通用抗毒液素
阅读说明：本技术 通用抗毒液素 (Universal antitoxic liquid ) 是由 允·Y·黄 于 2018-02-16 设计创作，主要内容包括：本公开涉及一种用于治疗有毒动物咬伤的通用抗毒液素,以及使用新型靶定的噬菌体展示技术开发所述通用抗毒液素的方法。(The present disclosure relates to a universal antitoxin for use in the treatment of venomous animal bites, and methods for developing the universal antitoxin using novel targeted phage display technologies.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460,213的权益，该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
参考电子提交的序列表
电子提交的序列表的内容(名称：4133.001PC01_ST25.txt；大小：32,474字节；以及创建日期：2018年2月15日)通过引用整体并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是根据海军内部实验室独立研究计划(Navy In-House LaboratoryIndependent Research Program)授予的ILIR-5160在政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本公开内容一般涉及使用噬菌体展示短肽的通用抗毒液素(antivenom)开发。
背景技术
表达短肽的M13噬菌体已被用作递送载具(delivery vehicle)以将各种结合基序转运(transport)至靶。对噬菌体尾部蛋白质的遗传修饰允许表达具有可变序列、长度和组成的特有肽。表达的肽可以结合特定的表位，从而形成用于确认结合配偶体(bindingpartner)的高通量系统的基础。
动物毒液螫入(envenomation)是世界范围内的主要公共卫生问题，被世界卫生组织列为被忽视的疾病。例如，全球约有40万人，每年在美国和加拿大有近9,000人受到毒蛇咬伤毒液螫入的影响。几种基于抗体的抗毒液素可用于肠内治疗。响尾蛇科多价免疫Fab(Ovine)是目前唯一可广泛用于治疗北美响尾蛇患者的产品；然而，它的高成本和副作用是常见问题。
基于抗体的抗毒液素是通过将宿主动物暴露于纯毒液以进行免疫调节并提取所得抗体而开发的。虽然基于抗体的策略已经获得了针对某些蛇类物种的成功疗法，但在制造的安全性、功效和成本方面仍然存在限制。另外，基于抗体的策略在对抗来自其他动物(蛛形纲动物和水母类)的毒液螫入方面的效果有限。
然后从动物中分离血清，并纯化毒液反应性抗体。虽然这种基于抗体的策略已经获得了针对某些蛇类物种的成功疗法，但在制造的安全性、功效和经济方面仍然存在局限性。基于抗体的抗毒液素最严重的副作用之一是患者对来自马或绵羊的异源免疫球蛋白的免疫反应，称为血清病。此外，大多数基于抗体的溶液要么需要特殊的储存条件，要么在冻干的情况下，则需要在施用前复原(reconstitution)；这两者都会降低它们在偏远和严峻条件下的实用性(utility)。虽然其他人已经生产了基于抗体的抗毒液素，但鉴于昂贵且耗时的生产过程的影响以及应用的局限性，他们对抗毒液素生产的持续追求是值得怀疑的。
以下参考文献提供了关于抗毒液素技术的现有技术的背景信息，并且通过引用整体并入本文：Molenaar,T.J.等人.Uptake and processing of modified bacteriophageM13 in mice:implications for phage display.Virology 293,182-191,doi:l0.1006/viro.2001.1254(2002)；Rabies and Envenomings A Neglected Public Health Issue(WHO 2007)；WHO Guidelines for the Production Control and Regulation of SnakeAntivenom Immunoglobulins(WHO 2010)；Warrell,D.A.Guidelines for the managementof snake-bites(WHO 201 0)；Smith,S.等人.Bedside management considerations inthe treatment of pit viper envenomation.J Emerg Nurs 40,537-545,doi:l0.1016/j.jen.2014.01.002(2014)；Mowry,J.B.,Spyker,D.A.,Cantilena,L.R.,Jr.,Bailey,J.E.&Ford,M.2012Annual Report of the American Association of Poison ControlCenters'National Poison Data System(NPDS):30th Annual Report.Clin Toxicol(Phila)51,949-1229,doi:10.3109/15563650.2013.863906(2013)；Kanaan,N.C.等人.Wilderness Medical Society Practice Guidelines for the Treatment of PitviperEnvenomations in the United States and Canada.Wilderness Environ Med 26,472-487,doi:l0.1016/j.wem.2015.05.007(2015)；Holland,D.R.等人.The crystalstructure of a lysine 49 phospholipase A2 from the venom of the cottonmouthsnake at 2.0-A resolution.J Biol Chem 265,17649-17656(1990)；Fralick,J.,Chadha-Mohanty,P.&Li,G.in Advances in Biological and Chemical TerrorismCountermeasures(eds R.Kendall,S.Presley,G.Austin,&P.Smith)179-202(CRC Press,2008)；Philipson,L.,Albertsson,P.A.,Frick,G.The purification and concentrationof viruses by aqueous polymer phase systems.Virology,11,553-571(1960)；Yu,J.&Smith,G.P.[1]Affinity maturation of phage-displayed peptide ligands.267,3-27,doi:10.10 16/s0076-6879(96)67003-7(1996)；Prakash S.S.Phage display technologyfor anti-venom production.Clinical Microbiology and Infection 13:4(October2015)；Roncolato,E.C.等人.Phage display as a novel promising antivenomtherapy:a review.93:79-84 Toxicon.(Jan.2015；Epub Nov.2014)。
发明内容
本公开提供了一种多物种抗毒液素组合物。所述组合物含有噬菌体表达的肽，所述肽与几种不同动物毒液共有的靶结合。所述噬菌体表达的肽通常是7-12聚体肽，其可以结合许多靶，包含金属、碳水化合物和蛋白质。
本公开还提供了一种基于编辑反映多种动物毒液的共有蛋白质序列(consensusprotein sequence)的肽靶设计的改进方法。然后，所述共有蛋白质序列提供用于噬菌体展示淘选(对不同毒液蛋白质序列的富集同源区域的亲和分配)的靶。
在一示例性实施方案中，本公开提供了一种基于西部棉口蝮(WesternCottonmouth)毒液中的共有磷脂酶A2(PLA2)蛋白质序列的肽靶设计的改进方法。因此，该共有序列在生成对北美毒蛇具有通用性的抗毒液素中提供了用于噬菌体展示淘选的靶。所述方法包括重新定义靶序列以包含北美七种最常见的毒蛇的同源区域。具体地，该方法涉及通过靶向保守的活性位点重新定义靶肽以模拟肽家族的同源区域。该方法可以使用下表1中列出的噬菌体表达的肽。
本公开还涉及一种抗毒液素配制品(formulation)，其包含悬浮在药学上可接受的载剂(carrier)中的噬菌体表达的肽，其中所述肽被配置成结合保守的蛇毒液组分，从而中和毒液毒性。
本公开还提供了一种用于确认(identify)有毒动物咬伤的类型和严重程度的诊断试剂盒。所述试剂盒含有多种肽和多种标记分子。每种肽靶向一种或多种动物物种的毒液特有的序列。每个标记分子与对应的特有肽缀合。抽取被咬受害者的血液并使血液与肽/标记缀合物接触。所述试剂盒还包含测定，所述测定配置成检测所述标记分子，从而显示与所述血液中各自的靶结合的肽。因此，所述试剂盒可以检测哪些肽与靶结合，以及结合的程度，从而确认血液中发现的动物物种毒液的类型和咬伤的严重程度。
在一些实施方案中，本文公开了一种多物种抗毒液素组合物，其包含噬菌体表达的肽，所述肽结合多于一种动物的毒液共有的靶；以及药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，所述噬菌体表达的肽的长度为约7至约12个氨基酸；其中所述靶是金属、碳水化合物、蛋白质或其任何组合。在一些实施方案中，所述噬菌体表达的肽是线性的。在一些实施方案中，所述噬菌体表达的肽是环状的。
在一些实施方案中，所述噬菌体表达的肽的靶是蛋白质。在一些实施方案中，所述噬菌体表达的肽的靶是磷脂酶A2(PLA2)。
在一些实施方案中，所述组合物包括选自以下的一种或多种肽：SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及其任何组合。在一些实施方案中，所述组合物包括包含SEQ ID NO:1的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括由SEQ ID NO:1组成的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括包含SEQ ID NO:2的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括由SEQ ID NO:2组成的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括包含SEQ ID NO:3的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括由SEQ ID NO:3组成的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括包含SEQ ID NO:4的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括由SEQ ID NO:4组成的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包括选自以下的一种或多种肽：SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及其任何组合。在一些实施方案中，所述组合物包括包含SEQ ID NO:9的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括由SEQ ID NO:9组成的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括包含SEQ ID NO:10的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括由SEQ ID NO:10组成的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括包含SEQ ID NO:11的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括由SEQ ID NO:11组成的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括包含SEQ ID NO:12的肽。在一些实施方案中，所述组合物包括由SEQ ID NO:12组成的肽。
在一些实施方案中，本文公开了包含噬菌体表达的肽的组合物，其中所述噬菌体表达的肽由M13噬菌体表达。
在一些实施方案中，本文公开了中和多种动物毒液的组合物，其中所述多种动物毒液来源于一个或多个蛇类物种。
在一些实施方案中，本文公开了一种或多种噬菌体表达的肽，其与一种或多种动物毒液中的靶结合。在一些实施方案中，所述噬菌体表达的肽选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及其任何组合。在一些实施方案中，所述噬菌体表达肽靶向磷脂酶A2。仍在一些实施方案中，所述一种或多种噬菌体表达的肽包括选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及其任何组合的肽。在一些实施方案中，所述噬菌体表达的肽由M13噬菌体表达。
本文还提供了编码本文公开的任何一种肽的一种或多种分离的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包括选自以下的序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及其任何组合。
在一些实施方案中，本文提供了一种或多种载体(vector)，其包括编码本文公开的任何一种肽的核酸。在一些实施方案中，所述一种或多种载体包括本文公开的核酸。
在一些实施方案中，本文提供了宿主细胞，其包括本文公开的分离的核酸分子，或本文公开的分离的载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。在一些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌K12ER2738。
在一些实施方案中，本文还提供了一种生产本文公开的组合物或本文公开的肽的方法，所述方法包括在生产所述肽的条件下培养本文公开的宿主细胞。在一些实施方案中，本文提供了一种生产本文公开的组合物或本文公开的肽的方法，所述方法包括(a)确认西部棉口蝮毒液中的共有PLA2蛋白质序列；(b)确认其他蛇类物种中的共有PLA2蛋白质序列；以及(c)经由噬菌体展示淘选生产一种或多种噬菌体。
在一些实施方案中，本文公开了一种治疗与动物毒液接触的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用(administer)本文公开的组合物。在一些实施方案中，所述动物毒液来自西部棉口蝮毒液。在一些实施方案中，所述组合物结合所述动物毒液，从而中和毒液毒性。在一些实施方案中，施用的所述组合物包括选自以下的肽：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及其任何组合。在一些实施方案中，所述组合物通过口服、直肠、透皮、静脉内、肌肉内、腹膜内、骨髓内、硬膜外或皮下方式施用。
在一些实施方案中，本文提供了一种包括本文公开的组合物的诊断试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括包含选自以下的肽的组合物：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及其任何组合。在一些实施方案中，所述试剂盒包括包含选自以下的肽的组合物：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及其任何组合。
附图说明
从附图的元件中可以明显看出以下内容，这些元件是出于说明的目的而提供的，并不一定按比例绘制。
图1A显示了在空间填充模型中从西部棉口蝮(Agldstrodon piscivorusleucostoma)毒液中分离的PLA2的晶体结构。已经使用分别表示催化网络和金属结合氨基酸的圆圈确认了残基。二次图像(secondary image)显示晶体结构的90°逆时针旋转，以观察活性残留物。
图1B是来自西部棉口蝮蛇毒液的PLA2的保守序列，其用作淘选用靶肽。表示活性催化位点(黄色)和金属结合位点(红色)的内部区域用作噬菌体淘选的模板肽。
图2是当利用来自第二轮淘选的多克隆噬菌体混合物将西部棉口蝮毒液孵育30分钟时PLA2抑制的图示。抑制作用取决于多克隆噬菌体混合物的浓度。
图3是显示使用从噬菌体展示文库分离的噬菌体克隆物抑制PLA2活性的条形图。
图4是显示Ph.D.-12-7噬菌体对美国五种主要蛇毒液的跨物种抗PLA2活性的条形图。所选噬菌体克隆物之一Ph.D.-12-7显示了对北美所有主要响尾蛇毒液的抗PLA2活性。
图5A至图5D示出了用于从各种噬菌体展示系统开发通用抗毒液素的方法的步骤。图5A显示了毒液组分的序列分析。图5B显示了噬菌体的亲和力选择。图5C显示了体外和体内功效测试。图5D显示蛇咬伤受害者的噬菌体治疗。
虽然本公开易于进行各种修改和替代形式，但是在附图中通过示例的方式示出了具体的实施方案，并且将在本文中对其进行详细描述。然而，应该理解的是，本公开不旨在限于所公开的特定形式。而是，本公开将覆盖落入由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。
具体实施方式
本文提供了肽和包括肽的组合物。在一些实施方案中，肽结合蛇毒液并中和毒液毒性。在一些实施方案中，肽结合PLA2并中和毒液毒性。在一具体的实施方案中，分离本文公开的蛋白质。
还提供了编码这种蛋白质的分离的核酸(多核苷酸)，例如互补DNA(cDNA)。还提供了载体(如表达载体)和包括编码这种蛋白质的核酸(多核苷酸)的细胞(如宿主细胞)。还提供了制备这种蛋白质的方法。在其他方面，本文提供了用于检测蛇毒液的方法和用途。在其他方面，本文提供了治疗某些病症(例如蛇咬伤)的方法。还提供了相关的组合物(如药物组合物)、试剂盒和检测方法。
为了促进对本公开的原理的理解，现在将参考附图中示出的多个说明性实施方案，并且将使用具体语言来描述这些实施方案。
a.术语
应注意，术语“一种”实体是指该实体中的一个或多个；例如，“一种核苷酸序列”应理解为表示一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一种”、“一个或多个”以及“至少一个”在本文中可互换使用。
此外，本文使用的“和/或”将被视为具体公开了两个指定特征或组分中的每一个，具有或不具有另一个。因此，在诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”意在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)以及“B”(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”意在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
类似地，除非上下文另有明确说明，否则词语“或”意在包括“和”。还应理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值是近似的，并且提供用于描述。
应当理解，在本文中用语言“包括”描述的无论是哪些方面，还提供了以“由...组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他类似方面。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所涉及领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary ofCell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及the OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,OxfordUniversity Press为本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用字典。
单位、前缀和符号以其国际单位制(Système International de Unites,SI)接受的形式表示。数字范围包含定义该范围的数字。除非另有说明，否则氨基酸序列以氨基至羧基取向从左至右书写。本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，其在提及说明书时可以作为一个整体。因此，通过参考整个说明书，可以更全面地定义下文紧接着定义的术语。
术语“约”在本文中用于指大约、大致、大概或在其区域内。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过在所述数值以上和以下扩展边界来修改该范围。因此，“约10-20”指“约10至约20”。通常，术语“约”可以通过例如10％、向上或向下(更高或更低)的变化幅度(variance)而在数值以上和以下范围内修改所述数值。
本文所用的应用于物体的术语“天然存在的”是指物体可以在自然界中找到这一事实。例如，存在于可从自然界中的来源分离的生物体(包含病毒)中并且在实验室中没有被人有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
“噬菌体”或“细菌噬菌体”是指感染细菌的病毒。术语“噬菌体”用于指两种类型的病毒，但在某些情况下，如上下文所指出的，也可以用作特别指代细菌噬菌体的简写。细菌噬菌体是通过利用一些或所有宿主生物合成机制(即感染细菌的病毒)在细菌内繁殖的专性细胞内寄生虫。虽然不同的细菌噬菌体可能含有不同的物质，但它们都含有核酸和蛋白质，并且在某些情形下可以包封在脂质膜中。根据噬菌体，核酸可以是DNA或RNA但不同时是这两者，并且它可以以各种形式存在。噬菌体有两种感染细菌细胞的方式。一种是溶原性，其中噬菌体DNA掺入细菌的染色体中并且变成多代休眠。需要至少一种环境诱导剂使噬菌体DNA从细菌染色体上切除并建立第二种类型的感染，即裂解期。在这个阶段，细菌被转化为噬菌体制造工厂。产生数百个噬菌体并裂解细菌细胞以释放它们。然后释放的噬菌体找到另一种宿主细菌，并重复该过程。
“M13噬菌体”、“M13细菌噬菌体”等是用M13病毒侵染的噬菌体。在本文公开的一些实施方案中，M13噬菌体是用M13病毒感染的大肠杆菌。M13噬菌体由被包被蛋白(coatingprotein)包裹的环状单链DNA分子组成。在本文公开的一些实施方案中，M13噬菌体产生包含SEQ ID NO:1-4的抗毒液素肽。
“抗毒液素”是一种对抗毒液作用的血清。抗毒液素用于治疗某些毒性咬伤和叮刺。在本文的一个特定实施方案中，抗毒液素用于治疗蛇咬伤。所需的特定抗毒液素取决于所涉及的物种。“通用抗毒液素”与一种以上物种的毒液或毒液蛋白质反应。换言之，通用抗毒液素是与不同物种的毒液交叉反应的抗毒液素。
“噬菌体展示淘选”是一种使用细菌噬菌体检查蛋白质-蛋白质、蛋白质-肽和蛋白质-DNA相互作用的技术。噬菌体展示淘选允许富集相关噬菌体。
“磷脂酶A2”或“PLA2”是属于水解甘油磷脂的sn-2酯以产生脂肪酸和溶血磷脂的一类酶的酶。PLA2催化3-sn-磷酸甘油酯中2-酰基基团的钙依赖性水解，这释放出作为信号分子前体的甘油磷脂和花生四烯酸。蛇毒液的PLA2包括非常大型的酶超家族，其由六种主要类型中的16个识别的基团构成。这些主要类型包含分泌型PLA2s(sPLA2)、细胞溶质PLA2s(cPLA2)、钙独立性PLA2s(iPLA2)、血小板活化因子(PAF)乙酰水解酶/氧化脂质脂蛋白相关联的PLA2(LpPLA2s)、脂肪PLA2s(AdPLA2s)和溶酶体PLA2s(LPLA2s)。PLA2s对甘油磷脂的水解导致脂肪酸的释放和相关溶血磷脂的产生。
“共有序列”是在不同但相关的DNA或RNA或蛋白质序列中的同源区域之间共有的核苷酸或氨基酸的序列。
“多肽”是指包括至少两个连续连接的氨基酸残基的链，其中该链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可以含有修饰，例如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键形成。“蛋白质”可以包括一种或多种多肽。
如上所述，多肽变体包含例如修饰的多肽。修饰包含例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人,Blood 116:270-79(2010)，其通过引用整体并入本文)、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、消旋化、硒化、硫酸化、氨基酸向蛋白质的转移-RNA介导的添加(例如精氨酸化)以及泛素化。
如本文所用，通过比对以使第一蛋白质序列(如IL-2序列)和第二蛋白质序列(如第二IL-2序列)之间的同一性或相似性最大化，确认蛋白质序列中的“对应氨基酸”、“对应位点”或“等同氨基酸”。用于确认第二蛋白质序列中的等同氨基酸的数字基于用于确认第一蛋白质序列中的对应氨基酸的数量。
本文所用的术语“表达”是指多核苷酸产生基因产物(例如RNA或多肽)的过程。
“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-支链侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在一些实施方案中，IL-2-CD25融合蛋白中预测的非必需氨基酸残基被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替换。确认不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见，例如，Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；以及Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997))。
对于多肽，术语“基本同源性”表示当最佳比对和比较时，两个多肽或其指定序列是相同的，其中在至少约80％的氨基酸中，在至少约90％至95％的氨基酸处或者在至少约98％至99.5％的氨基酸处具有适当的氨基酸***或缺失。
“结合亲和力”通常是指分子的单个结合位点(例如，本文公开的肽)与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如肽和抗原)之间的1：1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以以本领域已知的多种方式测量和/或表达，包含但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD由koff/kon的商计算，而KA由kon/koff的商计算。kon是指例如肽与抗原的缔合速率常数，而koff是指例如肽与抗原的解离。kon和koff可以通过本领域普通技术人员已知的技术(例如
如本文所用，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-支链侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在某些实施方案中，本文公开的肽内的一个或多个氨基酸残基可以用具有相似侧链的氨基酸残基替换。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语，是指肽可以特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是，例如多肽的连续氨基酸[线性或连续表位(contiguous epitope)]或表位可以例如一起来自一种或多种多肽的两个或更多个非连续区域(构象、非线性、不连续或非连续的表位)。在某些实施方案中，本文公开的肽结合的表位可以通过例如NMR光谱、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、氢/氘交换与质谱联用(如液相色谱电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变映射(例如，定点诱变映射)来确定。对于X射线晶体学，可以使用本领域任何已知方法完成结晶(例如,GiegéR等人,(1994)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；ChayenNE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303)。
如本文所用，术语“核酸分子”意在包含DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cDNA。
术语“下游”是指位于参考核苷酸序列3'的核苷酸序列。“下游”还可以指位于参考肽序列的C末端的肽序列。
术语“上游”是指位于参考核苷酸序列5'的核苷酸序列。“上游”还可以指位于参考肽序列的N末端的肽序列。
对于核酸，术语“基本同源性”表示当最佳比对和比较时，两个核酸或其指定序列是相同的，其中在至少约80％的核苷酸中，在约90％至95％的核苷酸处或者在至少约98％至99.5％的核苷酸处具有适当的核酸***或缺失。替代地，当区段(segment)在选择性杂交条件下与链的互补物(complement)杂交时，存在基本同源性。
如本文所用，术语“调节区”是指位于编码区上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关联的编码区的转录、RNA加工、稳定性或翻译。调节区可以包含启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。如果编码区用于在真核细胞中表达，则多腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3'。
编码基因产物(例如多肽)的多核苷酸可以包含与一个或多个编码区可操作地相关联的启动子和/或其他转录或翻译控制元件。除启动子之外的其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号，也可以与编码区可操作地相关联以引导基因产物表达。
多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包含但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(立即早期启动子，结合内含子-A)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包含衍生自脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-珠蛋白，以及其他能够控制真核细胞中基因表达的序列。额外合适的转录控制区包含组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如，由干扰素或白细胞介素诱导的启动子)。
类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包含但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。
术语“序列同一性百分比”、“同一性百分比”、“序列同一性”或“同一性”可互换使用，是指考虑到为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即缺口)，在比较窗口上在两个多核苷酸或多肽序列之间共享的相同匹配位置的数目。匹配位置是在靶序列和参考序列两者中呈现相同核苷酸或氨基酸的任何位置。由于缺口不是核苷酸或氨基酸，因此不对靶序列中呈现的缺口计数。同样地，由于对靶序列核苷酸或氨基酸而不对来自参考序列中的核苷酸或氨基酸计数，因此不对参考序列中呈现的缺口计数。
可以使用数学算法完成两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定，如下面的非限制性实施例中所述。
序列同一性的百分比通过以下来计算：确定在两个序列中均发生相同氨基酸残基或核酸碱基的位置的数目，以获得匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，以及将结果乘以100，以获得序列同一性的百分比。两个序列之间的序列比较和序列同一性百分比的确定可以通过在线使用且下载容易获得的软件来完成。合适的软件程序可从各种来源获得，并用于蛋白质和核苷酸序列两者的比对。确定百分比序列同一性的一个合适程序是bl2seq，其是可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法执行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适的程序是例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其是EMBOSS生物信息学程序套件的一部分并且也可从欧洲生物信息学研究所(EBI)www.ebi.ac.uk/Tools/psa获得。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可以各自具有其自身的序列同一性百分比。应注意，序列同一性百分比值四舍五入到最接近的十分之一。例如，80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入到80.2。还应注意，长度值将始终是整数。
可以使用GCG软件包(可从worldwideweb.gcg.com获得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及缺口权重(weight)40、50、60、70或80以及长度权重1、2、3、4、5或6来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。也可以使用已纳入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989))，使用PAM120残基重量表(weightresidue table)、缺口长度补偿值(penalty)12，缺口补偿值4来确定两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。此外，可以使用已纳入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及缺口权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重为1、2、3、4、5或6来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
本文描述的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，以例如确认相关序列。这样的搜索可以使用Altschul,等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)执行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序执行，得分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序执行，得分＝50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402中所述利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov。
核酸可以存在于全细胞中、存在于细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术[包含碱性/SDS处理、CsCl显带(banding)、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他方法]从其他细胞组分或其他污染物，例如其他细胞核酸(例如，染色体的其他部分)或蛋白质中纯化时，核酸被“分离”或“基本上纯化”。参见F.Ausubel,等人,ed.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and WileyInterscience,New York(1987)。
可以根据标准技术使核酸(如cDNA)突变以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可以根据需要影响氨基酸序列。特别地，设想到了与天然的V、D、J、常数序列、切换序列和本文所述的其他这种序列基本上同源或由其衍生的DNA序列(其中“衍生的”表示序列与另一序列相同或有修饰)。
如本文所用，术语“载体”意指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以连接有额外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导它们可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，还包含其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关联病毒)，它们具有相同的功能。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意指包括非天然存在于细胞中的核酸的细胞，并且可以是其中引入了重组表达载体的细胞。应当理解，这些术语不仅意指特定的受试细胞，还意指这种细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这种后代实际上不能与亲本细胞相同，但仍包含在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。示例性宿主细胞包含但不限于原核细胞(如大肠杆菌)，或者替代地，真核细胞，例如真菌细胞(例如，酵母细胞，如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或粟酒裂殖酵母)，以及各种动物细胞，例如昆虫细胞(如Sf-9)或哺乳动物细胞(例如，HEK293F、CHO、COS-7、NIH-3T3)。
本文所用的短语“紧邻氨基酸下游”是指紧邻氨基酸末端羧基的位置。类似地，短语“紧邻氨基酸的上游”是指紧邻氨基酸的末端胺基的位置。因此，本文所用的短语“***位点的两个氨基酸之间”是指在两个相邻氨基酸之间***异源部分(例如，半衰期延长的部分)的位置。
本文所用的“治疗”或“处理”是指例如疾病或病症严重程度的降低；病程持续时间的缩短；与疾病或病症有关联的一种或多种症状的改善或消除；为患有疾病或病症的受试者提供有益效果，而不必治愈该疾病或病症。
如本文所用，“施用”是指使用本领域技术人员已知的任何各种方法和递送系统将包括治疗剂的组合物物理引入受试者。本文描述的肽的不同施用途径包含静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、脊柱或其他肠胃外(例如通过注射或输注)施用途径。本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射施用，包含但不限于静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、鞘内、***内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注、以及体内电穿孔。替代地，本文所述的肽可以经由非肠胃外途径施用，例如经由局部、表皮或粘膜途径施用，例如，经由鼻内、口服、***、直肠、舌下或局部途径施用。还可以例如，一次、多次和/或在一个或多个延长的时段内执行施用。
“疫苗”意指用于刺激受试者中的特异性免疫应答(或免疫原性应答)的组合物。在一些实施方案中，免疫原性应答是保护性的或提供保护性免疫。例如，在致病生物的情况下，疫苗使受试者能够更好地抵抗疫苗针对的生物体的感染或抵抗由该生物体导致的疾病恶化。替代地，在癌症的情况下，疫苗加强了受试者对已恶化的癌症的天然防御。这些类型的疫苗还可以防止当前癌症的进一步进展，防止所治疗的癌症的复发和/或消除未被先前治疗杀死的癌细胞。
如本文所用，在向受试者施用疗法的背景下，术语“有效量”是指实现期望的预防或治疗效果的疗法的量。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。受试者可以是动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如非灵长类动物(如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(如猴或人)，最优选地是人。在某些实施方案中，这种术语是指非人类动物(例如，非人类动物，如猪、马、牛、猫或狗)。在一些实施方案中，这种术语是指宠物或农场动物。在具体的实施方案中，这种术语指人类。
如本文所用，术语“ug”和“uM”分别与“μg”和“μΜ”互换使用。
在以下小节中更详细地描述了本文描述的各个方面。
b.肽
本公开还确认了强结合保守的蛇毒液组分并中和毒液毒性的噬菌体表达的肽。在一些实施方案中，本文公开了强结合保守的蛇毒液组分的肽。在一些实施方案中，本文公开了中和毒液毒性的肽。在一些实施方案中，本文公开了强结合保守的蛇毒液组分并中和毒液毒性的肽。
与例如限于抗原靶向的基于抗体的抗毒液素疗法不同，本公开的噬菌体展示为选择噬菌体表达的肽提供了强有力的工具，该噬菌体表达的肽以高特异性和亲和力结合许多不同的靶。这些噬菌体表达的肽是短的，通常是7-12聚体片段，其结构可以是线性或环状的。示例包含环状7聚体和线性12聚体肽。
在一个实施方案中，本文公开了线性7聚体。在一个实施方案中，本文公开了线性8聚体。在一个实施方案中，本文公开了线性9聚体。在一个实施方案中，本文公开了线性10聚体。在一个实施方案中，本文公开了线性11聚体。在一个实施方案中，本文公开了线性12聚体。
在一个实施方案中，本文公开了环状7聚体。在一个实施方案中，本文公开了环状8聚体。在一个实施方案中，本文公开了环状9聚体。在一个实施方案中，本文公开了环状10聚体。在一个实施方案中，本文公开了环状11聚体。在一个实施方案中，本文公开了环状12聚体。
金属、碳水化合物和蛋白质是动物毒液的主要组分。本文公开的肽可以靶向许多大分子。在一些实施方案中，本文公开了靶向金属、碳水化合物和蛋白质的肽。在一些实施方案中，本文公开了靶向金属和碳水化合物的肽。在一些实施方案中，本文公开了靶向金属和蛋白质的肽。在一些实施方案中，本文公开了靶向碳水化合物和蛋白质的肽。在一些实施方案中，本文公开的肽靶向碳水化合物。在一些实施方案中，本文公开了结合蛋白质的肽。在一个实施方案中，本文公开的肽靶向金属。
本文公开了包括选自SEQ ID NO:1-4的序列的肽。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQ ID NO:1的肽(SPLHKTM；也称为Ph.D.-C7C-6)。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQ ID NO:2的肽(SGMKKTK；也称为Ph.D.-C7C-7)。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQ ID NO:3的肽(KTTKMGL；也称为Ph.D.-C7C-9)。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQID NO:4的肽(KLIHGNGVMDEG；也称为Ph.D.-12-2或Ph.D.-12-7)。
在一些实施方案中，本文公开了SEQ ID NO:1-4的生物学活性变体。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1-4的生物活性片段和变体包括与SEQ ID NO:1-4中所示序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1-4相比，生物活性变体包含一个或多个额外的氨基酸。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1-4相比，生物活性变体包含一个或更少的氨基酸。
在一些实施方案中，本文公开的肽的生物学变体包括一个或多个突变。在一些实施方案中，突变是取代突变。在一些实施方案中，取代是不影响蛋白质折叠和/或活化的氨基酸的保守取代。保守取代的示例属于由碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬氨酸)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和蛋氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)组成的组。通常不更改比活性的氨基酸取代在本发明的领域中是已知的。最常发生的更改是Ala/Ser、Vai/IIe、Asp/Giu、Thr/Ser、Ala/Giy、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Giy、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/IIe、Leu/Val、Ala/Giu、Asp/Giy以及相反的更改。
在一些实施方案中，本文公开了SEQ ID NO:1-4的反向共有肽序列。在一个实施方案中，反向共有肽序列包括SEQ ID NO:9。在一个实施方案中，反向共有肽序列包括SEQ IDNO:10。在一个实施方案中，反向共有肽序列包括SEQ ID NO:11。在一个实施方案中，反向共有肽序列包括SEQ ID NO:12。
在本公开的另一个实施方案中，具有SEQ ID NO:1-4的反向共有序列的肽用于开发咬伤或叮刺诊断试剂盒。在下文更详细地描述试剂盒。
表1：
大多数基于抗体的溶液要么需要特殊的储存条件，要么在冻干的情况下，则需要在施用前复原；这两者都会降低它们在动物毒害经常发生的偏远和严峻条件下的实用性。本文公开了不需要特殊储存条件的肽溶液。
在一些实施方案中，本文公开的肽在室温时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在-80℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在-80℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在-70℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在-60℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在-50℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在-40℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在-30℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在-20℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在-10℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在0℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在10℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在20℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在30℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在40℃时是稳定的。在一些实施方案中，本文公开的肽在50℃时是稳定的。
在一个实施方案中，本文公开的肽包括西部棉口蝮蛇的PLA2共有肽。在一具体的实施方案中，来自p.leucostoma蛇的毒液通过Ph.D.TM-7、Ph.D.TM-12和Ph.DTM-C7C噬菌体展示肽文库(New England
c.肽生产
本公开的一个实施方案的M13噬菌体可以在缺乏常见的致病性相关序列的专门大肠杆菌K12ER2738中廉价且安全地繁殖。所得产物可以比抗血清更有效地纯化。
使用本公开的方法开发特定的抗毒液素配制品快速且简单，足以允许定制以满足特定需要。一个选择周期将需要一周，并且可以在大约2至6个月内完成候选噬菌体的整个选择。因为根据本公开的基于噬菌体的解毒剂的合成可以利用大肠杆菌的非致病性菌株，而不需要大型或危险的动物，所以避免了将这种动物保持在实验室环境中的风险和负担。
基于西部棉口蝮毒液中的共有PLA2蛋白质序列的肽靶设计因此为噬菌体展示文库的亲和力分配提供了有用的靶。使用ELISA测试和毒液组分(PLA2或蛋白酶)活性测定的肽亲和力测定可用于评估基于展示噬菌体的抗毒液素的有效性。表位靶向的二氧化硅方法(in silica approach)允许蛋白质家族或超家族的普遍靶向，例如在特定属中靶向PLA2。PLA2活性区域在蝮蛇(A.piscovorus)物种中具有～95％的同源性。靶序列的随机靶向产生几种表达可变基序的结合物，该可变基序通过不同机制抑制活性，从而产生更强的抑制效果。当扩展到北美常见的毒蛇时，目前PLA2构建体的同源性在西部菱纹背响尾蛇(Crotalusatrox)中降至56％。重新定义靶序列以包含北美五种最常见的毒蛇的同源区域，可以将共有序列提高到97％。进一步定义靶肽以模拟肽家族的这些同源区域中的保守活性和金属结合位点，从而提供了开发通用抗毒液素的改进方法。它们的结构和功能关系已经普遍为人所知。然而，由于基于抗体的抗毒液生产方法的局限性，这种知识并未促进通用抗毒液素的开发。然而，本公开的噬菌体展示方法可以利用使用BlastX算法的相似性搜索的结果来实现。然后毒液序列可以分类并用作靶肽以开发基于噬菌体的抗毒液。因此，可以开发通用抗毒液素，其靶向任何爬行动物、蜘蛛、水母或其他有毒动物的共有序列。
在一些实施方案中，本文公开了产生本文公开的肽的方法。该方法包括基于西部棉口蝮毒液中的共有PLA2蛋白质序列确认肽靶，以提供用于噬菌体展示淘选的靶；重新定义靶序列以包含北美至少五种常见毒蛇的同源区域；以及通过靶向保守的活性位点重新定义靶肽以模拟肽家族的同源区域。
示例性的北美蛇包含但不限于东部菱纹背响尾蛇(响尾蛇(Crotalusadamanteus)；西部菱纹背响尾蛇(Crotalus atrox)；西部珊瑚蛇(Micruroideseuryxanthus)；东部珊瑚蛇(Micrurus fulvius)；铜头蛇(Agkistrodon contortrix)；棉口蝮；黄腹海蛇(Pelamis platura)；木纹响尾蛇(Crotalus horridus)；莫哈韦响尾蛇(Crotalus scutulatus)；以及黑色响尾蛇(Sistrurus catenatus)。
d.核苷酸
在某些方面，本文提供了多核苷酸，其包括编码本文所述的肽的核苷酸序列，该肽结合保守的蛇毒液组分并中和毒液毒性。在一些实施方案中，本文公开了多核苷酸。
本文公开了包括选自SEQ ID NO:5-8的序列的多核苷酸。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQ ID NO:5的多核苷酸。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQ ID NO:6的多核苷酸。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQ ID NO:7的多核苷酸。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQ ID NO:8的多核苷酸。
本文还公开了包括选自SEQ ID NO:13-16的序列的多核苷酸。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQ ID NO:13的多核苷酸。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQ IDNO:14的多核苷酸。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQ ID NO:15的多核苷酸。在一个实施方案中，本文公开了包括SEQ ID NO:16的多核苷酸
本文提供了包括编码本文提供的任何肽的核苷酸序列的多核苷酸，以及包括这种多核苷酸序列的载体，例如用于在宿主细胞中有效表达它们的表达载体，例如M13细菌噬菌体。
如本文所用，“分离的”多核苷酸或核酸分子是与核酸分子的天然来源(例如，小鼠或人类)中存在的其他核酸分子分开的多核苷酸或核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。例如，术语“基本上不含”包含多核苷酸或核酸分子的制剂(preparation)具有少于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特别是少于约10％)的其他材料，例如细胞材料、培养基、其他核酸分子、化学前体和/或其他化学品。在一具体的实施方案中，分离或纯化编码本文所述的肽的核酸分子。
本文还提供了编码包括SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:13-16的肽的多核苷酸，该多核苷酸例如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列替换和消除mRNA不稳定性元件进行优化。通过引入密码子改变和/或消除mRNA中的抑制区来生成编码本文公开的肽的优化的核酸以用于重组表达的方法可以通过相应地调整例如美国专利号5,965,726；6,174,666；6,291,664；6,414,132；以及6,794,498中所述的优化方法来实现。例如，可以使RNA内的潜在剪接位点和不稳定性元件(例如，富含A/T或A/U的元件)突变，而不更改由核酸序列编码的氨基酸，以增加用于重组表达的RNA的稳定性。这些更改利用遗传密码的简并性，例如，针对相同的氨基酸使用替代密码子。在一些实施方案中，可能需要更改一个或多个密码子以编码保守突变，例如具有与原始氨基酸相似的化学结构和性质和/或功能的相似氨基酸。这种方法可以使得，相对于由未优化的多核苷酸编码的本文公开的肽的表达，本文公开的肽的表达增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多。
在某些实施方案中，编码本文公开的肽的优化的多核苷酸序列可以与编码本文所述的肽的未优化的多核苷酸序列的反义(例如，互补)多核苷酸杂交。
可以通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸，并确定多核苷酸的核苷酸序列。编码本文所述的肽的核苷酸序列可以使用本领域熟知的方法确定，即，已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以生成编码肽的核酸的方式进行组装。编码本文公开的肽的这种多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装[例如，如Kutmeier G等人,(1994),BioTechniques 17:242-6)中所述]，其简要地涉及含有编码肽的序列部分的重叠寡核苷酸的合成、那些寡核苷酸的退火和连接，然后通过PCR对连接的寡核苷酸的扩增。
替代地，可以使用本领域熟知的方法(例如，PCR和其他分子克隆方法)从合适来源(例如杂交瘤)的核酸生成编码本文所述的肽的多核苷酸。例如，使用可与已知序列的3'和5'端杂交的合成引物的PCR扩增可以使用从产生感兴趣的肽的杂交瘤细胞获得的基因组DNA执行。扩增的核酸可以被克隆到载体中以在宿主细胞中表达并进一步克隆。
编码本文公开的肽的核酸可以化学合成或通过PCR扩增或通过克隆从合适的来源获得，该PCR扩增使用可与序列的3'和5'端杂交的合成引物而该克隆使用特异于特定基因序列的寡核苷酸探针以确认例如来自编码本文公开的肽的cDNA文库的cDNA克隆物。然后可以使用本领域熟知的任何方法将通过PCR生成的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体中。
可以使用常规工序(例如，通过使用寡核苷酸探针)容易地分离和测序本文所述的DNA编码肽。
还提供了在高度严格性、中等或较低严格性杂交条件下与编码本文所述的肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。杂交条件已在本领域中描述，并且是本领域技术人员已知的。例如，在严格条件下的杂交可以涉及于约45℃与6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中的过滤器结合的DNA杂交，然后于约50-65℃在0.2xSSC/0.1％SDS中进行一次或多次清洗；在高度严格条件下的杂交可以涉及于约45℃在6xSSC中与过滤器结合的核酸杂交，然后于约68℃在0.1xSSC/0.2％SDS中进行一次或多次清洗。在其他严格杂交条件下的杂交是本领域技术人员已知的，并且已经描述过，参见，例如Ausubel FM等人,eds.,(1989)Current Protocolsin Molecular Biology,Vol.I,Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,New York,页码6.3.1-6.3.6和2.10.3。
e.细胞和载体
在某些方面，本文提供了表达(如重组表达)特异性结合PLA2和相关的多核苷酸的本文所述的肽(或其抗原结合片段)的细胞(如宿主细胞)，以及表达载体。本文提供了载体(如表达载体)，其包括多核苷酸，该多核苷酸包括编码本文公开的肽或片段的核苷酸序列，以在宿主细胞中重组表达。本文还提供了包括用于重组表达本文所述的肽的这种载体的宿主细胞。在一特定方面，本文提供了用于生产本文所述的肽的方法，包括从宿主细胞中表达这种肽。
在一些实施方案中，M13噬菌体表达本文公开的肽。M13噬菌体用作递送载具以将各种结合基序转运至靶。在一些实施方案中，对噬菌体尾部蛋白质的遗传修饰允许表达具有可变序列、长度和组成的特有肽。表达的肽可以结合特定的表位，从而形成用于确认结合配偶体的高通量系统的基础。在一些实施方案中，M13噬菌体表达选自SEQ ID NO:1-4的肽。
在一些实施方案中，M13噬菌体表达包括SEQ ID NO:1的肽。在一些实施方案中，M13噬菌体表达包括SEQ ID NO:2的肽。在一些实施方案中，M13噬菌体表达包括SEQ ID NO:3的肽。在一些实施方案中，M13噬菌体表达包括SEQ ID NO:4的肽。
在一些实施方案中，M13噬菌体表达包括SEQ ID NO:13的肽。在一些实施方案中，M13噬菌体表达包括SEQ ID NO:14的肽。在一些实施方案中，M13噬菌体表达包括SEQ IDNO:15的肽。在一些实施方案中，M13噬菌体表达包括SEQ ID NO:16的肽。
在一些实施方案中，M13噬菌体具有长的血浆半衰期(t 1/2＝4.5小时)。
本文公开的M13噬菌体在3-11的pH范围内是稳定的。在一些实施方案中，M13噬菌体的pH为3。在一些实施方案中，M13噬菌体的pH为4。在一些实施方案中，M13噬菌体的pH为5。在一些实施方案中，M13噬菌体的pH为6。在一些实施方案中，M13噬菌体的pH为7。在一些实施方案中，M13噬菌体的pH为7.4。在一些实施方案中，M13噬菌体的pH为8。在一些实施方案中，M13噬菌体的pH为9。在一些实施方案中，M13噬菌体的pH为10。在一些实施方案中，M13噬菌体的pH为11。
本文公开的M13噬菌体也耐受低于80℃的温度。
本文公开的M13噬菌体在没有任何特殊的储存条件下在室温下在培养基中具有超过6个月的半衰期。
一旦获得了编码本文所述的肽的多核苷酸，就可以使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术生产用于产生肽分子的载体。
因此，本文描述了用于通过表达含有蛋白质编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域技术人员熟知的方法构建含有蛋白质编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包含，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。还提供了可复制载体，其包括可操作地连接启动子的编码本文所述的蛋白质的核苷酸序列。
可以通过常规技术将表达载体转移至细胞(如宿主细胞)，然后可以通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的蛋白质。因此，本文提供了含有编码本文所述的蛋白质或其片段的多核苷酸的宿主细胞，该多核苷酸可操作地连接启动子以在宿主细胞中表达这种序列。
可以利用多种宿主表达载体系统来表达本文所述的肽。这种宿主表达系统表示载具，可以通过该载具产生并随后纯化感兴趣的编码序列，但也表示细胞，该细胞可以在用合适的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达本文所述的肽。这些包含但不限于用含有肽编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，例如细菌(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如毕赤酵母)；用含有肽编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有肽编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如，绿藻，如莱茵衣藻)；或携带重组表达构建体的哺乳动物细胞系统[例如，COS(如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa，以及NIH3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10细胞]，该重组表达构建体含有衍生自哺乳动物细胞的基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。在一个特定的实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌K12ER2738。
在一些实施方案中，用于表达本文所述的肽的细胞是人类细胞，例如人类细胞系。在一具体的实施方案中，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。在一特定的实施方案中，是细菌细胞例如大肠杆菌或真核细胞(如哺乳动物细胞)。
在细菌系统中，可以使用许多表达载体。例如，当要生产大量这种肽时，为了生成肽分子的药物组合物，可能需要引导易于纯化的高水平蛋白质产物表达的载体。这种载体包含但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruether U&Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2:1791-1794)，其中肽编码序列可以单独连接到具有lac Z编码区的框中的载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye S&Inouye M(1985)Nuc Acids Res 13:3101-3109；Van HeekeG&Schuster SM(1989)J Biol Chem 24:5503-5509)；等等。例如，pGEX载体也可用于表达外源多肽作为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。
在昆虫系统中，例如，苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)可用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾细胞中生长。肽编码序列可以被单独克隆到病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并被置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将感兴趣的肽编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因***腺病毒基因组中。***病毒基因组的非必需区域(如区域E1或E3)将产生可存活且能够在受感染的宿主中表达肽分子的重组病毒(例如，参见Logan J&Shenk T(1984)PNAS 81(12):3655-9)。为了有效翻译所***的肽编码序列，也可能需要特定的起始信号。这些信号包含ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相，以确保整个***物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以有多种天然和合成的来源。通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等可以增强表达效率(参见，例如，Bitter G等人,(1987)Methods Enzymol.153:516-544)。
此外，可以选择宿主细胞株，其调节所***的序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征和特定机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用真核宿主细胞，其具有用于基因产物的初级转录物合理加工、糖基化和磷酸化的细胞机制。这种哺乳动物宿主细胞包含但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不是内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、COS(如COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。
在一具体的实施方案中，本文所述的肽具有降低的岩藻糖含量或无岩藻糖含量。可以使用本领域技术人员已知的技术生产这种肽。例如，可以在缺少或缺乏岩藻糖基化能力的细胞中表达该肽。在一特定的示例中，具有敲除α1,6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因的细胞系可用于产生具有降低的岩藻糖含量的肽。
为了重组蛋白的长期高收率生产，可以生成稳定的表达细胞。
在某些方面，不是使用含有病毒复制起点的表达载体，而是可以用DNA和可选择的标志物来转化宿主细胞，该DNA通过适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制。在引入外源DNA/多核苷酸后，可以允许工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换为选择性培养基。重组质粒中的可选择的标志物赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并生长以形成病灶，而该病灶又可以克隆并扩增到细胞系中。该方法可有利地用于工程化表达本文所述的肽的细胞系。这种工程化细胞系可特别用于筛选和评价与肽分子直接或间接相互作用的组合物。
可以使用许多选择系统，包含但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人,(1977)Cell 11(1):223-32)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska EH&SzybalskiW(1962)PNAS 48(12):2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy I等人.,(1980)Cell22(3):817-23)基因可分别用于tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞。此外，抗代谢物抗性可用作以下基因的选择基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler M等人.,(1980)PNAS 77(6):3567-70；O’Hare K等人,(1981)PNAS 78:1527-31)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan RC&Berg P(1981)PNAS 78(4):2072-6)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Wu GY&Wu CH(1991)Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev P(1993)Ann Rev PharmacolToxicol 32:573-596；Mulligan RC(1993)Science 260:926-932；以及Morgan RA&Anderson WF(1993)Ann Rev Biochem 62:191-217；Nabel GJ&Felgner PL(1993)TrendsBiotechnol 11(5):211-5)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre RF等人,(1984)Gene 30(1-3):147-56)。重组DNA技术领域中通常已知的方法可以常规应用于选择所需的重组克隆物，并且这种方法描述于例如Ausubel FM等人,(eds.),Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler M,Gene Transfer andExpression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)中；以及Dracopoli NC等人,(eds.),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994)；Colbère-Garapin F等人.,(1981)J Mol Biol 150:1-14的第12和13章中，其全部内容通过引用并入本文。
可以通过载体扩增来增加肽的表达水平[参见Bebbington CR&Hentschel CCG,The use of vectors based on gene amplification for the expression of clonedgenes in mammalian cells in DNA cloning,Vol.3(Academic Press,New York,1987)中的回顾]。当表达肽的载体系统中的标志物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加基因标志物的拷贝数。由于扩增的区域与肽基因相关，肽的产量也将增加(Crouse GF等人,(1983)Mol Cell Biol 3:257-66)。
一旦通过重组表达生产本文所述的肽，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换；亲和力，特别是通过针对蛋白A后的特异性抗原的亲和力；以及上浆柱色谱法)、离心、差别溶解法(differentialsolubility)或通过任何其他的蛋白质纯化标准技术纯化。此外，本文描述的肽可以与本文描述的异源多肽序列或本领域已知的其他异源多肽序列融合以促进纯化。
在具体的实施方案中，分离或纯化本文描述的肽。通常，分离的肽是基本上不含具有与分离的肽不同的抗原特异性的其他肽的肽。例如，在一特定的实施方案中，本文所述的肽的制剂基本上不含细胞物质和/或化学前体。术语“基本上不含细胞物质”包含这样的肽制剂，其中该肽与从中分离出肽或重组产生肽的细胞的细胞组分分开。因此，基本上不含细胞物质的肽包含具有少于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以干重计)的异源蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白质”)和/或肽的变体的肽制剂。当重组生产肽时，它通常也基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂的体积的小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当通过化学合成生产肽时，它通常基本上不含化学前体或其他化学品，即，它与蛋白质合成中涉及的化学前体或其他化学物质分开。因此，肽的这种制剂具有少于约30％，20％，10％或5％(以干重计)的化学前体或除感兴趣的肽之外的化合物。在一具体的实施方案中，分离或纯化本文所述的肽。
f.组合物和药物组合物
本文公开了包括包含选自SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:9-12的序列的肽的组合物。本文还公开了包括包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12或其任何组合的肽的组合物。
在一个实施方案中，本文公开了包括包含SEQ ID NO:1的肽的组合物。在一个实施方案中，本文公开了包括包含SEQ ID NO:2的肽的组合物。在一个实施方案中，本文公开了包括包含SEQ ID NO:3的肽的组合物。在一个实施方案中，本文公开了包括包含SEQ ID NO:4的肽的组合物。在一个实施方案中，本文公开了包括包含SEQ ID NO:9的肽的组合物。在一个实施方案中，本文公开了包括包含SEQ ID NO:10的肽的组合物。在一个实施方案中，本文公开了包括包含SEQ ID NO:11的肽的组合物。在一个实施方案中，本文公开了包括包含SEQID NO:12的肽的组合物。
在一些实施方案中，本文公开的肽与一系列替代性递送系统(如纳米颗粒)一起配制。在一些实施方案中，提供了包括纳米颗粒和本文公开的肽的组合物。在一些实施方案中，本公开提供一种水性脂质体纳米颗粒组合物，其包括脂质体纳米颗粒的水性分散体和本文公开的肽。在一些实施方案中，纳米颗粒包封本文公开的肽。在一些实施方案中，将本文公开的肽添加至预形成的脂质体组合物中。在其他实施方案中，本文公开的肽在脂质体的形成期间掺入脂质体中。
本文还提供了包括本文所述的肽的组合物，该肽在生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂中具有所需的纯度(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)MackPublishing Co.,Easton,PA)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者来说是无毒的，并且包含：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚醇、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl paraben)，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一具体的实施方案中，药物组合物包括含于药学上可接受的载剂的本文所述的肽和任选的一种或多种额外的预防剂或治疗剂。在一具体的实施方案中，药物组合物包括含于药学上可接受的载剂的有效量的本文所述的肽和任选的一种或多种额外的预防性治疗剂。在一些实施方案中，肽是药物组合物中包含的唯一活性成分。本文所述的药物组合物可用于强结合保守的蛇毒液组分并中和毒液毒性。
用于肠胃外制剂的药学上可接受的载剂包含水性溶媒(aqueous vehicle)、非水性溶媒、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、螯合剂或络合剂和其他药学上可接受的物质。水性溶媒的示例包含氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖和乳酸林格注射液。非水性肠胃外溶媒包含植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑制细菌浓度或抑制真菌浓度的抗微生物剂加入包装在多剂量容器中的肠胃外制剂中，该多剂量容器包含酚类或甲酚类、汞制剂、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包含氯化钠和右旋糖。缓冲液包含磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包含硫酸氢钠。局部麻醉剂包含盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包含羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包含聚山梨醇酯80(
药物组合物可以配制成以任何途径施用至受试者。施用途径的特定示例包含鼻内、口服、肺部、透皮、皮内和肠胃外。本文还设想到了以皮下、肌肉内或静脉内注射为特征的肠胃外施用。注射剂可以以常规形式制备为液体溶液或悬浮液、适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或者制备为乳液。注射剂、溶液和乳液还含有一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，如果需要，待施用的药物组合物还可含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲液、稳定剂、溶解度增强剂和其他这种药剂，举例来说，如乙酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
包括本文公开的肽的组合物的肠胃外施用的制剂包含注射用无菌溶液；无菌干燥可溶性产品，例如冻干粉末，其仅在使用前与溶剂组合，包含皮下注射片剂；注射用无菌悬浮液；无菌干燥不溶性产品，其仅在使用前与溶媒组合；以及无菌乳液。溶液可以是水性溶液或非水性溶液。
如果静脉内施用，合适的载剂包含生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。
所描述的制备包括包含本文公开的肽的组合物的局部混合物用于局部和全身施用。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等，并且可以配制成乳膏、凝胶、软膏、乳液、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫、气溶胶、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂或适于局部施用的任何其他制剂。
包括本文公开的肽的组合物可以配制成用于部分或局部应用，例如以凝胶、乳膏和乳液的形式局部应用于皮肤和粘膜(例如眼睛内)，以及用于应用于眼睛或用于脑池内或脊柱内应用。设想到了局部施用以用于透皮递送，还用于施用至眼睛或粘膜，或用于吸入疗法。也可以施用单独的肽或肽与其他药学上可接受的赋形剂组合的鼻溶液。
包含离子电渗疗法和电泳装置的透皮贴剂是本领域技术人员熟知的，并且可用于施用本文公开的肽。例如，这种贴剂公开于美国专利号6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957中，每个所述美国专利通过引用整体并入。
在某些实施方案中，包括本文所述的肽的药物组合物是冻干粉末，其可以复原以作为溶液、乳液和其他混合物施用。它也可以复原并配制成固体或凝胶。通过将本文所述的肽或其药学上可接受的衍生物溶解在合适的溶剂中来制备冻干粉末。在一些实施方案中，冻干粉末是无菌的。溶剂可以含有改善粉末或由粉末制备的复原溶液的稳定性或其他药理学组分的赋形剂。可以使用的赋形剂包含但不限于右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适的试剂。溶剂还可含有缓冲液，例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其他这种缓冲液，在一个实施方案中是pH约为中性的缓冲液。随后对溶液进行无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，得到所需的配制品。在一个实施方案中，将所得溶液分配到小瓶中用于冻干。每个小瓶将含有单剂量或多剂量的化合物。冻干粉末可以在适当的条件(例如约4℃至室温)下储存。
用注射用水复原该冻干粉末提供了用于肠胃外施用的配制品。为了复原，将冻干粉末加入无菌水或其他合适的载剂中。精确的量取决于所选化合物。这样的量可以凭经验确定。
本文描述的肽和本文提供的其他组合物还可以配制成靶向待治疗的受试者的身体的特定组织、受体或其他区域。许多这样的靶向方法是本领域技术人员所熟知的。本文设想到了用于本组合物的所有这些靶向方法。对于靶向方法的非限制性示例，参见，例如，美国专利号6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874，每个所述美国专利通过引用整体并入。
用于体内施用的组合物可以是无菌的。这可以通过例如无菌过滤膜过滤而容易地完成。
g.用途和方法
本公开涉及一种用于生成通用抗毒液素的改进方法。根据该改进方法，噬菌体展示技术提供了用于选择噬菌体表达的肽的替代工具，该肽可以以高特异性和亲和力结合许多不同的毒液靶。
与现有技术中已知的任何抗毒液素生产方法相比，本文公开的新方法产生的抗毒液素具有更低的生产成本、更短的合成时间和更少的不良反应。另外，通过本方法生产的抗毒液素在环境温度下以液体形式长期储存是稳定的，这是先前认为对于抗毒液素来说不可能的特征。
h.检测&诊断用途
评价了它们的氨基酸序列、抑制作用和跨物种反应性。
除了通用抗毒液素之外，这种新方法不需要辅助噬菌体、载体再克隆和额外的单链片段可变(scFv)抗体纯化步骤。
本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物可用于使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法测定生物样本中的毒性水平，该免疫组织学方法包含免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀或Western印迹。合适的抗体测定标记是本领域已知的并包含酶标记，例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标签，如鲁米诺；以及荧光标记，如荧光素和罗丹明，以及生物素。这种标记可用于标记本文公开的肽或包括肽的组合物。
对可检测水平的毒液的测定意在包含直接地(例如，通过确定或估算绝对毒液水平)或相对地(例如，通过与第二生物样本中的疾病相关联毒液水平比较)定性或定量地测量或估算第一生物样本中的毒液水平。第一生物样本中的毒液水平可以测量或估算并与标准毒液水平进行比较，该标准取自从未暴露于有毒咬伤的个体获得的第二生物样本或通过来自没有暴露于毒液的个体群体的水平平均化而确定。如本领域所理解的，一旦“标准”毒液水平已知，它可以重复用作比较标准。
如本文所用，术语“生物样本”是指从受试者、细胞系、组织，或潜在地表达本文公开的肽的其他细胞来源获得的任何生物样本。用于从动物(例如人类)获得组织活检和体液的方法是本领域熟知的。生物样本包含外周单核血细胞。
本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物可用于预后、诊断、监测和筛选应用，包含本领域技术人员熟知且视为标准以及基于本说明书的体外和体内应用。用于免疫系统状态和/或免疫应答的体外评估和评价的预后、诊断、监测和筛选测定和试剂盒可用于预测、诊断和监测以评价患者样本，包含已知或已怀疑暴露于有毒的叮咬的那些，或进行关于预期或期望的免疫系统应答或抗原应答的评价。
在一个实施方案中，本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物可用于活组织检查样本的免疫组织化学中。
在另一个实施方案中，本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物可用于检测PLA2的水平。本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物可以携带可检测或功能性标记。当使用荧光标记时，目前可用的显微镜检查和荧光激活细胞分选分析(FACS)或本领域已知的两种方法工序的组合可以用来确认和定量特异性结合成员。本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物可以携带荧光标记。示例性荧光标记包含例如反应性和共轭探针，例如氨基香豆素、荧光素和德克萨斯红、Alexa Fluor染料、Cy染料和DyLight染料。本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物可以携带放射性标记，例如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、90Y、99Tc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、211At、213Bi、225Ac和186Re。当使用放射性标记时，本领域已知的目前可用的计数方法可以用来确认和定量本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物与PLA2的特异性结合。在标记是酶的情况下，可以通过如本领域已知的任何目前利用的比色、分光光度、荧光分光光度、电流分析或气体分析技术来完成检测。这可以通过在允许在本文公开的肽或包括公开的肽的组合物和PLA2之间形成复合物的条件下使样本或对照样本与本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物接触来实现。在样本和对照物中检测并比较本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物和PLA2之间形成的任何复合物。本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物还可用于经由免疫亲和纯化来纯化PLA2。
本文还包含测定系统，其可以以测试试剂盒的形式制备成用于定量分析例如PLA2的存在程度。系统或测试试剂盒可以包括标记的组分，例如标记的抗体，以及一种或多种额外的免疫化学试剂。关于试剂盒的更多信息，参见例如下文的(h)。
i.治疗用途和方法
在一些实施方案中，肽结合蛇毒液并中和毒液毒性。在一些实施方案中，肽结合PLA2并中和毒液毒性。M13噬菌体也可以从身体中清除而没有不良反应，在使用基于抗体的抗血清疗法时会发生不良反应(如血清病)。可以实施本公开的方法以快速且容易地定制设计一种抗毒液素，该抗毒液素对任何特定分支(subset)的有毒动物通用，并且在基于抗体的疗法不能耐受的条件下是稳定的。
本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物可以通过多种途径递送至受试者。在一些实施方案中，肽或组合物经由肠胃外、鼻内、气管内、口服、皮内、局部、肌肉内、腹膜内、透皮、静脉内、肿瘤内、结膜和皮下途径递送。也可以，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及将雾化剂用作喷雾剂的制剂而采用肺部施用。
将有效治疗和/或预防病症的本文公开的肽或包括本文公开的肽的组合物的量将取决于疾病的性质，并且可以通过标准临床技术确定。
组合物中采用的精确剂量还将取决于施用途径，以及由其引起的感染或疾病的严重性，并且应根据从业医师的判断和每个受试者的情况来决定。例如，有效剂量也可以根据施用方式、靶点、患者的生理状态(包含年龄、体重和健康状况)、患者是人类还是动物、施用的其他药物，或者治疗是预防性的还是治疗性的而变化。通常，患者是人类，但也可以治疗包含转基因哺乳动物在内的非人类哺乳动物。治疗剂量经最佳滴定以优化安全性和功效。
在某些实施方案中，采用体外测定来帮助确认最佳剂量范围。可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线推知有效剂量。
对于利用本文公开的肽的被动免疫，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至15mg/kg患者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重、10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内，或者换言之，对于70kg的患者，分别是70mg或700mg或在70-700mg范围内。在一些实施方案中，施用至患者的剂量为约1mg/kg至约20mg/kg患者体重。
示例性治疗方案需要施用一次或以重复剂量施用。单剂量之间的间隔可以是每小时、每天、每周、每月、每3个月、每6个月或每年。
j.试剂盒
在一些实施方案中，本文提供了包括一种或多种本文公开的肽的试剂盒。在一具体的实施方案中，本文提供一种药物包或试剂盒，其包括一个或多个容器，所述容器填充有本文所述的蛋白质、核酸或药物组合物中的一种或多种成分，例如本文提供的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，试剂盒含有本文所述的药物组合物和任何预防或治疗剂，例如本文所述的那些。任选地与这种容器随附的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的格式的公告(notice)，该公告反映了该机构批准制造、使用或销售以用于人类施用。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于确认有毒动物咬伤的类型和严重程度的诊断试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括(a)多种肽，每种肽靶向多种动物毒液之一特有的序列；(b)多种标记分子，每种标记分子与所述多种肽中相应的一种缀合；以及(c)测定，所述测定配置成检测所述标记分子，从而显示与其各自的靶结合的肽。
在一些实施方案中，本公开还提供了一种用于确认有毒动物咬伤的类型和严重程度的诊断试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括多种肽。在一些实施方案中，所述试剂盒包括多种标记分子。在一些实施方案中，所述试剂盒中的每种肽靶向特有物种的毒液的序列。在一些实施方案中，所述试剂盒中的一种或多种肽靶向相同物种的毒液特有的序列。
在一些实施方案中，所述试剂盒中测试的样本是血液。在一个特定的实施方案中，试剂盒中测试的样本是人类血液。在一些实施方案中，所述样本被分离并与所述试剂盒中的一种或多种肽接触。在一些实施方案中，所述试剂盒中的所述肽被标记。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含测定，所述测定配置成检测所述标记分子，从而显示与所述血液中其各自的靶结合的肽。因此，在一些实施方案中，所述试剂盒可以检测哪些肽与靶结合，以及结合的程度，从而确认在所述血液中发现了什么动物物种毒液以及咬伤的严重程度。
本文还提供了可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括含于一个或多个容器中的本文所述的蛋白质，优选纯化的蛋白质。在一个实施方案中，试剂盒包括含于一个或多个容器中的包括本文所述的蛋白质的组合物。在一具体的实施方案中，本文所述的试剂盒含有基本上分离的蛋白质作为对照物。在另一具体的实施方案中，本文所述的试剂盒进一步包括不与通用毒液抗原反应的对照抗体。在另一具体的实施方案中，本文描述的试剂盒含有用于检测蛋白质或包括蛋白质的组合物与通用毒液抗原结合的一个或多个元件(例如，所述蛋白质可以与可检测的底物缀合，所述底物例如荧光化合物、酶促底物、放射性化合物或发光化合物；或者识别本文公开的蛋白质的抗体可以与可检测的底物缀合)。在具体的实施方案中，本文提供的试剂盒可以包含本文公开的重组生产的或化学合成的蛋白质。所述试剂盒中提供的所述通用毒液抗原也可以附着在固体支撑物上。在一更具体的实施方案中，上述试剂盒的检测装置包含附着有通用毒液抗原的固体支撑物。这种试剂盒还可以包含未附着的报告基因标记的抗人抗体或抗小鼠/大鼠抗体。在该实施方案中，可以通过所述报告基因标记的抗体的结合来检测蛋白质与毒液的结合。
以说明的方式而非限制的方式提供以下实施例。
实施例
实施例1.
检索西部棉口蝮(A.p.leucostoma)PLA2蛋白质序列信息，以及使用基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.,Lipman,D.J.(1990)Basic Local Alignment Search Tool.J.Mol.Bioi.215:403-410)对序列进行其活性位点和与其他PLA2蛋白的同源性的筛选。设计保守的57个氨基酸共有肽，以及用BLAST比较以确定北美相关的五种主要毒蛇类物种之间的序列同源性，其中相似性≥95％。
执行PLA2 3D晶体结构分析以观察靶定的共有序列氨基酸的溶剂可及性(IPPA-www.RCSB.org Protein Data Bank notation)。
使用9-芴基甲氧基羰基/叔-丁基固相肽合成方法合成该57个氨基酸共有肽作为靶肽，其中纯度为～98％。然后通过定制肽合成服务将其作为乙酸盐形式沉淀以用于淘选目的。
利用增强的淘选方法代替由Ph.D.噬菌体展示库(Ph.D.Phage Display Library)手册描述的标准96孔板淘选系统。毛细管的玻璃表面与靶肽交联，以将模拟的活性位点呈现给噬菌体展示文库。使用可裂解的交联剂Sulfo-LC-SPDP[磺基琥珀酰亚胺基6-(3'-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)己酸酯]的交联工序将靶肽结合到氨基甲硅烷基化的(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)玻璃毛细管上。10μ容量的Microcaps毛细管(21-170°F)用高效液相色谱级丙酮清洗并用氨基硅烷试剂处理。用10mM Sulfo-LC-SPDP直接改性甲硅烷基化玻璃毛细管。将玻璃交联毛细管在室温(RT)下孵育1小时，然后用偶联缓冲液洗涤两次。SPDP改性的毛细管用含于水的10mg/ml靶PLA2肽填充，并于4℃孵育过夜以完成交联反应。使用10μl毛细管噬菌体展示选择系统的优势显而易见，因为它最大限度地减少了每次淘选工序(下一节)所需的危险化学品、浓缩肽和噬菌体库的所需体积。
然后使用源自Ph.D.噬菌体展示库的说明手册的改进淘选方法针对靶蛋白淘选噬菌体。即，使用多通道Heidolph蠕动泵和Marprene(0.5mm孔径1.6mm壁)管道制备含有肽交联的10μl Microcaps毛细管的管道线路。小的10J.tl体积的Microcaps毛细管加上伴随管道(～250μl)仅需要最小体积的稀释噬菌体文库(2.5μl文库稀释于247.5μl阻断缓冲液中，用于淘选的1011噬菌体分离物)。用阻断缓冲液包被该线路，然后噬菌体文库稀释液按线路通过该系统进行选择以使噬菌体与毛细管表面上的交联肽强结合。于37℃或在室温(RT)下孵育管道线路30分钟后，根据所用的文库洗脱结合毛细管的噬菌体：对于Ph.D.TM-7和Ph.D.TM-12文库，使用洗脱缓冲液[25mM二硫苏糖醇(DTT)，pH 8.5]；或者对于Ph.D.TM-C7C噬菌体文库分离物，使用酸性洗脱缓冲液(0.2M甘氨酸-HCI(pH 2.2),1mg/ml BSA)。捕获洗脱的噬菌体并使用1M Tris-HCl(pH9.1)中和。
使用聚乙二醇(PEG)沉淀法收获噬菌体。将扩增的噬菌体原液与1/6总体积的20％PEG-8000/2.5M NaCl溶液混合，然后使其于4℃在50ml Oakridge管中沉淀过夜。然后通过12,000rpm离心(Avanti JXN-30,Beckman Coulter,Brea,CA)于4℃将冷却的噬菌体沉淀20分钟。在最后的离心运行后收集重悬的噬菌体并重悬于pH 7.5的PBS中。使用制造商的手册在异丙基-P-D硫代半乳糖苷/5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-P-D-半乳糖苷(50mM IPTG I 40mMXGAL)培养基上滴定收集的噬菌体。将次级淘选的多克隆噬菌体溶液用于初始PLA2抑制测试，以及从软琼脂滴定板中单独挑取单克隆噬菌体分离物并扩增。
使用
图1显示了在空间填充模型中显示的从西部棉口蝮(A.p.leucostoma)毒液中分离的PLA2的晶体结构。已经使用分别表示催化活性位点和金属结合氨基酸的黄色圆圈和红色圆圈确认了残基。这些溶剂暴露的残基是噬菌体结合的可能位点。该区域中的结合噬菌体可以破坏蛋白质的酶活性并导致限制毒液活性的损害。
将来自针对PLA2共有肽而经次级淘选的噬菌体的初始多克隆噬菌体混合物用西部棉口蝮毒液(4.88μg/ml)孵育30分钟。孵育后，使用磷脂酶A2测定来测量PLA2的酶活性。测量一式三份的纯毒液以及1：4和1：1稀释液中的荧光。这些结果显示在图2中。存在的噬菌体的量影响可测量荧光的强度。来自该多克隆噬菌体混合物的单克隆噬菌体分离物列于表2中。
表2按核苷酸和肽序列将单克隆噬菌体分离物列表。从感染的细胞中分离噬菌体DNA并测序。解析所得的色谱图以确定核苷酸序列，然后将其翻译成肽序列。分离物Ph.D.-12-2和Ph.D.-12-5的核苷酸序列是相同的，这表明该噬菌体的多个分离物得以分离。从进一步的研究中移除一个重复的噬菌体以避免重复。
表2：所选单克隆噬菌体结合基序的核苷酸序列和相应的肽序列
图3显示了使用从分离的噬菌体展示文库分离的噬菌体克隆物对PLA2活性的抑制。将单个噬菌体分离物用西部棉口蝮毒液(4.88μg/ml)孵育30分钟，然后加入PLA2底物。监测反应，其中时间点对应于图3中展示的10分钟。单独的分离物使PLA2活性降低35％-60％。
如图2中可见，存在的噬菌体量影响可测量荧光的强度。1：4稀释液不会在统计学上降低测定的荧光强度，但对于噬菌体与毒液的1：1稀释液，荧光信号的减少则是浓度依赖性的；这证明较高浓度的噬菌体会进一步降低PLA2的酶活性。以与多克隆混合物相同的方式测定单克隆噬菌体分离物的抑制作用。单克隆噬菌体分离物在相同稀释率下比多克隆混合物更大程度地抑制PLA2(图3)。单独的分离物将PLA2活性降低至未抑制活性的35％至60％。由于存在于单独的噬菌体分离物上的多种可能的结合基序，可以通过靶向活性区域的特有结合表位来增加PLA2抑制。因此，噬菌体混合物(cocktail)的使用将具有协同效应。
图4显示了针对五种主要北美蛇的所选噬菌体克隆之一，即Ph.D.-12-7的跨物种抗PLA2活性。最初用于淘选靶的共有肽被设计为与所有主要北美响尾蛇PLA2具有～95％同源性。所选噬菌体克隆物的这种跨物种反应性是使用噬菌体展示技术潜在开发通用抗毒液素的最佳证据。
实施例2.
通过例如蛇咬伤使受试者接触动物毒液。作为响应，施用治疗有效量的包括本文所述的M13-噬菌体表达的肽的多物种抗毒液素组合物。滴定治疗剂量的所述组合物以优化安全性和功效。施用包括本文所述的噬菌体表达的肽的组合物通过与保守的PLA2结合来中和毒液毒性。之后，从体内清除M13噬菌体，而没有不良反应。如果需要，进一步施用治疗有效量的包括本文所述的M13-噬菌体表达的肽的多物种抗毒液素组合物。
实施例3.
通过例如蛇咬伤使受试者接触动物毒液。作为响应，施用治疗有效量的包括本文所述的M13-噬菌体表达的肽的多物种抗毒液素组合物。滴定治疗剂量的所述组合物以优化安全性和功效。施用包括本文所述的噬菌体表达的肽的组合物中和毒液毒性。之后，从体内清除M13噬菌体，而没有不良反应。如果需要，进一步施用治疗有效量的包括本文所述的M13-噬菌体表达的肽的多物种抗毒液素组合物。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：用于治疗眼病的组合物和方法