人，Almez介导的酰胺化反应对液相肽合成的应用(Application of Almez-mediated Amidation Reactions to SolutionPhase Peptide Synthesis),Tetrahedron Letters第39卷,第1517-1520页,1998)。

医药组合物

本文也提供caTCR加CSR免疫细胞组合物(诸如在本文中也被称作调配物的医药组合物)，其包括免疫细胞(诸如T细胞)，所述免疫细胞在其表面上呈递根据本文所描述的caTCR中的任一者的caTCR及根据本文所描述的CSR中的任一者的CSR。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物为医药组合物。

所述组合物可包括：均质细胞群体，其包括相同细胞类型的caTCR加CSR免疫细胞及表达相同caTCR及CSR，或异质细胞群体，其包括含有不同类型的caTCR加CSR免疫细胞的多个caTCR加CSR免疫细胞群体，表达不同caTCR及/或表达不同CSR。所述组合物可进一步包括不为caTCR加CSR免疫细胞的细胞。

因此，在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞组合物，其包括相同细胞类型的caTCR加CSR免疫细胞(诸如caTCR加CSR T细胞)的均质细胞群体及表达相同caTCR及CSR。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物为医药组合物。

在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞组合物，其包括异质细胞群体，所述异质细胞群体包括含有不同细胞类型的caTCR加CSR免疫细胞的多个caTCR加CSR免疫细胞群体，表达不同caTCR及/或表达不同CSR。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体彼此独立地为选自由以下组成的群组的细胞类型：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，组合物中的全部caTCR加CSR免疫细胞为相同细胞类型(例如全部caTCR加CSR免疫细胞为细胞毒性T细胞)。在一些实施例中，至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体具有不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的细胞类型(例如，一个caTCR加CSR免疫细胞群体由细胞毒性T细胞组成，且另一caTCR加CSR免疫细胞群体由天然杀手T细胞组成)。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达相同caTCR。在一些实施例中，至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的caTCR。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的caTCR。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于相同靶抗原的caTCR。在一些实施例中，至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的靶抗原的caTCR(例如，一个caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于pMHC复合体且另一caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于细胞表面受体)。在一些实施例中，在至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同靶抗原的caTCR的情况下，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于与相同疾病或病症相关的靶抗原(例如，各靶抗原与诸如乳癌的癌症相关)的caTCR。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达相同CSR。在一些实施例中，至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的CSR。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的CSR在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于相同靶配体的CSR。在一些实施例中，至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的靶配体的CSR(例如，一个caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于pMHC复合体且另一caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于细胞表面受体)。在一些实施例中，在至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同靶配体的CSR的情况下，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于与相同疾病或病症相关的靶配体(例如，各靶配体与诸如乳癌的癌症相关)的CSR。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物为医药组合物。

因此，在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞组合物，其包括多个根据本文所描述的实施例中的任一者的caTCR加CSR免疫细胞群体，其中组合物中的所有caTCR加CSR免疫细胞具有相同细胞类型(例如，所有caTCR加CSR免疫细胞为细胞毒性T细胞)，且其中各caTCR加CSR免疫细胞群体表达不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的caTCR。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于相同靶抗原的caTCR。在一些实施例中，至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的靶抗原的caTCR(例如，一个caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于pMHC复合体且另一caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于细胞表面受体)。在一些实施例中，在至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同靶抗原的caTCR的情况下，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于与相同疾病或病症相关的靶抗原(例如，各靶抗原与诸如乳癌的癌症相关)的caTCR。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物为医药组合物。

在一些实施例中，提供一种caTCR加CSR免疫细胞组合物，其包括多个根据本文所描述的实施例中的任一者的caTCR加CSR免疫细胞群体，其中组合物中的所有caTCR加CSR免疫细胞具有相同细胞类型(例如，所有caTCR加CSR免疫细胞为细胞毒性T细胞)，且其中各caTCR加CSR免疫细胞群体表达不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的caTCR。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于相同靶配体的CSR。在一些实施例中，至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的靶配体的CSR(例如，一个caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于pMHC复合体且另一caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于细胞表面受体)。在一些实施例中，在至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同靶配体的CSR的情况下，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于与相同疾病或病症相关的靶配体(例如，各靶配体与诸如乳癌的癌症相关)的CSR。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物为医药组合物。

在一些实施例中，提供一种组合物，其包括多个根据本文所描述的实施例中的任一者的caTCR加CSR免疫细胞群体，其中至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体具有不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的细胞类型。在一些实施例中，所有caTCR加CSR免疫细胞群体具有不同细胞类型。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体彼此独立地为选自由以下组成的群组的细胞类型：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达相同caTCR。在一些实施例中，至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的caTCR。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的caTCR。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于相同靶抗原的caTCR。在一些实施例中，至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的靶抗原的caTCR(例如，一个caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于pMHC复合体且另一caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于细胞表面受体)。在一些实施例中，在至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同靶抗原的caTCR的情况下，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于与相同疾病或病症相关的靶抗原(例如，各靶抗原与诸如乳癌的癌症相关)的caTCR。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达相同CSR。在一些实施例中，至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的CSR。在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的CSR在一些实施例中，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于相同靶配体的CSR。在一些实施例中，至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同于其它caTCR加CSR免疫细胞群体的靶配体的CSR(例如，一个caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于pMHC复合体且另一caTCR加CSR免疫细胞群体特异性结合于细胞表面受体)。在一些实施例中，在至少一个caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于不同靶配体的CSR的情况下，各caTCR加CSR免疫细胞群体表达特异性结合于与相同疾病或病症相关的靶配体(例如，各靶配体与诸如乳癌的癌症相关)的CSR。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物为医药组合物。

在组合物制备期间的各个时刻，可能需要或者宜低温保存细胞。术语“冷冻(frozen/freezing)”及“低温保存(cryopreserved/cryopreserving)”可互换使用。冷冻包含冷冻干燥。

如一般技术人员所理解，冷冻细胞可具破坏性(参见Mazur,P.,1977,Cryobiology14:251-272)，但存在大量可供防止此类破坏用的程序。举例来说，可通过(a)使用低温保护剂、(b)控制冷冻速率及/或(c)在可使降解反应降到最低的足够低的温度下存储来避免破坏。示范性低温保护剂包含二甲亚砜(DMSO)(Lovelock及Bishop,1959,Nature 183:1394-1395；Ashwood-Smith,1961,Nature 190:1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(Rinfret,1960,Ann.N.Y.Acad.Sci.85:576)、聚乙二醇(Sloviter及Ravdin,1962,Nature 196:548)、白蛋白、聚葡萄糖、蔗糖、乙二醇、i-赤藻糖醇、D-核糖醇、D-甘露糖醇(Rowe等人,1962,Fed.Proc.21:157)、D-山梨糖醇、i-肌醇、D-乳糖、氯化胆碱(Bender等人,1960,J.Appl.Physiol.15:520)、氨基酸(Phan The Tran及Bender,1960,Exp.Cell Res.20:651)、甲醇、乙酰胺、甘油单乙酸酯(Lovelock,1954,Biochem.J.56:265)及无机盐(PhanThe Tran及Bender,1960,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.104:388；Phan The Tran及Bender,1961,Radiobiology,Proceedings of the Third Australian Conference onRadiobiology,llbery编,Butterworth,London,第59页)。在特定实施例中，可使用DMSO。添加血浆(例如，至20-25％的浓度)可强化DMSO的保护作用。在添加DMSO之后，细胞可保持在0℃下直到冷冻，因为1％的DMSO浓度在高于4℃的温度下可具有毒性。

在细胞的低温保存中，缓慢控制的冷却速率可为关键的且不同低温保护剂(Rapatz等人,1968,Cryobiology 5(1):18-25)及不同细胞类型具有不同的最佳冷却速率(关于冷却速度对干细胞的存活率及对于其移植潜能的影响，参见例如Rowe及Rinfret,1962,Blood 20:636；Rowe,1966,Cryobiology 3(1):12-18；Lewis等人,1967,Transfusion7(1):17-32；及Mazur,1970,Science 168:939-949)。水变成冰的融化阶段的热量应所述极少。冷却程序可通过使用例如可编程冷冻装置或甲醇浴液程序进行。可编程冷冻设备允许测定最佳冷却速率且促成标准可再生冷却。

在特定实施例中，经DMSO处理的细胞可于冰上预先冷却且转移至含有经冷藏的甲醇的托盘中，其又放置于机械制冷机(例如，Harris或Revco)中于-80℃下。甲醇浴液及样品的热电偶测量指示1℃至3℃/分钟的冷却速率可为优选的。在至少两个小时之后，样本可达到-80℃的温度且可直接放置于液氮(-196℃)中。

在彻底冷冻之后，细胞可迅速转移至长期低温存储容器中。在一优选实施例中，样品可低温存储于液氮(-196℃)或蒸气(-1℃)中。高效液氮冰箱的可用性有助于此类存储。

关于操控、低温保存及长期存储细胞的其它考虑因素及程序可见于以下示范性参考文献中：美国专利第4,199,022号、第3,753,357号及第4,559,298号；Gorin,1986,Clinics In Haematology 15(1):19-48；Bone-Marrow Conservation,Culture andTransplantation,Proceedings of a Panel,Moscow,1968年7月22-26日,InternationalAtomic Energy Agency,Vienna,第107-186页；Livesey及Linner,1987,Nature 327:255；Linner等人,1986,J.Histochem.Cytochem.34(9):1 123-1 135；Simione,1992,J.Parenter.Sci.Technol.46(6):226-32。

在低温保存之后，可解冻冷冻细胞以根据一般技术人员已知的方法使用。冷冻细胞优选地快速解冻且在解冻后立刻冷藏。在特定实施例中，含有冷冻细胞的小瓶可浸入温水浴中直到其颈部；平缓旋转将确保细胞悬浮液随着解冻发生混合且提高从温水到内部冰块的热传递。一旦冰完全融化，即可立刻将小瓶放置于冰上。

在特定实施例中，可在解冻期间使用防止细胞凝集的方法。示范性方法包含：在冷冻之前及/或之后添加脱氧核糖核酸酶(Spitzer等人,1980,Cancer 45:3075-3085)、低分子量聚葡萄糖及柠檬酸盐、羟乙基淀粉(Stiff等人,1983,Cryobiology 20:17-24)等。如一般技术人员所理解，如果使用对人类有毒的低温保护剂，则那么应在治疗用途之前移除。DMSO无严重毒性。

示范性载剂及细胞投与模式描述于美国专利公开案第2010/0183564号第14-15页。其它医药载剂描述于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,David B.Troy编,Lippicott Williams&Wilkins(2005)中。

在特定实施例中，细胞可从培养基收集，且洗涤并于载剂中浓缩至治疗有效量。示范性载剂包含盐水、缓冲盐水、生理盐水、水、汉克氏溶液(Hanks'solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)、Nonnosol-R(Abbott Labs)、Plasma-Lyte A(R)(BaxterLaboratories,Inc.,Morton Grove,IL)、甘油、乙醇及其组合。

在特定实施例中，载剂可补充有人血清白蛋白(HSA)或其它人类血清组分或胎牛血清。在特定实施例中，输注载剂包含含5％HAS或右旋糖的缓冲盐水。其它等张剂包含多羟基糖醇，包含三元醇或高级糖醇，诸如甘油、赤藻糖醇、***糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。

载剂可包含缓冲剂，诸如柠檬酸盐缓冲剂、丁二酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、反丁烯二酸盐缓冲剂、葡糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂及/或三甲胺盐。

稳定剂是指宽泛的一类赋形剂，其功能范围可介于增积剂至有助于防止细胞粘附于容器壁上的添加剂之间。典型的稳定剂可包含多羟基糖醇；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸及苏氨酸；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌肉肌醇、半乳糖醇、甘油及环醇，诸如肌醇；PEG；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油及硫代硫酸钠；低分子量多肽(即，<10个残基)；蛋白质，诸如HSA、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖及葡萄糖；双糖，诸如乳糖、麦芽糖及蔗糖；三糖，诸如棉子糖；及多糖，诸如聚葡萄糖。

在需要时或在有利时，组合物可包含诸如利多卡因(lidocaine)的局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。

示范性防腐剂包含苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苯甲铵、卤化苯甲烃铵、氯化六羟季铵、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇及3-戊醇。

组合物内的细胞的治疗有效量可为大于10²个细胞、大于10³个细胞、大于10⁴个细胞、大于10⁵个细胞、大于10⁶个细胞、大于10⁷个细胞、大于10⁸个细胞、大于10⁹个细胞、大于10¹⁰个细胞或大于10¹¹个细胞。

在本文所揭示的组合物及调配物中，细胞的体积一般为一公升或更小、500ml或更小、250ml或更小、或100ml或更小。因此，所投与的细胞密度通常为大于10⁴个细胞/毫升、10⁷个细胞/毫升或10⁸个细胞/毫升。

本文也提供核酸组合物(诸如医药组合物，在本文中也称作调配物)，其包括编码本文所描述的caTCR及/或CSR及/或SSE的核酸中的任一者。在一些实施例中，核酸组合物为医药组合物。在一些实施例中，核酸组合物进一步包括以下中的任一者：等张剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂及/或防腐剂；及/或含水媒剂，诸如纯化水、糖水溶液、缓冲溶液、生理盐水、聚合物水溶液或不含核糖核酸酶的水。待添加的这些添加剂及含水媒剂的量可根据核酸组合物的使用形式适当地选择。

本文所揭示的组合物及调配物可经制备用于通过例如注射、输注、灌注或灌洗投与。组合物及调配物可进一步经调配用于骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结节内、***内、腹膜内、病灶内、***内、***内、直肠内、局部、鞘内、瘤内、肌肉内、囊泡内及/或皮下注射。

用于体内投与的调配物必须为无菌的。此通过例如经由无菌过滤膜过滤容易地实现。

使用caTCR加CSR免疫细胞的治疗方法

本发明的caTCR加CSR免疫细胞可向个体(例如，诸如人类的哺乳动物)投与，以治疗与靶抗原(TA)表达相关的疾病及/或病症(在本文中也称作“靶抗原阳性”或“TA阳性”疾病或病症)，包含(例如)癌症及传染性疾病(诸如病毒感染)。因此，本申请案在一些实施例中提供一种用于治疗个体的靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的方法，其包括向个体投与有效量的组合物(诸如医药组合物)，所述组合物包括根据本文所描述的实施例中的任一者的caTCR加CSR免疫细胞。在一些实施例中，癌症是选自例如由以下组成的群组：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳癌、子***、胆管癌、结肠直肠癌、食道癌、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰脏癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、***癌、肉瘤、胃癌、子宫癌及甲状腺癌。在一些实施例中，病毒感染是由选自由例如以下组成的群组的病毒引起的：巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)、艾巴二氏病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)、B型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s Sarcoma associatedherpesvirus,KSHV)、人类***状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)、***病毒(Molluscum contagiosum virus,MCV)、人类T细胞白血病病毒1(Human T cell leukemiavirus 1,HTLV-1)、人类免疫缺乏病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)及C型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)。

举例来说，在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的靶抗原相关疾病(诸如癌症或病毒感染)的方法，其包括向所述个体投与有效量的组合物，所述组合物包括免疫细胞(诸如T细胞或自然杀手细胞)，所述免疫细胞于其表面上呈递以下各者：a)caTCR，所述caTCR包括i)第一TCRD，其包括源自TCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM，及第二TCRD，其包括源自TCR的另一跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，及ii)特异性结合于靶抗原的抗原结合模块，其中所述抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD；及b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括i)特异性结合于靶配体的配体结合域、ii)跨膜域，及iii)能够提供协同刺激信号至免疫细胞的胞内信号传导域。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在一些实施例中，TCR为αβTCR，且第一及第二TCR-TM源自TCRα及β亚单位跨膜域。在一些实施例中，TCR为γδTCR，且第一及第二TCR-TM源自TCRγ及δ亚单位跨膜域。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR连接肽或其片段，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR连接肽或其片段。在一些实施例中，第一连接肽包括第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽的全部或一部分或其变异体，及/或第二连接肽包括第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的连接肽的全部或一部分或其变异体。在一些实施例中，第一及第二连接肽通过二硫键连接。在一些实施例中，第一TCRD进一步包括第一TCR胞内域，及/或第二TCRD进一步包括第二TCR胞内域。在一些实施例中，第一TCR胞内域包括来自第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域的序列，及/或第二TCR胞内域包括来自第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的胞内域的序列。在一些实施例中，第一TCRD为第一TCR-TM所源自的TCR亚单位的片段，及/或第二TCRD为第二TCR-TM所源自的TCR亚单位的片段。在一些实施例中，caTCR进一步包括至少一个辅助胞内域，其包括T细胞协同刺激信号传导序列(诸如来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30或CD40)。在一些实施例中，caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中所述第一及第二稳定域彼此具有使所述caTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，第一及第二稳定域通过二硫键连接。在一些实施例中，第一及第二稳定域包括抗体域(诸如C_H1及C_L抗体域)或其变异体。在一些实施例中，TCRM能够募集至少一种选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组的TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，TCRM相较于包括T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。在一些实施例中，TCRM促进caTCR-CD3复合体形成。在一些实施例中，任何两个caTCR模块或域之间存在间隔模块。在一些实施例中，抗原结合模块为抗体部分。在一些实施例中，抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗原结合模块为多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施例中，靶抗原为细胞表面抗原。在一些实施例中，细胞表面抗原是选自由蛋白质、碳水化合物及脂质组成的群组。在一些实施例中，细胞表面抗原为疾病相关抗原，诸如肿瘤相关或病毒编码抗原。在一些实施例中，细胞表面抗原为CD19、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，靶抗原为表面呈递肽/MHC复合体。在一些实施例中，肽/MHC复合体包括源自疾病相关抗原(诸如肿瘤相关或病毒编码抗原)的肽及MHC蛋白。在一些实施例中，肽/MHC复合体包括肽及MHC蛋白，其中所述肽源自选自由WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA组成的群组的蛋白质。在一些实施例中，MHC蛋白为MHC I类蛋白质。在一些实施例中，MHC I类蛋白质为HLA-A。在一些实施例中，HLA-A为HLA-A02。在一些实施例中，HLA-A02为HLA-A*02:01。在一些实施例中，CSR的靶配体为细胞表面抗原。在一些实施例中，靶配体为肽/MHC复合体。在一些实施例中，CSR的靶配体与caTCR的靶抗原相同。在一些实施例中，靶配体与靶抗原不同。在一些实施例中，靶配体为疾病相关配体。在一些实施例中，靶配体为癌症相关配体。在一些实施例中，癌症相关配体为例如CD19、CD20、CD22、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D或FCRL5。在一些实施例中，癌症相关配体为肽/MHC复合体，其包括源自包含WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA的蛋白质的肽。在一些实施例中，靶配体为病毒相关配体。在一些实施例中，靶配体为免疫检查点分子。在一些实施例中，免疫检查点分子包含PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。在一些实施例中，靶配体为细胞凋亡分子。在一些实施例中，细胞凋亡分子包含FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。在一些实施例中，配体结合域为抗体部分。在一些实施例中，配体结合域抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，配体结合域为(或源自)靶配体的受体的胞外域的全部或一部分。在一些实施例中，受体包含例如FasR、TNFR1、TNFR2、PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG-3、4-1BB、OX40、CD27及TIM-3。在一些实施例中，CSR的跨膜域包括源自例如CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜域。在一些实施例中，CSR的协同刺激信号传导域包括免疫细胞协同刺激分子的胞内域的全部或一部分、基本上由其组成或由其组成，所述免疫细胞协同刺激分子包含(例如)CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，及其类似物。在一些实施例中，CSR进一步包括在配体结合域、跨膜域及协同刺激信号传导域中的任一者之间的间隔域。在一些实施例中，间隔域包括连接两个CSR域的肽连接子。在一些实施例中，免疫细胞为γδT细胞。在一些实施例中，免疫细胞为经修饰以阻断或减少TCRα及/或β链的表达的αβT细胞。在一些实施例中，免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的靶抗原相关疾病(诸如癌症或病毒感染)的方法，其包括向所述个体投与有效量的组合物，所述组合物包括免疫细胞(诸如T细胞或自然杀手细胞)，所述免疫细胞于其表面上呈递以下各者：a)特异性结合靶抗原的caTCR，所述caTCR包括i)第一TCRD，其包括源自天然存在的αβTCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM，及第二TCRD，其包括源自天然存在的αβTCR的另一跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，及ii)特异性结合于靶抗原的抗原结合模块，其中所述抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD；及b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括i)特异性结合于靶配体的配体结合域、ii)跨膜域，及iii)能够提供协同刺激信号至免疫细胞的胞内信号传导域。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的靶抗原相关疾病(诸如癌症或病毒感染)的方法，其包括向所述个体投与有效量的组合物，所述组合物包括免疫细胞(诸如T细胞或自然杀手细胞)，所述免疫细胞于其表面上呈递以下各者：a)特异性结合靶抗原的caTCR，所述caTCR包括i)第一TCRD，其包括源自天然存在的γδTCR的跨膜域中的一者的第一TCR-TM，及第二TCRD，其包括源自天然存在的γδTCR的另一跨膜域的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，及ii)特异性结合于靶抗原的抗原结合模块，其中所述抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD；及b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括i)特异性结合于靶配体的配体结合域、ii)跨膜域，及iii)能够提供协同刺激信号至免疫细胞的胞内信号传导域。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的靶抗原相关疾病(诸如癌症或病毒感染)的方法，其包括向所述个体投与有效量的组合物，所述组合物包括免疫细胞(诸如T细胞或自然杀手细胞)，所述免疫细胞于其表面上呈递以下各者：a)特异性结合靶抗原的caTCR，所述caTCR包括i)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第一TCR-TM，及第二TCRD，其包括源自SEQ ID NO:6的氨基酸序列的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，及b)特异性结合于靶抗原的抗原结合模块，其中所述抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD；及b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括i)特异性结合于靶配体的配体结合域、ii)跨膜域，及iii)能够提供协同刺激信号至免疫细胞的胞内信号传导域。在一些实施例中，第一TCR-TM中的至少一者相较于其所源自的氨基酸序列包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代。在一些实施例中，各TCR-TM相较于其所源自的氨基酸序列彼此独立地包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM及/或第二TCR-TM相较于其所源自的氨基酸序列各自彼此独立地包括不超过5个氨基酸取代。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，各TCR-TM相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者经定位使得其在caTCR中可与第二TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者相互作用。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的靶抗原相关疾病(诸如癌症或病毒感染)的方法，其包括向所述个体投与有效量的组合物，所述组合物包括免疫细胞(诸如T细胞或自然杀手细胞)，所述免疫细胞于其表面上呈递以下各者：a)特异性结合靶抗原的caTCR，所述caTCR包括i)第一TCRD，其包括源自SEQ ID NO:7的氨基酸序列的第一TCR-TM，及第二TCRD，其包括源自SEQ ID NO:8的氨基酸序列的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，及b)特异性结合于靶抗原的抗原结合模块，其中所述抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD；及b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括i)特异性结合于靶配体的配体结合域、ii)跨膜域，及iii)能够提供协同刺激信号至免疫细胞的胞内信号传导域。在一些实施例中，第一TCR-TM中的至少一者相较于其所源自的氨基酸序列包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代。在一些实施例中，各TCR-TM相较于其所源自的氨基酸序列彼此独立地包括一或多个(诸如2、3、4、5或更多个)氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM及/或第二TCR-TM相较于其所源自的氨基酸序列各自彼此独立地包括不超过5个氨基酸取代。在一些实施例中，TCR-TM中的至少一者相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，各TCR-TM相较于其所源自的氨基酸序列包括单一氨基酸取代。在一些实施例中，第一TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者经定位使得其在caTCR中可与第二TCR-TM中的经取代氨基酸中的至少一者相互作用。在一些实施例中，第一TCR-TM及第二TCR-TM是根据表2中所列的caTCR中的任一者选择。在一些实施例中，CSR域是根据表3中所列的CSR中的任一者选择。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的靶抗原相关疾病(诸如癌症或病毒感染)的方法，其包括向所述个体投与有效量的组合物，所述组合物包括免疫细胞(诸如T细胞或自然杀手细胞)，所述免疫细胞于其表面上呈递以下各者：a)特异性结合靶抗原的caTCR，所述caTCR包括：i)第一TCRD，其包括具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的第一TCR-TM，及第二TCRD，其包括具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM，及b)特异性结合于靶抗原的抗原结合模块，其中所述抗原结合模块连接于第一及/或第二TCRD；及b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括i)特异性结合于靶配体的配体结合域、ii)跨膜域，及iii)免疫细胞协同刺激分子片段(fCSM)，其包括能够提供协同刺激信号至免疫细胞的胞内信号传导域，其中所述协同刺激分子片段包括SEQ ID NO:51-56及86-89中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR跨膜域源自CD8。在一些实施例中，CSR包括跨膜蛋白片段(fTMP)，其中所述跨膜蛋白片段包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括在配体结合域之后的间隔肽。在一些实施例中，间隔肽包括SEQ ID NO:103或104的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR域是根据表3中所列的CSR中的任一者选择。在一些实施例中，靶抗原为CD19。在一些实施例中，靶配体为CD19。在一些实施例中，caTCR抗原结合模块为Fab样抗原结合部分，其包括含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域及含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域。在一些实施例中，靶抗原为CD19且靶配体为CD19。在一些实施例中，CSR配体结合域为包括SEQ IDNO:77的氨基酸序列的scFv。在一些实施例中，靶抗原为CD19且靶配体为CD20。在一些实施例中，CSR配体结合域为包括SEQ ID NO:78的氨基酸序列的scFv。在一些实施例中，靶抗原为AFP肽/MHC复合体(例如AFP158/HLA-A02复合体)且靶配体为GPC3。在一些实施例中，caTCR抗原结合模块为Fab样抗原结合部分，其包括含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的V_H域及含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的V_L域。在一些实施例中，CSR配体结合域为包括SEQ IDNO:79的氨基酸序列的scFv。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的CD19相关疾病(诸如癌症)的方法，其包括向所述个体投与有效量的组合物，所述组合物包括免疫细胞(诸如T细胞或自然杀手细胞)，所述免疫细胞于其表面上呈递以下各者：a)特异性结合CD19的caTCR，所述caTCR包括i)第一TCRD，其包括具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的第一TCR-TM，及第二TCRD，其包括具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)Fab样抗原结合模块，其包括第一Fab链，所述第一Fab链包括含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域，及第二Fab链，所述第二Fab链包括含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域，其中第一Fab链连接于第一及第二TCRD中的一者，且第二Fab链连接于另一TCRD；及b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括i)特异性结合于CD19的scFv，所述scFv包括含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域及含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域；ii)跨膜域，及iii)免疫细胞协同刺激分子片段(fCSM)，其包括能够提供协同刺激信号至免疫细胞的胞内信号传导域，其中协同刺激分子片段包括SEQ IDNO:51-56及86-89中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR跨膜域源自CD8。在一些实施例中，CSR包括跨膜蛋白片段(fTMP)，其中所述跨膜蛋白片段包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括在配体结合域之后的间隔肽。在一些实施例中，间隔肽包括SEQ ID NO:103或104的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR域是根据表3中所列的CSR中的任一者选择。在一些实施例中，CSR配体结合域为包括SEQ ID NO:77的氨基酸序列的scFv。在一些实施例中，CD19相关疾病为白血病，例如急性淋巴母细胞白血病(ALL)。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的CD19/CD20相关疾病(诸如癌症)的方法，其包括向所述个体投与有效量的组合物，所述组合物包括免疫细胞(诸如T细胞或自然杀手细胞)，所述免疫细胞于其表面上呈递以下各者：a)特异性结合CD19的caTCR，所述caTCR包括i)第一TCRD，其包括具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的第一TCR-TM，及第二TCRD，其包括具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)Fab样抗原结合模块，其包括第一Fab链，所述第一Fab链包括含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的V_H域，及第二Fab链，所述第二Fab链包括含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的V_L域，其中第一Fab链连接于第一及第二TCRD中的一者，且第二Fab链连接于另一TCRD；及b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括i)特异性结合于CD20的scFv，所述scFv包括含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的V_H域及含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的V_L域；ii)跨膜域，及iii)免疫细胞协同刺激分子片段(fCSM)，其包括能够提供协同刺激信号至免疫细胞的胞内信号传导域，其中协同刺激分子片段包括SEQ IDNO:51-56及86-89中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR跨膜域源自CD8。在一些实施例中，CSR包括跨膜蛋白片段(fTMP)，其中所述跨膜蛋白片段包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括在配体结合域之后的间隔肽。在一些实施例中，间隔肽包括SEQ ID NO:103或104的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR域是根据表3中所列的CSR中的任一者选择。在一些实施例中，CSR配体结合域为包括SEQ ID NO:81的氨基酸序列的scFv。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的AFP/GPC3相关疾病(诸如癌症，例如肝癌)的方法，其包括向所述个体投与有效量的组合物，所述组合物包括免疫细胞(诸如T细胞或自然杀手细胞)，所述免疫细胞于其表面上呈递以下各者：a)特异性结合AFP肽/MHC复合体(例如AFP158/HLA-A02复合体)的caTCR，所述caTCR包括i)第一TCRD，其包括具有SEQID NO:10的氨基酸序列的第一TCR-TM，及第二TCRD，其包括具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的第二TCR-TM，其中第一及第二TCRD形成能够募集至少一种TCR相关信号传导分子的TCRM；及b)Fab样抗原结合模块，其包括第一Fab链，所述第一Fab链包括含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的V_H域，及第二Fab链，所述第二Fab链包括含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的V_L域，其中第一Fab链连接于第一及第二TCRD中的一者，且第二Fab链连接于另一TCRD；及b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括i)特异性结合GPC3的scFv，所述scFv包括含有SEQ IDNO:64的氨基酸序列的V_H域及含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的V_L域；ii)跨膜域，及iii)免疫细胞协同刺激分子片段(fCSM)，其包括能够提供协同刺激信号至免疫细胞的胞内信号传导域，其中协同刺激分子片段包括SEQ ID NO:51-56及86-89中的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR跨膜域源自CD8。在一些实施例中，CSR包括跨膜蛋白片段(fTMP)，其中所述跨膜蛋白片段包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR包括在配体结合域之后的间隔肽。在一些实施例中，间隔肽包括SEQ ID NO:103或104的氨基酸序列。在一些实施例中，CSR域是根据表3中所列的CSR中的任一者选择。在一些实施例中，CSR配体结合域为包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列的scFv。

也涵盖治疗有需要的个体的靶抗原相关疾病的方法，其包括向所述个体投与包括表达不同caTCR及/或不同CSR的多个免疫细胞的组合物。因此，在一些实施例中，根据如本文所描述的用于治疗个体的靶抗原相关疾病的方法中的任一者，所述组合物为如本文所描述的异质caTCR加CSR免疫细胞组合物。

在一些实施例中，个体为哺乳动物(例如，人类、非人灵长类、大鼠、小鼠、母牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在一些实施例中，个体为人类。在一些实施例中，个体为临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在一些实施例中，个体年龄小于约60岁(包含例如年龄小于约50、40、30、25、20、15或10岁中的任一者)。在一些实施例中，个体年龄大于约60岁(包含例如年龄大于约70、80、90或100岁中的任一者)。在一些实施例中，个体经诊断患有或在环境或遗传学上易患本文所描述的疾病或病症中的一或多者(诸如癌症或病毒感染)。在一些实施例中，个体具有与一或多种本文所描述的疾病或病症相关的一或多种风险因素。

在一些实施例中，本发明的caTCR加CSR免疫细胞组合物与第二、第三或第四试剂(包含例如抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂)组合投与以治疗涉及靶抗原表达的疾病或病症。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物与细胞因子(诸如IL-2)组合投与。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物与增加MHC蛋白的表达及/或增强MHC蛋白对肽的表面呈递的试剂组合投与。在一些实施例中，试剂包含例如IFN受体促效剂、Hsp90抑制剂、p53表达增强剂及化学治疗剂。在一些实施例中，试剂为IFN受体促效剂，包含例如IFNγ、IFNβ及IFNα。在一些实施例中，试剂为Hsp90抑制剂，包含例如坦螺旋霉素(tanespimycin)(17-AAG)、阿螺旋霉素(alvespimycin)(17-DMAG)、瑞他霉素(retaspimycin)(IPI-504)、IPI-493、CNF2024/BIIB021、MPC-3100、Debio 0932(CUDC-305)、PU-H71、Ganetespib(STA-9090)、NVP-AUY922(VER-52269)、HSP990、KW-2478、AT13387、SNX-5422、DS-2248及XL888。在一些实施例中，试剂为p53表达增强剂，包含例如5-氟尿嘧啶及Nutlin-3。在一些实施例中，试剂为化学治疗剂，包含例如拓朴替康(topotecan)、依托泊苷(etoposide)、顺铂(cisplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及长春碱(vinblastine)。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的靶抗原阳性疾病的方法，其包括向个体与细胞因子(诸如IL-2)组合投与根据本文所描述的实施例中的任一者的caTCR加CSR免疫细胞组合物。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物与细胞因子同时投与。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物及细胞因子依序投与。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的靶抗原阳性疾病的方法，其中表达靶抗原的细胞通常并不呈递或以相对低水准呈递包括靶抗原及MHC I类蛋白质的复合体于其表面上，所述方法包括向个体与一试剂组合投与根据本文所描述的实施例中的任一者的caTCR加CSR免疫细胞组合物，所述试剂增加MHC I类蛋白质的表达及/或增强MHC I类蛋白质对靶抗原的表面呈递。在一些实施例中，试剂包含例如IFN受体促效剂、Hsp90抑制剂、p53表达增强剂及化学治疗剂。在一些实施例中，试剂为IFN受体促效剂，包含例如IFNγ、IFNβ及IFNα。在一些实施例中，试剂为Hsp90抑制剂，包含例如坦螺旋霉素(tanespimycin)(17-AAG)、阿螺旋霉素(alvespimycin)(17-DMAG)、瑞他霉素(retaspimycin)(IPI-504)、IPI-493、CNF2024/BIIB021、MPC-3100、Debio 0932(CUDC-305)、PU-H71、Ganetespib(STA-9090)、NVP-AUY922(VER-52269)、HSP990、KW-2478、AT13387、SNX-5422、DS-2248及XL888。在一些实施例中，试剂为p53表达增强剂，包含例如5-氟尿嘧啶及Nutlin-3。在一些实施例中，试剂为化学治疗剂，包含例如拓朴替康、依托泊苷、顺铂、太平洋紫杉醇及长春碱。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物与试剂同时投与。在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞组合物及试剂依序投与。

在一些实施例中，提供一种治疗有需要的个体的靶抗原相关疾病(诸如癌症或病毒感染)的方法，其包括向个体投与有效量的组合物，所述组合物包括编码根据本文所描述的实施例中的任一者的caTCR及CSR的核酸。基因传递方法为所属领域中已知的。参见例如美国专利第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号，其以全文引用的方式并入本文中。

癌症治疗可例如通过肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸收缩、进展时间、存活持续时间、无进展存活期、总反应率、反应持续时间、生活品质、蛋白质表达及/或活性来评估。可使用确定疗法功效的方法，包含例如经由放射成像测量反应。

在一些实施例中，治疗功效以肿瘤生长抑制百分比(TGI％)形式测量，其使用方程式100-(T/C×100)计算，其中T为经***的平均相对肿瘤体积，且C为未***的平均相对肿瘤体积。在一些实施例中，％TGI为约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％或超过95％。

病毒感染治疗可例如通过病毒负荷、存活持续时间、生活品质、蛋白质表达及/或活性来评估。

疾病

在一些实施例中，caTCR加CSR免疫细胞可适用于治疗与靶抗原相关的癌症。可使用本文所描述的方法中的任一者治疗的癌症包含非血管化，或基本上尚未血管化的肿瘤，以及血管化肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤((诸如血液肿瘤，例如白血病及淋巴瘤)或可包括实体肿瘤。待用本发明的caTCR加CSR免疫细胞处理的癌症的类型包含(但不限于)癌瘤、母细胞瘤及肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性病、良性与恶性肿瘤及例如肉瘤、癌瘤与黑色素瘤的恶性病。成人肿瘤/癌症及儿科肿瘤/癌症也包含在内。

血液癌为血液或骨髓的癌症。血液(或血性)癌的实例包含白血病，包含急性白血病(诸如急性淋巴球性白血病、急性骨髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病及骨髓母细胞性、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性及红白血病)、慢性白血病(诸如慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病及慢性淋巴球性白血病)、真性红血球增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(顽固性及高级形式)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、重链病、骨髓发育不良综合症、毛细胞白血病及骨髓发育不良。

实体肿瘤为通常不含有囊肿或液体区域的异常组织块体。实体肿瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤关于形成其的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌瘤及淋巴瘤)。诸如肉瘤及癌瘤的实体肿瘤的实例包含肾上腺皮质癌、胆管癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤及其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胃癌、淋巴恶性肿瘤、胰脏癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、***癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺癌(例如，甲状腺髓质癌及***状甲状腺癌)、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、髓质癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒膜癌、威耳姆士瘤、子***(例如，子***瘤及侵袭前子宫颈发育不良)、结肠直肠癌、***、肛管或肛肠癌、***癌、外阴癌(例如，鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌及纤维肉瘤)、***癌、口咽癌、食道癌、头癌(例如，鳞状细胞癌)、颈癌(例如，鳞状细胞癌)、睪丸癌(例如，***癌、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎上皮癌、绒膜癌、肉瘤、莱迪希氏细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤及脂肪瘤)、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、子宫癌(例如，子宫内膜癌)、尿道上皮癌(例如，鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌、输尿管癌及膀胱癌)、以及CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤及混合神经胶质瘤)、神经胶母细胞瘤(也称为多形性神经胶母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、胚细胞瘤、神经管胚细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤及脑转移瘤)。

癌症治疗可例如通过肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸收缩、进展时间、存活持续时间、无进展存活期、总反应率、反应持续时间、生活品质、蛋白质表达及/或活性来评估。可使用确定疗法功效的方法，包含例如经由放射成像测量反应。

在其它实施例中，caTCR加CSR免疫细胞可适用于通过靶向病原体相关(诸如病毒编码)抗原治疗传染性疾病。待预防或治疗的感染例如可能是由病毒、细菌、原虫或寄生虫引起的。靶抗原可为病原性蛋白质、多肽或肽，其造成由病原体引起的疾病，或能够在受到病原体感染的宿主中诱导免疫反应。可由caTCR加CSR免疫细胞靶向的病原性抗原包含(但不限于)源自以下的抗原：鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、边虫属(Anaplasmagenus)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、巴西钩虫(Ancylostomabraziliense)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、溶血隐秘杆菌(Arcanobacteriumhaemolyticum)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、曲菌属(Aspergillus genus)、星状病毒科(Astroviridae)、巴贝西虫属(Babesia genus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、干瑟勒巴通氏菌(Bartonella henselae)、BK病毒、人芽囊原虫(Blastocystis hominis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、螺旋体属(Borrelia genus)、螺旋体(Borrelia spp)、布鲁氏菌属(Brucella genus)、马来血丝虫(Brugia malayi)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae family)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)及其它伯克霍尔德菌物种、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、杯状病毒科(Caliciviridae family)、曲杆菌属(Campylobacter genus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、念珠菌属(Candida spp)、沙眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)、肺炎性披衣菌(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉热披衣菌(Chlamydophila psittaci)、CJD朊病毒、华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、梭菌属(Clostridium spp)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、粗球菌属(Coccidioides spp)、冠状病毒(coronaviruses)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、贝氏考克斯菌(Coxiella burnetii)、克里米亚-刚果出血热病毒、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、隐胞子虫属(Cryptosporidiumgenus)、巨细胞病毒(CMV)、登革病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3及DEN-4)、脆双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、埃博拉病毒(EBOV)、胞虫属、查菲艾利希体(Ehrlichiachaffeensis)、尤温艾利希氏体(Ehrlichia ewingii)、艾利希体属(Ehrlichia genus)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、肠球菌属(Enterococcus genus)、肠病毒(Enterovirus genus)、肠病毒(Enteroviruses)(主要为科沙奇A病毒及肠病毒71(EV71))、表皮癣菌属(Epidermophyton spp)、艾巴二氏病毒(Epstein-Barr Virus；EBV)、大肠杆菌O157：H7、大肠杆菌O111及大肠杆菌O104：H4、肝片吸虫(Fasciola hepatica)及巨大肝蛭(Fasciola gigantica)、FFI朊病毒、丝虫总科(Filarioidea superfamily)、黄病毒属(Flaviviruses)、土伦病法兰西斯氏菌(Francisella tularensis)、梭杆菌属(Fusobacterium genus)、白地丝霉菌、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia intestinalis)、颔口虫属(Gnathostoma spp)、GSS朊病毒、瓜纳里托病毒(Guanarito virus)、杜氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、亨尼帕病毒(亨德拉病毒尼帕病毒)、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1及2(HSV-1及HSV-2)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、HIV(人类免疫缺乏病毒)、威尼克外瓶霉(Hortaea werneckii)、人类博卡病毒(HBoV)、人类疱疹病毒6(HHV-6)及人类疱疹病毒7(HHV-7)、人类间质肺炎病毒(hMPV)、人类***状瘤病毒(HPV)、人类副流行性感冒病毒(HPIV)、人类T细胞白血病病毒1(HTLV-1)、日本脑炎病毒、JC病毒、胡宁病毒(Juninvirus)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's Sarcoma associated herpesvirus；KSHV)、金格杆菌(Kingella kingae)、肉芽肿克雷伯氏菌(Klebsiella granulomatis)、库鲁氏朊病毒(Kuru prion)、拉沙病毒(Lassa virus)、嗜肺性退伍军人杆菌(Legionellapneumophila)、利什曼原虫属(Leishmania genus)、钩端螺旋体属(Leptospira genus)、单核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、淋巴球性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocyticchoriomeningitis virus；LCMV)、马丘波病毒(Machupo virus)、马拉色氏霉菌属(Malassezia spp)、马尔堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒、横川后殖吸虫(Metagonimusyokagawai)、微孢子虫门(Microsporidia phylum)、***病毒(MCV)、腮腺炎病毒、麻风分支杆菌及弥漫型麻风分枝杆菌、结核分支杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎霉浆菌、变形纤毛虫(Naegleria fowleri)、美洲钩虫(Necator americanus)、淋病双球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)、星形土壤丝菌(Nocardiaasteroides)、诺卡菌属(Nocardia spp)、人蟠尾丝虫(Onchocerca volvulus)、***立克次体(Orientia tsutsugamushi)、正粘液病毒科(流感)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、并殖吸虫属(Paragonimus spp)、卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)、细小病毒B19(Parvovirus B19)、巴斯德菌属(Pasteurellagenus)、疟原虫属(Plasmodium genus)、杰氏肺囊虫(Pneumocystis jirovecii)、脊髓灰白质炎病毒(Poliovirus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、呼吸道融合病毒(RSV)、鼻病毒(Rhinovirus/rhinoviruses)、痘立克次体(Rickettsia akari)、立克次体属(Rickettsiagenus)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、立克次氏立克次体(Rickettsiarickettsii)、伤寒立克次体(Rickettsia typhi)、东非瑞夫特河谷羊热病病毒、轮状病毒(Rotavirus)、德国麻疹病毒(Rubella virus)、萨比亚病毒(Sabia virus)、沙门氏菌属(Salmonella genus)、疥螨(Sarcoptes scabiei)、SARS冠状病毒、住血吸虫属(Schistosoma genus)、志贺杆菌属(Shigella genus)、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus)、汉坦病毒(Hantavirus)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、葡萄球菌属(Staphylococcus genus)、葡萄球菌属(Staphylococcus genus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、肠类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、绦虫属(Taeniagenus)、有钩条虫(Taenia solium)、蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus；TBEV)、犬蛔虫(Toxocara canis)或猫蛔虫(Toxocara cati)、弓虫(Toxoplasma gondii)、***(Treponema pallidum)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、***毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、发癣菌属(Trichophyton spp)、鞭虫(Trichuris trichiura)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、水痘带状疱疹病毒(Varicella zoster virus；VZV)、水痘带状疱疹病毒(Varicella zoster virus；VZV)、主天花病毒或次天花病毒、vCJD朊病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、西尼罗河病毒(West Nile virus)、西部马脑炎病毒(Western equineencephalitis virus)、潘氏丝状虫(Wuchereria bancrofti)、黄热病病毒(Yellow fevervirus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)及假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)。

在一些实施例中，使用caTCR加CSR免疫细胞治疗致癌传染性疾病，诸如由致癌病毒造成的感染。致癌病毒包含(但不限于)CMV、EBV、HBV、KSHV、HPV、MCV、HTLV-1、HIV-1及HCV。caTCR的靶抗原可为病毒癌蛋白，包含(但不限于)Tax、E7、E6/E7、E6、HBx、EBNA蛋白(例如，EBNA3 A、EBNA3 C及EBNA 2)、v-周期素、LANA1、LANA2、LMP-1、k-bZIP、RTA、KSHV K8及其片段。参见Ahuja,Richa等人,Curr.Sci.,2014。

制品及试剂盒

在本发明的一些实施例中，提供一种制品，其含有适用于治疗靶抗原阳性疾病的材料，所述靶抗原阳性疾病诸如癌症(例如肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳癌、子***、胆管癌、结肠直肠癌、食道癌、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰脏癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、***癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或甲状腺癌)或病毒感染(例如由CMV、EBV、HBV、KSHV、HPV、MCV、HTLV-1、HIV-1或HCV造成的感染)。制品可包括容器及在容器上或容器随附的标签或药品说明书。适合的容器包含例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由各种材料形成，诸如玻璃或塑胶。一般来说，容器容纳对于治疗本文所描述的疾病或病症有效的组合物，且可具有无菌接取口(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为于其表面上呈递本发明的caTCR及CSR的免疫细胞。标签或药品说明书指示所述组合物用于治疗特定病状。标签或药品说明书将进一步包括关于向患者投与caTCR加CSR免疫细胞组合物的说明。也涵盖包括本文所描述的组合疗法的制品及试剂盒。

药品说明书是指市售治疗产品封装中通常所包含的含有关于适应症、使用、剂量、投与、与此类治疗产品的使用有关的禁忌及/或警告的资讯的说明。在一些实施例中，药品说明书指示，所述组合物用于治疗靶抗原阳性癌症(诸如肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳癌、子***、胆管癌、结肠直肠癌、食道癌、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰脏癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、***癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或甲状腺癌)。在其它实施例中，药品说明书指示，所述组合物用于治疗靶抗原阳性病毒感染(例如由CMV、EBV、HBV、KSHV、HPV、MCV、HTLV-1、HIV-1或HCV造成的感染)。

另外，制品可进一步包括第二容器，其包括药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可进一步包含就商业及使用者观点来说所需的其它物质，包含其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器。

也提供适用于任选地与制品组合用于各种用途，例如用于治疗本文所描述的靶抗原阳性疾病或病症的试剂盒。本发明的试剂盒包含包括caTCR加CSR免疫细胞组合物(或单位剂型及/或制品)的一或多个容器，及在一些实施例中进一步包括另一试剂(诸如本文所描述的试剂)及/或根据本文所描述的方法中的任一者使用的说明书。试剂盒可进一步包括选择适合于治疗的个体的说明。本发明试剂盒中供应的说明为通常在标签或药品说明书(例如，试剂盒中包含的纸片)上的书面说明，但机器可读说明(例如，磁性或光学存储盘上载有的说明)也为可接受的。

举例来说，在一些实施例中，试剂盒包括一种组合物，所述组合物包括于其表面上呈递caTCR及CSR的免疫细胞。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包括于其表面上呈递caTCR及CSR的免疫细胞的组合物，及b)有效量的至少一种其它试剂，其中其它试剂增加MHC蛋白的表达及/或增强MHC蛋白对肽的表面呈递(例如，IFNγ、IFNβ、IFNα或Hsp90抑制剂)。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包括于其表面上呈递caTCR及CSR的免疫细胞的组合物，及b)关于向个体投与caTCR加CSR免疫细胞组合物以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的说明。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包括于其表面上呈递caTCR及CSR的免疫细胞的组合物，b)有效量的至少一种其它试剂，其中其它试剂增加MHC蛋白的表达及/或增强MHC蛋白对肽的表面呈递(例如，IFNγ、IFNβ、IFNα或Hsp90抑制剂)，及c)关于向个体投与caTCR加CSR免疫细胞组合物及其它试剂以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的说明。caTCR加CSR免疫细胞组合物及其它试剂可存在于单独的容器中或单一容器中。举例来说，试剂盒可包括一种独特组合物或两种或多于两种组合物，其中一种组合物包括caTCR加CSR免疫细胞且另一组合物包括其它试剂。

在一些实施例中，试剂盒包括：a)包括caTCR及CSR的一或多种组合物，及b)关于组合caTCR及CSR与免疫细胞(诸如源自个体的免疫细胞，例如T细胞或自然杀手细胞)以形成包括于其表面呈递caTCR及CSR的免疫细胞的组合物及向个体投与caTCR加CSR免疫细胞组合物以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的说明。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包括caTCR及CSR的一或多种组合物，及b)免疫细胞(诸如细胞毒性细胞)。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包括caTCR及CSR的一或多种组合物，b)免疫细胞(诸如细胞毒性细胞)，及c)关于组合caTCR及CSR与免疫细胞以形成包括于其表面上呈递caTCR及CSR的免疫细胞的组合物及向个体投与caTCR加CSR免疫细胞组合物以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的说明。

在一些实施例中，试剂盒包括编码caTCR及CSR的一种核酸(或一组核酸)。在一些实施例中，试剂盒包括：a)编码caTCR及CSR的核酸(或一组核酸)，及b)表达核酸(或一组核酸)的宿主细胞(诸如免疫细胞)。在一些实施例中，试剂盒包括：a)编码caTCR及CSR的核酸(或一组核酸)，及b)关于以下的说明：i)于宿主细胞(诸如免疫细胞，例如T细胞)中表达caTCR及CSR、ii)制备包括表达caTCR及CSR的宿主细胞的组合物及iii)向个体投与包括表达caTCR及CSR的宿主细胞的组合物以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)。在一些实施例中，宿主细胞源自个体。在一些实施例中，试剂盒包括：a)编码caTCR及CSR的核酸(或一组核酸)，b)表达核酸(或一组核酸)的宿主细胞(诸如免疫细胞)，及c)关于i)于宿主细胞中表达caTCR及CSR、ii)制备包括表达caTCR及CSR的宿主细胞的组合物及iii)向个体投与包括表达caTCR及CSR的宿主细胞的组合物以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的说明。

本发明的试剂盒是在适合的包装中。适合的包装包含(但不限于)小瓶、瓶子、罐、可挠性包装(例如密封Mylar或塑胶袋)及其类似物。试剂盒可任选地提供诸如缓冲剂的额外组分及说明性资讯。本申请案因此也提供制品，其包含小瓶(诸如密封小瓶)、瓶子、罐、可挠性包装及其类似物。

与caTCR加CSR免疫细胞组合物的使用相关的说明大体上包含关于所期望治疗的剂量、给药时程及投与途径的资讯。容器可为单位剂量、散装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。举例来说，可提供如下试剂盒，所述试剂盒含有足够剂量的如本文所揭示的caTCR加CSR免疫细胞组合物以向个体提供延长时段(诸如一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月或更长时段中的任一者)的有效治疗。试剂盒也可包含多个单位剂量的caTCR及CSR，及医药组合物以及使用说明且以对于在药房(例如医院药房及配药房)中存储及使用来说足够的量包装。

所属领域的技术人员将认识到，在本发明的范围及精神内，若干实施例为可能的。现将参照下列非限制性实例来更详细地描述本发明。以下实例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。

示范性实施例

实施例1.在一个实施例中，提供一种免疫细胞，其包括：

a)嵌合抗体-T细胞受体(TCR)构筑体(caTCR)，其包括：

i)特异性结合于靶抗原的抗原结合模块；及

ii)T细胞受体模块(TCRM)，其包括含有第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有第二TCR-TM的第二TCRD，其中所述TCRM有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子；及

b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括：

i)能够与靶配体结合或相互作用的配体结合模块；

ii)跨膜模块；及

iii)能够提供协同刺激信号至所述免疫细胞的协同刺激免疫细胞信号传导模块，

其中所述配体结合模块及所述协同刺激免疫细胞信号传导模块并非源自同一分子，且其中所述CSR缺乏功能性原代免疫细胞信号传导域。

实施例2.根据实施例1所述的免疫细胞，其中所述CSR缺乏任何原代免疫细胞信号传导序列。

实施例3.根据实施例1或2所述的免疫细胞，其中所述靶抗原为细胞表面抗原。

实施例4.根据实施例3所述的免疫细胞，其中所述细胞表面抗原是选自由蛋白质、碳水化合物及脂质组成的群组。

实施例5.根据实施例4所述的免疫细胞，其中细胞表面抗原是选自由以下组成的群组：CD19、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5。

实施例6.根据实施例1或2所述的免疫细胞，其中靶抗原为包括肽及主要组织相容性复合体(MHC)蛋白的复合体。

实施例7.根据实施例6所述的免疫细胞，其中肽源自选自由以下组成的群组的蛋白质：WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA。

实施例8.根据实施例1至7中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一TCR-TM源自第一T细胞受体的跨膜域中的一者，且所述第二TCR-TM源自第一T细胞受体的另一跨膜域。

实施例9.根据实施例8所述的免疫细胞，其中TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。

实施例10.根据实施例9所述的免疫细胞，其中所述TCRM相较于包括第一T细胞受体跨膜域的TCRM允许至少一种TCR相关信号传导分子的募集增强。

实施例11.根据实施例8至10中任一项所述的免疫细胞，其中第一TCR-TM相较于其所源自的跨膜域包括至多5个氨基酸取代，及/或第二TCR-TM相较于其所源自的跨膜域包括至多5个氨基酸取代。

实施例12.根据实施例11所述的免疫细胞，其中所述第一TCR-TM包括单一氨基酸取代及/或所述第二TCR-TM包括单一氨基酸取代。

实施例13.根据实施例8至12中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一T细胞受体为γ/δT细胞受体。

实施例14.根据实施例8至12中任一项所述的免疫细胞，其中所述第一T细胞受体为α/βT细胞受体。

实施例15.根据实施例1至14中任一项所述的免疫细胞，其中抗原结合模块为选自由以下组成的群组的抗体部分：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv及单链Fv(scFv)。

实施例16.根据实施例15所述的免疫细胞，其中抗原结合模块包括V_H域及V_L域，且其中V_H域连接于TCRD中的一者的氨基端且V_L域连接于另一TCRD的氨基端。

实施例17.根据实施例16所述的免疫细胞，其中V_H域经由C_H1域连接于TCRD中的一者且V_L域经由C_L域连接于另一TCRD。

实施例18.根据实施例15所述的免疫细胞，其中caTCR进一步包括至少一个额外抗原结合模块。

实施例19.根据实施例18所述的免疫细胞，其中所述至少一个额外抗原结合模块为抗体部分。

实施例20.根据实施例18或19所述的免疫细胞，其中caTCR为多特异性的。

实施例21.根据实施例15至20中任一项所述的免疫细胞，其中所述抗原结合模块包括融合于TCRD中的一者的氨基端的scFv。

实施例22.根据实施例21所述的免疫细胞，其中caTCR包括融合于第一TCRD的氨基端的第一scFv及融合于第二TCRD的氨基端的第二scFv。

实施例23.根据实施例22所述的免疫细胞，其中第一scFv结合于不同于第二scFv的靶标。

实施例24.根据实施例1至23中任一项所述的免疫细胞，其中所述caTCR为杂二聚体，其包括含有第一TCRD的第一多肽链及含有第二TCRD的第二多肽链，且其中抗原结合模块连接于第一及第二TCRD中的一或两者的氨基端。

实施例25.根据实施例1至24中任一项所述的免疫细胞，其中所述caTCR进一步包括稳定模块，所述稳定模块包括第一稳定域及第二稳定域，其中所述第一稳定域及所述第二稳定域彼此具有使caTCR稳定的结合亲和力。

实施例26.根据实施例25所述的免疫细胞，其中所述稳定模块是选自由以下组成的群组：C_H1-C_L模块、C_H2-C_H2模块、C_H3-C_H3模块及C_H4-C_H4模块。

实施例27.根据实施例25或26所述的免疫细胞，其中第一与第二稳定域之间存在共价键。

实施例28.根据实施例27所述的免疫细胞，其中所述共价键为二硫键。

实施例29.根据实施例25至28中任一项所述的免疫细胞，其中所述稳定模块位于抗原结合模块与TCRM之间。

实施例30.根据实施例25至29中任一项所述的免疫细胞，其中所述caTCR为杂二聚体，其包括：

a)第一多肽链，其包括融合于第一TCRD的氨基端的第一稳定域，及第二多肽链，其包括融合于第二TCRD的氨基端的第二稳定域，且其中抗原结合模块融合于第一及第二稳定域中的一或两者的氨基端。

实施例31.根据实施例1至30中任一项所述的免疫细胞，其中caTCR以约0.1pM至约500nM的平衡解离常数(Kd)结合于靶抗原。

实施例32.根据实施例1至31中任一项所述的免疫细胞，其中TCR相关信号传导分子是选自由CD3δε、CD3γε及ζζ组成的群组。

实施例33.根据实施例1至32中任一项所述的免疫细胞，其中靶抗原与靶配体相同。

实施例34.根据实施例1至32中任一项所述的免疫细胞，其中靶抗原与靶配体不同。

实施例35.根据实施例34所述的免疫细胞，其中靶配体为表达于呈递靶抗原的细胞的表面上的配体。

实施例36.根据实施例1至35中任一项所述的免疫细胞，其中靶配体为疾病相关配体。

实施例37.根据实施例36所述的免疫细胞，其中靶配体为癌症相关配体。

实施例38.根据实施例37所述的免疫细胞，其中癌症相关配体是选自由以下组成的群组：CD19、CD20、CD22、CD47、IL4、GPC-3、ROR1、ROR2、BCMA、GPRC5D及FCRL5。

实施例39.根据实施例37所述的免疫细胞，其中癌症相关配体为肽/MHC复合体，其包括源自蛋白质的肽，所述蛋白质选自由以下组成的群组：WT-1、AFP、HPV16-E7、NY-ESO-1、PRAME、EBV-LMP2A及PSA。

实施例40.根据实施例36所述的免疫细胞，其中靶配体为病毒相关配体。

实施例41.根据实施例1至35中任一项所述的免疫细胞，其中靶配体为免疫调节分子。

实施例42.根据实施例41所述的免疫细胞，其中免疫调节分子为免疫抑制受体，且CSR为免疫抑制受体的拮抗剂。

实施例43.根据实施例41所述的免疫细胞，其中免疫调节分子为免疫刺激受体，且CSR为免疫刺激受体的促效剂。

实施例44.根据实施例41所述的免疫细胞，其中靶配体为免疫检查点分子。

实施例45.根据实施例44所述的免疫细胞，其中免疫检查点分子是选自由以下组成的群组：PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40及GAL9。

实施例46.根据实施例41所述的免疫细胞，其中靶配体为抑制性细胞因子。

实施例47.根据实施例1至35中任一项所述的免疫细胞，其中靶配体为细胞凋亡分子。

实施例48.根据实施例47所述的免疫细胞，其中细胞凋亡分子是选自由以下组成的群组：FasL、FasR、TNFR1及TNFR2。

实施例49.根据实施例1至48中任一项所述的免疫细胞，其中所述配体结合模块为抗体部分。

实施例50.根据实施例49所述的免疫细胞，其中CSR的抗体部分是选自由以下组成的群组：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv及单链Fv(scFv)。

实施例51.根据实施例50所述的免疫细胞，其中CSR的抗体部分为scFv。

实施例52.根据实施例1至48中任一项所述的免疫细胞，其中配体结合模块源自受体的胞外域。

实施例53.根据实施例52所述的免疫细胞，其中受体是选自由以下组成的群组：FasR、TNFR1、TNFR2、PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG-3、4-1BB、OX40、CD27、TIM-3、IL-10R、IL-6R及IL-4R。

实施例54.根据实施例1至53中任一项所述的免疫细胞，其中CSR的跨膜模块包括源自以下的跨膜域：CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。

实施例55.根据实施例1至54中任一项所述的免疫细胞，其中所述协同刺激免疫细胞信号传导模块源自TCR的协同刺激受体的胞内域。

实施例56.根据实施例55所述的免疫细胞，其中所述协同刺激受体是选自由以下组成的群组：CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27及CD40。

实施例57.根据实施例1至56中任一项所述的免疫细胞，其中CSR的表达为可诱导的。

实施例58.根据实施例57所述的免疫细胞，其中在活化免疫细胞后，CSR的表达为可诱导的。

实施例59.根据实施例1至32中任一项所述的免疫细胞，其中caTCR的抗原结合模块包括结合于CD19的抗体部分，其中CSR的配体结合模块包括结合于CD19的scFv，且其中跨膜模块及协同刺激免疫细胞信号传导模块均源自CD28。

实施例60.根据实施例59所述的免疫细胞，其中结合于CD19的抗体部分包括：V_H域，其包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列，及V_L域，其包括SEQ ID NO:59的氨基酸序列，其中结合于CD19的scFv包括：V_L域，其包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列，及V_L域，其包括SEQ IDNO:59的氨基酸序列，且其中CSR包括CD28的片段，其包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

实施例61.根据实施例60所述的免疫细胞，其中caTCR包括两个多肽链，其包括SEQID NO:72及73或SEQ ID NO:74及75的氨基酸序列，及/或其中CSR包括SEQ ID NO:80的氨基酸序列。

实施例62.根据实施例1至32中任一项所述的免疫细胞，其中caTCR的抗原结合模块包括结合于AFP的抗体部分，其中CSR的配体结合模块包括结合于GPC3的scFv，且其中跨膜模块及协同刺激免疫细胞信号传导模块均源自CD28。

实施例63.根据实施例62所述的免疫细胞，其中结合于AFP的抗体部分包括：V_H域，其包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列，及V_L域，其包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列，其中结合于GPC3的scFv包括：V_L域，其包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列，及V_L域，其包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列，且其中CSR包括CD28的片段，其包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

实施例64.根据实施例63所述的免疫细胞，其中caTCR包括两个多肽链，其包括SEQID NO:68及69或SEQ ID NO:70及71的氨基酸序列，及/或其中CSR包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列。

实施例65.根据实施例1至32中任一项所述的免疫细胞，其中caTCR的抗原结合模块包括结合于CD19的抗体部分，其中CSR的配体结合模块包括结合于CD20的scFv，且其中跨膜模块及协同刺激免疫细胞信号传导模块均源自CD28。

实施例66.根据实施例65所述的免疫细胞，其中结合于CD19的抗体部分包括：V_H域，其包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列，及V_L域，其包括SEQ ID NO:59的氨基酸序列，其中结合于CD20的scFv包括：V_H域，其包括SEQ ID NO:60的氨基酸序列，及V_L域，其包括SEQ IDNO:61的氨基酸序列，且其中CSR包括CD28的片段，其包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

实施例67.根据实施例66所述的免疫细胞，其中caTCR包括两个多肽链，其包括SEQID NO:72及73或SEQ ID NO:74及75的氨基酸序列，及/或其中CSR包括SEQ ID NO:81的氨基酸序列。

实施例68.在一个实施例中，提供一或多种核酸，其编码根据实施例1至67中任一项所述的caTCR及CSR，其中caTCR及CSR各自由经所述一或多个核酸编码的多肽链组成。

实施例69.在一个实施例中，提供一或多种核酸，其编码：

a)嵌合抗体-T细胞受体(TCR)构筑体(caTCR)，其包括：

i)特异性结合于靶抗原的抗原结合模块；及

ii)T细胞受体模块(TCRM)，其包括含有第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)及含有第二TCR-TM的第二TCRD，其中所述TCRM有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子，且其中caTCR由一或多个多肽链组成；及

b)嵌合信号传导受体(CSR)，其包括：

i)能够与靶配体结合或相互作用的配体结合模块；

ii)跨膜模块；及

iii)能够提供协同刺激信号至所述免疫细胞的协同刺激免疫细胞信号传导模块，其中所述配体结合模块及所述协同刺激免疫细胞信号传导模块并非源自同一分子，其中所述CSR缺乏功能性原代免疫细胞信号传导域，且其中CSR由一或多个多肽链组成。

实施例70.根据实施例68或69的一或多种核酸，其中caTCR及CSR经编码于相同核酸分子上。

实施例71.根据实施例68或69的一或多种核酸，其中caTCR及CSR经编码于不同核酸分子上。

实施例72.根据实施例68至71中任一项所述的一或多种核酸，其包括编码可操作地连接于诱导性启动子的CSR的核苷酸序列。

实施例73.根据实施例72的一或多种核酸，其中在活化免疫细胞后，所述诱导性启动子为可诱导的。

实施例74.根据实施例72的一或多种核酸，其中所述诱导性启动子为经活化T细胞(NFAT)衍生的启动子的核因子。

实施例75.在一个实施例中，提供一或多种载体，其包括根据实施例68至74中任一项所述的一或多种核酸。

实施例76.根据实施例75的一或多种载体，其中所述载体中的至少一者包括编码caTCR的核酸序列且至少一个其它载体包括编码CSR的核酸序列。

实施例77.根据实施例75的一或多种载体，其包括单一载体，所述单一载体包括一或多种核酸。

实施例78.在一个实施例中，提供一种组合物，其包括根据实施例68至74中任一项所述的一或多种核酸或根据实施例75至77中任一项所述的一或多种载体。

实施例79.在一个实施例中，提供一种免疫细胞，其包括根据实施例68至74中任一项所述的一或多种核酸或根据实施例75至77中任一项所述的一或多种载体。

实施例80.根据实施例79所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞进一步包括由根据实施例68至74中任一项所述的一或多种核酸或根据实施例75至77中任一项所述的一或多种载体表达的caTCR。

实施例81.根据实施例79或80所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞进一步包括由根据实施例68至74中任一项所述的一或多种核酸或根据实施例75至77中任一项所述的一或多种载体表达的CSR。

实施例82.根据实施例1至67及79至81中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞及抑制T细胞。

实施例83.根据实施例1至67及79至82中任一项所述的免疫细胞，其中

a)所述caTCR为杂二聚体，其包括含有第一TCRD的第一多肽链及含有第二TCRD的第二多肽链，且其中所述抗原结合模块包括连接于TCRD中的一或两者的氨基端的一或两个多肽链，及

b)CSR包括单一多肽链，所述免疫细胞包括：

i)编码caTCR的第一多肽链的第一核酸序列；

ii)编码caTCR的第二多肽链的第二核酸序列；及

iii)编码CSR的第三核酸序列。

实施例84.根据实施例83所述的免疫细胞，其包括：

a)第一载体，其包括处于第一启动子控制下的第一核酸序列；

b)第二载体，其包括处于第二启动子控制下的第二核酸序列；及

c)第三载体，其包括处于第三启动子控制下的第三核酸序列。

实施例85.根据实施例83所述的免疫细胞，其包括：

a)第一载体，其包括：

i)处于第一启动子控制下的第一核酸序列；及

ii)处于第二启动子控制下的第二核酸序列；及

b)第二载体，其包括处于第三启动子控制下的第三核酸序列。

实施例86.根据实施例83所述的免疫细胞，其包括载体，所述载体包括：

a)处于第一启动子控制下的第一核酸序列；

b)处于第二启动子控制下的第二核酸序列；及

c)处于第三启动子控制下的第三核酸序列。

实施例87.根据实施例84至86中任一项所述的免疫细胞，其中第一启动子及/或第二启动子为组成性活性启动子。

实施例88.根据实施例84至87中任一项所述的免疫细胞，其中第三启动子为诱导性启动子。

实施例89.根据实施例83所述的免疫细胞，其包括：

a)第一载体，其包括处于单一第一启动子控制下的第一核酸序列及第二核酸序列；及

b)第二载体，其包括处于第二启动子控制下的第三核酸序列。

实施例90.根据实施例83所述的免疫细胞，其包括载体，所述载体包括：

a)处于单一第一启动子控制下的第一核酸序列及第二核酸序列；及

b)处于第二启动子控制下的第三核酸序列。

实施例91.根据实施例89或90所述的免疫细胞，其中所述第一启动子为组成性活性启动子。

实施例92.根据实施例89至91中任一项所述的免疫细胞，其中所述第二启动子为诱导性启动子。

实施例93.根据实施例88或92所述的免疫细胞，其中在活化免疫细胞后，所述诱导性启动子为可诱导的。

实施例94.根据实施例88或92所述的免疫细胞，其中所述诱导性启动子为NFAT衍生的启动子。

实施例95.根据实施例83所述的免疫细胞，其包括载体，所述载体包括全部处于单一启动子控制下的第一核酸序列、第二核酸序列及第三核酸序列。

实施例96.根据实施例84至95中任一项所述的免疫细胞，其中所述载体整合于免疫细胞基因组中。

实施例97.在一个实施例中，提供一种医药组合物，其包括根据实施例1至67及79至96中任一项所述的免疫细胞及药学上可接受的载剂。

实施例98.在一个实施例中，提供一种杀灭呈递靶抗原的靶细胞(或治疗靶抗原相关疾病)的方法，其包括使靶细胞与根据实施例1至67及79至96中任一项所述的免疫细胞接触。

实施例99.根据实施例98所述的方法，其中接触是在体内进行。

实施例100.根据实施例98所述的方法，其中接触是在体外进行。

实施例101.在一个实施例中，提供一种治疗有需要的个体的靶抗原相关疾病的方法，其包括向个体投与有效量的根据实施例97的医药组合物。

实施例102.根据实施例101所述的方法，其中所述靶抗原相关疾病为癌症。

实施例103.根据实施例102所述的方法，其中所述癌症是选自由以下组成的群组：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳癌、子***、胆管癌、结肠直肠癌、食道癌、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰脏癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、***癌、肉瘤、胃癌、子宫癌及甲状腺癌。

实施例104.根据实施例101所述的方法，其中所述靶抗原相关疾病为病毒感染。

实施例105.根据实施例104所述的方法，其中所述病毒感染是由选自由以下组成的群组的病毒引起的：巨细胞病毒(CMV)、艾巴二氏病毒(EBV)、B型肝炎病毒(HBV)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、人类***状瘤病毒(HPV)、***病毒(MCV)、人类T细胞白血病病毒1(HTLV-1)、人类免疫缺乏病毒(HIV)及C型肝炎病毒(HCV)。

实施例106.根据实施例101至105中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞为个体的自体免疫细胞。

实施例107.在一个实施例中，提供一种将协同刺激信号提供至包括caTCR或经编码caTCR的核酸转导的免疫细胞的方法，其包括将根据实施例68至74中任一项所述的一或多种核酸或根据实施例75至77中任一项所述的一或多种载体引入至所述细胞。

实例

材料及方法

细胞样品、细胞系及抗体

从美国菌种保存中心(American Type Culture Collection)获得细胞系HepG2(ATCC HB-8065；HLA-A2+，AFP⁺)、SK-HEP-1(ATCC HTB-52；HLA-A2+，AFP^-)、Raji(ATCC CCL-86；CD19⁺)、CA46(ATCC CRL-1648；CD19⁺)、Jurkat(ATCC CRL-2899，CD19^-)、J.RT3-T3.5(ATCC TIB-153)、Jeko-1(ATCC CRL-3006；CD19⁺)、THP-1(ATCC TIB-202，CD19^-)、Daudi(ATCC CCL-213；CD19⁺)、HeLa(ATCC CCL-2)、MDA-MB-231(ATCC HTB-26)及MCF-7(ATCCHTB-22)。Jurkat为源自T细胞白血病的人类T淋巴细胞系。J.RT3-T3.5为源自Jurkat细胞的缺乏T细胞受体β链的突变株。Raji为表达CD19的伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)细胞系。通过CRISPR技术产生Raji-CD19基因剔除(Raji-CD19KO)株。设计三个不同的指导序列用于靶向Raji细胞中的CD19。从Origene购得CRISPR-Cas9载体且将各指导序列单独地克隆至pCas-Guide载体中。在电穿孔三天后，通过流动式细胞测量术评估通过各指导序列达成的基因剔除的效率且选择最佳CD19基因剔除合并物以通过限制稀释法进行克隆选择。所选择的克隆经定序确认为完全CD19基因剔除。所有细胞系是在补充有10％FBS及2mM谷氨酰胺的RPMI 1640或DMEM中于37℃/5％CO₂下培养。

购买以下各者：针对结合至FITC或APC的人类HLA-A02(克隆BB7.2)的单克隆Ab及其结合至FITC或APC的同型对照小鼠IgG 2b；针对人类或小鼠CD3、人类T细胞受体各种亚单位、3×Flag标签、HA标签的抗体；与PE或FITC结合的山羊F(ab)2抗人类IgG；及荧光结合的山羊F(ab')2抗小鼠Ig(英杰公司(Invitrogen))。优瑞科生物科技公司(EurekaTherapeutics)内部研发且生产了针对AFP158/HLA-A*02:01特异性抗体的抗个体基因型抗体。使用BD FACSCanto II收集流动式细胞测量术数据且使用FlowJo软件包分析。

所有肽均为购买的且由Elim Biopharma合成。肽的纯度＞90％。将肽溶解于DMSO中或以10mg/mL于盐水中稀释且在-80℃下冷冻。通过使肽与重组HLA-A*02:01及β-2微球蛋白(β2M)再折叠，产生生物素标记单链AFP158/HLA-A*02:01及对照肽/HLA-A*02:01复合单体。经由连接于HLA-A*02:01胞外域(ECD)的C端末端的BSP肽通过BirA酶来生物素标记单体。将荧光标记抗生蛋白链菌素与生物素标记肽/HLA-A*02:01复合单体混合，形成荧光标记肽/HLA-A*02:01四聚体。

例如通过用编码嵌合构筑体的载体转染293T细胞，产生含有人类CD19特异性或AFP158/HLA-A*02:01特异性CAR或abTCR的慢病毒。在用CD3/CD28珠粒(Invitrogen)刺激一天之后，在100U/ml介白素-2(IL-2)存在下，使用原代人类T细胞进行转导。向涂有纤维连接蛋白(Retronectin)(Takara)的6孔培养板中的T细胞涂覆经浓缩的慢病毒，持续96小时。使用分别含有PE结合的抗生蛋白链菌素或抗myc抗体的生物素标记AFP158/HLA-A*02:01四聚体(“AFP158四聚体”)，通过流动式细胞测量术评定抗AFP及抗CD19嵌合构筑体的转导效率。在第5天及其后每3至4天重复流动式细胞测量术分析。

用一个或两个编码caTCR构筑体的两个亚单位的载体转导细胞系。转导五天后，使用抗HA(抗HA标签抗体，ChIP级，Abcam)或抗Flag抗体(在兔中产生的抗Flag抗体，Sigma)，产生细胞裂解产物用于蛋白质印迹法。

通过Cytox 96非放射性LDH细胞毒性分析(Promega)分析肿瘤细胞毒性。使用EasySep人类T细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)，由PBMC富集的全血制备CD3⁺T细胞，其不利地耗竭CD14、CD16、CD19、CD20、CD36、CD56、CD66b、CD123、血型糖蛋白A表达细胞。通过CD3/CD28戴诺珠粒(Invitrogen)，根据制造商方案活化及扩增人类T细胞。在具有10％FBS加上100U/ml IL-2的RPMI1640培养基中培养及维持经活化的T细胞(ATC)，且在第7至14天使用。经活化的T细胞(免疫细胞)与靶细胞以各种效靶比(effector-to-target ratio)(例如，2.5:1或5:1)共培养16小时且分析细胞毒性。

实例1.嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)设计

涵盖各种嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)设计，且于图1中展示六个不同的实例(caTCR-1、caTCR-2、caTCR-3、caTCR-4、caTCR-5及caTCR-6)。在这些设计中，各种抗体部分(Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或scFv)融合于缺乏可变域及恒定域且包含其连接肽(在恒定域后的区)、其跨膜域或其变异体及任何胞内域的全部或部分的T细胞受体α/β链或γ/δ链的氨基端，以形成可表达于T细胞的表面上的caTCR杂二聚体。在原生TCR中，Vα/Vβ或Vδ/Vγ域形成TCR的抗原结合域。吾人的设计以各种抗体部分置换Vα-Cα/Vβ-Cβ或Vδ-Cδ/Vγ-Cγ区，且引入至少一个变异TCR跨膜域，因此赋予抗体对构筑体的结合特异性，及使得所述构筑体相较于仅具有天然存在的TCR跨膜域的TCR或相关构筑体在TCR复合体中募集辅助分子(诸如CD3δε、CD3γε及CD3ζζ)的能力增强。caTCR构筑体如下命名：caTCR-[设计#]-[变异***置][#]。设计#1对应于具有Fab抗体部分的caTCR，设计#2对应于具有Fab'抗体部分的caTCR，设计#3对应于具有(Fab')2抗体部分的caTCR，设计#4对应于具有Fv抗体部分的caTCR，设计#5对应于具有单一scFv抗体部分的caTCR，且设计#6对应于具有两个scFv抗体部分的caTCR(参见图1)。无变异***置及#0(例如，caTCR-1-0)对应于具有天然存在的TCR域的构筑体，且#≥1对应于在变异***置中具有特异性变异体的caTCR(例如，caTCR-1-TM1对应于一个跨膜域变异体，caTCR-1-EC1对应于一个胞外域变异体；参见表2)。

在caTCR-1(IgV_H-IgC_H1-TCRδ/IgV_L-IgC_L-TCRγ)设计中，抗体重链的可变域及第一恒定域(IgV_H-IgC_H1)置换TCRδ链中直到一位置的氨基端部分，所述位置毗邻TCRδ链的胞外域中在Vδ-Cδ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRδ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。对应抗体轻链的可变域及恒定域(IgV_L-IgC_L)置换TCRγ链中直到一位置的氨基端部分，所述位置毗邻TCRγ链的胞外域中的Vγ-Cγ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRγ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。

在caTCR-1的一个实施例中，一个链包含抗AFP158/HLA-A*02:01抗体的IgV_H域(SEQ ID NO:62)，所述IgV_H域融合于IgC_H1域(SEQ ID NO:37-47中的任一者)，所述IgC_H1域融合于TCRδ链的羧基端部分，所述羧基端部分包含跨膜域及TCRδ链的连接肽的全部或部分，且另一链包含抗AFP158/HLA-A*02:01抗体的IgV_L域(SEQ ID NO:63)，所述IgV_L域融合于IgC_L域(SEQ ID NO:48)，所述IgC_L域融合于TCRγ链的羧基端部分，所述羧基端部分包含跨膜域及TCRγ链的连接肽的全部或部分。在一些实施例中，两个TCR跨膜域均为天然存在的。在一些实施例中，TCR跨膜域中的至少一者为非天然存在的变异体，其包括一或多个氨基酸取代。在一些实施例中，TCRδ链的羧基端部分包含具有SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列的连接肽。在一些实施例中，TCRδ链的羧基端部分包含具有SEQ ID NO:7及9-13中的任一者的氨基酸序列的跨膜域。在一些实施例中，TCRγ链的羧基端部分包含具有SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列的连接肽。在一些实施例中，TCRγ链的羧基端部分包含具有SEQ ID NO:8及14-26中的任一者的氨基酸序列的跨膜域。

在caTCR-2(IgV_H-IgC_H1-铰链-TCRδ/IgV_L-IgC_L-连接子-TCRγ)设计中，抗体重链的可变域、第一恒定域及铰链(IgV_H-IgC_H1-铰链)置换TCRδ链中直到一位置的氨基端部分，所述位置毗邻TCRδ链的胞外域中在Vδ-Cδ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRδ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。融合于连接子(IgV_L-IgC_L-连接子)的对应抗体轻链的可变域及恒定域置换TCRγ链中直到一位置的氨基端部分，所述位置毗邻TCRγ链的胞外域中在Vγ-Cγ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRγ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。

在caTCR-3(IgV_H-IgC_H1-铰链-TCRδ/IgV_H-IgC_H1-铰链-TCRγ+IgV_L-IgC_L)设计中，抗体重链的可变域、第一恒定域及铰链(IgV_H-IgC_H1-铰链)置换TCRδ链中直到一位置的氨基端部分，所述位置毗邻TCRδ链的胞外域中在Vδ-Cδ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRδ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。抗体重链的可变域、第一恒定域及铰链(IgV_H-IgC_H1-铰链)置换TCRγ链中直到一位置的氨基端部分，所述位置毗邻TCRγ链的胞外域中在Vγ-Cγ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRγ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。对应抗体轻链的可变域及恒定域(IgV_L-IgC_L)与IgV_H-IgC_H1域结合。

在caTCR-4(IgV_H-TCRδ/IgV_L-TCRγ)设计中，抗体重链的可变域(IgV_H)置换TCRδ链中直到一位置的氨基端部分，所述位置毗邻TCRδ链的胞外域中在Vδ-Cδ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRδ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。对应抗体轻链的可变域(IgV_L)置换TCRγ链中直到一位置的氨基端部分，所述位置毗邻TCRγ链的胞外域中在Vγ-Cγ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRγ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。

在caTCR-5(IgV_H-IgV_L-TCRδ/TCRγ)设计中，融合于对应抗体轻链的可变域的抗体重链的可变域(IgV_H-IgV_L或IgV_L-IgV_H)置换TCRδ链中直到一位置的氨基端部分，所述位置毗邻TCRδ链的胞外域中在Vδ-Cδ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRδ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。TCRγ链中直到一位置的氨基端部分缺失，所述位置毗邻TCRγ链的胞外域中在Vγ-Cγ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRγ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。

在caTCR-6(IgV_H-IgV_L-TCRδ/IgV_H-IgV_L-TCRγ)设计中，融合于对应抗体轻链的可变域的抗体重链的可变域(IgV_H-IgV_L或IgV_L-IgV_H)置换TCRδ链中直到一位置的氨基端部分，所述位置毗邻TCRδ链的胞外域中在Vδ-Cδ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRδ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。融合于对应抗体轻链的可变域的抗体重链的可变域(IgV_H-IgV_L或IgV_L-IgV_H)置换TCRγ链中直到一位置的氨基端部分，所述位置毗邻TCRγ链的胞外域中在Vγ-Cγ区后的连接肽或在所述连接肽内，任选地，其中TCRγ链的跨膜域诸如通过一或多个氨基酸的取代修饰。

实例2：经抗CD19 caTCR-1及抗CD19嵌合刺激受体转导的T细胞的构建及表征

编码抗CD19结合部分(SEQ ID NO:58及59)的核酸片段是用于生成包括CD28跨膜及胞内信号传导序列(SEQ ID NO:51)的嵌合协同刺激受体(CSR；在本文中也称作“CSR1”)及caTCR-1构筑体(caTCR-1-0或caTCR-1-TM5)两者。仅用CSR，仅用caTCR-1-0，用caTCR-1-0结合CSR或caTCR-1-TM5结合CSR转导原代T细胞。通过细胞表面染色测定转导效率，且所有caTCR-1T细胞通过与模拟T细胞混合而匹配大致40％的受体阳性。

体外杀灭

将CD80/86阴性NALM6细胞(表达CD19的白血病细胞)用作靶细胞，以用于以2.5:1的效靶比进行T细胞刺激。培育16小时后，使用Cytox 96非放射性细胞毒性分析(Promega)测量特异性T细胞溶解。

用抗CD19-caTCR-1-0或抗CD19-caTCR-1-TM5表达抗CD19-CSR产生能够在体外裂解NALM6肿瘤细胞的完全功能性细胞毒性T细胞(图2)。因为仅表达caTCR-1-0的T细胞及表达caTCR-1(caTCR-1-0或caTCR-1-TM5)及CSR两者的那些T细胞均能够裂解几乎100％的NALM6靶细胞，所以在两种类型的T细胞之间未观测到经杀灭靶细胞的数目的显著差异。

细胞因子分泌

释放至体外杀灭反应的上清液中的细胞因子的浓度是通过Bioplex200(Luminex)、使用Bio-plex Pro人类细胞因子8-plex试剂盒(BioRad)测量。表达CSR结合caTCR的T细胞(CSR-阳性及caTCR-阳性T细胞)相较于表达单独ca-TCR-1-0的T细胞释放更多细胞毒性细胞因子(图3)。

胞内细胞因子表达

在分泌抑制剂布雷菲尔德菌素A(BFA)存在下，以1:2的E:T比率用靶细胞刺激T细胞4小时。T细胞被渗透且使用细胞因子特异性抗体检测响应于肿瘤刺激而表达的细胞因子。使用流动式细胞测量术测定细胞因子与阳性细胞的百分比。CSR-阳性及caTCR-阳性T细胞相较于仅表达ca-TCR-1-0的T细胞表达更多胞内细胞因子(表5)。

表5

总之，所述结果表明添加CSR增加caTCRT细胞的敏感性及反应性。CSR-caTCR双阳性T细胞中所表达及所释放的细胞因子的量增加表明caTCR-1与CSR的协同刺激提高了T细胞的细胞毒性潜力。

脱粒

T细胞裂解肿瘤细胞的主要机制是通过产生释放至靶细胞中的细胞毒性分子的分泌性颗粒。CD107a可用作脱粒活性的标记物且增加的CD107a表达与细胞毒性T细胞功能的增加相关。

将T细胞与荧光结合的抗CD107a混合且在内吞抑制剂莫能菌素存在下以1:2的E:T比率用靶细胞刺激4小时。在T细胞表面上检测到的CD107a的量是通过抗原识别诱导的细胞毒性脱粒的程度的直接度量。caTCR T细胞上的CSR接合增加T细胞脱粒，进一步证明CSR使治疗性T细胞具有更多的针对所预期肿瘤细胞的反应性(图4)。

增殖

在治疗癌症时，经基因修饰的T细胞的增殖及存留对于授受性T细胞转移疗法的成功至关重要。为分析CSR对T细胞增殖及持续性的效应，用胞内染料CFSE标记T细胞，且在T细胞用肿瘤细胞刺激而***时观测到染料的稀释。也能够通过对在指定日剩余的CFSE-阳性细胞的数目计数来测量T细胞的存留。

将相应T细胞在血清中饥饿隔夜且使用CellTrace CFSE(Thermo Fisher C34554)经CFSE标记。以2:1的E:T比率培育100,000个T细胞且当T细胞在指定日***时，使用流动式细胞测量术观测CFSE染料的连续稀释。通过FAC对T细胞的总数目计数。

CFSE稀释在CSR刺激下增大，表明这些T细胞具有较高的增殖潜力(图5)。重要的是，细胞数目也增加，意味着所述细胞不仅增殖较好，而且其存留也得以维持(表6)。

表6

所述结果展示，能够用表达靶配体及靶抗原两者的肿瘤细胞同时刺激CSR及caTCR两者，且CSR与caTCR的协同刺激增强caTCR T细胞的细胞毒性、增殖潜力及存留。这些是将使用授受性转移来增加基于caTCR的疗法的治疗潜力的所有特征。

实例3.经抗AFP caTCR-1及抗GPC3 CSR转导的T细胞的构建及表征

使用编码抗AFP结合部分(SEQ ID NO:62及63)的核酸片段生成caTCR-1构筑体(caTCR-1-0或caTCR-1-TM5)。使用编码抗GPC3结合部分(SEQ ID NO:64及65)的核酸片段生成包括CD28跨膜及胞内信号传导序列(SEQ ID NO:51)的CSR(即CSR1)。

体外杀灭

将HEPG2细胞(表达AFP及GPC3的人类肝癌细胞)及HEPG2-GPC3.KO细胞(其中靶向基因剔除GPC3基因的HEPG2细胞)用作靶细胞，以用于以2.5:1的效靶比进行T细胞刺激。培育16小时后，使用Cytox 96非放射性细胞毒性分析(Promega)测量特异性T细胞溶解。

用抗AFP-caTCR-1-0或抗AFP-caTCR-1-TM5表达抗GPC3-CSR产生能够在体外裂解HEPG2细胞的完全功能性细胞毒性T细胞(图6)。仅表达caTCR-1-0的T细胞的特异性杀灭(约15％)比表达caTCR-1(caTCR-1-0或caTCR-1-TM5)与CSR两者的T细胞(约55％至约65％之间)少得多。相比之下，当使用HEPG2-GPC3.KO靶细胞时(图6)，对于表达caTCR与CSR两者的T细胞来说，特异性杀灭减小至约10％，表明CSR与其靶配体的接合引起细胞毒性增加。

细胞因子分泌

释放至体外杀灭实验的上清液中的细胞因子的浓度是通过Bioplex200(Luminex)、使用Bio-plex Pro人类细胞因子8-plex试剂盒(BioRad)测量。对于表达caTCR靶抗原与CSR靶配体两者的HEPG2靶细胞来说，CSR-阳性及caTCR-阳性T细胞相较于仅表达ca-TCR-1-0的T细胞释放更多细胞毒性细胞因子(图7)。相比之下，对于缺乏CSR靶配体的HEPG2-GPC3.KO靶细胞来说，仅表达ca-TCR-1-0的T细胞或表达caTCR与CSR两者的T细胞之间的差异很小或无差异(图7)。

胞内细胞因子表达

在分泌抑制剂布雷菲尔德菌素A(BFA)存在下，以1:2的E:T比率用靶细胞(HEPG2)刺激T细胞4小时。T细胞被渗透且使用细胞因子特异性抗体检测响应于肿瘤刺激而表达的细胞因子。使用流动式细胞测量术测定细胞因子与阳性细胞的百分比。CSR-阳性及caTCR-阳性T细胞相较于仅表达ca-TCR-1-0的T细胞表达更多胞内细胞因子(表7)。

表7

总之，所述结果表明，添加CSR增加了具有不同caTCR靶抗原及CSR靶配体的caTCR加CSR T细胞的敏感性及反应性。这些CSR-caTCR双阳性T细胞中所表达及所释放的细胞因子的量增加进一步证明caTCR-1与CSR的协同刺激提高了T细胞的细胞毒性潜力。

脱粒

将T细胞与荧光结合的抗CD107a混合且在内吞抑制剂莫能菌素存在下以1:2的E:T比率用HEPG2靶细胞刺激4小时。caTCR T细胞上的CSR接合增加T细胞脱粒，进一步证明CSR使治疗性T细胞具有更多的针对所预期肿瘤细胞的反应性(图8)。

增殖

将T细胞用胞内染料CFSE标记，且测量在指定日剩余的CFSE阳性细胞的染料稀释及数目。

将相应T细胞在血清中饥饿隔夜且使用CellTrace CFSE(Thermo Fisher C34554)经CFSE标记。以2:1的E:T比率培育100,000个T细胞且当T细胞在指定日***时，使用流动式细胞测量术观测CFSE染料的连续稀释。通过FAC对T细胞的总数目计数。

CFSE稀释在CSR刺激下增大，表明这些T细胞具有较高的增殖潜力(图9)。重要的是，细胞数目也增加，意味着所述细胞不仅增殖较好，而且其存留也得以维持(表8)。

表8

所述结果展示，能够用配体阳性肿瘤细胞同时刺激CSR及caTCR两者，且CSR与caTCR的协同刺激增强caTCR T细胞的细胞毒性、增殖潜力及存留。这些是将使用授受性转移来增加基于caTCR的疗法的治疗潜力的所有特征。

实例4.经抗CD19 caTCR-1及抗CD20 CSR转导的T细胞的构建及表征

使用编码抗CD20结合部分(SEQ ID NO:60及61)的核酸片段生成抗CD20 CSR(即“CSR1”)，其包括CD28跨膜及胞内信号传导序列(SEQ ID NO:51)，表达于同一载体上，所述载体表达使用抗CD19结合部分(SEQ ID NO:58及59)生成的抗CD19 caTCR-1-0或caTCR-1-TM5。

体外杀灭

将Raji、BV173、NALM6及Jeko-1细胞(表达CD19及CD20的细胞系)用作靶细胞，以用于以2.5:1的效靶比进行T细胞杀灭。培育16小时后，使用Cytox 96非放射性细胞毒性分析(Promega)测量特异性T细胞溶解。

用抗CD19-caTCR-1-0或抗CD19-caTCR-1-TM5表达抗CD20-CSR产生能够在体外裂解多种CD19-阳性、CD20-阳性肿瘤细胞的完全功能性细胞毒性T细胞(图10)。

细胞因子分泌

释放至Raji体外杀灭实验的上清液中的细胞因子的浓度是通过Bioplex200(Luminex)、使用Bio-plex Pro人类细胞因子8-plex试剂盒(BioRad)测量。CSR-阳性及caTCR-阳性T细胞相较于仅表达ca-TCR-1-0的T细胞释放更多GM-CSF、IFNγ及TNFα(图11)。

脱粒

将T细胞与荧光结合的抗CD107a混合且在内吞抑制剂莫能菌素存在下以1:2的E:T比率用Raji靶细胞刺激4小时。caTCR T细胞上的CSR接合增加T细胞脱粒，进一步证明CSR使治疗性T细胞具有更多的针对所预期肿瘤细胞的反应性(图12)。

实例2至4展示，CSR为可与各种抗原靶向部分组合使用以增加表达caTCR的T细胞对于广泛范围的病变细胞的治疗潜力的模块化分子。

实例5：经抗CD19 caTCR-1及抗CD19嵌合刺激受体变异体转导的T细胞的构建及表征

使用编码抗CD19结合部分(SEQ ID NO:58及59)的核酸片段生成嵌合协同刺激受体(CSR)及caTCR-1-0构筑体(在此实例中称作“caTCR-1”)两者。通过将抗CD19结合部分融合于CSR序列制备不同CSR。CSR1包括CD28跨膜及胞内信号传导序列(SEQ ID NO:90)。CSR2包括CD8跨膜序列及4-1BB胞内信号传导序列(SEQ ID NO:91)。CSR3包括4-1BB跨膜及胞内信号传导序列(SEQ ID NO:92)。CSR4包括CD8跨膜序列及CD27胞内信号传导序列(SEQ IDNO:93)。CSR5包括CD27跨膜及胞内信号传导序列(SEQ ID NO:94)。CSR6包括CD8跨膜序列及CD30胞内信号传导序列(SEQ ID NO:95)。CSR7包括CD30跨膜及胞内信号传导序列(SEQ IDNO:96)。CSR8包括CD8跨膜序列及OX40胞内信号传导序列(SEQ ID NO:97)。CSR9包括OX40跨膜及胞内信号传导序列(SEQ ID NO:98)。

仅用抗CD19 CSR或用抗CD19 caTCR-1结合抗CD19 CSR转导原代T细胞。通过细胞表面染色测定转导效率，且所有caTCR转导的T细胞通过与模拟T细胞混合而匹配大致40％的受体阳性。

仅表达抗CD19 CSR的T细胞

体外杀灭

将Raji或NALM6细胞用作靶细胞，以用于以2.5:1的效靶比进行T细胞刺激。培育16小时后，使用Cytox 96非放射性细胞毒性分析(Promega)测量特异性T细胞溶解。仅表达抗CD19 CSR-6、CSR-7、CSR-8或CSR-9的T细胞并不会导致经杀灭靶细胞的数目相较于未经转导的模拟T细胞升高(数据未示出)。

细胞因子分泌

释放至体外杀灭反应的上清液中的细胞因子的浓度是通过Bioplex200(Luminex)、使用Bio-plex Pro人类细胞因子8-plex试剂盒(BioRad)测量。仅表达抗CD19CSR-6、CSR-7、CSR-8或CSR-9的T细胞在用Raji或NALM6培育时并不会释放大量IFNγ(数据未示出)。

表达抗CD19 caTCR-1及抗CD19 CSR的T细胞

在两个不同批次的实验中，将表达抗CD19 caTCR-1及抗CD19 CSR的相应T细胞在血清中饥饿隔夜且使用CellTrace CFSE(Thermo Fisher C34554)经CFSE标记。以2:1的E:T比率用NALM6培育T细胞且当T细胞在指定日***时，使用流动式细胞测量术观测CFSE染料的连续稀释。通过FAC对T细胞的总数目计数。使用从第二供体获得的原代T细胞反复这些实验。观测到类似结果(数据未示出)。

观测表达抗CD19 caTCR-1及抗CD19 CSR两者的所有T细胞的CFSE稀释，表明这些T细胞的高增殖潜力(图14至15)。另外，表达抗CD19 caTCR-1及抗CD19 CSR两者的T细胞展示经10天时段的显著存留(表9)。在对照实验中，仅表达抗CD19 CSR-1至抗CD19 CSR-5中的任一者的T细胞并未展示增殖潜力或存留随时间增加(数据未示出)。

表9

实例6：经抗CD19 caTCR-1及抗CD19 CSR转导的T细胞的体内功效研究

在人类CD19+NALM-6pre-B急性淋巴母细胞白血病(ALL)模型中测试表达抗CD19caTCR-1及抗CD19 CSR-1两者的T细胞的体内抗肿瘤活性。将表达荧光素酶的NALM-6细胞经静脉内(i.v.)植入至NOD SCIDγ(NSG)免疫功能不全小鼠中，且通过测量肿瘤衍生的生物发光评定肿瘤负荷。肿瘤植入后第六天，基于全生物发光通量将小鼠随机分组为处理组：(1)5×10⁶个未经转导的供体匹配(模拟)T细胞的i.v.注入；(2)仅表达抗CD19caTCR-1的2×10⁶个T细胞(“caTCR-1T细胞”)的i.v.注入；及(3)表达抗CD19 caTCR-1及抗CD19CSR-1两者的2×10⁶个T细胞(“caTCR-1CSR-1T细胞”；n＝每组6只小鼠)的i.v.注入。T细胞输注对小鼠造成的健康影响是通过监测其全身外观、体重及不良反应的其它临床征象(包含体温降低、呼吸困难及后肢麻痹/虚弱)来评估。

如图16中所示，虽然caTCR-1T细胞及caTCR-1CSR-1T细胞处理导致肿瘤生长抑制，但caTCR-1CSR-1T细胞展示相较于caTCR-1T细胞的抗肿瘤活性增强。所有经caTCR-1T细胞治疗及经caTCR-1CSR-1T细胞处理的小鼠在研究持续时间内均展现正常步态、姿势及活动/反应。此外，经caTCR-1T细胞治疗及经caTCR-1CSR-1T细胞处理的小鼠的体重在研究期间无损失。大体上，所治疗小鼠缺乏可观测到的异常参数证明caTCR-1CSR-1T细胞疗法安全。

为测定细胞因子体内释放量，在向带有NALM-6肿瘤的小鼠投与抗CD19 CAR-T细胞或caTCR-1CSR-1T细胞之后24小时分析关键细胞因子，包含与临床细胞因子释放综合症有关的细胞因子。通过Luminex Magpix技术，使用BioRad Bio-Plex试剂盒定量细胞因子含量。如图17中所示，经caTCR-1CSR-1T细胞处理的小鼠的细胞因子释放量相比经CAR-T处理的小鼠显著较低。

实例7：经抗AFP caTCR-1及抗GPC3 CSR转导的T细胞的体内功效研究

在所建立的人类AFP⁺/HLA-A2⁺Hep G2肝癌异种移植模型中测试表达抗AFP caTCR-1与抗GPC3 CSR-1两者的T细胞的体内抗肿瘤活性(构筑体资讯参见实例3)。将Hep G2细胞皮下(s.c.)植入SCID-Beige小鼠的右侧腹上。当肿瘤达到～100mm³时，小鼠经瘤内(i.t.)注入有：(1)5×10⁶个未经转导的供体匹配(模拟)T细胞；(2)表达包括相同抗AFP结合部分(SEQ ID NO:62及63)的抗AFP CAR的2×10⁶个T细胞；或(3)表达抗AFP caTCR-1及抗GPC3CSR-1的2×10⁶个T细胞(n＝每组6只小鼠)。T细胞输注对小鼠造成的健康影响是通过监测其全身外观、体重及不良反应的其它临床征象(包含体温降低、呼吸困难及后肢麻痹/虚弱)来评估。

如图18中所示，抗AFP CAR T细胞治疗与抗AFP caTCR-1/抗GPC3 CSR-1T细胞治疗均引起深刻且显著(****P<0.0001；邓尼特氏多重比较检验(Dunnett's multiplecomparison test))的肿瘤生长抑制。所有经抗AFP CAR-T处理的小鼠及经抗AFP caTCR-1/抗GPC3 CSR-1T细胞处理的小鼠在研究持续时间期间均展现正常的步态、姿势及活动/反应。另外，经抗AFP CAR-T处理的小鼠及经抗AFP caTCR-1/抗GPC3 CSR-1T细胞处理的小鼠的体重在研究期间无损失。大体上，所治疗小鼠缺乏可观测到的异常参数证明抗AFPcaTCR-1/抗GPC3 CSR-1T细胞疗法安全。

序列表

序列表

<110> 优瑞科生物技术公司(Eureka Therapeutics, Inc.)

刘宏(Liu, Hong)

张鹏博(Zhang, Pengbo)

L•霍兰(Horan, Lucas)

许奕阳(Xu, Yiyang)

B•K•斯特利(Staley, Binnaz K.)

刘连兴(Liu, Lianxing)

云泓若(Yun, Hongruo)

<120> 表达嵌合活化受体及嵌合刺激受体的细胞及其用途

<130> 75004-20010.40

<140> 尚未指配

<141> 与此同时

<150> US 62/490,580

<151> 2017-04-26

<150> US 62/490,578

<151> 2017-04-26

<150> US 62/490,576

<151> 2017-04-26

<160> 105

<170> 用于Windows 4.0版的FastSEQ

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 1

Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser

1 5 10 15

Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln

20 25 30

Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys

35 40 45

Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val

50 55 60

Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn

65 70 75 80

Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys

85 90 95

Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn

100 105 110

Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val

115 120 125

Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135 140

<210> 2

<211> 177

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 2

Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

130 135 140

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

165 170 175

Phe

<210> 3

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 3

Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys Asn Gly Thr

1 5 10 15

Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile

20 25 30

Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val

35 40 45

Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr Glu

50 55 60

Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val

65 70 75 80

His Ser Thr Asp Phe Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys

85 90 95

Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys

100 105 110

Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr

115 120 125

Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

145 150

<210> 4

<211> 173

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 4

Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu

1 5 10 15

Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys

20 25 30

Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His Trp Gln Glu

35 40 45

Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys

50 55 60

Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys

65 70 75 80

Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys

85 90 95

Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val

100 105 110

Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr

115 120 125

Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu

145 150 155 160

Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

165 170

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 5

Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg

1 5 10 15

Leu Trp Ser Ser

20

<210> 6

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 6

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

1 5 10 15

Leu Val Ser Ala Leu Val Leu

20

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 7

Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

20 25

<210> 8

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 8

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu

20

<210> 9

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 9

Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Ser Leu

20 25

<210> 10

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 10

Val Leu Gly Leu Arg Val Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

20 25

<210> 11

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 11

Val Leu Gly Cys Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

20 25

<210> 12

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 12

Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Phe Ala Val Ser Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

20 25

<210> 13

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 13

Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Ser

20 25

<210> 14

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 14

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Tyr Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 15

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 15

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Gly Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 16

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 16

Tyr Leu Val Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Val

1 5 10 15

Ile Val Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 17

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 17

Tyr Leu Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 18

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 18

Tyr Tyr Val Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 19

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 19

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Val

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 20

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 20

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Val Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 21

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 21

Tyr Tyr Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 22

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 22

Tyr Ile Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ile

1 5 10 15

Ile Leu Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 23

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 23

Tyr Tyr Met Tyr Cys Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 24

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 24

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser Phe Val Tyr Ser Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 25

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 25

Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Met Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 26

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 26

Gln Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe

20 25

<210> 27

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 27

Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp

1 5 10 15

Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg

20 25 30

<210> 28

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 28

Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val

1 5 10 15

Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg

35 40

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 29

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

1 5 10 15

Ala

<210> 30

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 30

Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val

1 5 10 15

Leu Ser Ala

<210> 31

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 31

Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys

1 5 10 15

Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met

20 25 30

Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg

35 40

<210> 32

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 32

Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu

1 5 10 15

Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val

20 25 30

His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg

35 40 45

<210> 33

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 33

Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu

1 5 10 15

Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala

20

<210> 34

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 34

Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser

1 5 10 15

Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala

20 25 30

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 35

Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe

1 5

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 36

Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

1 5 10

<210> 37

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 37

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

65 70 75 80

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

85 90 95

Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 38

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 38

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val

85 90 95

Glu Arg Lys

<210> 39

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 39

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val

85 90 95

Glu Arg Lys Cys

100

<210> 40

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 40

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val

85 90 95

Glu Arg Lys Cys Cys

100

<210> 41

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 41

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

85 90 95

Glu Leu Lys Thr Pro

100

<210> 42

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 42

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

85 90 95

Glu Ser Lys Tyr Gly

100

<210> 43

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 43

Asp Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr Gln Pro

1 5 10 15

Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro Gln

20 25 30

Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val Thr Ala

35 40 45

Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Thr Thr

50 55 60

Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly Lys Ser

65 70 75 80

Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp Val Thr

85 90 95

Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr

100 105 110

Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser

115

<210> 44

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 44

Asp Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr Pro Gln

1 5 10 15

Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro Gln

20 25 30

Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val Thr Ala

35 40 45

Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Thr Thr

50 55 60

Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly Lys Ser

65 70 75 80

Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp Val Thr

85 90 95

Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro

100 105

<210> 45

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 45

Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg

1 5 10 15

His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly

20 25 30

Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser

35 40 45

Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr

50 55 60

Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly

65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu

85 90 95

Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro

100 105 110

Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala

115 120 125

Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys

130 135 140

Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro

145 150 155

<210> 46

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 46

Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg Cys Cys Lys

1 5 10 15

Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr

20 25 30

Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu

35 40 45

Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu Ser Gly

50 55 60

His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys

65 70 75 80

Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp

85 90 95

Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser

100

<210> 47

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 47

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

1 5 10 15

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

20 25 30

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

35 40 45

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

65 70 75 80

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

85 90 95

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro

100

<210> 48

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 48

Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 49

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 49

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

50 55 60

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

65 70 75 80

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

85 90 95

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

100 105

<210> 50

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 50

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

50 55 60

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

65 70 75 80

Gly Lys Gly His Asp Gly Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

85 90 95

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105

<210> 51

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 51

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

50 55 60

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

65 70 75 80

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

85 90 95

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

100 105

<210> 52

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 52

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 53

<211> 94

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 53

Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala

20 25 30

Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg

35 40 45

Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

50 55 60

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

65 70 75 80

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

85 90

<210> 54

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 54

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 55

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 55

Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg

1 5 10 15

Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly

20 25 30

Pro Ser Trp Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu

35 40 45

Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu

50 55 60

Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His

65 70 75 80

Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln

85 90 95

Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

100 105

<210> 56

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 56

Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His

1 5 10 15

Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln

20 25 30

Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

35 40

<210> 57

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 57

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

65

<210> 58

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 58

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg Ser Asn

100 105 110

Trp Trp Tyr Asn Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 59

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 59

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 60

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 60

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 61

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 61

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Asp Gly Glu Lys

1 5 10 15

Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp

20 25 30

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr

35 40 45

Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala

65 70 75 80

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 62

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 62

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Ser Gly Gly Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ile Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Val Ser Leu Val Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 63

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 63

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Glu Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Gly

85 90 95

Ser Arg Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 64

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Ser Tyr Leu Asn His Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 65

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 65

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Val Tyr Gly Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Thr Leu

85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 66

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 66

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Val Phe Trp Val Arg Gln Arg Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Asp

35 40 45

Ile Asn Pro Val Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Arg Gly

85 90 95

Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 67

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 67

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 68

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 68

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Ser Gly Gly Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ile Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Val Ser Leu Val Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

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210 215 220

Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser

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Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn

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Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

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<210> 69

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 69

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Glu Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Gly

85 90 95

Ser Arg Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

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Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr

210 215 220

Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu

225 230 235 240

Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu

245 250 255

Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg

260 265 270

Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

275 280

<210> 70

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Ser Gly Gly Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ile Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Val Ser Leu Val Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

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130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

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210 215 220

Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser

225 230 235 240

Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn

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Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Val Leu Phe Ala Lys Thr

260 265 270

Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

275 280 285

<210> 71

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 71

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

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Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Glu Val Ser Asn Arg Phe

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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Gly

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Ser Arg Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

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Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

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Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr

210 215 220

Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu

225 230 235 240

Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Leu Val Tyr Leu Leu Leu Leu

245 250 255

Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Val Ile Val Thr Cys Cys Leu Leu Arg

260 265 270

Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

275 280

<210> 72

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 72

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

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Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg Ser Asn

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Trp Trp Tyr Asn Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

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Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

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Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

165 170 175

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

195 200 205

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

210 215 220

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His

225 230 235 240

Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys

245 250 255

His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser

260 265 270

Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val

275 280 285

Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

290 295

<210> 73

<211> 281

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 73

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

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Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Tyr

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Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

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Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

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Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp

210 215 220

Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln

225 230 235 240

Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys

245 250 255

Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr

260 265 270

Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

275 280

<210> 74

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

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Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg Ser Asn

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Trp Trp Tyr Asn Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

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Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

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Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

165 170 175

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

195 200 205

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

210 215 220

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His

225 230 235 240

Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys

245 250 255

His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser

260 265 270

Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Val Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val

275 280 285

Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu

290 295

<210> 75

<211> 281

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 75

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

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Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Tyr

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Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

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Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

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Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

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Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly

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Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

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Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp

210 215 220

Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln

225 230 235 240

Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Leu Val Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys

245 250 255

Ser Val Val Tyr Phe Val Ile Val Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr

260 265 270

Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

275 280

<210> 76

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 76

Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Glu Met Ala

20

<210> 77

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 77

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

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His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

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Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr

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Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu

115 120 125

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

145 150 155 160

Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

165 170 175

Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro

180 185 190

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr

195 200 205

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr

210 215 220

Tyr Cys Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg

225 230 235 240

Ser Asn Trp Trp Tyr Asn Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser

260

<210> 78

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 78

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Asp Gly Glu Lys

1 5 10 15

Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp

20 25 30

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr

35 40 45

Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala

65 70 75 80

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Gln Val Gln Leu

115 120 125

Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met

130 135 140

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp

145 150 155 160

Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr

165 170 175

Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala

180 185 190

Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

195 200 205

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 79

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 79

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Val Tyr Gly Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Thr Leu

85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser

100 105 110

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Leu Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

145 150 155 160

Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr

180 185 190

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

195 200 205

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Tyr Leu Asn His Gly Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 80

<211> 368

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 80

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu

115 120 125

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

145 150 155 160

Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

165 170 175

Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro

180 185 190

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr

195 200 205

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr

210 215 220

Tyr Cys Ala Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg

225 230 235 240

Ser Asn Trp Trp Tyr Asn Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

260 265 270

Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys

275 280 285

His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp

290 295 300

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Leu Leu Val Thr Val

305 310 315 320

Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His

325 330 335

Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys

340 345 350

His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

355 360 365

<210> 81

<211> 353

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 81

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Asp Gly Glu Lys

1 5 10 15

Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp

20 25 30

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr

35 40 45

Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala

65 70 75 80

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Gln Val Gln Leu

115 120 125

Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met

130 135 140

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp

145 150 155 160

Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr

165 170 175

Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala

180 185 190

Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

195 200 205

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro

245 250 255

Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly

260 265 270

Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe

275 280 285

Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Leu Leu Val Thr

290 295 300

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu

305 310 315 320

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

325 330 335

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

340 345 350

Ser

<210> 82

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 82

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Val Tyr Gly Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Thr Leu

85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser

100 105 110

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Leu Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

145 150 155 160

Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr

180 185 190

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

195 200 205

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Tyr Leu Asn His Gly Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val

245 250 255

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile

260 265 270

Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly

275 280 285

Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala

290 295 300

Cys Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

305 310 315 320

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

325 330 335

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

340 345 350

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

355

<210> 83

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 83

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 180

<210> 84

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 84

gccgccccga ctgcatctgc gtgttccaat tcgccaatga caagacgctg ggcggggttt 60

gtgtcatcat agaactaaag acatgcaaat atatttcttc cggggacacc gccagcaaac 120

gcgagcaacg ggccacgggg atgaagcag 149

<210> 85

<211> 335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 85

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 180

ctcgaggccg ccccgactgc atctgcgtgt tccaattcgc caatgacaag acgctgggcg 240

gggtttgtgt catcatagaa ctaaagacat gcaaatatat ttcttccggg gacaccgcca 300

gcaaacgcga gcaacgggcc acggggatga agcag 335

<210> 86

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 86

Pro Thr His Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala

1 5 10 15

Gly His Met Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr

20 25 30

Leu Ser Thr His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe

35 40 45

Ile Arg Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu

50 55 60

Ala Gly Ala Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys

65 70 75 80

Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro

85 90 95

Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys

100 105 110

Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

115

<210> 87

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 87

Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro

1 5 10 15

Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr

20 25 30

Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

35 40 45

<210> 88

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 88

Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn Pro Thr Pro Glu Asn

1 5 10 15

Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln Ser Leu Leu Val Asp

20 25 30

Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr Ser Ala Pro Val Ser

35 40 45

Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala Gly Pro Val Leu Phe Trp Val

50 55 60

Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys

65 70 75 80

His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys

85 90 95

Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg

100 105 110

Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu

115 120 125

Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Cys His

130 135 140

Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Asp Ala

145 150 155 160

Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr

165 170 175

Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp

180 185 190

Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly

195 200 205

Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp

210 215 220

His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser

225 230 235 240

Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro

245 250 255

Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys

260

<210> 89

<211> 184

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 89

His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys

1 5 10 15

Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg

20 25 30

Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu

35 40 45

Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Cys His

50 55 60

Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Asp Ala

65 70 75 80

Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr

85 90 95

Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp

100 105 110

Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly

115 120 125

Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp

130 135 140

His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser

145 150 155 160

Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro

165 170 175

Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys

180

<210> 90

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 90

Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu

1 5 10 15

Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro

20 25 30

Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val

35 40 45

Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

50 55 60

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

65 70 75 80

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

85 90 95

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

100 105

<210> 91

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 91

Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

20 25 30

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

35 40 45

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

50 55 60

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

65 70 75 80

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

85 90 95

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

100 105 110

Gly Cys Glu Leu

115

<210> 92

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 92

Ala Ala Ala Thr Gly Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val

1 5 10 15

Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile

20 25 30

Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe

35 40 45

Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

50 55 60

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

65 70 75 80

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

85 90 95

Cys Glu Leu

<210> 93

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 93

Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

20 25 30

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

35 40 45

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

50 55 60

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Gln Arg Arg Lys Tyr Arg

65 70 75 80

Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr

85 90 95

Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp

100 105 110

Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

115 120

<210> 94

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 94

Ala Ala Ala Thr Gly Pro Thr His Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu

1 5 10 15

Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln

20 25 30

Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu

35 40 45

Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe

50 55 60

Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys

65 70 75 80

Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys

85 90 95

Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln

100 105 110

Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

115 120

<210> 95

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 95

Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

20 25 30

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

35 40 45

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

50 55 60

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys His Arg Arg Ala Cys Arg

65 70 75 80

Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser

85 90 95

Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr

100 105 110

Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg

115 120 125

Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr

130 135 140

Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Asp Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro

145 150 155 160

Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys

165 170 175

Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr

180 185 190

Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu

195 200 205

Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro

210 215 220

Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu

225 230 235 240

Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser

245 250 255

Gly Lys

<210> 96

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 96

Ala Ala Ala Thr Gly Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn

1 5 10 15

Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln

20 25 30

Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr

35 40 45

Ser Ala Pro Val Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala Gly Pro

50 55 60

Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly Ser Ser

65 70 75 80

Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln

85 90 95

Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu

100 105 110

Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly

115 120 125

Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln

130 135 140

Pro Leu Met Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro

145 150 155 160

Leu Gln Asp Asp Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu

165 170 175

Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr

180 185 190

Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu

195 200 205

Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu

210 215 220

Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu

225 230 235 240

Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu

245 250 255

Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys

260 265

<210> 97

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 97

Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

20 25 30

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

35 40 45

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

50 55 60

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Ala Leu Tyr Leu Leu Arg

65 70 75 80

Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly

85 90 95

Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr

100 105 110

Leu Ala Lys Ile

115

<210> 98

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 98

Ala Ala Ala Thr Gly Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu

1 5 10 15

Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala

20 25 30

Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Trp Val Glu Val Pro Gly Gly

35 40 45

Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu

50 55 60

Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln

65 70 75 80

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

85 90 95

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

100 105 110

Ile

<210> 99

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 99

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Val Trp Gly Trp Gln Gly Gly Met Tyr Pro Arg Ser Asn Trp

100 105 110

Trp Tyr Asn Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 100

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 100

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 101

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 101

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Ser Ala Ala Trp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 102

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 102

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser His Asp Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

65 70 75 80

Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Gly Leu Pro Leu Thr Phe

85 90 95

Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 103

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 103

Ala Ala Ala

1

<210> 104

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 104

Ala Ala Ala Thr Gly

1 5

<210> 105

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 105

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asp

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Val Tyr Gly Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Thr Leu

85 90 95

Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser

100 105 110

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Leu Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

145 150 155 160

Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr

180 185 190

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

195 200 205

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Tyr Leu Asn His Gly Asp Tyr Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly

245 250 255

Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

260 265 270

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg

275 280 285

Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

290 295 300

Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser

305 310 315 320

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala

325 330 335

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

340 345 350

Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

355 360 365

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser

370 375 380

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln

385 390 395 400

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser

405 410 415

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys

420 425 430

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala

435 440 445

Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr

450 455 460

Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

465 470 475 480

Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

485 490 495

Val Glu Ile Lys

500